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Purificação e caracterização da lacase do fungo Trametes cubensis (Mont.) Sacc. 1891Damasceno, Andrey Azedo, 92-99233-2173 27 May 2016 (has links)
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Previous issue date: 2016-05-27 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The following interest in fungal enzymes comes about their potential for industrial use, as well as biotechnological research. In this context, the enzyme laccase (EC 1.10.3.2) stand out by its potential use in several industrial applications. Thus, the main goal of this research was to characterize the laccase enzyme produced by the Amazonian fungus Trametes cubensis. The T. cubensis strain was collected in Tefé National Forest (FLONA) and the enzymatic activity was determined from the submerged and semi-solid fermentation. As substrate, sawdust of the wood of Simarouba amara and sugarcane bagasse was tested. As inductors, copper sulfate, “ABTS” and mineral medium were used. The laccase was purified by means of ion exchange chromotography and characterized by mass (SDS-PAGE and zymogram) and determined kinetic parameters Km and Vmax. The most expressive laccase activity occurred in the medium with substrate of Simarouba amara (marupá) with 184 U / mL. The yield was 40% and purification factor of 1.5, with Vmax and Km of 33.33 μmol.L-1 6.66 mM, respectively. The becoming laccase from Trametes cubensis has an apparent molecular mass of approximately 40 kDa. In this way, from the cultivation of Trametes cubensis, it is possible to obtain laccases, however, the study is still necessary in reference the use of different inductors, looking for a potentialization of this activity. / O crescente interesse pelas enzimas fúngicas vem em função da sua potencialidade para uso industrial, bem como na pesquisa biotecnológica. Neste contexto, a enzima lacase (EC 1.10.3.2) destaca-se pelo seu potencial uso em diversas aplicabilidades industriais. Assim, o objetivo dessa pesquisa foi caracterizar a enzima lacase produzida pelo fungo amazônico Trametes cubensis. A cepa de T. cubensis foi coletada na Floresta Nacional de Tefé (FLONA) e determinada a atividade enzimática a partir da fermentação submersa e semi-sólida. Como substrato testou-se serragem da madeira de Simarouba amara e bagaço-de-cana de açúcar. Como indutores utilizou-se sulfato de cobre, ABTS e meio mineral. A lacase foi purificada por meio de cromotografia de troca iônica e caracterizada quanto à massa (SDS-PAGE e zimograma) e determinados os parâmetros cinéticos Km e Vmax. A atividade de lacase mais expressiva ocorreu no meio com substrato de Simarouba amara (marupá) com 184 U/mL. O rendimento foi de 40% e fator de purificação de 1,5, com Vmax e Km de 33,33 μmol.L-1 6,66 mM, respectivamente. A lacase proveniente de Trametes cubensis apresenta massa molecular aparente de, aproximadamente, 40 kDa. Nesse sentido, a partir do cultivo de Trametes cubensis é possível obter lacases, contudo, estudos ainda são necessários no que se refere ao uso de diferentes indutores, visando uma potencialização dessa atividade.
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Extração de biomoleculas em sistemas de duas fases aquosas convencionais e com polimeros termossensiveisIgarashi, Luciana 09 August 2003 (has links)
Orientadores: Telma Teixeira Franco, Theo Guenter Kieckbusch / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:15:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2003 / Resumo: A extração contínua e semi-contínua de uma enzima modelo, xilanase, foi estudada em colunas do tipo spray, de pratos perfurados e empacotada utilizando sistema de duas fases aquosas (SDF A) composta por polietileno glicol (PEG) 4000 e fosfato de potássio dibásico. Para a coluna spray, o hold-up da fase dispersa e o coeficiente global de transferência de massa (KD a) foram avaliados para diferentes velocidades superficiais da fase leve. Os resultados indicaram que um aumento na velocidade superficial da fase dispersa na faixa de O - 0,18 mm/s apresentou um efeito positivo sobre o KD a e hold-up. Para a coluna de pratos perfurados foi observado que o aumento da velocidade superficial da fase dispersa e no número de pratos também promoveu um aumento nos dois parâmetros de extração da coluna. A seletividade de separação da xilanase e albumina de soro bovino, BSA, (contaminante modelo) foi alta, pois cerca de 60% da enzima foi extraída para a fase leve, enquanto uma quantidade insignificante de BSA foi obtida nesta fase. A possibilidade de usar a coluna de pratos e recheada na operação contínua e contra-corrente para a extração da enzima também foi avaliada. Foram estudadas a influência de diferentes tipos de recheio como os anéis de Raschig, esferas de vidro e anéis de poliestireno assim como a razão da velocidade superficial da fase leve (pEG) e pesada (sal). A melhor seletividade foi obtida com os anéis de poliestireno 94% da xilanase na fase polimérica enquanto apenas 3% do contaminante foi obtido nesta fase. Em uma segunda parte deste trabalho explorou-se o SDF A contendo apenas um copolúnero termossensível em um processo em batelada. Foram utilizados copolímeros randômicos contendo grupos de óxido de etileno (EO) e óxido de propileno (PO) hidrofobicamente modificados, sendo que a modificação foi realizada através da inserção de grupos hidrofóbicos alifáticos C1JI29 nas duas pontas do polímero. Neste sistema a fase superior é enriquecida em água e a fase inferior no polímero (cerca de 6-8%, p/p). A