Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:00:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339552.pdf: 1776510 bytes, checksum: da1705c78b546bdd9cc227ab480ba339 (MD5) Previous issue date: 2016 / O Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) é um parasito hemoflagelado que compartilha reservatórios e vetores com o Trypanosoma cruzi, sendo capaz de infectar mamíferos silvestres e domésticos, assim como o ser humano. Dentre as proteínas envolvidas na regulação do metabolismo energético do T. rangeli, avaliamos neste trabalho a expressão e a atividade enzimática da arginina quinase (AK), enzima que possui atividade de fosfotransferase e cataliza a interconversão entre a fosfoarginina e ADP, assim como arginina e ATP, sendo essencial para diferentes processos celulares em tripanosomatídeos, como por exemplo, infecção, multiplicação celular e diferenciação celular. O crescimento dos parasitos em meio LIT foi acompanhado durante nove dias, sendo observada uma menor expressão da AK somente no dia 1, aumentando no dia 2 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK aumentou progressivamente até o 5º dia de cultivo, decaindo gradativamente nos dias subsequentes. Durante a diferenciação celular de formas epimastigotas para tripomastigotas realizada ao longo de oito dias em meio DMEM, a maior expressão da AK foi detectada nas formas epimastigotas (dia 0) e a maior atividade enzimática nas formas de transição (dia 4). Durante a diferenciação de tripomastigotas em epimastigotas foi observada uma menor expressão da AK somente nos dias 3 e 4, sendo aumentada no dia 5 e mantendo-se estável nos dias subsequentes. A atividade enzimática da AK se manteve constante nos tripomastigotas recém isolados e no primeiro dia de cultivo, aumentando no segundo dia e se mantendo constante até o sexto dia, quando teve um aumento da atividade, que novamente se manteve constante até o nono dia e então decaindo nos últimos dias. Embora estudo prévio tenha demonstrado uma localização flagelar da TrAK a maior parte da atividade da AK foi encontrada na fração citosólica após purificação do citoesqueleto e flagelo. Na comparação entre diferentes espécies e cepas de tripanosomatídeos, a cepa SC 58 de T. rangeli apresentou uma atividade quase duas vezes maior do que a cepa Choachí. A atividade nas cepas de T. cruzi foi praticamente constante quando comparadas entre si e também com a cepa Choachí. Através destes resultados é possível inferir que a atividade da AK parece estar relacionada à multiplicação celular e a adaptação à condições metabólicas adversas (ex. diferenciação celular), sendo influenciada pela demanda energética do parasito.<br> / Abstract : Trypanosoma rangeli (Kinetoplastida; Trypanosomatidae) is a hemoflagellate parasite that infects wild and domestic mammals, as well as humans, sharing reservoirs and vectors with Trypanosoma cruzi. In this work we evaluate the expression and the enzymatic activity of the T. rangeli arginine kinase (AK), an enzyme with phosphotransferase activity that catalyzes the interconversion between phosphoarginine and ATP¸ as the arginine and ATP. AK is essential in trypanosomatids for diferent cellular processes, like infection, cellular multiplication and cellular diferentiation. The AK expression was monitored during the T. rangeli epimastigotes growth in LIT medium for nine days, revealing an increasing expression of AK during the first couple of days and then stabilizing. The enzymatic AK activity have increased up to the fifth day of in vitro culture and then gradually decreased during the subsequent days. During the cellular differentiation in vitro, higher AK expression levels were observed for the epimastigote forms (day 0) but the higher enzymatic activity was detected for the transition forms (day 4). During the in vitro differentiation of bloodstream forms to replicative forms the AK expression have increased up to the fifth day and remained stable up to the ninth day. During this process the AK enzymatic activity revealed a slight increase up to the second day and the stabilised up to the sixth day when a second peak of activity was observed followed by decay up to the ninth day. Although previous studies have demonstrated a flagellar localization for the TrAK, higher AK activity was found on the cytosolic fraction. The AK activity revealed to be distinct among T. rangeli strains, being two times higher for the SC58 strain when compared to the Choachí strain, which revealed similar AK activity as observed for T. cruzi. We conclude that AK activity might be related to the T. rangeli cellular multiplication, differentiation and metabolic adaptation to adverse conditions, being influenced by the parasite?s energetic demands.