Le protozoaire Leishmania est à l’origine d’une maladie tropicale négligée qui peut s’avérer mortelle si elle n’est pas traitée adéquatement. Dans les dernières années, l’efficacité des médicaments utilisés dans le combat de la leishmaniose a grandement diminué en raison de la résistance du parasite à ceux-ci. Bien que le Topotecan (TPT), présentement utilisé comme antitumoral, ait démontré une activité antileishmaniale puissante (EC50 de l’ordre des nanomolaires), son efficacité pourrait être compromise par l’émergence de la résistance du parasite d’autant plus que des résistances tumorales cliniques au TPT ont déjà été rapportées. Dans cette étude, les mécanismes de résistance au TPT par Leishmania infantum ont été caractérisés d’un point de vue moléculaire. Le génome complet des parasites sélectionnés résistants au TPT (16 x EC50) (TPT700.1, TPT700.2, TPT700.3) a été séquencé. Le rôle dans la résistance des différents éléments génétiques identifiés a été confirmé à l’aide d’une complémentation par nucléofection épisomale dans le parasite sauvage et a été étudié avec des simulations computationnelles. Aucune amplification ni délétion n’a été identifiée et seulement une variation mineure du nombre de chromosomes a été observée. Cependant, un polymorphisme d’un seul nucléotide non synonyme a été identifié dans le gène de la grande sous-unité de la topoisomérase IB (TOP IB), la cible du TPT, chez chacun des parasites mutants résistants conférant des niveaux de résistance variables (TPT700.1 F187Y > TPT700.3 W232R > TPT700.2 G191A > sauvage). De plus, des modélisations in sillico ont permis d’illustrer la proximité de ces substitutions d’acides aminés au site catalytique de TOP IB ainsi qu’au site de liaison du TPT. En conclusion, ces résultats suggèrent qu’une mutation ponctuelle dans la grande sous-unité TOP IB est suffisante pour engendrer des hauts niveaux de résistance (environ 24 x EC50) chez TPT700.1F187Y, TPT700.2G191A et TPT700.3 W232R. TPT pourrait être considéré comme un modèle pharmacologique pour l’étude de la résistance chez Leishmania. / Leishmania, a protozoan parasite, causes a neglected tropical disease that is fatal if left untreated. In recent years, the effectiveness of the drugs used to tackle leishmaniasis has decreased dramatically due to the emergence of drug resistant parasites. Even though Topetecan (TPT), currently employed as an anti-tumoral drug, has shown strong anti-leishmanial activity (its EC50 being measured in nanomoles), its efficiency may be compromised by the resistance developped by the parasites, similarly to the resistance already recorded by tumoral cells to the drug. In this study, the mecanisms of resistance to TPT by Leishmania infantum were caracterised at the molecular level. The whole genome of parasites resistant to TPT (16 x EC50) (TPT700.1, TPT700.2, TPT700.3) was sequenced. The role of various genetic elements in the resistance mecanisms was confirmed via a complementation by episomal nucleofection in the wild type and was studied with the help of computational models. Neither amplications nor deletions were identified and only a minor variation in the chromosome number was observed. However, a non-synonymous single nucleotide polymorphism was identified in the gene coding the large subunit of topoisomerase IB, TPT’s target, within each of the resistant mutant parasites confering variable levels of resistance (TPT700.1 F187Y > TPT700.3 W232R > TPT700.2 G191A > wild type). Furthermore, in sillico models highlighted the proximity of these amino acid substitutions to the catalytic site of topoisomerase IB and also to the binding pockets of TPT. In conclusion, these results suggest that a point mutation in the large subunit of TOP IB is sufficient to confer high levels of resistance (about 24 x EC50) to TPT700.1F187Y, TPT700.2G191A and TPT700.3 W232R. Therefore, TPT can be considered a pharmacological tool to study resistance in Leishmania.

