A risperidona é um medicamento antipsicótico que quando metabolizada da origem a dois metabólitos hidroxilados quirais, a 7-hidroxirisperidona (7-RispOH) e a 9-hidroxirisperidona (9-RispOH). A 9-RispOH apresenta as mesmas propriedades farmacológicas que a risperidona e já é comercializada como fármaco, com o nome genérico de paliperidona. Estudos em humanos mostram que existem diferenças na disposição cinética dos enantiômeros da 9-RispOH, com uma maior prevalência do enantiômero (+)-9-RispOH em plasma. Dessa forma, este trabalho teve como finalidade avaliar a capacidade de algumas espécies de fungos e também de catalisadores de Jacobsen em (bio)transformar enantiosseletivamente a risperidona em seu metabólito ativo 9-RispOH. Para tanto, foi desenvolvido um método de separação para a risperidona e seus metabólitos utilizando cromatografia líquida de alta eficiência quiral. Este método foi então aplicado nos estudos de biotransformação enantiosseletivo e nos estudos de catálise assimétrica. A separação cromatográfica foi realizada empregando a coluna Chiralcel OJ-H e metanol:etanol (50:50, v/v) + 0,2% de trietilamina como fase móvel. A vazão e temperatura utilizadas foram 0,8 mL min-1 e 25oC, respectivamente. Para extração dos analitos do meio de cultura, foi empregada a microextração em fase sólida (SPME) como técnica de preparação de amostra. O processo de SPME foi realizado utilizando uma fibra C18 mergulhando diretamente a fibra na amostra por 30 minutos e dessorvendo a fibra diretamente na fase móvel por 5 minutos. A validação e estudos de biotransformação foram realizados empregando a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS). O método foi validado e todos os parâmetros encontram-se de acordo com as recomendações da literatura. O estudo de biotransformação foi realizado com diferentes espécies de fungos e somente os fungos do gênero Cunninghamella foram capazes de biotransformar a risperidona em seu metabólito ativo. O fungo Cunninghamella echinulata foi capaz de biotransformar estereosseletivamente a risperidona no seu metabólito ativo (+)-9-RispOH com excesso enantiomérico de 100% e o fungo Cunninghamella elegans foi também capaz de biotransformar estereosseletivamente a risperidona nos dois enantiômeros da 9-RispOH em diferentes proporções. Os estudos preliminares de catálise assimétrica foram realizados empregando a cromatografia líquida e detecção por UV-Vis, injetando diretamente alíquotas no sistema cromatográfico. Esses estudos mostraram que na condição de reação 1:50:50 (em número de mols, catalisador:oxidante:substrato) houve uma catálise assimétrica da risperidona que demonstrou ser enantiosseletiva para o metabólito 7-RispOH (E1). / Risperidone is an atypical antipsychotic drug. Its metabolism yields in two hydroxylated chiral metabolites, 7-hydroxyrisperidone (7-RispOH) and 9-hydroxyrisperidone (9-RispOH). The 9-RispOH metabolite presents the same pharmacologic activity of the parent drug risperidone. This led this drug to be marketed as drug under the generic name paliperidone. Studies have shown differences in the kinetic disposition of the 9-RispOH enantiomers with higher prevalence of the (+)-9-RispOH enantiomer in plasma. Thus, this work aimed to evaluate the ability of some species of fungi and Jacobsen catalysts in the enantioselective (bio)transformation of risperidone into its active chiral metabolite 9-RispOH. To accomplish that, it was developed a separation method to analyze risperidone and its metabolites by chiral high-performance liquid chromatography. This method was employed in enantioselective biotransformation studies and in asymmetric catalysis studies. The chromatographic separation was performed on a Chiralcel OJ-H column using methanol:ethanol (50:50, v/v) plus 0.2% triethylamine as the mobile phase at a flow rate of 0.8 mL min-1. The SPME process was performed by immersing directly a C18 probe fiber in the culture medium during 30 min. The analytes were desorbed from the fiber directly in the mobile phase during 5 min. The method validation and the biotransformation studies were performed by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The method was completely validated and all parameters were in agreement with the literature recommendations. The biotransformation studies were performed employing different species of fungi and only the Cunninghamella genus was able to biotransform risperidone into its active metabolite. The Cunninghamella echinulata fungus was able to biotransform risperidone into the active metabolite, (+)-9-RispOH, resulting in 100% of enantiomeric excess. The Cunninghamella elegans fungus was also able to biotransform stereoselectively risperidone into (+)- and ()-9-RispOH enantiomers at different rates. Preliminary studies of asymmetric catalysis were performed using high-performance liquid chromatography with UV-Vis detector (HPLC-UV). The aliquots were directly injected in the chromatography system. These studies showed that the reaction with 1:50:50 (catalyst:oxidant:substrate, in number of mols, in this sequence) presented an asymmetric catalysis of risperidone and that showed to be enantioselective to 7-RispOH (E1) metabolite.