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T05:04:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339987.pdf: 3371871 bytes, checksum: 0236decf0594051bc0eccebfd98d80d4 (MD5) Previous issue date: 2016 / O câncer de pulmão é um dos tumores malignos mais comuns e com maior taxa de mortalidade, indicando a necessidade da busca por intervenções terapêuticas mais eficientes. As cucurbitacinas são triterpenos tetracíclicos poliidroxilados, reconhecidas como compostos com promissora atividade antitumoral. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos antitumorais de um novo derivado semissintético da cucurbitacina B, a DACE, em esquemas de tratamento combinado com três fármacos antineoplásicos: cisplatina, irinotecano e paclitaxel, frente a uma linhagem de células de câncer de pulmão humano (A549). A DACE apresentou efeito sinérgico com todos os fármacos testados e as combinações mais efetivas induziram bloqueio da fase G2/M do ciclo celular por modular a expressão de p53 e survivina, além de induzir alterações na homeostase do citoesqueleto e morte celular via apoptose. Os tratamentos combinados inibiram completamente o potencial clonogênico das células A549, sem interferir na proliferação de fibroblastos saudáveis de pulmão humano (MRC-5). A DACE inibiu a migração e invasão das células A549, sendo que os tratamentos combinados modularam vias de sinalização relacionadas com os processos de migração celular e metástase. O efeito antiproliferativo da DACE associado com os fármacos foi potencializado pela L-butionina-sulfoximina, e atenuado pela N-acetilcisteína, indicando possível envolvimento da via oxidativa neste efeito. Os efeitos citotóxicos dos tratamentos combinados também foram reduzidos por um inibidor de caspases, indicando que a morte celular via apoptose é dependente da ação de caspases. Após esta etapa, foi selecionada a associação mais promissora [DACE+paclitaxel (PAC)] para ser testada com modelo xenográfico ectópico de tumor de pulmão com células A549. Após trinta dias da inoculação das células tumorais nos animais, pode ser observado o desenvolvimento dos tumores, os quais foram detectados e monitorados por meio de imagens cintilográficas com a administração do radioisótopo 99mTc-HYNIC-ßAla-Bombesina(7-14). Após o tratamento dos animais, foi observado que a associação DACE+PAC foi o esquema de tratamento mais promissor porque inibiu o crescimento dos tumores e reduziu a massa tumoral residual viável do tecido tumoral, em comparação com os tratamentos individualmente. Além disso, o tratamento combinado não induziu danos compatíveis com hepatotoxicidade e nefrotoxicidade. O conjunto destes dados comprova que a associação DACE+PAC exerceu ação antitumoral mais promissora, tanto in vitro como in vivo, com baixa toxicidade para tecidos não tumorais, sendo esse esquema também menos susceptível ao desenvolvimento de resistência.<br> / Abstract : In addition to the higher mortality rate, lung cancer is also one of the most common malignant tumors, which increases the need for more effective therapeutic interventions. Cucurbitacines are tetracyclic triterpenoids polyhydroxy recognized as compounds which present promising antitumor activity. The aim of this study was to evaluate the antitumor effects of a new semi-synthetic derivative of cucurbitacin B, DACE, combined with three anticancer drugs: cisplatin, irinotecan and paclitaxel, against a cell line of human lung cancer cells (A549). DACE showed synergistic effects with all drugs tested and the most active combinations induced antiproliferative effects by cell cycle G2/M arrest, modulated the p53 and survivin expression, as well as induced alterations in cytoskeletal homeostasis and led to cell death via apoptosis. The combined treatments completely inhibited the clonogenic potential of A549 cells and did not harm the cell proliferation of nontumoral human lung fibroblasts (MRC-5). DACE treatment also inhibits migration and invasion of A549 cells, and the combined treatments modulate signaling pathways related to cell migration and metastasis processes. The antiproliferative effect of DACE associated with the drugs was enhanced by L-butionine sulfoximine, and attenuated by N-acetylcysteine, indicating a possible involvement of oxidative pathway in these effects. The cytotoxic effects of the combined treatments were also reduced by a caspase inhibitor, indicating an activity caspase-dependent cell death. Therefore, the most promising combination [DACE + Paclitaxel (PAC)] was selected to be evaluated with an ectopic xenograft model of A549 lung cancer cells. Thirty days after the