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Introduction: le Virus Respiratoire Syncytial humain (RSV) induit un taux élevé de morbidité et de mortalité chez les enfants, les personnes immunodéprimées et les personnes âgées. Il existe un besoin urgent d'un nouveau traitement antiviral et d'un vaccin efficaces. Les cellules épithéliales des voies aériennes (AEC) sont la cible principale de RSV et constituent la première ligne de défense grâce à des mécanismes distincts, qui incluent une réponse antivirale autonome cellulaire. La protéine p62/SQSTM1 a de multiples fonctions cellulaires, y compris la séquestration spécifique de la cargaison ubiquitinée (c'est-à-dire, les protéines/organelles et les bactéries intracellulaires) pour leur clairance par autophagie. Des données publiées ont mis en évidence un rôle important de p62 dans la régulation de plusieurs virus (par exemple, le virus de la grippe et la dengue), favorisant ou restreignant sa réplication en fonction du virus. L'objectif de notre étude est de déterminer le rôle de p62 dans la régulation du cycle infectieux de RSV. Méthodes et résultats: L'analyse de l'expression de p62 dans les cellules A549 a montré que p62 est induit et phosphorylé au début de l'infection par RSV. Il est ensuite dégradé plus tardivement durant l’infection. La déplétion des niveaux de p62 a diminué l'accumulation intracellulaire des protéines virales, tandis que la relâche des virions infectieux a été augmentée. De plus, nous avons observé que la réplication de recRSV-GFP est diminuée dans des cellules exprimant de façon stable la protéine associée aux microtubules 1A/1B, chaîne légère 3 (LC3). LC3 recrute p62 et ses cargaisons à l'autophagosome pour qu'ils soient dégradés par autophagie. Des études sont actuellement en cours pour déterminer les mécanismes moléculaires, dépendant de p62, impliqués dans la régulation de la réplication de RSV. Conclusion: nos résultats mettent en évidence un rôle clé de p62 dans la réplication et la propagation de RSV. Ces études aideront à définir si p62 pourrait représenter une cible thérapeutique potentielle pour lutter contre l'infection à RSV. / Introduction: Human respiratory syncytial virus (RSV) causes a high rate of morbidity and mortality worldwide in children, immunocompromised and elderly people. There is an urgent need for effective antiviral treatments and vaccines for RSV. Airway epithelial cells (AECs) are the primary target of RSV and constitute the first line of defense through distinct mechanisms, including intrinsic antiviral responses. The p62/SQSTM1 protein has multiple cellular functions including cell signaling and sequestration of specific ubiquitinated cargo (i.e. proteins/organelles and intracellular bacteria) for autophagic degradation. The replication of several viruses has been shown to be sensitive to p62 levels. The goal of our study is to investigate the role of p62 in the regulation of RSV replication. Methods and Results: Analysis of p62 expression in A549 cells showed that p62 is induced and phosphorylated during early stages of RSV infection, followed by degradation at later times. P62 silencing diminished the intracellular accumulation of viral proteins, while causing increased release of infectious virions. Additionally, we observed that the stable expression of Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3), which recruits p62 and its cargos to the autophagosome for autophagy degradation, reduces recRSV-GFP replication. Studies are currently undertaken to determine the molecular mechanisms involved in p62-dependent regulation of RSV replication. Conclusion: Our results highlight a key role of p62 in the replication of RSV. These studies will help to define whether p62 might represent a potential therapeutic target to fight RSV infection.