BORGES, K. B. Análise estereosseletiva da tioridazina e seus principais metabólitos: um estudo cinético de biotransformação empregando fungos. 2006. 124f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. Atualmente, existe um grande interesse em estudar a biotransformação estereosseletiva de fármacos, incluindo os processos que reproduzem as vias de metabolização in vivo. Alguns desses estudos estão sendo realizados empregando microrganismos como, por exemplo, fungos. A cromatografia líquida de alta eficiência é umas das técnicas que pode ser empregada para a resolução, identificação e quantificação das espécies quirais formadas. A tioridazina (THD) é um fármaco quiral, com atividade antipsicótica utilizado para o tratamento da esquizofrenia. Possui como principais metabólitos a tioridazina-2-sulfóxido (THD-2-SO) e tioridazina-2-sulfona (THD-2-SO2), ambos com atividade antipsicótica, e a tioridazina-5-sulfóxido (THD-5-SO), que contribui para o efeito cardiotóxico do fármaco. Portanto, o presente trabalho tem por finalidade o desenvolvimento de um método de análise estereosseletiva da THD-2-SO e THD-5-SO em meio de cultura para avaliação do potencial de biotransformação da THD por alguns fungos. A melhor resolução dos estereoisômeros da THD-2-SO e THD-5-SO foi obtida utilizando a coluna CHIRALPAK® AS e fase móvel hexano : etanol : metanol (92:6:2, v/v/v) + 0,5% de dietilamina. A extração líquido líquido foi utilizada na preparação das amostras, tendo como solvente extrator o éter etílico. O método desenvolvido apresentou recuperação em torno de 100% para todos os compostos avaliados. Os coeficientes de variação e erros obtidos nos estudos de precisão e exatidão, intra e interensaios, foram inferiores a 10%. O método desenvolvido e validado foi empregado para avaliar o potencial de biotransformação da THD por 12 fungos endofíticos isolados de Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria e Viguiera robusta e 1 fungo de solo (Penicillium waksmanii). Dentre os 13 fungos avaliados, quatro merecem destaque por apresentarem um potencial de biotransformação estereosseletivo mais evidenciado: Phomopsis sp. (TD2) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (9,3% e 5,8%, respectivamente);Glomerella cingulata (VA1) apresentou maior mono-5-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) + (R)-(FE) (39,7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) apresentou maior mono-2-sulfoxidação para as formas (S)-(SE) e (R)-(FE) (84,4% e 82,5%, respectivamente) e Aspergillus fumigatus (VR12) apresentou maior mono-2-sulfoxidação das formas (S)-(FE) (20,7%) e (R)-(SE) (34,4%). / BORGES, K. B. Stereoselective analysis of thioridazine and its major metabolites: a kinetic study of biotransformation by fungi. 2006. 124p. Dissertation (Masters degree) Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006. The interest in stereoselective biotransformation of drugs including the processes that reproduce the in vivo metabolism has been increased. To study drug metabolism several models have been used. Among them, studies carried out using microorganisms, mainly fungi have been standing out. High-Performance Liquid Chromatography can be used for the resolution, identification and quantification of the chiral species formed. The thioridazine (THD) is a chiral drug used as antipsychotic for the treatment of schizophrenia. The main metabolites of THD are thioridazine-2-sulfoxide (THD-2-SO), thioridazine-2-sulfone (THD-2-SO2) and thioridazine-5-sulfoxide (THD-5-SO). The THD-2-SO and THD-2-SO2 possesss antipsychotic activity and THD-5-SO contributes to the cardiotoxicity of drug more than the parent compound. Therefore, the aim of the present work was to develop a method for the stereoselective analysis of THD-2-SO and THD-5-SO in culture medium to study biotransformation of THD by some fungi. The simultaneous determination of thioridazine-2-sulfoxide and thioridazine-5-sulfoxide was performed on a CHIRALPAK® AS column using a mobile phase constituted of hexane: ethanol: methanol (92:6:2, v/v/v) + 0.5% diethylamine. Diethyl ether was used as extraction solvent. Recoveries around 100% were obtained for all the evaluated species. The coefficients of variation and relative errors in precision and accuracy studies (within-day and between-day) were below 10%. The validated method was used to evaluate the biotransformation of THD by 12 endophytic fungi isolated from Tithonia diversifolia, Viguiera arenaria and Viguiera robusta and 1 fungus isolated from soil (Penicillium waksmanii). Among the 13 fungi evaluated, four of them deserve prominence for presenting an evidenced stereoselective biotransformation potential: Phomopsis sp. (TD2) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) e (R)-(FE) (9.3% and 5.8%, respectively); Glomerella cingulata (VA1) presented greater mono-5-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) + (R)-(FE) (39.7%); Diaporthe phaseolorum (VR4) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(SE) and (R)-(FE) (84.4% and 82.5%, respectively) and Aspergillus fumigatus (VR12) presented greater mono-2-sulfoxidation to the forms (S)-(FE) (20.7%) and (R)-(SE) (34.4%).

No presente estudo, uma triagem foi realizada com 12 fungos marinhos Penicillium miczynskii CBMAI 930, Penicillium raistriicki CBMAI 931, Aspergillus sydowii CBMAI 933, Aspergillus sydowii CBMAI 934, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Bionectria sp. CBMAI 936, Penicillium oxalicum CBMAI 1185, Penicillium citrinum CBMAI 1186, Penicillium decaturense CBMAI 1234, Penicillium raistriicki CBMAI 1235, Cladosporium sp. CBMAI 1237 e Aspergillus sydowii CBMAI 1241 para avaliar o potencial enzimático destes micro-organismos frente à fenilacetonitrila 1. Estes micro-organismos foram isolados de esponjas e alga coletadas do litoral norte do estado de São Paulo. A triagem foi realizada em meio sólido mineral suplementado com glicose e fenilacetonitrila 1 como única fonte de nitrogênio. Dentre os fungos, 8 adaptaram-se muito bem ao substrato 1 nas respectivas quantidades 5 µL (0,04 mmol), 10 µL (0,08 mmol) e 15 µL (0,12 mmol). Em seguida, a triagem foi realizada em meio líquido (20 µL (0,17 mmol), 40 µL (0,35 mmol) e 60 µL (0,50 mmol) de fenilacetonitrila 1 e obteve um bom crescimento de massa micelial dos fungos. Experimentos realizados na ausência de fenilacetonitrila 1, tanto em meio sólido, quanto em meio líquido, não promoveram o crescimento microbiano, evidenciando que as enzimas capazes de hidrolisarem nitrilas presente no sistema catalítico são construtivas. A fenilacetonitrila 1 foi biotransformada ao ácido 2-(2-hidroxifenil)acético 1b (51% pelo fungo A. sydowii CBMAI 934) por todos os fungos adaptados. Devido ao bom crescimento do fungo A. sydowii CBMAI 934 em meio mineral sólido e líquido na presença de fenilacetonitrila 1, este fungo foi selecionado para promover reações de hidrólise frente a diferentes organonitrilas, arilcetonitrilas: 4-fluorofenilacetonitrila 2, 4-clorofenilacetonitrila 3, 4-metoxifenilacetonitrila 4, 2-metilfenilacetonitrila 5, 3-metilfenilacetonitrila 6, 4-metilfenilacetonitrila 7 aos seus correspondentes ácidos carboxílicos 4-fluorofenilacético 2a (51%), 4-clorofenilacético 3a (55%), 4-metoxifenilacético 4a (43%), 2-metilfenilacético 