melhor separação do DNA e do plasmídeo utilizando o copolímero hidrofóbicabicamente modificado (HM-EOPO) carregado positivamente foi obtido usando uma baixa força iônica a pH 8. O uso do sal, K2SO4' que não possui força eletroquúnica em sistemas contendo o copolímero HM-EOPO mostrou que o coeficiente de partição (K) das proteínas não apresentou dependência com o pH do sistema, e que em pHs extremos houve indícios de que a proteína poderia ter apresentados mudanças estruturais na molécula / Abstract: The semi-continuous and continuous extraction of a model enzyme, xylanase, in spray, sieve plates and packed columns were investigated using aqueous two-phase systems composed by polyethylene glycol (PEG) 4000 and potassium phosphate. For the spray column, the dispersed phase hold-up and overall mass transfer coefficients (Ko a) were evaluated for different superficial velocities of the dispersed phase (light phase). Resuhs indicated that an increase in superficial velocity in the range of O - 0.18 mmls of the dispersed phase had a positive effect on KD a and on hold-up in all colunm heights studied, 75, 161 and 246mm. For the sieve plate column, the effect ofthe superficial velocity ofthe dispersed phase and number of plates were also studied. Results showed that the KD a and hold-up increased with an increase in both parameters. The selectivity of separation of xylanase and BSA (model contaminant) was very high, since 60% of the enzyme was extracted in the light phase, whereas no significant amount of BSA was extracted. The possibility of using the sieve plate and packed column in continuous operations for enzyme extraction was studied. The influence of several kinds of packings, Raschig rings, glass spheres and polyestirene rings was studied as well as the superficial velocity ratio of the salt and PEG phases. The best selectivity was obtained with the polyestirene ring whith 94% of xylanase recovery in the polimeric phase and just 3% of contaminant was recovery to this phase. In a second part of this work a system composed by a thermoseparating hydrophobica11y modified polymers (HM-EOPO) has been used in one-polymer extraction systems, where the top phase is enriched by water and the bottom phase is enriched by the polymer (about 6-8%, w/w). The best separation ofDNA ftom plasmid was obtained using a low ionic system at pH 8 when the polymer is positively charged. By using salts that do not produce electrochemica1 driving force in the system contained HM-EOPO copolymer it is possible to distinguish other driving forces acting on the partitioning of biomolecules. One salt used in this study, K2S04, has this property. The partition coefficient of the proteins studied in this work, showed an independence of the pH of the system, but at extreme pH variation in K with the protein charge would indicate structural changes in the proteic molecule / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Doutor em Engenharia Química
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Estudo do processo de produção de particulas lipidicas solidas e lipossomas : estudo de variaveis e encapsulação de medicamentos de primeiro tratamento da tuberculoseAlves, Giuliana Piovesan 19 July 2003 (has links)
Orientador: Maria Helena Andrade Santana / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T18:15:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2003 / Resumo: Neste trabalho estudou-se a produção escalonável de particulas lipidicas sólidas (pós respiráveis) e lipossomas, úteis como veículos para liberação controlada de fármacos. As partículas foram produzidas pelo processo de secagem por atomização, ¿spray-drying", e os lipossomas preparados por dispersão em água das partículas (pró-lipossomas) previamente produzidas com agitação de alto cisalhamento. O fosfolipídio natural hidrogenado da soja Epikuron 200SH foi utilizado como componente estrutural e o açúcar manitol como excipiente, ou material núcleo. Os tuberculostáticos Isoniazida e Pirazinamida foram incorporados em ambos os veículos, visando a produção de medicamentos de liberação controlada. A incorporação de excipientes e as condições operacionais influenciaram o rendimento mássico do processo e as propriedades das partículas sólidas, permitindo a modulação para uso em aplicações específicas. As partículas sólidas apresentaram diâmetros menores que 5mm e a incorporação dos fármacos variou de 20 a 100%, dependendo das condições operacionais da secagem e da formulação. Os fármacos incorporados nas partículas lipídicas sólidas foram liberados continuamente durante 24 horas, comportando-se como membranas secas. As propriedades dos lipossomas preparados foram influenciadas pelo tipo de impelidor e pela microestrutura da partícula sólida usada. Diâmetros médios da ordem de 2000nm e com distribuição homogênea de tamanhos foram obtidos com impelidor de alto cisalhamento produzido pela empresa Kroma Equipamentos Especiais Ltda.. A encapsulação da Isoníazida nos lipossomas variou de 4 a 15%, com liberação gradual de 24h e 1h, quando preparados a partir de partículas secas com microestrutura mais cristalina e mais amorfa, respectivamente. As partículas lipídicas produzidas pelo processo de secagem por atomização possuem propriedades de liberação controlada de fármacos e são úteis como pós para administração pulmonar ou como pró-lipossomas. Resultados obtidos em escala piloto demonstram a viabilidade do escalonamento do processo através da produção de partículas com caracteristicas semelhantes às obtidas em escala