L'efficacité de la reproduction bovine a considérablement diminué dans les dernières décennies et cette diminution constitue un problème économique majeur. Pour mieux contrer ce problème, la physiologie des cellules stéroïdogéniques ovariennes dont les cellules de granulosa (CG) doit être mieux comprise au cours des dernières étapes de la croissance folliculaire, de l'ovulation et de la lutéinisation. En ce sens, nous avons précédemment identifié divers gènes induits dans les CG des follicules ovulatoires bovins par la LH/hCG incluant Ankyrin-repeat and SOCS-box protein 9 (ASB9). Cependant, les mécanismes d’action d’ASB9 dans les CG étaient encore indéfinis. Les objectifs de cette étude étaient d'élucider le rôle d'ASB9 dans les CG ainsi que ses effets sur ses partenaires spécifiques PAR1, TSG6 et TAOK1. Un modèle in vivo de CG provenant de follicules à différentes phases de développement: petits follicules (SF), follicules dominants (DF) et follicules ovulatoires (OF), et un modèle in vitro de CG en culture ont été utilisées. L'inhibition d’ASB9 dans les CG via CRISPR/Cas9 a montré une augmentation significative de PAR1, PCNA, CCND2 et CCNE2 et une diminution significative de TAOK1, TSG6 et CASP3. Dans le modèle in vivo, PAR1 a été différentiellement exprimé dans DF et TSG6 et TAOK1 ont été induits dans OF. L'inhibition de l'ASB9 a aussi entraîné une diminution de l'apoptose des CG et de l'activité caspase3/7. Des analyses Western blot ont démontré que l'induction d'ASB9 dans OF, après l'injection d'hCG, était concomitante avec une diminution significative des niveaux de phosphorylation de MAPK3/1 tandis que pMAPK3/1 augmentait après l'inhibition d'ASB9. Ces résultats supportent qu'ASB9 pourrait être un régulateur de l'activité et de la fonction des CG en ciblant des protéines spécifiques qui affectent la signalisation MAPK, limitant la prolifération des CG. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension de l’activité ovarienne et de la reproduction bovine. / The efficiency of bovine reproduction has considerably decreased in recent decades and this decrease constitutes a major economic problem. To better counter this problem, the physiology of ovarian steroidogenic cells including granulosa (CG) cells needs to be better understood during the later stages of follicular growth, ovulation and luteinization. In this sense, we have previously identified various genes induced in the CGs of bovine ovulatory follicles by LH / hCG including Ankyrin-repeat and SOCS-box protein 9 (ASB9). However, ASB9 mechanisms of action in GC were still undefined. The objectives of this study were to elucidate the role of ASB9 in CG as well as its effects on target partners PAR1, TSG6 and TAOK1, and on MAPK signaling. An in vivo model of GC from follicles at different developmental stages: small follicles (SF), dominant follicles (DF), and ovulatory follicles (OF) and an in vitro model of cultured GC along with the CRISPR/Cas9 approach to inhibit ASB9 were used. Inhibition of ASB9 in GC resulted in significant increase in PAR1, PCNA, CCND2, and CCNE2 and significant decrease in TAOK1, TNFAIP6, and CASP3 expression. From in vivo samples, PAR1 was differentially expressed in DF as compared to OF while TSG6 and TAOK1 were induced in OF. Further analyses showed an increase in GC number and a decrease in apoptosis and caspase3/7 activity following ASB9 inhibition. Western blot analyses demonstrated that ASB9 induction in OF by hCG was concomitant with a significant decrease in MAPK3/1 phosphorylation levels while pMAPK3/1 increased following ASB9 inhibition. These results provide strong evidence that ASB9 is a regulator of GC activity and function by modulating MAPK signaling pathway likely through specific binding partners such as PAR1, therefore controlling GC proliferation. These results contribute to a better understanding of ovarian activity and bovine reproduction.

L’asthme équin, une maladie inflammatoire considérée non infectieuse, est néanmoins associé avec la présence de certains streptocoques et Pasteurellaceae. La similarité entre les espèces de Pasteurellaceae complexifie toutefois leur différenciation. L’objectif de cette étude est d’évaluer la présence de différents Pasteurellaceae dans les voies respiratoires de chevaux atteints d’asthme. Des amorces qPCR ont été optimisées pour [Pasteurella] caballi, Nicoletella semolina, Pasteurella multocida et Haemophilus influenzae, mais plusieurs espèces d'intérêt (notamment Actinobacillus spp.) n'ont pas pu être étudiées faute d'amorces spécifiques. Des lavages nasaux, oraux et bronchoalvéolaires de douze chevaux (six sains, six asthmatiques) gardés dans différents environnements ont été analysés. Pour N. semolina, les analyses ont été approfondies chez dix chevaux asthmatiques (phase II : lavages nasaux et bronchoalvéolaires), et chez dix chevaux sains (phase III : lavages nasaux). N. semolina a été identifié dans 0 à 66 % des échantillons et était retrouvé en plus forte quantité dans le nez de chevaux gardés à l’intérieur et nourris avec du foin. Dans les phases II et III, N. semolina a été identifié dans 90 à 100 % des échantillons nasaux, et dans six lavages bronchoalvéolaires. [P.] caballi a été identifié dans la cavité orale de 83 % des chevaux, indépendamment du statut de santé. H. influenzae et P. multocida n’ont pas été détectés. Aucun Pasteurellaceae analysé n’était associé à l’asthme équin sévère. N. semolina était fréquemment retrouvé dans les voies respiratoires et sa charge nasale était influencée par l’environnement. Les amorces synthétisées faciliteront de futures études sur les Pasteurellaceae. / Equine asthma, an inflammatory disease considered non-infectious, is associated with the presence of certain streptococci and Pasteurellaceae. Strong similarities between Pasteurellaceae species prevent specific differentiation. The objective of the study was to evaluate the presence of different Pasteurellaceae in the airways of horses with severe asthma. Quantitative PCR primers were optimized for [Pasteurella] caballi, Nicoletella semolina, Pasteurella multocida and Haemophilus influenzae. Several species of interest (in particular Actinobacillus spp.) could not be studied due to a lack in primer specificity. Nasal, oral and bronchoalveolar lavages from twelve horses (six healthy, six asthmatics) kept in different environments were analyzed. For N. semolina, further investigation was pursued through inclusion of ten asthmatic horses (phase II: nasal washes and bronchoalveolar lavages), and ten healthy horses (phase III: nasal washes). N. semolina was identified in 0 to 66 % of samples and was found in larger loads in the nose of horses kept inside and fed hay. In phases II and III, N. semolina was identified in 90 to 100 % of nasal samples and in six bronchoalveolar lavages. [P.] caballi was only identified in the oral cavity, with 83 % of positive horses regardless of health status. H. influenzae and P. multocida were not detected. No specific Pasteurellaceae studied here were associated with severe equine asthma. N. semolina was identified frequently in respiratory samples and its nasal load was influenced by the horse’s environment. The optimized primers will facilitate future studies on Pasteurellaceae.