5a (76%), 3-metilfenilacético 6a (52%) e 4-metilfenilacético 7a (46%), em nitrila alifática, 2-(1-ciclo-hexen-1-il)acetonitrila 8 ao ácido 2-(1-ciclo-hexen-1-il)acético 8a (28%) e nitrila hetero-aromática, 2-cianopiridina 19 a 2-piridinamida 19a. As reações foram acompanhadas por GC-FID e os produtos de biotransformações foram isolados e caracterizados por GC-MS, HRMS, RMN de 1H e de 13C. Este trabalho envolveu o primeiro estudo frente à biotransformação de nitrilas por micro-organismos de origem marinha. / In the present study, a screening of 12 marine fungi Penicillium miczynskii CBMAI 930, Penicillium raistriicki CBMAI 931, Aspergillus sydowii CBMAI 933, Aspergillus sydowii CBMAI 934, Aspergillus sydowii CBMAI 935, Bionectria sp. CBMAI 936, Penicillium oxalicum CBMAI 1185, Penicillium citrinum CBMAI 1186, Penicillium decaturense CBMAI 1234, Penicillium raistriicki CBMAI 1235, Cladosporium sp. CBMAI 1237 and Aspergillus sydowii CBMAI 1241 was done in order to evaluate the enzymatic potential of these microorganisms in phenylacetonitrile 1. These microorganisms were isolated from sponges and algae collected at the north shore of Sao Paulo State. The screening was carried out in solid mineral medium supplemented with glucose and phenylacetonitrile 1 as the only source of nitrogen. Among the fungi, 8 adapted to the subtract really well 5 µL (0,04 mmol), 10 µL (0,09 mmol) and 15 µL (0,13 mmol). Afterwards, a screening was carried out in liquid medium 20 µL (0,17 mmol), 40 µL (0,35 mmol) and 60 µL (0,50 mmol) of phenylacetonitrile 1) and a great mass of the fungi was obtained. The phenylacetonitrile 1 was biotransformed in the acid 2-(2-hydroxyphenyl)acetic 1b (51% by the fungus A. sydowii CBMAI 934) by all the adapted fungi. Experiments carried out without phenylacetonitrile 1, both in solid and liquid media did not show microbial growth. Enzymes which hydrolyzed nitriles present in the catalytic system were constructive. Due to the good growth rate of the fungus A. sydowii CBMAI 934 in solid and liquid mineral media in presence of phenylacetonitrile 1, this fungus was selected to promote hydrolysis reactions in different organonitriles, arylacetonitriles: 4-fluorophenylacetonitrile 2, 4-chlorophenylacetonitrile 3, 4-methoxyphenylacetonitrile 4, 2-methylphenylacetonitrile 5, 3-methylphenylacetonitrile 6, 4-methylphenylacetonitrile 7 in their corresponding carboxylic acids 4-fluorophenylacetic 2a (51%), 4-chlorophenylacetic 3a (55%), 4-methoxyphenylacetic 4a (43%), 2-methylphenylacetic 5a (76%), 3-methylphenylacetic 6a (52%) and 4-methylphenylacetic 7a (46%), aliphatic nitrile 2-(1-cyclohexen-1-yl)acetonitrile 8 to 2-(1-cyclohexen-1-yl)acetic acid 8a (28%) and heteroaromatic nitrile 2-cyanopiridine 19 to 2-pyridinecarboxamides 19a. The reactions were monitored by GC-FID and the biotransformation products were isolated and characterized by GC-MS, HRMS and 1H and 13C NMR. This work involved the first study on the biotransformation of nitriles by marine microorganisms.

A ocorrência de fármacos no meio ambiente têm despertado o interesse de pesquisadores, uma vez que podem causar efeitos adversos à comunidade biótica. O norfloxacino (NOR) é um fármaco amplamente empregado no tratamento de infecções bacterianas tanto em humanos como em animais, e devido as suas propriedades físico-químicas, tem sido alvo de estudos envolvendo o seu monitoramento e efeitos toxicológicos em micro-organismos, principalmente em ambientes aquáticos. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo a investigação da biotransformação/biodegradação do fármaco NOR por fungos derivados de ambiente marinho. Primeiramente, foi realizada uma triagem a partir de 7 cepas fúngicas, das quais 4 foram selecionadas - Penicillium raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Aspergillus sydowii CBMAI 1241 e Penicillium raistrickii CBMAI 1235 - para avaliar a influência da adição do fármaco na inoculação dos mesmos. Os experimentos foram realizados na presença do fármaco (0,1 mg mL-1), e em caldo nutritivo (malte 2% em água do mar artificial) por 35 dias (32°C, 130 rpm). A adição do fármaco no dia, e após a inoculação, não influenciou no crescimento dos fungos. No entanto, a formação de produtos de biotransformação foi observada para o experimento com adição do NOR no dia da inoculação, os quais foram identificados por LC-QqTOF, baseando-se na similaridade entre as massas obtidas experimentalmente e teórica, assim como os produtos já reportados na literatura. A porcentagem de biodegradação do fármaco foi determinada para o experimento com adição do fármaco após a inoculação, para os fungos: P. raistrickii CBMAI 931 (34,07%) e A. sydowii CBMAI 1241 (58,91%). Para os experimentos realizados em meio mineral (59,35%) e na presença de um consórcio de fungos (57,05%), não foram observadas diferenças significativas. Não foi possível elucidar a estrutura do produto isolado na presença do fungo A. sydowii CBMAI 1241, devido a sua baixa concentração e a possibilidade de conjugação com substâncias endógenas. Um método analítico foi desenvolvido e validado para a determinação da porcentagem de biodegradação do fármaco nos experimentos com os fungos marinhos. / The occurrence of drugs on the environment has called attention to researchers, since they can cause adverse effects to the biotic community. The norfloxacin (NOR) is a compound widely used for treatment of serious bacterial infections in human and animals. Due to the physicochemical properties of this compound it has been focus of studies concerning about its monitoring and toxicological effects on microorganisms, mainly in aquatic environment. Thus, in the present study the biotransformation/biodegradation of NOR by marine-derived fungi was investigated. Firstly, it was performed a screening with 7 strain of marine fungi, in a which 4 were selected - Penicillium raistrickii CBMAI 931, Cladosporium sp. CBMAI 1237, Aspergillus sydowi CBMAI 1241 and Penicillium raistrickii CBMAI 1235 - to evaluate the influence of NOR addition in the inoculation. The experiments were carried out in the presence of NOR (0,1 mg mL-1) in nutritive broth (malt 2% in artificial sea water) for 35 days (32°C, 130 rpm). The NOR addition on the first day and after inoculation, did not affect the fungal growth. Nevertheless, the formation of biotransformation products was observed to the experiment with addition on the first day. These products were identified by LC-QqTOF, based on the similarity between experimental and theoretical mass, as the products already reported on the literature. The percentage of drug biodegradation was determined for the fungi P. raistrickii CBMAI 931 (34,07%) and A. sydowi CBMAI 1241 (58,91%) for the experiment carried out with NOR addition after inoculation. For the experiments performed in mineral medium (59,35%) and in the presence of fungal consortium (57,05%) no differences were observed for the biodegradation. It was not able to elucidate the structure of isolated product, in the presence of A. sydowii CBMAI 1241, due to its low concentration and probable conjugation with endogenous substances. The analytical method was developed and validated to determine the percentage of drug biodegradation in the experiments with marine fungi.