de laboratório / Abstract: This work presents scale up studies for the production of so1id lipid particles (respirable powders) and liposomes, which are useful as vehic1es for contro1led delivery of rugs. The lipid particles were produced by spray drying, and the liposomes were prepared by hydration of the particles under high shear mixing. It was used a hydrogenated phospholipid, Epikuron 200 SH, as a structural component of the particles, and mannitol was used as excipient or core material. The tubercu1osis drugs Isoniazid and Pirazinamide were incorporated in both vehicles (powder and liquid formulation). The incorporation of excipients and the operational conditions influenced the process mass yield and the solid particles properties, enabling the modulation of the particles for specific app1ications. The lipid particles had a diameter of less than 5mm, and the efficiency of drug incorporation varied nom 20 to 1000Aa, depending on the drying operational conditions and the formulation. The incorporated drugs were gradually re1eased during 24 hours, behaving 1ike dried membranes. The liposomes properties were influenced by the impeller type and by the so1id particle microstructure. Mean diameters around 2000mn and with homogeneous size distribution were obtained using a high shear impeller produced by Kroma Equipamentos Especiais Ltda.. The Isoniazid encapsu1ation mo liposomes varied from 4 to 15%, with a gradual release of 24 and 1 hour, when prepared by more crystalline or amorphous microstructures, respectively. The lipid particles produced by spray drying presented a controlled release of drugs, being useful as powders for pulmonary administration or pro-liposomes. Results obtained in pilot scale showed the feasibility for the scaling up of the process, through the production of particles with similar properties to the ones produced by laboratory scale / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química
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Preparación de micropartículas de quitosano para microencapsulación de biomoléculasAguirre Zazzali, Paula January 2011 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Micropartículas desarrolladas a partir de materiales poliméricos han sido ampliamente investigados en los últimos años por diferentes protocolos de fabricación como transportadores de agentes terapéuticos (biomoléculas). En este estudio micropartículas de quitosano se prepararon usando una modificación del método de coacervación de van der Lubben, quien utiliza sulfato de sodio como agente entrecruzante. Albúmina sérica bovina (BSA) se uso como proteína modelo, siendo encapsulada por el método de incubación en las micropartículas de quitosano. Las micropartículas fueron caracterizadas por su tamaño y morfología, y se determinaron los parámetros de eficiencia de encapsulación (EE), capacidad de carga (CC) y se estudió la cinética de liberación in vitro de BSA usando una solución tampón fosfato (PBS) 5 mM de pH 7,4 a 37 ºC. Se obtuvieron micropartículas esféricas con una superficie lisa y tamaños que fluctuaron entre los 5 y 14 µm, tanto para las micropartículas vacías como las cargadas con BSA, el cual fue independiente de la concentración de BSA. Nuestros resultados mostraron que una mayor concentración de proteínas presentó mayores valores de EE y de CC. Los patrones de liberación de la proteína desde las micropartículas cargadas con BSA a diferentes concentraciones mostraron mayores valores de liberación de ésta a mayores concentraciones de BSA. En conclusión, este nuevo protocolo resultó ser adecuado en la formación de micropartículas de quitosano con valores de parámetros de liberación in vitro adecuados de bioméculas / Proyecto Fondecyt No. 1080185
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Estudo quimioenzimatico da sintese de um analogo do residuo N-terminal de nikkomicinasMilagre, Cintia Duarte de Freitas 03 August 2018 (has links)
Orientador: Jose Augusto Rosario Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:21:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2003 / Mestrado
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Desarrollo y caracterización de un conjugado del péptido análogo a glucagón (GLP-1) a nanopartículas de oro, como nueva forma de entrega de biomoléculas con potencial aplicación en diabetesPérez Ortiz, María Magdalena 05 1900 (has links)
Tesis presentada a la Universidad de Chile
para optar al grado de Doctora en Ciencias Farmacéuticas / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / Para probar este concepto, se sintetizaron en fase sólida tres nuevos análogos
del GLP-1, los cuales fueron caracterizados por cromatografía líquida y
espectrometría de masas. Adicionalmente, a los péptidos se les evaluó su
estructura secundaria por dicroísmo circular y su actividad insulinotrópica in
vitro en la línea celular de páncreas Beta-TC-6. Posteriormente se prepararon y
caracterizaron fisicoquímicamente los conjugados obtenidos; para ello se
utilizaron técnicas de espectrofotometría UV-visible, microscopía electrónica de
transmisión, potencial zeta y dispersión dinámica de la luz. Finalmente se
evaluó la estabilidad de los conjugados, se estudió su permeabilidad intestinal,
utilizando un sistema in vitro basado en un cocultivo de células de
adenocarcinoma de colon humano y mucosecretoras (Caco-2/goblet), y además
se determinó la actividad hipoglicemiante in vivo de uno de los péptidos y su
respectivo conjugado a AuNP, después de una administración intraperitoneal en
ratas.