La prise en compte du microbiote intestinal porcin est une approche de plus en plus considérée dans la qualification des mesures de contrôle des pathogènes alimentaires issus de cette filière de production. Toutefois, ces études, en conditions protégées, sont généralement réalisées in vivo, nécessitent des installations spécialisées, coûteuses en fonctionnement. Une alternative possible à l’utilisation des animaux serait la disponibilité d’un système in vitro mimant le microbiote intestinal cultivé en bioréacteur. Ce projet de recherche vise la mise au point d’un système de culture en bioréacteur pour la production d’un microbiote dérivé du microbiote intestinal porcin, puis la mesure de l’effet de deux huiles essentielles sur le microbiote. Un système, original par son alimentation continue par un digestat d’aliment conventionnel porcin, a été utilisé dans le cadre de ce projet. En effet, ce système est composé de huit réacteurs, dont un réacteur mère permettant la croissance du microbiote qui a été distribué dans les sept réacteurs fils afin de disposer de conditions reproductibles. Les résultats obtenus par séquençage métagénomique 16S par Illumina MiSeq des échantillons démontrent une grande évolution de la composition des échantillons à 48 h par rapport au contenu intestinal utilisé pour l’inoculation. Toutefois, cette variation a diminué considérablement entre 48h et 72h, pour offrir une fenêtre d’analyse de microbiotes complexes d’origine intestinale porcine pour l’évaluation d’additifs alimentaires. Dans le cadre de cette étude, l’introduction de deux huiles essentielles, le Thymol et le Carvacrol, a été testée dans le système à 48h, pour deux concentrations (200 ou 1000 ppm). Les résultats de PCR quantitative ont démontré une augmentation significative des populations de Lactobacilles dans les réacteurs contenant du Thymol à 1000 ppm en 24h (entre l’ajout à 48h et la fin de l’expérience, à 72 h) ou par comparaison avec le réacteur contrôle sans huile à la fin de l’essai, mais aucune différence significative n’a été observée pour le Carvacrol. Toutefois, aucune différence significative n’a été observée au niveau de la composition du microbiote entre les réacteurs comportant des additifs différents. Cette étude a permis le développement d’un système de bioréacteur permettant de maintenir un microbiote dérivé du microbiote intestinal porcin sur 72h, ainsi que sa mise en oeuvre pour mesurer l’effet de l’addition d’une huile essentielle dans un réacteur. / Pig intestinal microbiota is an approach more considered in the foodborne pathogen control qualification in the pig production. However, these studies are commonly conducted in vivo needing specific installation and significant costs. A possible alternative to the use of animals would be the used of an in vitro system to mimic the intestinal microbiota, in a bioreactor. This research project aims to setup a bioreactor system to produce a microbiota derived from the pig intestinal microbiota, and to assess the effect of two essentials oils on this microbiota. The system used in this project is unique by its design, continuously supplied using digested piglet feed as a culture media. This system is composed of eight reactors, including a mother reactor for the growth of the microbiota that was divided between seven daughter reactors to obtain reproducible conditions. Results obtained by 16S metagenomic sequencing using Illumina MiSeq of the samples showed an evolution of the sample composition at 48h compared to intestinal content used for inoculation. However, this variation decreases between 48h and 72h, offering a window for the analysis of food additives effect on the microbiota from piglet origin. In this study, two essentials’ oils, Thymol and Carvacrol, were added to the system at 48h, at a concentration of 200 and 1000 ppm, respectively. Quantitative PCR showed a significant increase of Lactobacilli in reactors containing Thymol at 1000 ppm in 24h (between the addition at 48h and the end of the experiment at 72h) or when comparing with the control reactor without oils at the end of the experiment, but no significative difference was observed for the Carvacrol. However, no significative difference was observed in microbiota composition between the reactors containing the different additives. This study enabled the development of a bioreactor system to maintain a microbiota derived from the pig intestinal microbiota over 72h, and the possibility to assess the effect of essential oils addition in a reactor.