Orientador: Gláucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-24T20:06:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abrahao_MeissaRochaEssenfelder_M.pdf: 2164946 bytes, checksum: 5d4f141c4a784953c0b6ee598b74b6e3 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A biotecnologia é uma área interdisciplinar que tem possibilitado inúmeros avanços no desenvolvimento de processos sustentáveis e na obtenção de novos produtos de interesse industrial. Entre estes exemplos estão os aromas naturais que, atualmente, são preferidos por muitos consumidores e já dominam o mercado em certas regiões como a Europa. Uma das opções biotecnológicas para a obtenção destes compostos ocorre pela biotransformação de terpenos, que são derivados de isoprenos, e substratos amplamente distribuídos na natureza. Estes compostos são classe relevante dentre os compostos de aroma e alguns podem ser obtidos a custos relativamente baixos. Limoneno e ?-pineno, por exemplo, estão disponíveis como subprodutos de indústrias de frutas cítricas e de papel, respectivamente. Estes monoterpenos são considerados substratos ideais para obtenção de derivados oxigenados, os terpenóides, muitos dos quais de grande interesse comercial. Nessa perspectiva, 51 fungos endofíticos das frutas caju (Anacardium occidentale L.), jenipapo (Genipa americana L.), sapoti (Manilkara zapota L.) e camu-camu (Myrciaria dubia), foram isolados durante este trabalho. As linhagens foram também avaliadas quanto ao potencial para biotransformação de limoneno ou ?-pineno como fontes únicas de carbono. A partir deste segundo substrato, destacaram-se dois fungos produtores de verbenona, um dos compostos chave do aroma de alecrim (Rosmarinus officinalis). A produção de verbenona por via biotecnológica mostrou um grande potencial para a continuidade dos estudos, tendo em vista que a concentração obtida foi de, aproximadamente, 200 mg/L após 288 horas de contato com o subtrato ?-pineno. Além disso, outro fungo apresentou produção de álcool perílico a partir da biotransformação de limoneno. Este produto é um terpenóide, cujos mecanismos de proteção contra o câncer já tem sido investigados e reconhecidos, aumentando o interesse na sua pesquisa e produção biotecnológica. No encerramento do trabalho, os três fungos com resultados positivos pra biotransformação de terpenos foram analisados em microscopia óptica para observação de suas morfologias e auxílio na identificação / Abstract: As an interdisciplinary field, biotechnology has allowed several advances for the development of sustainable processes and many achievements concerning production of new compounds with industrial interest. Natural aroma compounds have been frequently prioritized by costumers and dominate a considerable market share in some regions such as Europe, and one of biotechnological routes for obtaining these compounds occurs through the biotransformation of terpenes. These substrates are naturally available compounds derived from isoprene units, and represent a relevant class of aroma compounds, which can be often obtained at relatively low costs. Limonene and ?-pinene, for instance, are available as by-products in citrus and pine industries, respectively. These monoterpenes represent ideal precursors for biotechnological production, leading to their oxygenated derivatives denominated terpenoids, some of which commercially valuable. In this perspective, fifty one endophytic fungi from Brazilian fruits, such as cashew (Anacardium occidentale L.), genipap (Genipa americana L.), sapodilla (Manilkara zapota L.) and camu-camu (Myrciaria dubia) were screened during this work. Furthermore, these fungal strains were tested in the biotransformation of limonene or ?-pinene as sole carbon source. Amongst all fungi, two strains showed noteworthy capability to biotransform ?-pinene into verbenone, key compound of rosemary (Rosmarinus officinalis) aroma. The biotechnological production of verbenone proved to be an interesting strategy with a great future potential, considering that that the concentration of this product reached approximately 200 mg/L after 288 hours of contact with the substrate ?-pinene. Moreover, from the biotransformation of limonene, one fungi produced perillyl alcohol. This important terpenoid presents protection mechanisms against cancer already investigated and recognized. The practical steps achieved in this project also involved the observation of these strains with positive results through optical microscopy, in order to verify their morphology and general characteristics / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Gláucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T05:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Molina_Gustavo_D.pdf: 62790925 bytes, checksum: aac4f7324e48e27f7a1b9fdc0102ecd7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Este trabalho de doutorado teve como principal objetivo estudar a produção biotecnológica de compostos de aroma a partir da biotransformação de terpenos, analisando potenciais biocatalisadores, processos bioquímicos diferenciados e a otimização das condições de processo envolvidas na produção destes aromas naturais para possíveis aplicações industriais. Inicialmente, o trabalho prático foi direcionado para uma série de estudos com o fungo Fusarium oxysporum 152B, visando complementar os recentes avanços alcançados pelo grupo de pesquisa na caracterização e otimização da bioconversão de R-(+)-limoneno em ?-terpineol. Desta forma, os resultados foram promissores, demonstrando o grande potencial e versatilidade deste fungo para a área, sendo que este biocatalisador foi capaz de produzir diferentes metabólitos a partir dos substratos S-(?)-limoneno, ?-pineno, ?-terpineno e linalol. Na sequência, o trabalho visou avaliar a bioconversão de S-(?)-limoneno para limoneno-1,2-diol em maiores detalhes. A produção de limoneno-1,2-diol, em condições não otimizadas, chegou a 1,2 g.L-1, sendo que foi detectada a continuação desta via metabólica quando este produto foi posteriormente metabolizado a 1-hidroxi-2- oxolimoneno, sugerindo que o fungo Fusarium oxysporum 152B possui uma via de degradação de limoneno recentemente descoberta. O trabalho prático visou também a otimização da produção de limoneno-1,2-diol por meio de uma estratégia sequencial de experimentos. Com base nas análises estatísticas, a produção deste composto a partir da bioconversão de S-(?)-limoneno pelo fungo Fusarium oxysporum 152B chegou a 3,7 g.L-1, utilizando pH 6,5, 5 g.L-1 de substrato, a 28 oC e 250 rpm de agitação. Além disso, esta foi a primeira descrição da utilização do resíduo agroindustrial conhecido como manipueira, originada ao longo do processamento da mandioca, para a produção de biomassa deste fungo, bem como uma das maiores concentrações de limoneno-1,2-diol reportadas na literatura específica. Além disso, o trabalho conduzido visou realizar uma série de comparações práticas entre a biotransformação de R-(+)-limoneno a ?-terpineol e a bioconversão de S-(?)-limoneno a limoneno-1,2-diol, pela mesma linhagem. Adicionalmente, este foi o primeiro trabalho que analisou as diferenças ultraestruturais causadas no biocatalisador ao longo do processo de bioconversão destes substratos, por meio de microscopia eletrônica de varredura e transmissão. Finalmente, foi estudada a otimização da produção de ?-terpineol, a partir da biotransformação de limoneno, utilizando o biocatalisador reconhecido como Sphingobium sp. Após o trabalho prático e análise estatística dos dados, observou-se que as melhores condições para desenvolvimento deste processo foram pH 7,0, concentração de limoneno de 350 g.L-1, agitação de 200 rpm e 28 oC. Nestas condições, a produção deste álcool monoterpênico chegou a 500 g.L-1, que pode ser considerada como a maior concentração de ?