Los resultados obtenidos revelaron que los tres péptidos sintetizados: GLP-1(7-
37)-Lys(Acet), GLP-1(7-37)-Lys(Cys) y GLP-1(7-37)-Lys(PegCys), tienen una
conformación de tipo α hélice en disolución acuosa y presentan una actividad
insulinotrópica similar a la de la incretina endógena GLP-1. Sin embargo,
generan conjugados que difieren en estabilidad y capacidad de penetrar el
epitelio intestinal, probablemente debido al tipo de interacción que generan con
las AuNP. De esta forma, los conjugados de los péptidos que contienen cisteína
(péptidos tiolados) resultaron ser más estables que el del péptido sin cisteína,
frente al pH gástrico e intestinal, pues generan una interacción de tipo Au-S que
le otorga una mayor estabilidad estérica al sistema coloidal. Por otra parte, el
conjugado de AuNP al péptido GLP-1(7-37)-Lys(PegCys) fue el que penetró en
mayor medida la monocapa de células, encontrándose aproximadamente un
0.016 % de oro después de 4 h de incubación, mientras que con los otros
conjugados el nivel de oro no superó el 0.008 %. Además los péptidos y sus
conjugados a AuNP no presentaron toxicidad en los sistemas celulares empleados (Beta-TC-6 y Caco-2/goblet, respectivamente). Finalmente, de la
evaluación de la actividad hipoglicemiante in vivo se obtuvo que la eficacia
hipoglicémica para el análogo GLP-1(7-37)-Lys(PegCys) y su conjugado a
AuNP fue similar a la de la incretina endógena (18.7 ± 6.67 %, 27.6 ± 6.33 % y
22.1 ± 8.26 %, respectivamente), revelando que tanto la modificación realizada
en el extremo C- terminal de GLP-1, como la presencia de la AuNP, no afectan
su bioactividad.
De esta forma, el sistema de entrega desarrollado en esta Tesis demostró
penetrar las células intestinales en diferentes grados, y disminuir los niveles de
glicemia in vivo de una manera similar al péptido endógeno después de su
administración intraperitoenal, revelando que este tipo de sistemas es capaz de
atravesar barreras biológicas y que la conjugación al nanomaterial no afecta la
actividad de la biomolécula, por lo que podría convertirse en una estrategia para
la entrega de biomacromoléculas con aplicación en diabetes / Generally, the therapeutic potential of peptides and proteins is hampered by
their physicochemical characteristics, which prevent their successful delivery. In
this regard, GLP-1 is a peptide incretin that has great therapeutic usefulness
due to their interesting action on glucose metabolism, so it is currently an
excellent candidate option for the treatment of the type 2 Diabetes Mellitus.
However, as a peptidic macromolecule, GLP- 1 has a poor permeability across
the intestinal epithelium and is very susceptible to the enzymatic degradation.
To overcome these drawbacks some efforts have been made to improve its
therapeutic efficacy, such as development of metabolically stable analogs, but
very few studies have been focused on the study of the delivery systems to
prolong their action and improve its bioavailability.
In this Thesis the study of a potential delivery system based on the use of gold
nanoparticles (AuNP) for biomacromolecules, such as GLP-1, is presented. This
system searches for to increase the permeability of peptides across the
intestinal epithelium and enhance its bioavailability while retaining the biological
activity of the biomolecules. Thus, a nanoscale delivery system was developed,
wherein GLP-1 analogues were conjugated to the surface of AuNP.