tumor cell inoculation in the animals, the tumor development was detected and monitored through scintigraphic images with the radioisotope 99mTc-HYNIC-ßAla-Bombesin(7-14) administration. After the treatment of the animals, the combined scheme with PAC + DACE was the most promising treatment regimen because it inhibited tumor growth and reduced residual viable tumor tissue, when compared to the individual treatments. Furthermore, the combined treatment did not induce damage compatible with hepatotoxicity and nephrotoxicity. In summary, the set of these data shows that the combined therapy with DACE + PAC showed both in vitro and in vivo most promising antitumor activity, with low toxicity to nontumor tissues, and the development of resistance to the combined treatment was less likely to occur.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-02-21T05:10:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344149.pdf: 1727559 bytes, checksum: 733bd45a1c780d68fbfea4f073162125 (MD5) Previous issue date: 2016 / A cadeia produtiva de suíno precisa rever com frequência seu planejamento, priorizando ações que visem sustentabilidade da atividade. Assim os biodigestores anaeróbios (BA) do tipo "Lagoa Coberta", destacam-se pela capacidade de geração e armazenamento de biogás a partir de dejetos suínos, bem como de gerar um digestato final utilizado na fertilização de solos e pastagens. Já os tratamentos de dejetos em reatores biológicos aeróbios (RBA) seguidos de sedimentação, visam a estabilização dos dejetos e sua segregação entre fase líquida (água residuária) e fase sólida (lodo). Os sistemas de tratamentos de dejetos caracterizam-se por gerar grandes volumes de efluentes finais e lodos acumulados que podem ser reciclados na agricultura. No entanto pouco se sabe da implicação destes efluentes e lodos no que se refere à segurança sanitária. Esta tese doutoral teve como objetivo ?Avaliar a higienização de dejeto suinícola em sistemas de tratamentos atuais, bem como prospectar métodos alternativos que visem o reciclo agrícola seguro desses dejetos como fertilizantes?. Para isso, as atividades foram divididas em três etapa: 1) Monitoramento de patógenos entéricos em dejetos suinícolas tratados e não tratados em BA e RBA seguido por sedimentação; 2) Higienização de digestatos por meio de estocagem em temperaturas tropicais, bem como prospecção de sanitizantes que visassem melhorar o aspecto sanitário e agronômico dos digestatos; 3) Avaliação ex situ do comportamento dos patógenos em solos fertilizados com digestato suinícola. Os resultados obtidos apresentaram a ineficiência dos BA do tipo ?Lagoa Coberta? frente à inativação de patógenos entéricos virais (rotavírus, circovírus e adenovírus porcino) em dejetos suinícolas, mas por outro lado apresentaram a capacidade desses patógenos, incluindo Salmonella enterica - Typhimurium, sedimentarem rapidamente durante a decantação do efluente suinícola tratado em RBA, deslocando-se da fase líquida e concentrando-se na fase sólida onde permaneceram infecciosos (processo de sedimentação); No que se referiu a estabilidade temporal de patógenos entéricos frente às temperaturas ambientes (16 e 37oC) houve inativação promissora em efluente e lodo suinícola estocado em temperaturas de 22 e 37°C (ocorridas durante estação de verão em países de clima tropical); No que se referiu à prospecção de satitizantes, dos aditivos testados (CaO, cinzas, ureia, casca de ovos e CaCO3, bem como sua mistura), sempre que houve presença de ureia a concentração de amônia livre aumentou em função do pH e os patógenos entéricos virais e bacterianos (bacteriófagos PHIx_174 e MS2, adenovírus humano, S. enterica e E. coli) foram melhor reduzidos (=99,9%) se comparados aos tratamentos baseados somente na adição de cinza e CaO. Essa inativação promissora na presença de ureia não ocorreu com os ovos de Ascaris lumbricoides testados, pois esses não reduziram ao longo dos primeiros 90 dias em nenhum dos tratamentos avaliados; Quando patógenos entéricos virais e bacterianos foram avaliados quanto ao comportamento em solos argilosos e arenosos fertilizados com digestato suinícola, os resultados mostraram menor estabilidade desses patógenos em solos argilosos e maior percolação e lixiviação a partir de solos arenosos (p=0,05). Espera-se que esses resultados auxiliarem a suprir as demandas alimentícias nacionais e internacionais, por meio da prospecção de fertilizantes, considerando que há necessidade de sustentabilidade na gestão dos resíduos gerados na cadeia produtiva de suínos e outros animais visando seu reciclo agrícola e segurança sanitária no âmbito "Saúde Única".