Aujourd'hui, l'un des modèles de souris humanisées le plus robuste est obtenu en injectant des cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC) issues de foie fœtal humain et en implantant du thymus fœtal autologue. Ce modèle, appelé BLT (Bone marrow/Liver/Thymus), s'est révélé capable de supporter une reconstitution, une maturation et une sélection optimales des cellules T. Les souris BLT sont utilisées pour de nombreuses études telles que la compréhension de la biologie du VIH ou plus récemment en médecine régénérative. Grâce à ce modèle, nous avons pu d’une part étudier le rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) lors de l’infection par le VIH mais aussi mieux comprendre la formation in vivo de tératomes lors de l’utilisation d’iPSC. Cependant, l'une des principales limites de cette technique réside dans l'obtention du tissu fœtal. Ici, nous avons décrit un nouveau protocole de souris humanisées greffées avec du thymus humain en utilisant des matériaux plus accessibles: du thymus humain retiré lors d’une chirurgie cardiaque chez des nouveaux-nés ou des enfants, et des HSC de sang de cordon. Des morceaux de ces thymus ont été implantés dans les quadriceps de souris immunodéficientes, après avoir été mis en culture. Ces souris CCST (Cord blood and Cardiac Surgery Thymus) ont permis une prise de greffe importante et un meilleur développement des lymphocytes T humains que les souris humanisées sans thymus. Les lymphocytes T des souris CCST et BLT ont montré une fonction similaire, évaluée par des tests de prolifération ex vivo et par rejet de lignées de cellules leucémiques allogéniques in vivo. Nous avons testé l’intérêt de cette nouvelle stratégie dans le modèle de l’infection au VIH-1, qui représente le modèle type de l’utilité des BLT. Nous avons montré que les souris CCST sont sensibles à l'infection par le VIH-1 par voie muqueuse ou intrapéritonéale, comme l'indique la détection de l'ADN du VIH et des cellules p24 +, similairement aux souris BLT. Les souris CCST ont présenté des réponses de lymphocytes T spécifiques du VIH-1 ex vivo plus efficaces que les BLT. Lors du traitement antirétroviral, les souris CCST, comme les BLT, ont vu leur charge virale diminuer. Ces résultats démontrent que les souris CCST représentent une alternative au modèle de souris BLT classique. Ces thymus, éthiquement plus facile à obtenir, peuvent être utilisés pour générer un grand nombre de souris par rapport aux thymus fœtaux. / Immunodeficient mice engrafted with human immune system provide an exciting in vivo model for a better understanding of its functioning and for development of new therapies. Today, one of the most robust humanized mouse model is achieved by injecting human hematopoietic stem cells (HSC) from fetal liver along with an implantation of autologous fetal thymic tissue. This model, called BLT, was shown to be able to support an optimal T cell reconstitution, maturation and selection. BLT mice are extensively used for many studies such as understanding HIV biology or in regenerative medicine. Indeed, our work used BLT mice on one hand to study the role of plasmacytoid dendritic cells (pDC) during the HIV infection and on the other hand to better understand the formation of teratomes from iPSCs in vivo. However, one of the biggest limitations of this technique is the procurement of the fetal tissue. Here we describe a new protocol to do humanized mice engrafted with human thymus pieces by using more accessible materials: human thymus obtained during cardiac surgery and cord blood HSC. Indeed, thymus is spontaneously removed during cardiac surgery in neonates and young children, thus it is an easy and ethical way to obtain this tissue. Those thymuses pieces were implanted in the quadriceps of a immunodeficient mice, after being put in culture. CCST mice (Cord blood and Cardiac Surgery Thymus) exhibited a significant engraftment of T-cells, compared to humanized mice without thymus. T-cells from both CCST and BLT mice showed a similar function as evaluated by proliferation assays upon PHA stimulation ex vivo and rejection of allogeneic leukemic cells lines in vivo. CCST mice were susceptible to HIV-1 infection via mucosal or intraperitoneal route, as shown by detectable viral load, HIV DNA and p24+ cells, at similar levels to those of BLT mice. Importantly, CCST mice displayed more effective ex vivo HIV-1-specific T-cell responses compared to BLT. Upon antiretroviral treatment, CCST mice, like BLT, were able to diminish the viral load. Our data suggest that CCST mice represent an alternative to the regular BLT mouse model. Those easy-to-access thymuses can be used to generate a large number of mice compared to fetal thymuses.

Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) est un pathogène important, entrainant des pertes économiques de 130 millions de dollars annuellement au Canada. La surveillance est effectuée par séquençage Sanger du gène ORF5 mais nous croyons que le séquençage du génome entier (SGE) du VSRRP permettrait une meilleure surveillance épidémiologique comparé au séquençage du gène ORF5. Pour développer une méthode efficace de SGE du VSRRP, 149 échantillons (sérums, poumons, tissus, autres) d’animaux malades ou récoltés pour fin de surveillance ont été analysés. L'ARN viral a été concentré par enrichissement d'ARN à queue poly (A) et le séquençage effectué sur une plateforme Illumina. Le SGE a été efficace dans 67,11% des échantillons, réussissant dans certains échantillons de poumons et de sérums possédant une valeur de quantification (Cq) du virus par RTqPCR jusqu’à 26,50 et 34.13, respectivement. La méthodologie développée de SGE du VSRRP a été 4650 fois plus sensible que les méthodes décrites précédemment. Pour quantifier l’impact du SGE, 88 échantillons (dont le SGE a réussi) ont été utilisés pour comparer le SGE au séquençageORF5. Deux génomes de VSRRP différents ont été trouvés dans quatre échantillons différents (taux de coinfection de 4,55%). Six génomes de VSRRP (6,52% des souches) ont été classés différemment par rapport à la classification ORF5. Ainsi, le SGE du VSRRP a permis une meilleure caractérisation de 9,10% des échantillons VSRRP positifs comparé au séquençage ORF5. Donc, le SGE du VSRRP est à la fois sensible et plus précis que la classification par l’ORF5. / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is an important pathogen, costing over 130 million dollars annually in Canada. Surveillance is done by Sanger sequencing of the ORF5 gene, but we hypothesized that whole genome sequencing (WGS) of PRRSV genome will allow a better epidemiological monitoring of PRRSV compared to ORF5 gene sequencing. To develop an efficient method of PRRSV WGS, 149 PRRSV samples (sera, lungs, pool of tissues and others) collected for surveillance or from sick animals were tested. Viral RNA was concentrated using a poly(A) tailed RNA enrichment method, and sequencing was done on an Illumina platform. WGS was successful in 67.11% of cases. WGS was successful in some tissues and lungs samples with RT-qPCR cycle quantification (Cq) values up to 26.50, and in some sera with Cq value up to 34.13. The developed WGS methodology was 4650 times more sensitive for PRRSV WGS than previously described methods. To quantify the impact of WGS, 88 successful samples for the WGS of PRRSV were used to compare efficiency of WGS and ORF5 sequencing. Two different full-length genomes of PRRSV were found in four of those samples (coinfection rate of 4.55%). Six full-length PRRSV genomes (6.52% of PRRSV strains) were found to cluster differently compared to ORF5 sequencing. WGS of PRRSV also enabled a better classification or characterisation of 9.10% of the PRRSV infected samples compared to ORF5 sequencing. Thus, WGS can be both sensitive and more accurate then ORF5 classification for the characterisation of PRRSV strains.