To probe this concept, three new analogs of GLP-1 on solid phase were
synthesized; the peptides were characterized by liquid chromatography and mass spectrometry and additionally their secondary structure and in vitro
insulinotropic activity, using Beta-TC-6 pancreatic cells, were evaluated.
Subsequently, the conjugates were physicochemically characterized by UVvisible
spectrophotometry, transmission electron microscopy, zeta potential and
dynamic light scattering. Finally, the stability of the conjugates and their
intestinal permeability, using a mucosecretory in vitro system based on human
colon adenocarcinoma cells (Caco-2) and goblet cells were studied. Additionally,
the in vivo hypoglycemic activity after intraperitoneal administration en rats of
one of the peptides and its conjugate was also determinate.
The results revealed that all three peptides synthesized: GLP-1(7-37)-Lys(Acet),
GLP-1(7-37)-Lys(Cys) and GLP-1(7-37)-Lys(PegCys), have an α helix
conformation in solution, and equal insulinotropic activity than the endogenous
incretin GLP-1. However, their conjugates differ in stability and ability to
penetrate the intestinal epithelium, probably due to the difference in the
interaction with the AuNP. In this way, the conjugates of the peptides containing
cysteine (thiolated peptides) were more stable, to the gastric and intestinal pH,
than the peptide without cysteine because generate an interaction of Au-S that
gives a greater steric stability to the colloidal system. Moreover, the conjugate of
GLP-1(7-37)-Lys (PegCys) to AuNP penetrated the cell monolayer in a greater
extent than the others, being found about 0.016 % gold after 4 h of incubation,
while with the other conjugated the gold level did not exceed 0.008 %. In
addition, peptides and their conjugates to AuNP did not show toxicity at cell
systems used (Beta-TC-6 and Caco-2/goblet, respectively). Finally, the
evaluation of the in vivo hypoglycemic activity showed that the hypoglycemic
efficacy for the GLP-1(7-37)-Lys (PegCys) analogue and its AuNP conjugate
were similar to the endogenous incretin (18.7 ± 6.67 %, 27.6 ± 6.33 % and 22.1
± 8.26 %, respectively), revealing that the modification in the C-terminal of the
GLP-1 molecule and the presence of the AuNP, do not affect its bioactivity. Thereby, the delivery system developed in this Thesis showed penetrate the
intestinal cells in different degrees, and decrease blood glucose levels in vivo in
a similar way to the endogenous peptide after intraperitoenal administration,
revealing that this type of system is capable of cross biological barriers and that
the conjugation to the nanomaterial does not affect the activity of the
biomolecule, so it could become a strategy for the delivery of
biomacromolecules with application in diabetes
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Danos oxidativos promovidos por espécies de Mn(III) sobre biomoléculas e células em situação de estresse / Oxidative damage induced by Mn(III) species over biomolecules and stressed cellsPereira, Tatiana Araujo 08 March 2012 (has links)
O manganês é um elemento traço essencial, porém existe uma preocupação com seus potenciais efeitos neurotóxicos associados à exposição a níveis excessivos, podendo provocar uma síndrome conhecida como manganismo, cujos sintomas são semelhantes aos da doença de Parkinson. A maioria dos trabalhos envolvendo manganês usa espécies de Mn(II), mas sabe-se que Mn(III) é acumulado em maior quantidade no cérebro. Nesse sentido, foi feito um estudo dos danos oxidativos e de toxicidade provocados por três complexos de Mn(III): citrato, pirofosfato e salicilenodiamina (respectivamente MnCit, MnPPi e EUK8). Para tanto, as três espécies foram sintetizadas e caracterizadas por métodos espectroscópicos. Em seguida foram determinadas suas capacidades pró-oxidantes sobre os seguintes marcadores: dihidrorodamina (DHR), tirosina (Tyr), albumina (BSA) e dopamina (DA). Finalmente, seu efeito sobre células cerebelares e da cepa HeLa estressada por meio de irradiação UV também foi avaliado, e foi usado ascorbato na tentativa de tratar o dano sobre células HeLa. O teste com a DHR também foi feito em presença de H2O2 e ascorbato. A capacidade pró-oxidante testada por fluorescência da DHR sugere