Le narval (Monodon monoceros) est une espèce emblématique de l'Arctique. Les narvals sont de plus en plus exposés à des perturbations anthropiques, pouvant augmenter leur niveau de stress et, par conséquent, avoir des impacts inconnus sur la dynamique de la population. La validation et l’étude de biomarqueurs de stress chronique pourraient donc améliorer les efforts de conservation chez cette espèce. La déhydroépiandrostérone (DHEA) et son métabolite sulfaté, la DHEA-S, sont collectivement appelés DHEA(S). Lorsque combinés sous forme de ratios avec le cortisol (cortisol/DHEA(S)), ils se sont révélés prometteurs dans l'évaluation du stress chronique chez les humains et certaines espèces animales domestiques ou sauvages. Au cours de projets de pose d’émetteurs en 2017 et 2018 dans la baie de Baffin, Nunavut, Canada, des narvals (n = 14) ont été échantillonnés au début et à la fin des manipulations. La DHEA(S) sérique a ensuite été mesurée à l’aide de deux techniques immuno-enzymatiques (ELISAs) développées pour les humains et disponibles commercialement. Une validation partielle des deux ELISAs a pu être réalisée par détermination du coefficient de variation intra-essai, confirmation de la linéarité de dilution de la DHEA(S) et calcul du pourcentage de récupération. La DHEA était également bien conservée dans le sérum de narvals suite à un stockage prolongé de 12 et 24 mois à -80°C, soulignant le potentiel d'analyse d'échantillons archivés. Les valeurs sériques moyennes (ng/ml ± SEM) de cortisol, de DHEA(S) et des ratios cortisol/DHEA(S) au début et à la fin des manipulations respectivement étaient les suivantes : cortisol = 30,74 ± 4,87 et 41,83 ± 4,83; DHEA = 1,01 ± 0,52 et 0,99 ± 0,50; DHEA-S = 8,72 ± 1,68 et 7,70 ± 1,02; cortisol/DHEA = 75,43 ± 24,35 et 84,41 ± 11,76; cortisol/DHEA-S = 4,16 ± 1,07 et 6,14 ± 1,00). Le cortisol sérique et le ratio cortisol/DHEA-S étaient statistiquement plus élevés à la fin des manipulations (P = 0,024 et P = 0,035 respectivement). De plus, le cortisol sérique à la fin des manipulations était positivement corrélé à la longueur totale du corps de l’animal (P = 0,042) et avait tendance à être plus élevé chez les mâles (P = 0,086). Cette étude confirme que ces ELISAs sont une méthode d’analyse facile à réaliser, rapide et appropriée pour mesurer la DHEA(S) sérique chez le narval. La DHEA(S) sérique et les ratios cortisol/DHEA(S) représentent des biomarqueurs potentiels pour évaluer le stress chronique chez les narvals et possiblement chez d'autres espèces de cétacés. / Narwhals (Monodon monoceros) are an iconic Arctic species and are increasingly being exposed to anthropogenic disturbances that may increase their stress levels with unknown consequences for the overall population dynamics. The validation and measurement of chronic stress biomarkers could contribute towards an improved understanding and conservation efforts for this species. Dehydroepiandrosterone (DHEA), and its sulfated metabolite DHEA-S, are collectively referred to as DHEA(S). When serum DHEA(S) concentrations are combined in a ratio with cortisol (cortisol/DHEA(S)), it has shown promise for evaluating chronic stress in humans, domestic animals, and wildlife. During field tagging in 2017 and 2018 on Baffin Bay, Nunavut, Canada, wild narwhals (n = 14) were sampled at the beginning and end of capture-tagging procedures (acute stressor). Serum DHEA(S) were measured with commercially available competitive enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) developed for humans. A partial validation of the assays was performed by determination of the intra-assay coefficient of variation, confirmation of the DHEA(S) dilutional linearity, and the calculation of the percentage of recovery. In addition, DHEA was conserved following extended storage at -80°C, highlighting the potential to analyze archival samples. Mean values (ng/mL ± SEM) of narwhal serum cortisol, DHEA(S), and cortisol/DHEA(S) ratios at the beginning and at the end of handling respectively are reported (cortisol = 30.74 ± 4.87, 41.83 ± 4.83; DHEA = 1.01 ± 0.52, 0.99 ± 0.50; DHEA-S = 8.72 ± 1.68, 7.70 ± 1.02; cortisol/DHEA = 75.43 ± 24.35, 84.41 ± 11.76, and cortisol/DHEA-S = 4.16 ± 1.07, 6.14 ± 1.00). Serum cortisol and cortisol/DHEA-S were statistically higher at the end of the capture (P = 0.024 and P = 0.035 respectively). Moreover, serum cortisol at the end of handling and prior to release was positively correlated to total body length (P = 0.042) and tended to be higher in males (P = 0.086). This study showed that these assays are easy to perform, rapid, and suitable for measuring serum DHEA(S) of narwhals and that serum DHEA(S) and calculated cortisol/DHEA(S) are potential biomarkers for chronic stress in narwhals and possibly other species of cetaceans, but this requires additional study.