Dans la cellule, les ARN pré messagers contenant des introns sont normalement retenus au noyau par leur interaction avec des facteurs d’épissage. Cependant, les ARN partiellement et non épissés des rétrovirus doivent entrer dans le cytoplasme pour servir de matrice pour la synthèse de certaines protéines telles que Env, Gag et Gag-Pol ainsi que d’ARN génomique qui sera empaqueté dans les nouveaux virions. Un mécanisme post-transcriptionnel utilisé par les lentivirus pour éviter la séquestration nucléaire de ces ARNm dépend d’une protéine virale appelée Rev. Pour assurer sa fonction d’exportation, Rev doit transiter entre le noyau et le cytoplasme et doit aussi pouvoir former des multimères. Par conséquent, Rev est dotée de domaines fonctionnels lui procurant ces habiletés. On retrouve le domaine riche en arginines qui contient le domaine de liaison à l’ARN et le signal de localisation nucléaire (NLS), un second domaine, riche en leucines, porte le signal d’exportation nucléaire (NES) et finalement le domaine de multimérisation. Bien que les protéines Rev du virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) et bovine (VIB) aient été caractérisées, aucune étude n’a été réalisée pour la protéine Rev du virus de la maladie de Jembrana (JDV) et très peu sur le virus de l’immunodéficience féline (VIF). Comme les domaines fonctionnels et la voie d’importation des protéines Rev déjà caractérisées sont différents, nous supposons que chaque protéine Rev possède une organisation qui lui est propre et que les mécanismes de transport nucléo-cytoplasmique diffèrent entre les virus. Ce projet a pour objectif de caractériser ces domaines pour la protéine Rev du JDV et ceux du VIF ainsi que les mécanismes permettant leur transport nucléaire. L’utilisation de mutants de la protéine Rev de ces virus couplés à la protéine de fluorescente verte (EGFP) exprimés dans des cellules appropriées et observés par microscopie a permis d’identifier des séquences NLS et NES différentes de celles déjà caractérisées. Le NLS de la protéine Rev du JDV a été identifié et est composé des résidus arginines de la séquence 76-RRPARRPPIRR-87 avec un NoLS composé des mêmes résidus en plus des arginines R74, R103 et R104. Son NES est composé des résidus hydrophobes de la séquence 116-MAELEERFEDLAL-128 et est du type de l’inhibiteur de la protéine kinase (PKI pour « protéine kinase inhibitor »). Pour la protéine Rev du VIF, son NLS est composé des résidus basiques de la séquence 84-KKKRQRRRRKKKAFKK-99. Le NoLS est composé des mêmes acides aminés en plus du résidu K82. De plus, les essais d’importation nucléaires et d’interaction semblent indiquer que les voies d’importation utilisées diffèrent entre les virus et que plusieurs voies peuvent être utilisées. Ces travaux pourront éventuellement servir de base pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les lentivirus. / In the cell, pre-messenger RNAs containing introns are normally retained in the nucleus by their interaction with splicing factors. However, the partially and unspliced ​​RNAs of retroviruses must enter the cytoplasm to serve as a template for the synthesis of certain proteins such as Env, Gag and Gag-Pol as well as genomic RNA to be packaged in the new virions. A post-transcriptional mechanism used by lentiviruses to prevent nuclear sequestration of these mRNAs depends on a trans-activator, the viral protein Rev. To ensure its export function, Rev must be able to shuttle between the nucleus and the cytoplasm and to form multimers. As a result, Rev has functional domains that provide these abilities: the arginine-rich domain, which contains the RNA binding domain and the nuclear localization signal (NLS), a second domain, rich in leucine, corresponding to the nuclear export signal (NES) and finally the multimerization domain. Although the Rev proteins of the human and bovine immunodeficiency virus (HIV-1 and BIV respectively) have been characterized, no studies have been performed for the Jembrana disease virus (JDV) Rev protein and very little on the feline immunodeficiency virus (FIV). Since the functional domains and import pathway of the already characterized Rev proteins are different, we assume that each Rev protein has its own organization and that the nucleo-cytoplasmic transport mechanisms differ between viruses. The goal of this project is to characterize these domains for the JDV and FIV Rev proteins as well as to elucidate mechanisms for their nuclear transport. The use of Rev mutants fused to the EGFP expressed in appropriate cells and observed by microscopy has identified NLS and NES sequences that differ from those already characterized. JDV Rev NLS is composed of arginine residues in the 76-RRPARRPPIRR-87 sequence with a NoLS composed of the same residues with the addition of arginine R74, R103 and R104. JDV Rev NES is composed of hydrophobic residues in the 116-MAELEERFEDLAL-128 sequence and is of the protein kinase inhibitor type (PKI). For the FIV Rev protein, its NLS is composed of basic residues in the 84-KKKRQRRRRKKKAFKK-99 sequence. FIV Rev NoLS is composed of the same residues with the addition of the lysine at position 82. In addition, the nuclear import and interaction tests suggest that the import routes used by Rev differ between the different viruses studied and that more than one import pathway may be used. This work could serve as a basis for identifying new therapeutic targets against lentiviruses.