que o ascorbato atua como anti-oxidante. Além disso, MnCit e MnPPi (mas não EUK8), quando na presença de H2O2, são menos oxidantes. O mesmo comportamento foi percebido nas medidas de fluorescência de Tyr. A carbonilação da BSA, verificada pela absorbância do seu marcador (DNPH), seria indício de capacidade oxidante dos complexos, mas não percebeu-se variação significativa de grupos C=O na proteína após tratamento com espécies de Mn(III), mesmo em amostras com H2O2, embora notem-se as mesmas tendências apresentadas pelos complexos com DHR e Tyr. Estudos de oxidação de DA por luminescência tiveram resultados inconclusivos, mas dados mais concretos em testes com medidas de absorbância de soluções de DA e fluorescência de misturas de DA com DHR indicaram que DA é preferencialmente oxidada por todos os compostos. A viabilidade celular de culturas de células neuronais granulares (CGC) mostrou pouca diferença entre as toxicidades dos compostos, mas verifica-se uma relação inversamente proporcional entre as toxicidades e lipofilicidades dos complexos. O mesmo não ocorre nos experimentos com HeLa, cuja viabilidade foi avaliada por contagem de colônias após fixação e coloração das células, pois nesse caso o EUK8 se mostrou o mais tóxico dos três. Além disso, ao contrário do observado com a DHR, o ascorbato teve ação pró-oxidante, e, aparentemente, houve um efeito sinérgico negativo entre os complexos e a radiação UV. Tratamento com o quelante p-aminossalicilato só foi eficaz na recuperação das culturas para amostras não irradiadas. / Manganese is an essential trace element, however there is considerable concern regarding its neurological effects when in excess, giving rise to a condition termed manganism which is characterized by Parkinson disease-like symptoms. Most evaluations of manganese toxicity use poorly defined Mn(II) species, although Mn(III) is known to accumulate preferentially in the brain. Therefore, in this work we proposed a study of oxidative damage and citotoxicity of Mn(III) derivatives of citrate, pyrophosphate and salycilenediamine (respectively, MnCit, MnPPi and EUK8). The species were synthesized and characterized by spectroscopic methods. Their pro-oxidant abilities were assessed over markers of oxidant activity dihydrorhodamine (DHR), tyrosine (Tyr), albumin (BSA) and dopamine (DA). In addition, their effect over granular cerebral cells (CGC) and HeLa cells stressed by ultraviolet irradiation was studied, and treated with ascorbate. Tests with DHR were repeated treating the samples with H2O2 and ascorbate. Pro-oxidant ability tested by both DHR and Tyr fluorescence suggest that ascorbate is antioxidant towards Mn(III)-induced oxidative damage. MnCit and MnPPi (but not EUK8), when in presence of peroxide, are less oxidants. An analogous trend was observed for BSA, although without statistical significance. Evaluation of DA formation by luminescence was inconclusive, but competition studies of DA+DHR mixtures indicated that DA is preferentially oxidized by all the complexes. To CGC, little difference was observed for the toxicities of the complexes. An inverse relationship of toxicity and lipophilicity has been observed. However this was not observed for HeLa cells, to which EUK8 was more toxic. In addition, and in opposition to the DHR solution study, ascorbate was found to be pro-oxidant. A negative synergic effect was observed between complex doses and irradiation. Treatment of the cells with paraaminosalicylate was beneficial only for non-irradiated cells.
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Danos oxidativos promovidos por espécies de Mn(III) sobre biomoléculas e células em situação de estresse / Oxidative damage induced by Mn(III) species over biomolecules and stressed cellsTatiana Araujo Pereira 08 March 2012 (has links)