-terpineol já relatada na bibliografia de processos biotecnológicos. / Abstract: This work aimed to study the biotechnological production of aroma compounds from the biotransformation of terpenes, analyzing potential biocatalysts, biochemical processes and optimization of process conditions involved in the production of natural flavors for industrial applications. Initially, the practical work was directed to a series of studies with the fungal strain Fusarium oxysporum 152B, aiming to enhance the knowledge obtained in recent advances achieved by our research group in the characterization and optimization of the biotransformation of R-(+)-limonene into ?-terpineol. Thus, the results were promising, showing the great potential and versatility of this fungus to the specific area, and this biocatalyst was able to produce new metabolites from substrates S-(?)-limonene, ?-pinene, ?-terpinene and linalool. In the sequence, this study aimed at assessing the bioconversion of S-(?)-limonene into limonene-1,2-diol in greater detail. Thus, chapters 3, 4 and 5 were designed to a better characterization of this pathway. The production of this compound under non-optimized conditions, reached 1.2 gL-1, and the continuation of this pathway has been detected when this product was subsequently metabolized to 1-hydroxy-2-oxolimonene, suggesting that the fungus Fusarium oxysporum 152B might have a limonene degradation pathway only recently discovered. The practical work also conducted an extensive optimization of the production of limonene-1,2-diol by means of a sequential strategy. Based on statistical analyzes, the production of this compound from the bioconversion of S-(?)-limonene by the fungus Fusarium oxysporum 152B reached 3.7 gL-1, using pH 6.5, 5 gL-1 of substrate at 28 ° C and 250 rpm agitation. Moreover, this is the first description of the use of agroindustrial residue known as cassava wastewater, for the production of this fungal biomass, as well as one of the highest concentration of biotechnological limonene-1,2-diol reported in the specific literature. In addition, the research conducted aimed to perform a series of comparisons between practical conditions involved in the biotransformation of R-(+)-limonene into ?-terpineol, and the bioconversion of S-(?)-limonene into limonene-1,2-diol, for the same strain. Additionally, this is the first study that reported the ultrastructural differences along the bioconversion process of these substrates by means of scanning and transmission electron microscopy. Finally, this work evaluated the optimization of the production of ?-terpineol from the biotransformation of limonene using the biocatalyst recognized as Sphingobium sp. After the practical work and statistical analysis, it was observed that the best conditions for developing this process were pH 7.0, concentration of limonene 350 g L-1, agitation at 200 rpm and 28 oC. Accordingly, the production of the monoterpe alcohol reached 500 g.L-1, which can be considered as the highest concentration of ?-terpineol already reported in the literature for biotechnological processes. / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T09:23:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Queiros_LiviaDias_M.pdf: 1473794 bytes, checksum: 8841b5d38503f939739da3243001d1ed (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A soja atrai considerável atenção no atual cenário econômico mundial devido ao seu elevado potencial nutritivo e efeitos potencialmente benéficos à saúde humana, que são atribuídos principalmente às isoflavonas. Esta classe de fenóis heterocíclicos é conhecida por suas atividades biológicas, tais como as atividades estrogênica, antioxidante e antitumoral, sendo as formas agliconas mais ativas do que as glicosiladas. Contudo, estudos têm mostrado que a eficácia clínica das isoflavonas está relacionada com a capacidade de produção de equol, um metabólito da daidzeína que, segundo a literatura vigente, é produzido exclusivamente pela ação da microbiota intestinal. Assim, há evidências de que nem todos os indivíduos são capazes de metabolizar as isoflavonas a equol, sendo essa variabilidade atribuída às diferenças na composição da microflora intestinal, hábitos alimentares, fatores genéticos, dentre outros. Neste contexto, os produtos à base de soja são uma forma de incluir as isoflavonas na dieta, sendo que o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) é um substrato que tem se apresentado com potencial para produção de novos alimentos com apelo saudável. Desse modo, com o propósito de aumentar o conteúdo de isoflavonas bioativas e avaliar a viabilidade de um processo biotecnológico para produção de equol in vitro, neste projeto foi investigada a aplicação de culturas starters e bactérias lácticas probióticas na fermentação do EHS, aliado à ação do extrato bruto de tanase obtido a partir de Paecilomyces variotti. Além disso, também foi avaliada a biotransformação dos compostos fenólicos e atividade antioxidante do produto obtido. O teor de fenóis totais foi avaliado pelo método de Folin-Ciocalteau, a atividade antioxidante pelos métodos in vitro ORAC e de sequestro de radicais DPPH e o perfil químico dos extratos, antes e depois dos processos de biotransformação, foi avaliado por CLAE-DAD com co-injeção de padrões de isoflavonas. Após o processo fermentativo e/ou tratamento enzimático do EHS, houve um significativo aumento no teor de fenólicos totais e capacidade antioxidante, evidenciada por ambos métodos empregados (ORAC e DPPH), quando comparados com o controle do EHS sem reação. Além disso, foi verificada uma modificação no perfil polifenólico das amostras do EHS biotransformadas evidenciado por CLAE-DAD, resultando em um aumento na concentração das formas agliconas em relação às glicosiladas, bem como o aumento da concentração de equol após os processos de biotransformação propostos. Os resultados obtidos por CLAE-DAD confirmaram que o extrato de tanase de P. variotty foi capaz de biotransformar as formas glicosiladas (daidzina e genistina) das isoflavonas em suas respectivas formas agliconas (daidzeína e genisteína), indicando uma atividade diglicosídica do extrato semipurificado de tanase. Pelo que se tem conhecimento, a hidrólise de isoflavonoides glicosilados por tanase, bem como a formação de equol, é um relato inédito na literatura demonstrando que é possível desenvolver um processo in vitro para a obtenção deste composto bioativo, sem a presença de bactérias intestinais, utilizando apenas uma biotransformação enzimática / Abstract: The soy attracts considerable attention in the current global economic scenario due to their high nutritional potential and potentially beneficial effects to human health, which are mainly attributed to isoflavones. This class of heterocyclic phenols is known for its biological activities, such as estrogenic, antioxidant and antitumor activities, and the aglycone forms are more active than the glycosylated. However, studies have shown that the clinical efficacy of isoflavones is related to the capacity to produce equol, a metabolite of daidzein, which according to the current literature it is produced exclusively by the action of the gut microbiota. Thus, there is evidence that not all individuals are able to metabolize isoflavones to equol and this variability is attributed to differences in the composition of gut microflora, diet, genetic factors, among others. In this context, the soy-based products are a way to include the isoflavones in the diet, and the soymilk is a substrate that has shown the potential to produce new foodstuff with healthy appeal. Thus, in order to increase the content of bioactive isoflavones and assess the viability