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Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA), a touché environ 70 millions d’individus, dont environ la moitié en sont morts. Bien qu’il existe aujourd’hui des traitements efficaces pour prévenir la progression du SIDA, il n’y a actuellement ni vaccin, ni traitement qui ne guérisse complètement. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) permettent de limiter l’établissement de l’infection en sécrétant des quantités importantes d’interféron de type I (IFN-I) en réponse à la détection du VIH. L’IFN-I permet non seulement d’établir un environnement antiviral, mais aussi d’amorcer la réponse immunitaire innée. Cette réponse des pDCs est régulée notamment par le récepteur immunoglobulin-like transcript 7 (ILT7) dont l’activation par son ligand, bone marrow stromal antigen 2 (BST2), réprime la production d’IFN. BST2 est par ailleurs un facteur de restriction du VIH-1 qui agit en retenant les particules virales à la surface des cellules infectées, limitant ainsi la dissémination du virus. La protéine accessoire Vpu du VIH-1 contrecarre l’action de BST2 sur la relâche virale par une régulation négative des niveaux de surface et par un déplacement hors des sites d’assemblages viraux. Ce déplacement, qui permet l’activation d’ILT7 par BST2, a un rôle double, soit d’augmenter la relâche virale par les cellules infectées, mais aussi de limiter la production d’IFN-I par les pDCs. Par une analyse de variants de Vpu provenant de souches pandémiques et non pandémiques du VIH-1, cette étude indique que cette fonction de Vpu est majoritairement associée au groupe pandémique M avec l’exception notable du sous-groupe C, responsable d’environ la moitié des infections mondiales. Ce phénotype des variants du sous-groupe C est associé à une incapacité à déplacer BST2 dans des cellules T infectées. Des analyses fonctionnelles où des cellules infectées détectées par des pDCs révèlent cependant que les protéines Vpu incapables d’augmenter l’activation d’ILT7 médiée par BST2 ont possiblement développé d’autres mécanismes pour limiter la production d’IFN-I par les pDCs, par exemple la limitation des contacts entre les cellules infectées et les pDCs afin de réduire la détection. / Human immunodeficiency virus (HIV), which is responsible for acquired immune deficiency syndrome (AIDS) has infected over 70 million people, approximately half of which have died from the illness. While there are treatments today that can prevent progression towards AIDS, there is currently no vaccine and no treatment that would completely cure people living with HIV. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) limit the establishment of the infection by producing large amounts of type-I IFN (IFN-I) after sensing HIV. IFN-I not only establishes an antiviral environment, but also initiates the innate immune response. This pDC response is regulated, in part, by the pDC-specific receptor immunoglobulin-like transcript 7 (ILT7), which inhibits IFN-I production, upon engagement of its ligand, bone marrow stromal antigen 2 (BST2). BST2 is also an HIV host restriction factor that tethers budding virions at the surface of the infected cell, to limit spread. The HIV-1 accessory protein Vpu counteracts BST2’s restriction through downregulation at the cell surface and displacement away from viral assembly sites. This displacement, which enables ILT7 activation, has a double role: relieving the restriction by BST2 on viral release and repressing IFN-I by pDCs. We screened Vpu variants from pandemic and non-pandemic HIV-1 strains, and found that this function is mostly present in the pandemic group M, although not in variants from clade C which are responsible for half of the global infections. This phenotype in the clade C variants tested was associated with an inability to efficiently displace BST2 in infected T cells. Functional analyses in sensing assays, however, reveal that Vpu variants unable to enhance BST2-mediated ILT7 activation may have evolved compensatory mechanisms to dampen IFN-I production by p