O manganês é um elemento traço essencial, porém existe uma preocupação com seus potenciais efeitos neurotóxicos associados à exposição a níveis excessivos, podendo provocar uma síndrome conhecida como manganismo, cujos sintomas são semelhantes aos da doença de Parkinson. A maioria dos trabalhos envolvendo manganês usa espécies de Mn(II), mas sabe-se que Mn(III) é acumulado em maior quantidade no cérebro. Nesse sentido, foi feito um estudo dos danos oxidativos e de toxicidade provocados por três complexos de Mn(III): citrato, pirofosfato e salicilenodiamina (respectivamente MnCit, MnPPi e EUK8). Para tanto, as três espécies foram sintetizadas e caracterizadas por métodos espectroscópicos. Em seguida foram determinadas suas capacidades pró-oxidantes sobre os seguintes marcadores: dihidrorodamina (DHR), tirosina (Tyr), albumina (BSA) e dopamina (DA). Finalmente, seu efeito sobre células cerebelares e da cepa HeLa estressada por meio de irradiação UV também foi avaliado, e foi usado ascorbato na tentativa de tratar o dano sobre células HeLa. O teste com a DHR também foi feito em presença de H2O2 e ascorbato. A capacidade pró-oxidante testada por fluorescência da DHR sugere que o ascorbato atua como anti-oxidante. Além disso, MnCit e MnPPi (mas não EUK8), quando na presença de H2O2, são menos oxidantes. O mesmo comportamento foi percebido nas medidas de fluorescência de Tyr. A carbonilação da BSA, verificada pela absorbância do seu marcador (DNPH), seria indício de capacidade oxidante dos complexos, mas não percebeu-se variação significativa de grupos C=O na proteína após tratamento com espécies de Mn(III), mesmo em amostras com H2O2, embora notem-se as mesmas tendências apresentadas pelos complexos com DHR e Tyr. Estudos de oxidação de DA por luminescência tiveram resultados inconclusivos, mas dados mais concretos em testes com medidas de absorbância de soluções de DA e fluorescência de misturas de DA com DHR indicaram que DA é preferencialmente oxidada por todos os compostos. A viabilidade celular de culturas de células neuronais granulares (CGC) mostrou pouca diferença entre as toxicidades dos compostos, mas verifica-se uma relação inversamente proporcional entre as toxicidades e lipofilicidades dos complexos. O mesmo não ocorre nos experimentos com HeLa, cuja viabilidade foi avaliada por contagem de colônias após fixação e coloração das células, pois nesse caso o EUK8 se mostrou o mais tóxico dos três. Além disso, ao contrário do observado com a DHR, o ascorbato teve ação pró-oxidante, e, aparentemente, houve um efeito sinérgico negativo entre os complexos e a radiação UV. Tratamento com o quelante p-aminossalicilato só foi eficaz na recuperação das culturas para amostras não irradiadas. / Manganese is an essential trace element, however there is considerable concern regarding its neurological effects when in excess, giving rise to a condition termed manganism which is characterized by Parkinson disease-like symptoms. Most evaluations of manganese toxicity use poorly defined Mn(II) species, although Mn(III) is known to accumulate preferentially in the brain. Therefore, in this work we proposed a study of oxidative damage and citotoxicity of Mn(III) derivatives of citrate, pyrophosphate and salycilenediamine (respectively, MnCit, MnPPi and EUK8). The species were synthesized and characterized by spectroscopic methods. Their pro-oxidant abilities were assessed over markers of oxidant activity dihydrorhodamine (DHR), tyrosine (Tyr), albumin (BSA) and dopamine (DA). In addition, their effect over granular cerebral cells (CGC) and HeLa cells stressed by ultraviolet irradiation was studied, and treated with ascorbate. Tests with DHR were repeated treating the samples with H2O2 and ascorbate. Pro-oxidant ability tested by both DHR and Tyr fluorescence suggest that ascorbate is antioxidant towards Mn(III)-induced oxidative damage. MnCit and MnPPi (but not EUK8), when in presence of peroxide, are less oxidants. An analogous trend was observed for BSA, although without statistical significance. Evaluation of DA formation by luminescence was inconclusive, but competition studies of DA+DHR mixtures indicated that DA is preferentially oxidized by all the complexes. To CGC, little difference was observed for the toxicities of the complexes. An inverse relationship of toxicity and lipophilicity has been observed. However this was not observed for HeLa cells, to which EUK8 was more toxic. In addition, and in opposition to the DHR solution study, ascorbate was found to be pro-oxidant. A negative synergic effect was observed between complex doses and irradiation. Treatment of the cells with paraaminosalicylate was beneficial only for non-irradiated cells.