<br> / Abstract : The swine production chain frequently needs review their planning, prioritizing actions aimed at sustainability of the activity. So the anaerobic digesters (AD) of the "Lagoon", distinguished by generation capacity and biogas storage from pig manure and to generate a final digestato used in the fertilization of soils and pastures. As for the waste treatment in aerobic biological reactors (ABR) followed by sedimentation, are used to stabilize the waste and its segregation between liquid phase (wastewater) and solid phase (sludge). Swine treatment systems are characterized by generating large volumes of effluent and final sludge, that it can be recycled in agriculture. However little is known about the sanitary security of effluents and sludge. This doctoral thesis aimed to "assess the hygiene in swine manure current treatments systems, as well as to seek alternative methods aimed at safe agricultural recycling of these wastes as fertilizer". For this, activities were divided into three stages: 1) Monitoring of enteric pathogens in treated pig manure and untreated in BA and RBA followed by sedimentation; 2) Hygienization of digestate by storage in temperatures of tropical areas, as well as prospecting sanitizers that aimed to improve the health and agronomic aspect of digestate; 3) Ex situ evaluation of pathogens behavior in fertilized soil with swine digestate. The results showed the inefficiency of AD against the inactivation of viral enteric pathogens (rotavirus, circovirus and porcine adenovirus) in swine waste, but on the other hand showed settling of these pathogens, including Salmonella enterica - Typhimurium, during the decanting of swine effluent treated in ABR, moving the liquid phase to solid, where they remained infectious (sedimentation process); Temporal stability of enteric pathogens was promising inactivation in effluent and swine slurry stored at 22 and 37°C (summer temperatures in tropical areas). For higienization of digestate CaO, ash, urea, eggshells and CaCO3, as well as their mixture, were tested as additives. The urea presence increased the free ammonia concentration in function of pH. The viruses and bacteria pathogens were reduced in =99,9% compared to only treatments based on the addition of ash and CaO. This promising inactivation in the presence of urea did not occur with the eggs of Ascaris lumbricoides tested because these have not reduced over the first 90 days in any of the evaluated treatments; When viral enteric pathogens and bacterial were assessed for behavior in clay and sandy soils fertilized with swine digestato, the results showed lower stability of these pathogens in clayey soils and higher percolation and leaching from sandy soils (p = 0.05). It is hoped that these findings assist to meet the national and international food demands, through the exploration of fertilizers, considering the sustainability and waste management of waste from animal production, aiming its agricultural recycling and health security under "One Health" concept.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-02-28T04:12:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 344115.pdf: 2234451 bytes, checksum: 06c0486258b20f0fe363185379554a02 (MD5) Previous issue date: 2016 / A mancha bacteriana é uma doença de grande importância em plantações de tomate. A produtividade das plantas atacadas por esta fitomoléstia é comprometida principalmente pela redução da área foliar. A aplicação de exopolissacarídeos (EPS) de Lactobacillus plantarum pode representar uma forma alternativa de controle de doenças em plantas de tomate. Esse trabalho objetivou avaliar o potencial do EPS de L. plantarum para controlar a mancha bacteriana causada por Xanthomonas gardneri em plantas de tomate. Após o crescimento de L. plantarum em biorreator, extraiu-se o EPS do meio de cultura livre de células. O EPS foi caracterizado por FTIR e aplicado em plantas de tomateiro (0; 0,5; 1,5 e 3,0 mg mL-1), e a inoculação do patógeno foi realizada 3 ou 7 dias depois. Verificou-se também o efeito protetor local e sistêmico do elicitor. In vitro, testou-se a atividade antimicrobiana do EPS contra X. gardneri. Mecanismos de defesa bioquímicos (teor de compostos fenólicos totais e de flavonoides, atividade da fenilalanina amônia liase (FAL), lipoxigenase (LOX), glutationa redutase (GR), peroxidases (POX), polifenoloxidases (PFO), catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e reação de hipersensibilidade (acúmulo de H2O2)), alterações fisiológicas (taxa fotossintética, condutância estomática, transpiração, rendimento fotoquímico do fotossitema II e índice SPAD) e morfológicas (microscopia de luz e fluorescência) foram analisados a partir de plantas de