L’obstacle majeur à l’éradication du VIH est l’existence de réservoirs cellulaires du VIH, qui échappent au traitement et à la réponse immunitaire de l’hôte. Ce réservoir s’établit très tôt dans l’infection, menant typiquement à la destruction d’un grand nombre de lymphocytes T CD4+. Cependant, une faible proportion de ces cellules retourne à l’état quiescent en ayant intégré le génome viral. La taille et l’évolution du réservoir chez l’adulte ont été bien élucidées. Cependant, on en sait moins sur la taille et la distribution du réservoir du VIH, et sur l’impact de l’initiation précoce de la thérapie antirétrovirale combinée (TARc) sur ces dernières dans la population infantile. Cet essai s’inscrit dans le cadre de l’étude prospective multicentrique EPIC4 (Early Pediatric Initiation, Canada Child Cure Cohort Study), qui a recruté 221 enfants infectés par la voie verticale dans neuf centres pédiatriques canadiens. Nous soumettons l’hypothèse que l'initiation très précoce de la TARc chez l’enfant infecté par le VIH permettrait de réduire le réservoir à ses plus bas niveaux, menant à un meilleur contrôle de la réplication virale suite à une éventuelle interruption de traitement. Nous avons obtenu des corrélations positives entre la taille du réservoir viral lymphocytaire sanguin du VIH-1 et l'âge de l’initiation de la TARc et l'âge à la suppression virale soutenue (SVS). Les niveaux des réservoirs sont négativement corrélés à la proportion de la vie sous TARc efficace et à la proportion de la vie sous SVS et au compte de lymphocytes T CD4+. Nous avons montré également qu’un traitement initié précocement dans les premiers six mois de vie serait un facteur de prédictions d’une suppression virale plus rapide et plus soutenue. Nos résultats confirment que l’initiation précoce de la TARc et le maintien à long terme de la suppression virale stable sont des facteurs clés conduisant à une taille limitée du réservoir viral. Par ailleurs, nous démontrons pour la première fois que la taille du réservoir inductible du VIH-1 mesurée dans les lymphocytes T CD4+ du sang périphérique après stimulation avec un analogue de prostratine corrèle significativement avec celle mesurée en ADN proviral. Ainsi, nous avons validé une nouvelle technique de mesure de réservoir inductible qui est rapide et moins coûteuse et surtout requiert un faible volume de sang donc semble très prometteuse pour des études sur le VIH-1 pédiatrique. / The major barrier to eradicating HIV is the existence of cellular reservoirs of HIV, which escape the treatment and immune response of the host. This reservoir is established very early in the infection, typically leading to the destruction of a large number of CD4+ T cells. However, a small proportion of these cells return to quiescent state after integrating the viral genome. The size and evolution of the reservoir in adults have been well understood. However, we know less about the size and distribution of the HIV reservoir, and the impact of early initiation of combination antiretroviral therapy (cART) on it in the infant population. Our study is a part of the Early Pediatric Initiation Canada, Child Cure Cohort (EPIC4); a prospective, multicenter study, which enrolled 221 vertically HIV-1 infected children in nine Canadian pediatric centers. We hypothesize that very early initiation of cART in HIV-infected children would reduce the reservoir to its lowest levels, leading to better control of viral replication following a possible interruption of treatment. A strong positive correlation was observed between reservoir size in peripheral blood and both the age at initiation of cART and the age at which sustained viral suppression (SVS) was achieved. We found a strong negative correlation between the size of the viral reservoir and the proportion of life spent on effective cART or the proportion of life with SVS and CD4+ T lymphocytes count. This study shows that starting cART within 6 months from birth is a predictor of faster and more sustained virological suppression in infants. Our findings suggest that early cART initiation in infants and long-term viral suppression are key factors leading to limited viral reservoir size. Furthermore, we established for the first time that the size of the inducible HIV-1 reservoir in peripheral blood CD4+ T lymphocytes of children, quantified by the prostratin analogue stimulation test, correlates with the size obtained using proviral DNA measurement. Thus, we have validated a new inducible reservoir measurement technique that is fast, less expensive, and, importantly requires a lower blood volume. This assay could be very promissing for evaluating inducible HIV-1 reservoirs in pediatric HIV-1 studies.