Le recours aux cellules souches pour améliorer la réparation et guérison des blessures et maladies musculosquelettiques chez le cheval est de plus en plus fréquent. Les développements récents dans la reprogrammation cellulaire ont permis le développement de nouvelles sources de cellules souches pour ces thérapies régénératives. Des cellules souches pluripotentes induites (iPS) autologues peuvent être dérivées de cellules adultes par la reprogrammation directe à travers l'expression induite des gènes de pluripotence. Le clonage par transfert nucléaire (SCNT) suivi de la dérivation de cellules souches embryonnaires (ES) permet la reprogrammation indirecte des cellules adultes. Cependant, l’efficacité de ces deux méthodes pour la dérivation de cellules pluripotentes génétiquement stables est faible. Nous avons donc combiné les techniques SCNT et iPS dans le but de développer un protocole efficace de dérivation de cellules iPS autologues à partir de fibroblastes de la peau équine. Quatre facteurs de reprogrammation ont été introduits dans les cellules fibroblastes de fœtus clonés (ntFF) ainsi que les cellules ES provenant d’embryons clonés (ntES) pour induire leur reprogrammation en cellules iPS autologues. Les cellules ntFF-iPS et ntES-iPS ont des capacités prolifératives avancées et expriment des marqueurs de pluripotence importants. Par contre, les cellules ntES ont une efficacité de reprogrammation significativement supérieure aux cellules nt-FF et forment des colonies trois fois plus rapidement. Contrairement aux cellules ntES, les cellules ntES-iPS démontrent une augmentation de l’expression des marqueurs de pluripotence et survivent à la culture cellulaire prolongée. Les résultats présentés dans ce mémoire attestent que l’utilisation de la reprogrammation secondaire de cellules FF et ES clonées permet la production de cellules souches pluripotentes autologues stables chez le cheval. / For veterinarians, regenerative medicine in horses has focused mainly in the use of stem cells for arthritis, tendon and ligament repair, indicating a need for treating musculoskeletal injuries. The recent developments in cell reprogramming have paved the way for alternative cell sources for stem cell therapies. Autologous pluripotent stem cell lines can be derived from adult cells either by direct reprogramming through induced expression of pluripotency genes (iPS) or indirectly by reprogramming through somatic cell nuclear transfer (SCNT) followed by the derivation of embryonic stem cells (ESC). However, outcome efficiencies of SCNT and iPS protocols are invariably low, indicating that alone neither of these reprogramming routes is sufficient for deriving genetically and epigenetically stable pluripotent stem cells. We hereby report on the production of autologous equine iPS cells by combining SCNT and iPS reprogramming protocols. Adult skin fibroblasts were used for SCNT, and the resulting cloned embryos were either used to obtain cloned fetal fibroblast cells (ntFF), or used for ESC culture (ntES). Cells were then transfected with reprogramming factors to derive autologous iPS cells. Both ntFF-iPS and ntES-iPS cells are capable of extensive proliferation and express important pluripotency factors. However, ntES reprogramming efficiency is significantly higher than ntFF cells, with ntES-iPS colonies forming three times faster. Additionally, ntES-iPS cells showed improved pluripotency marker expression when compared with ntES cells. The results presented in this memoir indicate that stable equine iPS cell lines may be readily obtained from secondary reprogramming of cloned ntFF and ntES cells, opening novel avenues for developing autologous pluripotent stem cell therapies.

Les tumeurs mammaires canines (CMT) sont les plus fréquents néoplasmes chez les chiennes intactes. Aucun consensus n’existe, actuellement, concernant le protocole thérapeutique des tumeurs invasives ou métastatiques. Des études récentes démontrent l’implication du dérèglement de la voie Hippo dans le développement et la progression des CMTs. Les statines, en inhibant la geranylgeranylation (GGylation) protéique, activent la voie Hippo et suspendent les effets transcriptionnels de YAP et TAZ. Cette étude évalue le ciblage thérapeutique de la voie Hippo avec deux statines (atorvastatine et fluvastatine) sur deux lignées cellulaires de CMT (CMT9 et CMT47). Les deux statines ont démontré une cytotoxicité pour CMT9 et CMT47 avec de IC50 de 0,95 µM et 23,5 µM respectivement. Les statines ont également diminué les niveaux des protéines effectrices de la voie, YAP et TAZ, ainsi que les niveaux d’ARNm de trois gènes cibles de YAP-TAZ/TEAD connus pour leur rôle dans la progression du cancer du sein et la chimiorésistance : CYR61, CTGF et RHAMM. De plus, la migration cellulaire de CMT47 et la croissance indépendante de l’ancrage des deux lignées ont été inhibées en présence de statines mais pas l’invasion de la matrice extracellulaire. Enfin, les analyses FACS ont montré une augmentation de l’apoptose et un arrêt du cycle cellulaire. Nos résultats suggèrent que les statines activent la voie Hippo et ciblent différents mécanismes moléculaires et cellulaires dans les CMT in vitro. Les statines agissent sur la voie Hippo et pourraient représenter une approche innovante pour le traitement des tumeurs mammaires canines invasives ou métastatiques. / Canine mammary tumours (CMTs) are the most common neoplasms in intact bitches, and no effective chemotherapeutic options are available for highly invasive and metastatic tumors. Recent studies show the potential involvement of dysregulated Hippo signaling in CMT development and progression. Protein geranylgeranylation (GGylation) is an important post-translational modification for many signaling molecules, and its blockade with statins has been shown to inhibit YAP/TAZ-mediated transcriptional activity via activation of the Hippo pathway. In this study, we sought to determine if protein GGylation represents a valid pharmacological