tomateiro tratadas com água destilada, EPS (1,5 mg mL-1) ou ASM (0,05 mg mL-1), inoculadas ou não com X. gardneri. Verificou-se redução de mais de 70% na severidade da mancha bacteriana em plantas de tomateiro tratadas com o EPS (1,5 mg mL-1) em relação à testemunha. O EPS de L. plantarum foi capaz de induzir resistência quando aplicado 3 dias antes da introdução do patógeno e apresentou efeito protetor local. In vitro, o EPS não apresentou atividade antimicrobiana sobre o agente patogênico. Alterações no perfil espectrofotométrico, na concentração dos ácidos ascórbico e elágico, e na atividade das enzimas FAL, LOX, GR, PFO, CAT e SOD foram observados em plantas tratadas com EPS ou ASM, desafiadas com o patógeno. Observou-se acúmulo de H2O2 nas células estomáticas e acúmulos celulósicos na epiderme das folhas tratadas com EPS. A taxa fotossintética aumentou nas plantas previamente pulverizadas com EPS e desafiadas com o patógeno, e diferentemente do observado nas plantas tratadas com ASM, o biopolímero reduziu a condutância estomática e a transpiração dos vegetais. Os parâmetros de rendimento fotoquímico e o índice SPAD não foram alterados com a aplicação do EPS. A aplicação do EPS altera o metabolismo de defesa das plantas e pode ser considerada uma alternativa para o controle da mancha bacteriana. O modo de ação é discutido em termos das alterações fisiólogicas, morfológicas e bioquímicas em plantas de tomate.<br> / Abstract : Bacterial spot is a disease of great importance in tomato crops. The productivity of plants attacked by this disease is mainly compromised by the reduction in leaf area. The application of exopolysaccharides (EPS) of Lactobacillus plantarum may represent an alternative form of disease control in tomato plants. This study aimed to evaluate the potential of EPS from L. plantarum to control bacterial spot caused by Xanthomonas gardneri in tomato plants. After growth of L. plantarum in a bioreactor, the EPS was extracted from cell-free culture medium. The EPS was characterized through FTIR and applied to tomato plants (0, 0.5, 1.5 and 3.0 mg mL-1) and inoculation of the pathogen was performed 3 or 7 days later. We also tested the local and systemic effect of the elicitor. In vitro, we tested the antimicrobial activity of EPS against X. gardneri. Biochemical defense mechanisms (phenolics compouds and flavonoids content, PAL, LOX, GR, POX, PPO, CAT, SOD activities and hypersensitivity reaction (accumulation of H2O2)), physiological (photosynthetic rate, stomatal conductance, transpiration, photochemical of fotossitema II and SPAD) and morphological (light and fluorescence microscopy) changes were analyzed from tomato plants treated with distilled water, EPS (1.5 mg mL-1) or ASM (0.05 mg mL-1), inoculated or not with X. gardneri. The EPS (1.5 mg mL-1) of L. plantarum was able to induce resistance when applied 3 days before the introduction of the pathogen and showed effect of local protection. In vitro, the EPS did not present antimicrobial activity against the pathogen. Changes in the spectrophotometric profile, ascorbic and ellagic acid concentration and in FAL, LOX, GR, PFO, CAT and SOD activities were observed in plants treated with EPS or ASM and challenged with the pathogen. It was observed accumulation of H2O2 in stomatal cells and alterations in the epidermis of the leaves treated with EPS. The photosynthetic rate increased in the plants previously sprayed with EPS and challenged with the pathogen, and different from that observed in the plants treated with ASM the biopolymer was able to reduce stomatal conductance and transpiration rates of plants. The photochemical performance parameters and the SPAD index didn?t change with the application of EPS. The application of EPS triggered the defense metabolism of tomato plants and can be an alternative to protect plants against bacterial spot. The mode of action is discussed in terms of physiological, morphological and biochemical changes in tomato plants.