of a biotechnological process for in vitro production of equol, in this project was investigated the application of starters and probiotic lactic bacteria strains in the fermentation of soymilk, combined with the action of the crude extract of tannase obtained from Paecilomyces variotii. Furthermore, it was also evaluated the biotransformation of phenolic compounds and antioxidant activity of the obtained product. The total phenolic content was assessed by Folin-Ciocalteau method, the antioxidant activity by in vitro methods of ORAC and DPPH radical sequestration and the chemical profile of the extracts, before and after the processes of biotransformation, was evaluated by HPLC-DAD with co- injection of standards of isoflavones. After the fermentation process and/or enzymatic treatment of the soymilk, there was a significant increase of the total phenolic content and antioxidant capacity, as evidenced by both methods employed (ORAC and DPPH), compared with the standard soymilk. Furthermore, there was observed a change in the polyphenolic profile of biotransformed samples of soymilk, evidenced by HPLC-DAD, resulting in an increase in the concentration of the aglycones in relation to glucosides forms, as well as there was a significant increase of the concentration of equol after the biotransformation processes proposed. The results obtained by HPLC-DAD confirmed that the extract of tannase from P. variotii was able to biotransform the glucosides forms (daidzin and genistin) of isoflavones in their aglycone forms (daidzein and genistein), indicating a diglycosidase activity of the crude extract of tannase. From what is known, the hydrolysis of glucosides isoflavone by tannase, as well as the formation of equol, is an unpublished report in the literature demonstrating that it is possible to develop an in vitro method for obtaining this bioactive compound, without the presence of gut bacteria process using only an enzymatic biotransformation / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Gláucia Maria Pastore / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-26T00:10:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulino_BrunoNicolau_M.pdf: 3431534 bytes, checksum: 95854820504f050fe2c1dd2bb892df9f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A crescente demanda por processos que tenham impacto ambiental reduzido, rendimentos consideráveis e ainda custos minimizados recorrem à biotecnologia como uma ciência que pode tornar essa necessidade uma realidade. Processos biotecnológicos para a produção de compostos de interesse industrial como biocorantes, açúcares funcionais, biosurfactantes e biodiesel são uma tendência no meio científico e ganham destaque pela inovação, resultados e aplicações obtidos. O apelo comercial dos produtos biotecnológicos é outro fator que influencia as pesquisas haja vista que esses produtos são considerados naturais e tem-se comprovado que muitos deles apresentam atividades biológicas relevantes. O aroma é um importante atributo dos alimentos e pode ser produzido via biotecnológica a partir de substratos de baixo custo. A utilização de resíduos agro-industriais com alto teor nesses substratos, como por exemplo, resíduos ricos em monoterpenos são de grande interesse na biotecnologia de produção de aromas. Além disso, a utilização de micro-organismos isolados de diferentes fontes como biocatalisadores na produção desses compostos é outra perspectiva, muito explorada e ainda desafiadora. A biotransformação de monoterpenos para a produção de compostos de aroma é vantajosa quando comparada com a síntese química clássica. Contudo, alguns problemas ainda devem ser minimizados, como sensibilidade dos biocatalisadores à toxicidade dos substratos ou condições operacionais e baixos rendimentos. Assim, a seleção de novos biocatalisadores, como micro-organismos endofíticos, o uso de ferramentas de engenharia genética e a utilização de métodos estatísticos de otimização de processos são promissores e caracterizam-se como a nova vertente na área de bioaromas, contornando as desvantagens até então limitantes dos processos de biotransformação. Eles permitem em alguns casos, o aumento de escala e dessa forma a real aplicação da bioconversão microbiana na indústria. Assim, trabalhos que visem selecionar novos biocatalisadores é ainda uma necessidade e quando aliados a otimização de processos podem fornecer caminhos para que os rendimentos da bioconversão de monoterpenos sejam aumentados. Nesse contexto, o presente trabalho visou selecionar micro-organismos com potencial para a bioconversão de monoterpenos de baixo custo e presentes em grandes quantidades em resíduos agro-industriais, como 'alfa'-pineno e R-(+)-limoneno, para a produção de compostos de aroma valorizados comercialmente, S-(-)-verbenona e 'alfa'-terpineol. O capítulo 1 traz uma revisão sobre os compostos monoterpênicos, abordando suas características químico-estruturais, biossíntese e recentes aplicações terapêuticas, além do seu uso como substratos na biotecnologia de produção de compostos de aroma. O capítulo 2 é dividido em duas partes: a parte I mostra os resultados de um screening realizado com 81 linhagens de fungos isolados de diferentes fontes, entre eles, fungos endofíticos, utilizados no estudo do potencial de biotransformação de R-(+)-limoneno e 'alfa'-pineno. A parte II descreve a otimização do processo de produção de S-(-)-verbenona biotecnológica a partir de ?-pineno por uma linhagem de fungo endofítico, ainda não identificado, isolado da romã (Punica granatum). O uso de um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) de 4 variáveis proporcionou o estabelecimento de condições mais favoráveis ao processo, elevando a concentração de verbenona que era de 66 mg.L-1 para aproximadamente 108 mg.L-1 em um dos ensaios do DCCR e em torno de 98 mg.L-1 no ensaio de validação. O capítulo 3 aborda a otimização do processo biotecnológico de produção de ?-terpineol a partir de R-(+)-limoneno pela linhagem Bacillus tequilensis isolada de resíduos de processamento de frutas cítricas. Após a otimização e validação do processo nas condições consideradas ótimas através da análise de superfícies de resposta, a concentração de ?-terpineol passou de 25 mg.L-1 para 85 mg.L-1. Portanto, os resultados obtidos no trabalho mostraram um ganho de rendimento nos processos de bioconversão de substratos monoterpênicos e que a otimização de processos é uma importante ferramenta para a melhoria das condições experimentais possibilitando trabalhos futuros que envolvam aumento de escala / Abstract: The growing demand for processes that reduce environmental impacts, have high yields and costs minimized uses biotechnology as a science that can make this need into a reality. Biotechnological processes for the production of industrial interesting compounds, such as biocolorant, functional sugars, biosurfactants and biodiesel, are a trend in the scientific field and are highlighted by innovation, application and results obtained. The commercial appeal of biotechnological products is another factor that stimulates researches since these products are considered natural and has been proven that many of them presents significant biological activities. The flavor is an important attribute of food and can be produced through biotechnological processes from low-cost-substrates. The use of agro-industrial wastes with high content of these substrates, such as residues rich in monoterpenes, is of great interest in biotechnology. Furthermore, the use of micro-organisms isolated from several sources as biocatalysts in the production of flavor compounds is another well-explored and challenging perspective. The biotransformation of terpenes for aroma compounds production is advantageous