target in CMTs. Two CMT cell lines (CMT9 and CMT47) were evaluated for their sensitivity to atorvastatin and fluvastatin. Results demonstrated statins to be cytotoxic to both cell lines, with IC50 values ranging from 0.95 µM to 23.5 µM. In addition, both statins lowered Hippo pathway effector proteins YAP and TAZ and reduced the mRNA levels of key transcriptional target genes known to be involved in breast cancer progression and chemoresistance (CYR61, CTGF and RHAMM). Moreover, both statins effectively inhibited cell migration in CMT47 and anchorage independent growth in CMT9 and CMT47, but did not modulate matrix invasion. Finally, our FACs results showed that both statins increase apoptosis and promote cell cycle arrests. Taken together, our results indicate that statins activate the Hippo pathway in CMTs and modulate several aspects of CMT’s molecular and cellular behaviours. These findings suggest that targeting the Hippo pathway with statins could be a novel approach for the treatment of invasive, metastatic or inoperable canine mammary gland cancers.

Introduction: L’arthrose est une maladie fréquente chez le chien. Même si des traitements palliatifs ont prouvé leur efficacité pour soulager les signes cliniques associés, aucun n’a permis de restaurer la structure des cartilages ou la fonction des patients. De nouvelles modalités de traitement sont proposées mais très peu d’évidences existent quant à leur efficacité. Un problème récurrent pour apporter plus d’évidence est le manque d’outils d’évaluation dûment validés. Objectif: Evaluer l’efficacité d’une diète contenant de la moule verte, ainsi que la validité de différentes méthodes pour évaluer les effets de ce traitement sur la condition arthrosique de chiens de propriétaire. Méthodes: Une étude prospective croisée contrôlée en aveugle a été conduite sur 30 chiens de propriétaires. Leur condition était stable et non traitée. Ils ont reçu une diète contrôle pendant 30 jours puis la diète thérapeutique pendant 60 jours. A J0 (inclusion), J30 (fin de la période contrôle) et J90 (fin du traitement), les concentrations plasmatiques en acides gras ω–3 (EPA et DHA), le pic de force verticale (PVF – critère de référence), un questionnaire multifactoriel standardisé (MFQ), et la conductance électrodermique (EDA) ont été mesurés. Deux fois par semaine, les propriétaires remplissaient un questionnaire sur la fonction spécifique à leur animal (CODI). L’activité locomotrice (actimétrie) a été enregistrée en continu sur 7 chiens. Résultats: Aucun effet secondaire n’a été documenté excepté une augmentation du poids des chiens durant la période traitement. La localisation -thoracique ou pelvienne- du membre étudié et le poids ont interagi avec PVF. Les taux d’EPA et DHA ont augmenté durant la période traitement (p=0.026 et p<0.001, respectivement), tout comme PVF corrigé pour l’effet du poids et de la localisation du membre (p=0.003). La validité technique de PVF a été vérifiée. La validité technique et selon-critère du CODI ont été vérifiées. MFQ n’a pas montré d’homogénéité suffisante entre ses différents composants, bien que les résultats du composite convergent partiellement avec PVF. L’EDA n’a pas montré de validité technique suffisante. L’actimétrie a montré une validité technique satisfaisante ainsi que des résultats convergeant avec ceux de PVF. Conclusions: La méthode choisie comme référence a montré un effet bénéfique de la diète testée et sa validité technique a été vérifiée. À la fois, CODI et l’actimétrie ont été validés. La validité d’EDA et de MFQ a été remise en question. L’actimétrie a donné des résultats prometteurs, probablement complémentaires de PVF. / Background: Osteoarthritis is a frequent disease in dogs. Even though palliative treatments have been proven efficient in alleviating the associated clinical signs, none restored structure of the cartilage or complete function of the patients. New modalities have been proposed but evidence of their effects is weak. The weakness of the evidence is partially explained by the rare validation of the methods of assessment. Objective: To assess the efficacy of a diet containing green-lipped mussel, as well as technical and concurrent validity of different assessment instruments for measuring the effects of a treatment on the osteoarthritic condition of client-owned dogs. Methods: A prospective blinded controlled crossover study was performed on 30 client-owned dogs, suffering from stable and non-treated osteoarthritis. They received a 30-day control diet, followed by a 60-day experimental therapeutic diet. Punctual methods of assessment included Peak of Vertical Force (PVF – “gold standard”), standardized MultiFactorial Questionnaire (MFQ) and ElectroDermal Activity (EDA), and were assessed at D0 (inclusion), D30 (end of control) and D90 (end of treatment). Twice a week, the owners completed a case-specific functional (CODI) assessment. Motor activity (actimetry) was continuously recorded on seven dogs. Results: No side effects were observed except the dogs gained weight during the second period. The location of the affected limb, thoracic or pelvic, as well as the body weight interfered with PVF. Both EPA and DHA increased during treatment (p=0.026 and p<0.001, respectively), as well as PVF after adjustment for location of the limb and weight (p=0.003). The technical validity of PVF was confirmed. Technical and concurrent validity of CODI were documented. The reliability of MFQ was insufficient since the individual components did not show homogeneity. However, concurrent validity of the composite scale was partially noted. Preliminary results proved the technical and concurrent validity of actimetry. Conclusions and clinical relevance: The “gold standard” method, PVF, showed a beneficial effect of the tested diet and its technical validity was verified. CODI and actimetry have been validated. The validity of MFQ and EDA has been questioned. Actimetry showed promising results, possibly complementing PVF.