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-20T21:21:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 203662.pdf: 475109 bytes, checksum: e464cd29864fb9539659fc45b145953d (MD5) / A inflamação é uma resposta do organismo a um estímulo agressor, químico, físico ou biológico, que tem como finalidade restaurar a integridade tecidual. Este fenômeno biológico é realizado através do acúmulo e ativação de leucócitos no local da injúria, que contribuem para a eliminação de antígenos e recuperação da homeostase. A inflamação é, também, fundamental para o estabelecimento da imunidade específica e eficiência da imunização. Uma das medidas de imunização mais eficaz é a vacinação. Uma vacina deve ter alto poder imunogênico para ser eficaz na profilaxia de doenças infecto-contagiosas. Desta forma, elas são geralmente associadas a substâncias adjuvantes, que amplificam a resposta protetora da vacina. Entretanto, alguns destes adjuvantes induzem efeitos indesejáveis, tais como excesso de inflamação local e sinais flogísticos sistêmicos. O presente estudo pretendeu verificar a atividade inflamatória induzida por seis adjuvantes, associados a uma vacina contra vírus rábico para futuro uso em animais. Os adjuvantes testados neste trabalho foram o Algamulin, Avridine, Hidróxido de Alumínio, b-Glucana (2 e 4 mg), SEPPIC-I e SEPPIC-II. Para este objetivo as diferentes formulações adjuvantes (50µl) adicionadas à vacina (50µl), a vacina pura (50µl) e PBS (Controle) foram inoculados em uma bolha de ar (3ml) formada do dorso (subcutâneo) de camundongos albinos da linhagem Swiss. Após 24 e 72 horas do desafio, os animais foram sacrificados e o conteúdo celular obtido da cavidade foi associado à intensidade do processo inflamatório. A contagem total de células leucocitárias e suas subpopulações foi realizada por Citometria de Fluxo. Para a análise de subpopulações, os leucócitos foram preparados e marcados, conforme o protocolo da PharMingen®, com anticorpos conjugados com fluoresceína ou ficoeritrina-R, específicos para as populações de Linfócitos B (anti-CD 19), Linfócitos T (anti-CD 3) e sub-população de Linfócitos T (anti-CD 4 e anti-CD 8). Nossos resultados permitem concluir que: 1. Todos os adjuvantes induzem inflamação cutânea; 2. Existe diferença de intensidade e na qualidade do infiltrado inflamatório induzido entre os diferentes adjuvantes utilizados. Alguns adjuvantes induzem um infiltrado inflamatório predominantemente de células mononucleares, Outros de polimorfonucleares; 3. Estas diferenças parecem resultar em padrões de resposta imune diferentes, de acordo com a célula mais estimulada. Os padrões de resposta predominantemente mononuclear foram observados com SEPPIC-I e SEPPIC-II. O Padrão de resposta apresentando grande quantidade de células polimorfonucleares foi observado com Hidróxido de Alumínio, Algamulin e Beta Glucana; 4. Avridine apresentou um infiltrado misto no qual havia a presença tanto de células mononucleares quanto polimorfonucleares;

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-20T22:25:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / O esgoto não tratado e lançado no meio ambiente é um problema que

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T08:29:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 195580.pdf: 642656 bytes, checksum: 23ca54a36dcd034d40bc7b31793b886a (MD5) / O vírus rábico pertence à Ordem Mononegavirales e Família Rhabdoviridae, sendo constituído por um RNA de sentido negativo, não-segmentado e que codifica para cinco proteínas (N, NS, M, G e L). São conhecidos até o momento 7 genótipos virais, sendo o genótipo 1 formado pelo vírus rábico clássico, com distribuição mundial. A genotipagem de amostras do vírus é realizada mais comumente pela análise dos genes da nucleoproteína e glicoproteína, embora a região não-codificante G-L tenha sido sugerida para caracterização de amostras mais homogêneas. O presente trabalho descreve a genotipagem e a análise filogenética de amostras de vírus rábico isoladas em SC durante o ano de 2002, através do seqüenciamento automatizado de produtos de RT-PCR. A extração de RNA viral, transcrição para cDNA e amplificação via RT-PCR do gene da nucleoproteína e da região não-codificante G-L, são descritas em detalhes. Os resultados demonstraram que a porção 5´ do gene da nucleoproteína é altamente conservada entre as amostras estudadas e divergentes das amostras padrão de laboratório, sendo todas classificadas como genótipo 1. A comparação da seqüência nucleotídica destas amostras com outros isolados brasileiros disponíveis no GenBank, questiona a distribuição espécie-específica, sugerida por outros autores, levantando a possibilidade de que os agrupamentos por regiões geográficas possam ser relevantes. A análise da região não-codificante G-L revelou alto grau de variabilidade entre as amostras catarinenses, possibilitando a distribuição das mesmas em dois grupos. Nenhuma destas amostras apresentou o sinal clássico de parada de transcrição na extremidade 5´ do gene da glicoproteína, relatado no modelo de pseudogene viral. Além disso, três isolados também não apresentaram este sinal na extremidade 5´ da região não-codificante G-L, sugerindo uma possível transcrição bicistrônica entre o gene da glicoproteína e a polimerase viral. Outra possibilidade é que existam novos sinais de parada de transcrição (para o gene da glicoproteína e da região não-codificante G-L) e de início de transcrição (para o gene da polimerase) ainda não descritos. A relevância destes achados é discutida em detalhes.