when compared with chemical synthesis. However, there are still some problems that must be minimized like biocatalysts sensitivity, toxicity of substrates and low yields. Thus, the selection of new biocatalysts, such as endophytic micro-organisms, use of genetic engineering and statistical methods for optimization of processes are promising and characterize a new perspective in bioaromas field. Thereby, works that search for new biocatalysts are necessary and associated with optimization processes can improve the monoterpenes bioconvertion. In this context, the objective of this work was the screening and selection of micro-organisms that are able to realize the biotransformation of low cost monoterpenes, 'alfa'-pinene and limonene, into high-value aroma compounds, such as verbenone and 'alfa-terpineol. The chapter 1 presents a current review on monoterpenes, showing their chemical characteristics, biosynthesis and recent therapeutic applications, besides their potential use as substrates for bioflavor production. The chapter 2 is divides in two parts: the first one shows the results of the screening of 81 strains of fungi isolated from several sources, including endophytic strains, for biotransformation of limonene and ?-pinene. The second part describes the optimization process for biotechnological verbenone production from "alfa'-pinene by a non-indentified fungal strain, isolated from pomegranate (Punica granatum). The use of a central composite rotatable design (CCRD) of 4 variables provided the optimal conditions for this process, increasing the verbenone concentration from 66 mg.L-1 to 108 mg.L-1 in one of the CCRD assays and 98 mg.L-1 after validation. The chapter 3 also shows an optimization study, in this case using limonene as substrate and the product obtained was ?-terpineol. The biocatalyst used was a bacterial strain, identified as Bacillus tequilensis, isolated from citrus fruit processing waste. After the optimization and validation in the best conditions obtained through the surface response analysis, the concentration of ?-terpineol reached was 85 mg.L-1. Therefore, the results obtained in this work show an improve of the yields in the biotransformation of both monoterpenic substrates and that optimization of processes is an important tool for the progress of future works involving scale-up studies / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:45:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes_DanielleBranta_D.pdf: 3780152 bytes, checksum: ba7b4a54629ff27a24abae14e788d60c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os aromas despertam grande interesse entre consumidores e indústrias de alimentos, especialmente por estarem diretamente relacionados ao sabor dos alimentos. Dentre os aromas de maior importância industrial destaca-se o grupo das lactonas, presentes em uma grande variedade de produtos naturais e compostos biologicamente ativos. Em virtude do destaque apresentado por essa classe de substâncias, diversos métodos para sua produção têm sido relatados. Como alternativa aos processos químicos tradicionais, propõe-se nesta pesquisa a utilização da biotecnologia de micro-organismos e enzimas para a produção de compostos aromáticos a partir de substratos naturais, como óleos vegetais hidrolisados.A fermentação microbiana é considerada um caminho potencial para a produção de aromas naturais, sendo o grupo formado pelos fungos um dos mais utilizados para esse fim. A biocatálise também é uma alternativa muito vantajosa e capaz de catalisar um grande número de reações estéreo- e regiosseletivas, o que não é alcançado por meio de síntese química clássica. O uso de enzimas isoladas torna-se preferível em relação ao uso de micro-organismos quando existem limitações relacionadas à permeabilidade do substrato na membrana da célula ou quando ocorrem reações secundárias indesejáveis.Considerando-se os argumentos citados, neste trabalho foram estudados dois métodos para a produção de lactonas. O primeiro deles, a biotransformação, foi feita a partir do uso de micro-organismos para a produção dos compostos em questão. O segundo método, a biocatálise, foi realizado através da reação de lactonização com o uso de lipases microbianas brutas isoladas e liofilizadas. Os substratos utilizados no estudo foram os óleos vegetais de mamona e linhaça previamente hidrolisados por lipases fúngicas produzidas por Rhizopus sp. e Geotrichum sp. A produção de lactonas foi alcançada em ambos os métodos. Com o uso da biotransformação, todos os micro-organismos testados (Geotrichum sp., Rhizopus sp., Aspergillus sp. (Linhagens 1068 e 1099) e Fusarium oxysporum) foram capazes de produzir diferentes tipos de lactonas, com destaque para o fungo Fusarium oxysporum, que produziu maior variedade delas (&61543;-decalactona, 2-cumaranona, mevalonolactona e pantolactona), além de alcançar o maior rendimento na produção de &61543;-decalactona (18,93 &956;L L-1), após 48 horas de reação e empregando-se os óleos de mamona e linhaça previamente hidrolisados pela lipase produzida pelo fungo Rhizopus sp.. Através do uso da biocatálise, ótimos resultados também foram alcançados, e a produção de lactonas foi possível ao se utilizar as lipases produzidas pelos fungos Rhizopus sp., Aspergillus sp. (Linhagem 1068) e Fusarium oxysporum, sendo possível a produção de &61543;-undecalactona, &61543;-decalactona e &61543;-dodecalactona, dependendo da lipase empregada e do tempo de reação. A maior produtividade foi obtida na produção de &61543;-undecalactona ao se utilizar a lipase produzida pelo fungo Rhizopus sp. após 24 horas de reação, obtendo-se um rendimento de 21,78 &956;L L-1, também a partir do uso dos óleos de mamona e linhaça hidrolisados previamente pela lipase produzida por Rhizopus sp. As lipases produzidas pelos fungos Geotrichum sp. e Aspergillus sp. (Linhagem 1099), também estudadas neste trabalho, não foram capazes de produzir lactonas / Abstract: Aromas arouse great interest among consumers and food industry, especially because heir direct relationship with food taste. In the midst of the most important industrial flavorings stands lactones group, which are present in a wide variety of natural products and biologically active compounds. Due to the prominence of this class of substances, several methods for the production of lactones have been reported. As an alternative to traditional chemical processes, it is proposed in this research the use of microbial and enzyme biotechnology for the production of aromatic compounds natural substrates, such as hydrolyzed vegetable oils. The microbial fermentation is considered a potential pathway for the production of natural flavor, and fungi group is the most widely used for this purpose. Biocatalysis is also a very useful alternative and is able to catalyze a large number of stereo- and regioive reactions, which is not achieved by classical chemical synthesis. The use of isolated enzymes is preferable over the use of microorganisms when there are limitations concerning the permeability of the substrate in the cell membrane or when undesired side reactions occur. Considering these arguments, two methods were investigated in this work for the production of lactones. The first one, biotransformation, was made the use of microorganisms for the production of these compounds. The second method, biocatalysis, was performed by lactonization reaction using crude microbial lipases that was isolated and lyophilized. Substrates used were the vegetable castor and linseed oils previously hydrolyzed by fungal lipases produced by Rhizopus sp. and Geotrichum sp. Lactones production was achieved in both methods. Using biotransformation, all microorganisms tested (Geotrichum sp., Rhizopus sp., Aspergillus sp. (Strains 