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Determinação do grau de ionização de aminoácidos polares carregados /Bossa, Guilherme Volpe. January 2013 (has links)
Orientador: Augusto Agostinho Neto / Orientador: Elso Drigo Filho / Coorientador: Tereza Pereira de Souza / Banca: Iolanda Midea Cuccovia / Banca: Marcelo Andres Fossey / Resumo: Proteínas e peptídeos são constituídos por subunidades estruturalmente mais imples chamadas aminoácidos. Uma importante propriedade destes é que, dependendo das características do meio (tais como pH e concentração iônica), os seus grupos onizáveis podem ceder prótons e, assim, adquirir carga elétrica não nula. Tal carga nfluenciará na eficiência da formação de ligações peptídicas e em interações proteína- igante, por exemplo. Partindo da hipótese de que a diferença entre os valores de pK dos rupos ionizáveis isolados e destes como partes constituintes de um aminoácido é devida, principalmente, à interação eletrostática adicional que se atribui à presença de rupos vizinhos, elaborou-se um modelo que emprega a forma linearizada da equação de Poisson-Boltzmann para o estudo de propriedades físico-químicas de moléculas com rês grupos ionizáveis. Neste trabalho tal modelo foi aplicado aos aminoácidos: Aspartato, Glutamato, Cisteína, Tirosina, Arginina, Lisina e Histidina. Calcularam-se os valores de pK e as respectivas cargas elétricas médias de tais moléculas. Como os esultados obtidos concordaram com aqueles oriundos de trabalhos experimentais, o modelo teórico foi expandido para tratar de di, tetra, pentapeptídeos e de resíduos de isina e glutamato da proteína Staphylococcal Nuclease. Os valores do Fator de Correlação de Pearson calculados para ambos proteínas e peptídeos são superiores a 0,99, fato este que evidencia a eficiência e versatilidade do modelo ao reproduzir alores de pK reportados por outros autores / Abstract: Proteins and peptides are composed of subunits structurally simpler called amino acids. An important property of these is that, depending on the medium characteristics (such pH and ionic concentration), its ionizable groups may provide protons and thereby acquire a nonzero electric charge. Such charge will affect the formation of peptide bond and protein-ligand interactions, for example. Assuming that the difference between pK values of the isolates ionizable groups and of these as constituents parts of an amino acid is mainly due to the extra electrostatic interaction attributed to the presence of neighboring groups, was developed a structure-based model that employs the linearized form of the Poisson-Boltzmann equation for the study of physicochemical properties of molecules with three ionizable groups. In this work it was applied to the amino acids: aspartate, glutamate, cysteine, tyrosine, arginine, lysine and histidine. The pK values and respective mean electric charges were calculated. As the calculated values agreed with those from experimental studies, the theoretical model has been expanded to the treatment of di, tetra, pentapeptides and Staphylococcal Nuclease residues. The Pearson Correlation Factor calculated for both proteins and peptides are above 0.99, what points to the effectiveness and versatility of the model to reproduce pK values reported by other works / Mestre
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Prospecção biomonitorada de inibidores da secreção de histamina obtidos a partir do extrato de Hymenacea stigonocarpa Mart. ex. Hayne (Fabaceae)Araujo, Adriano Cressoni [UNESP] 06 June 2013 (has links) (PDF)
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000716406.pdf: 1009644 bytes, checksum: 9956487a11a013c64929e4fac5497961 (MD5) / As reações alérgicas afetam grande parte da população e tem aumentado nos últimos anos. Nesse sentido, a histamina liberada pelos mastócitos é um mediador importante e a procura por compostos que inibam a liberação do referido mediador se faz necessária tendo em vista que os tratamentos disponíveis apresentam limitações. Estudos prévios demonstraram que o extrato metanólico bruto da casca do caule de Hymenaea stigonocarpa (ME) apresenta atividade inibitória sobre a liberação de histamina. Assim, o presente trabalho realizou o fracionamento biomonitorado do ME a fim de identificar a(s) frações mais ativa(s). As frações foram avaliadas em suspensão de mastócitos peritoneais de ratos Wistar machos desafiados com ionóforo A23187 e composto 48/80 (apenas as frações mais ativas). Posteriormente, a fração mais ativa foi avaliada em mastócitos sensibilizados com ovoalbumina (OVA). A dosagem de histamina foi realizada utilizando-se um sistema fluorimétrico automatizado e a análise fitoquímica por CG/EM. Os resultados mostraram que a fração acetato de etila foi a mais ativa e, na concentração de 100 g/mL inibiu em 78, 98 e 85% a liberação de histamina induzida pelo ionóforo A23187, composto 48/80 e OVA respectivamente. O fracionamento biomonitorado desta fração por cromatografia líquida sob vácuo (CLV) gerou seis sub-frações, das quais as mais ativas demonstraram ser constituídas por terpenos e ácidos graxos de cadeia longa / Allergic reactions affect most of the population and has increased in recent years. Accordingly, histamine released by mast cells is an important mediator and search for compounds that inhibit release of that mediator is necessary in order that the treatments available have limitations. Previous studies demonstrated that the crude methanol extract of the stem bark of Hymenaea stigonocarpa (ME) has an inhibitory activity on the histamine release. Thus, the present study performed the bioguided fractionation of the ME in order to identify (s) most active fractions (s). The fractions were evaluated on the histamine release from rat peritoneum mast cells challenged with ionophore A23187 and compound 48/80 (only the most active fractions). Subsequently, the most active fraction was evaluated in mast cells sensitized with ovalbumin (OVA). The dosage of histamine was performed using an automated fluorimetric system and phytochemical analysis by GC/MS. The results showed that the ethyl acetate fraction was the most active and at concentration of 100 g/mL inhibited by 78, 98 and 85% histamine release induced by ionophore A23187, compound 48/80 and OVA, respectively. The bioguided-fractionatation of this fraction by vacuum liquid chromatography (VLC) generated six sub-fractions, of which the most actives showed the presence of terpenes and long chain fatty acids
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