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T14:16:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A fermentação da maltose e maltotriose por Saccharomyces cerevisiae é de fundamental importância para diversas aplicações industriais desta levedura. No presente trabalho foi analisado aspectos do metabolismo destes açúcares relevantes para os processos de panificação e cervejaria. Por exemplo, células de leveduras continuam fermentando a massa do pão mesmo quando submetidas a refrigeração, sendo esta uma característica indesejável nas cepas de panificação. Uma vez que a maltose é o principal açúcar encontrado na massa do pão, a influência do frio (10ºC) na fermentação deste açúcar foi analisada em uma cepa selvagem de S. cerevisiae, e numa cepa csf1. mutante incapaz de transportar glicose e leucina a baixas temperaturas. A baixa temperatura afeta a cinética da fermentação por diminuir a velocidade de crescimento e rendimento celular final, com quase nenhum etanol produzido a partir de maltose pelas células selvagens a 10oC. A cepa csf1. foi incapaz de crescer em maltose a 10oC, indicando que o gene CSF1 é também necessário para a utilização de maltose a baixas temperaturas. Entretanto, o mutante csf1. também mostrou inibição acentuada da fermentação de glicose e maltose por estresse salino, além de uma significativa sensibilidade a uma série de compostos tóxicos, incluindo higromicina B, Ca2+, tetrametilamônio e pH ácido, mas não a altas concentrações de K+. Estes resultados indicam que o gene CSF1 estaria também envolvido na regulação de outros processos fisiológicos, incluindo a homeostase iônica. Em cervejaria a otimização do processo fermentativo depende da eficiente utilização de maltose e maltotriose pelas células de S. cerevisiae. Entretanto, as leveduras têm dificuldade de fermentar a maltotriose, e a incompleta utilização deste açúcar resulta, por exemplo, em uma cerveja de baixa qualidade, com um elevado extrato filtrável e sabor atípico. Para tentar compreender melhor a metabolização da maltotriose, a utilização deste açúcar foi analisada em cepas de S. cerevisiae com genótipos definidos e deletadas, ou não, em permeases específicas. A cepa selvagem analisada cresce lentamente em maltotriose, somente após uma extensa fase lag, sem produzir etanol durante o crescimento. Este fenótipo (crescimento lento e não fermentativo) não foi alterado pela deleção do gene AGT1, indicando que outro(s) transportador(es) estaria(m) provavelmente envolvido(s) na lenta utilização da maltotriose. Por outro lado uma cepa deletada nos transportadores de hexoses (hxt1-7. gal2.) fermentou eficientemente a maltotriose, mas quando o gene AGT1 foi deletado do genoma a cepa voltou a respirar este açúcar, indicando que a permease codificada pelo AGT1 é fundamental para a fermentação da maltotriose. Uma vez que a expressão constitutiva dos genes MAL é uma característica altamente desejável em cepas de panificação e cervejaria, decidiu-se analisar a contribuição que um gene regulador constitutivo teria na fermentação da maltotriose. Enquanto que algumas cepas MAL constitutivas foram capazes de fermentar eficientemente a maltotriose, a transformação de uma cepa selvagem incapaz de fermentar este açúcar com um plasmídeo contendo o gene MAL63c não melhorou a produção de etanol a partir de maltotriose. Estes resultados indicam a existência de outros fatores necessários para a eficiente fermentação de maltotriose por Saccharomyces cerevisiae. and maltotriose fermentation by Saccharomyces cerevisiae is of prime importance for several industrial applications of this yeast. In this work we have analyzed several aspects of the metabolism of these sugars relevant to the brewing and baking processes. For example, yeast cells still ferment the dough under refrigerated conditions, a characteristic highly undesirable for backing strains. Since maltose is the most abundant sugar in backing dough, we have studied the influence of cold temperature (10oC) on the fermentation of maltose by a S. cerevisiae wild-type strain, and a csf1. mutant impaired in glucose and leucine uptake at low temperatures. Cold temperature affected the fermentation kinetics by decreasing the growth rate and the final cell yield, with almost no ethanol been produced from maltose by the wild-type cells at 10oC. The csf1. strain did not grew on maltose when cultured at 10oC, indicating that the CSF1 gene is also required for maltose consumption at low temperatures. However, this mutant also