1068 and 1099) and Fusarium oxysporum) were able to produce different lactone types, especially using the fungus Fusarium oxysporum, which produced a greater variety (&61543;-decalactone, 2-cumaranone, mevalonolactone and pantolactone), achieving the best performance in y-x decalactone production (18.93 &956;L L-1), after 48 h employing castor and linseed oils hydrolyzed by lipase Rhizopus sp. Through the biocatalysis use, excellent results were also obtained, and the lactones production was possible using lipases produced by fungi Rhizopus sp., Aspergillus sp. (Strain 1068) and Fusarium oxysporum. The production of y-undecalactone, y-decalactone and y-dodecalactone was achieved depending on the lipase employed and the reaction time used. Highest yield was obtained in the &61543;-undecalactone production (21.78 &956;L L-1), using castor and linseed oils hydrolyzed by Rhizopus sp. lipase. Lipases produced by Geotrichum sp. and Aspergillus sp. (Strain 1099) was also studied in this work, but were unable to produce lactones / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutora em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-20T21:21:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_LiviaRosas_M.pdf: 6389418 bytes, checksum: 474ea71f0f4b85a4fb59fa346c31f972 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20), conhecida como tanase, é uma enzima com habilidade de atuar em ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis e também foi descrita como capaz de hidrolisar polifenóis como ácido clorogênico, epicatequina galato e epigalocatequina galato. Os polifenóis, ou compostos fenólicos, estão distribuídos em uma ampla variedade de fontes vegetais e estão relacionados à prevenção de câncer e doenças cardiovasculares. No entanto, os polifenóis ocorrem frequentemente como glicosídeos ou outros conjugados, o que pode comprometer a biodisponibilidade e os efeitos benéficos destes compostos à saúde, sendo necessária a biotransformação destes conjugados no trato gastrointestinal. Como alternativa tecnológica, a biotransformação enzimática dos polifenóis ou de suas fontes vegetais também pode liberar estes compostos de seus conjugados e consequentemente, melhorar a atividade funcional de tais antioxidantes. O objetivo do presente trabalho foi estudar a especificidade do extrato semipurificado de tanase de Paecilomyces variotii frente a diferentes padrões comerciais de polifenóis e avaliar sua atuação na matriz alimentar suco de laranja quanto a modificações em características físico-químicas, perfil fenólico e atividade antioxidante. O estudo da especificidade do extrato semipurificado de tanase foi realizado por CLAE-DAD e ESI-MS e o suco de laranja foi avaliado quanto aos parâmetros acidez total titulável, sólidos totais, pH, teor de vitamina C e fenólicos totais. As alterações no perfil fenólico do suco de laranja foram avaliadas por CLAE-DAD e a atividade antioxidante pelos métodos in vitro ORAC e de sequestro de radicais DPPH. Os resultados obtidos por CLAE-DAD e ESI-MS mostraram que não houve hidrólise dos padrões ácido clorogênico, ácido ferúlico, ácido elágico, resveratrol, quercetina e hesperetina pelo extrato semipurificado de tanase nas condições empregadas para o teste. No entanto, foi observado a hidrólise da ligação entre a aglicona e o dissacarídeo dos flavonoides rutina, naringina e hesperidina, gerando respectivamente os produtos quercetina, naringenina e hesperetina, e indicando uma atividade diglicosídica do extrato semipurificado de tanase. Para o suco de laranja, os resultados de acidez titulável, pH, sólidos solúveis e vitamina C não apresentaram diferença significativa após o tratamento enzimático do suco com extrato semipurificado de tanase, no entanto, houve um aumento de 16,8% no teor de fenólicos totais. Além disso, foi verificada uma modificação no perfil polifenólico do suco de laranja obtido por CLAE-DAD, resultando em um aumento na atividade antioxidante do suco biotransformado em aproximadamente 50% pelo método ORAC e 70% pelo método DPPH. Os padrões comerciais hesperidina e naringina biotransformados pelo extrato semipurificado de tanase também apresentaram maior atividade antioxidante do que o controle sem reação. Pelo que se tem conhecimento, a hidrólise de flavonoides glicosilados por tanase é um relato inédito na literatura e, portanto este trabalho fornece novos substratos para o extrato semipurificado de tanase de P. variotii e confirma que a biotransformação é uma boa estratégia para melhorar a atividade antioxidante in vitro de polifenóis e de suco de laranja / Abstract: Tannin acyl hydrolases (EC 3.1.1.20), commonly named as tannases, are enzymes able to act on ester and depside bonds of hydrolysable tannins and have also been described to hydrolyse polyphenols such as chlorogenic acid, epicatechin gallate and epigallocatechin gallate. Polyphenols, or phenolic compounds, are widely distributed in the plant kingdom and are related to the prevention of cancer and cardiovascular diseases. However, polyphenols are often found as glycosides or other conjugates, which may affect their bioavailability and health benefits, being necessary the biotransformation of these compounds in the gastrointestinal tract. As a technological alternative, the enzymatic biotransformation of the polyphenols or their plant sources can also release these compounds from their conjugates and therefore improve the functional activity of these antioxidants. The objectives of the present study were to investigate the specificity of the crude extract of tannase from Paecilomyces variotii in reaction with differents comercial standards of phenolic compounds and to evaluate the effects on the physico-chemical properties, phenolic profile and antioxidant activity of the orange juice reacted with the crude extract of tannase. The specificity study of the crude extract of tannase was performed by HPLC-DAD and ESI-MS. The orange juice was subject to analysis of titratable acidity, pH, and total solids, vitamin C and total phenolics contents. Furthermore, changes in the phenolic profile of orange juice were analyzed by HPLC-DAD and the antioxidant capacity of the samples was tested by in vitro DPPH and ORAC assays. The results obtained by HPLC-DAD and ESI-MS did not show hydrolysis of the standards chlorogenic acid, ferulic acid, ellagic acid, resveratrol, quercetin and hesperetin at test conditions. However, the crude extract of tannase was able to hydrolyse the glucosidic bond between disaccharide and aglycone of the flavonoids rutin, hesperidin and naringin, yielding as products quercetin, hesperetin and naringenin, respectively, and indicating a diglycosidase activity of the crude extract of tannase. For orange juice, the results of acidity, pH, soluble solids and vitamin C showed no significant difference after enzymatic treatment with the crude extract of tannase, but there was an increase of 16.8% in total phenolic content. In addition, there was an extensive modification in the polyphenolic profile from the biotransformed orange juice obtained by HPLC-DAD, which resulted about 50% and 70% increase in orange juice antioxidant activity by ORAC and DPPH methods, respectively. The standards hesperidin and naringin biotransformed by crude extract of tannase also showed higher antioxidant activities than the control. To the best of our known, this is the first report about tannase which could hydrolyze flavonoid glycosides and, therefore this work provides new substrates for crude extract of tannase from P. variotii and confirms that biotransformation is a good strategy to improve in vitro antioxidant activity of polyphenols and orange juice / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestra em Ciência de Alimentos