La reproduction est un pilier majeur de la productivité des fermes laitières. Dans ce contexte, il est pertinent d’identifier à l’avance les animaux à risque d’avoir des performances en reproduction sous-optimales, surtout si un traitement efficace est disponible pour améliorer ces performances. Les endométrites clinique et subclinique sont des conditions définies selon leur impact sur les performances en reproduction subséquentes et donc, des outils très intéressants de surveillance de la santé utérine. Le premier objectif de cette étude était de déterminer simultanément des seuils diagnostiques pour les endométrites clinique (diagnostiquée par le Metricheck) et subclinique (diagnostiquée par la cytologie endométriale ou par l’estérase leucocytaire) selon leur impact sur les performances en reproduction à la première saillie. L’écoulement vaginal purulent a été identifié comme seuil pour l’endométrite clinique, alors que les seuils identifiés pour l’endométrite subclinique ont été un pourcentage de polymorphonucléaires de 6% à la cytologie et une « forte quantité de leucocytes » à l’estérase leucocytaire. Le second objectif de l’étude était d’évaluer l’effet d’un traitement intra-utérin de céphapirine sur les performances à la première saillie des animaux sains et atteints d’endométrite. Aucun effet du traitement n’a été observé chez les vaches saines ou atteintes d’endométrite clinique, alors qu’une tendance à l’amélioration des performances a été associée au traitement chez celles atteintes d’endométrite subclinique. L’anovulation post-partum prolongée pourrait altérer l’efficacité du traitement de céphapirine, surtout chez les vaches atteintes d’endométrite clinique. / Reproduction is a major concern in the dairy industry. In this context, it is relevant to have an early identification of cows at risk of altered subsequent reproductive performance, especially if a treatment is available and effective to improve this performance. Clinical and subclinical endometritis are defined based on their impact on reproductive performance and are interesting tools for reproductive tract health surveillance. The first objective of this research project was to determine simultaneously diagnostic criteria for clinical (diagnosed by Metricheck) and subclinical (diagnosed by endometrial cytology or leukocyte esterase testing) endometritis based on their impact on reproductive performance at first service. Clinical endometritis was defined as presence of purulent vaginal discharge whereas subclinical endometritis was defined as presence of ≥ 6% of polymorphonuclear cells using endometrial cytology or the presence of “large amount of leukocytes” using leukocyte esterase testing. The second objective of this research project was to determine the effect of an intrauterine infusion of cephapirin on the reproductive performance at first service in cows with clinical endometritis, subclinical endometritis, and in cows unaffected by endometritis. Cephapirin treatment had no effect on first service pregnancy risk in unaffected cows or in cows affected by clinical endometritis. However, there was a tendency of a positive effect of the treatment in cows affected by subclinical endometritis. Presence of prolonged postpartum anovulation in cows may reduce the efficacy of the cephapirin treatment, especially in cows affected by clinical endometritis.