showed increased inhibition of glucose and maltose fermentation under salt stress, and an increased sensitivity to several toxic compounds, including hygromycin B, Ca2+, tetramethylammonium and acidic pH, but not to high K+ concentrations. These results indicate that the CSF1 gene is probably involved in the regulation of other physiological processes, including ion homeostasis. Fermentation process optimization in the brewing industry depends on the efficient utilization of maltose and maltotriose by S. cerevisiae. However, yeasts have a difficulty to ferment maltotriose, and the incomplete utilization of this sugar results, for example, in a low quality beer with high content of fermentable sugars and atypical flavor profiles. To further understand the utilization of maltotriose, we analyzed the uptake of this sugar in yeasts strains with defined genotypes, deleted or not in specific transporters. The wild-type strain analyzed grows slowly in maltotriose, only after an extensive lag phase, and no ethanol was produce during growth. This phenotype (slow growth with no fermentation) was not affected by deletion of the AGT1 gene, indicating that probably other transporters may be involved in the slow utilization of maltotriose. On the other hand, a strain that was deleted in the hexose transporters (hxt1-7. gal2.) fermented maltotriose efficiently, but when the AGT1 gene was disrupted from the genome the strain started to respired the sugar, indicating that the AGT1 permease is required for maltotriose fermentation. Since the constitutive expression of MAL genes is a desired property of baker#s and brewery#s strains, we analyzed the contribution that a constitutive regulatory gene would have in maltotriose fermentation. While some MAL constitutive strains were capable to efficiently ferment maltotriose , the transformation of a wild-type strain incapable to ferment this sugar with a plasmid harboring the MAL63c gene did not improve ethanol production from maltotriose. These results indicate the existence of other factors required for the efficient fermentation of maltotriose by Saccharomyces.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa catarina, Centro de Ciências Biológiocas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T14:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Drogas ou moléculas que interagem com DNA e RNA, especialmente aquelas capazes de clivar ácidos nucléicos, têm sido alvo de grande interesse por servir como ferramentas em biologia molecular, bioquímica e terapêutica. Nucleases químicas são compostos sintéticos que mimetizam a ação de nucleases enzimáticas naturais e podem ser utilizadas como uma alternativa em processos bioquímicos e biotecnológicos com algumas vantagens, tais como menor tamanho, o que lhes permite ação em regiões de macromoléculas inacessíveis a enzimas, e pelo fato de que sua especificidade e eficiência podem ser moduladas. O ligante macrocíclico poliaza 3,6,9,17,10,23-hexaazatriciclo[23.3.1.111,15]triaconta-1(29),11-(30),12.14,2S(26),27-hexaeno (BMXD) foi produzido pela primeira vez em 1990. Consiste de um macrociclo formado por duas porções dietilenotriamina separadas por duas pontes fenol, capaz de coordenar um ou dois centros Cu(II) pelas porções dietilenotriamina. Foi demonstrado previamente que o ligante BMXD apresenta afinidade por ATP e é capaz de promover sua conversão em ADP e ortofosfato através de uma reação oxidativa. Coordenando um ou dois centros de zinco, o ligante BMXD é capaz de se ligar a maleato, pirofosfato e melanina e é capaz de promover a clivagem hidrolítica de BNP. É demonstrado, no presente trabalho, que o complexo Cu2BMXD é capaz de promover a clivagem oxidativa de DNA, convertendo DNA plasmidial superenovelado em DNA plasmidial circular aberto com uma velocidade de 4,67 x 10-2h-1 a 50°C em pH 7,0.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T14:53:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 220751.pdf: 1392360 bytes, checksum: 4537ce975f642a376ad212bd07f39936 (MD5) / As regiões costeiras vêm recebendo nas últimas décadas um significativo aporte de contaminantes de origem antropogênica, incluindo o petróleo e seus derivados. Como conseqüência disso, ecossistemas como os manguezais, caracterizados por possuir amplas variações de salinidade, são alguns dos ecossistemas mais afetados e vulneráveis. A ostra-do-mangue Crassostrea rhizophorae (Mollusca: Bilvalvia), um molusco eurihalino e osmoconformador, com ampla distribuição na costa brasileira, pode ser utilizado como um organismo sentinela em programas de biomonitoramento. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da salinidade (35, 25, 15 e 9) sobre a