La tumeur des cellules de la granulosa (GCT) représente 5% des cas de cancers ovariens chez la femme. Bien que considérées comme peu malignes, la mort survient dans 80% des cas suite à une recrudescence de la maladie. En dépit de ces statistiques sinistres, peu d’études ont été portées sur ce type de cancer. Le premier objectif de cette étude consistait à élucider les mécanismes moléculaires causant les GCT en démontrant l’implication de la voie de signalisation PI3K/AKT dans leur étiologie. Pour ce faire, nous avons employé la technologie Cre-Lox afin de cibler le gène Pten (antagoniste de cette voie) spécifiquement dans les cellules de la granulosa chez la souris. Ces souris (Ptenflox/flox;Amhr2cre/+) ont occasionnellement développé des GCT, soutenant notre hypothèse de l’importance de la voie PI3K/AKT dans leur étiologie. La voie WNT/CTNNB1 est une autre voie de signalisation qui a récemment été impliquée dans le développement des GCT. Dans le cadre de ce projet, nous avons également testé l’existence possible d’une synergie fonctionnelle entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le développement de la maladie. Pour ce faire, nous avons créé le modèle transgénique Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+, chez lequel les cellules de la granulosa présentant non seulement une désinhibition de la voie PI3K/AKT, mais aussi une suractivation de la voie WNT/CTNNB1. Tel que prédit, les souris Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ ont développé une forme de GCT beaucoup plus agressive que celle observée chez les femelles Ptenflox/flox;Amhr2cre/+. Spécifiquement, le développement des tumeurs se déclenchait plus tôt, leur croissance était beaucoup plus rapide, nous avons pu observer des métastases pulmonaires et la dissémination des cellules tumorales dans la cavité péritonéale, et la maladie était invariablement fatale avant l’âge de 8 semaines. Le modèle Ptenflox/flox;Ctnnb1flox (ex3)/+;Amhr2cre/+ a donc servi à démontrer l'existence d'une synergie entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le développement de la GCT. De façon inattendue, les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ ont aussi présenté un phénotype de sous-fertilité qui n’était pas d’origine ovarienne. Il a récemment été démontré que la souche Amhr2cre dirige l’expression de Cre non seulement aux cellules de la granulosa, mais aussi au stroma utérin et au myomètre. Le second objectif de ce travail était donc de démontrer si et comment le phénotype d’infertilité chez les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ pouvait découler d’un défaut utérin. Lors de l'implantation, les cellules du stroma utérin se différencient en cellules déciduelles pour former la décidua maternelle (DM), qui se régresse ensuite par apoptose afin de faciliter l’invasion des cellules trophoblastiques. De plus, la DM, en collaboration avec le tissu foetal, recrute des uNKs dont le rôle est de remodeler les artères spiralées pour augmenter l’apport sanguin maternel vers le foetus en développement. Nous avons pu démontrer que l'utérus des femelles gestantes Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ présentait une DM anormalement résistante à l'apoptose, moins de uNKs et des artères spiralées non-remodelées. Par conséquent, l’invasion des cellules du trophoblaste était restreinte, compromettant le développement et la survie de l'embryon. Nous avons donc établi pour la première fois l’importance de Pten lors de la décidualisation et de l’invasion du trophoblaste. / The granulosa cell tumor (GCT) represents up to 5% of all ovarian cancer cases in women. Although GCT is characterized as a low-grade malignancy, death occurs in approximately 80% of cases following to the disease’s recurrence. Despite these statistics, very few studies have been dedicated to increasing our understanding of the molecular mechanisms responsible for the development of GCT. The first objective of this work was to elucidate some of these molecular mechanisms by proving the involvement of the PI3K/AKT signaling pathway in the etiology of GCT. To this end, we used Cre-LoxP technology to conditionally target Pten (a PI3K/AKT signaling antagonist) in granulosa cells. These transgenic mice (Ptenflox/flox;Amhr2cre/+) occasionally developed GCT, supporting our hypothesis on the importance of the PI3K/AKT pathway in the etiology of this disease. The WNT/CTNNB1 signaling pathway has also recently been implicated in GCT development. We therefore postulated that a functional synergy may exist between the WNT/CTNNB1 and PI3K/AKT pathways in development of GCT. To test this, we created a second transgenic model (Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+), in which the granulosa cells featured not only a disinhibition of the PI3K/AKT pathway but also a constitutive activation of the WNT/CTNNB1 pathway. As predicted, the Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ mice developed a form of GCT that was much more aggressive than the one observed in the Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ model. Specifically, the tumors developed sooner, their growth was faster, pulmonary metastases and the seeding of tumor cells in the abdominal cavity were observed, and the disease was invariably fatal by 8 weeks of age. The Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ model therefore served to demonstrate a synergy between the WNT/CTNNB1 and PI3K/AKT pathways in GCT development. Unexpectedly, the majority of the Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ females presented an infertility phenotype that was not caused by an ovarian defect. Recently, it has been shown that the Amhr2cre strain can direct the Cre activity not only to the granulosa cells but also to the uterine stroma and myometrium. The second objective of this work was therefore to determine if and how the infertility observed in Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ mice could be caused by a uterine defect. During implantation, uterine stromal cells differentiate into decidual cells and form the maternal decidua (MD), which subsequently regresses by apoptosis to facilitate trophoblast invasion. In collaboration with the fetal tissue, the MD also recruits uNKs, which are responsible for spiral artery remodeling that increases maternal blood flow to the developing fetus. We were able to demonstrate that the uteri of pregnant Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ females had a MD that was resistant to apoptosis, less uNKs, and spiral arteries that were not properly remodeled. Consequently, the trophoblast cell invasion was restricted, thereby compromising the development and survival of the embryo. We have therefore established for the first time the importance of Pten during the decidualization of the uterine stroma and trophoblast invasion.