O presente estudo avaliou a influência das concentrações de ácidos graxos não esterificados (AGNE Alto vs. Baixo) no dia 44±3 pós-parto, e dos dias pós-parto nas concentrações de metabólitos (ǰ-hidroxibutirato e glicose) e na qualidade oocitária e produção in vitro de embriões de vacas Holandesas no início da lactação (até 90 dias pós-parto). O experimento foi realizado na Fazenda Santa Rita (Agrindus S/A) localizada no município de Descalvado SP. A partir da data do parto foram selecionadas 30 vacas Holandesas para serem aspiradas a cada 14 dias em cinco diferentes momentos no início da lactação (30±3, 44±3, 58±3, 72±3 e 86±3 dias pós-parto). No momento da aspiração folicular (OPU), foram realizadas as colheitas de sangue para dosagem dos metabólitos, a avaliação do escore de condição corporal (ECC) e a contagem dos folículos visualizados. Os procedimentos de produção in vitro de embriões (maturação, fertilização e cultivo) foram realizados no laboratório da Bioembryo, localizado no município de Bauru - SP. A análise estatística foi realizada pelo procedimento GLM do SAS. Não se observou efeito de tratamento (Alto AGNE = 0,45 vs. Baixo AGNE = 0,52 mmol/L; P=0,20) e de tempo (30±3 = 0,54; 44±3 = 0,43; 58±3 = 0,43; 72±3 = 0,52 e 86±3 = 0,51 mmol/L; P=0,11) para as concentrações de β-hidroxibutirato. Para as concentrações de glicose não se verificou efeito do tratamento (Alto AGNE = 61,1 vs. Baixo AGNE = 63,6 mg/dL; P=0,26). No entanto, observou-se efeito de tempo para as concentrações de glicose (30±3 = 60,1; 44±3 = 63,0; 58±3 = 63,5; 72±3 = 62,1 e 86±3 = 63,0 mg/dL; P=0,03). O tratamento (Alto vs. Baixo AGNE) não influenciou a quantidade de folículos recrutados (P=0,36), oócitos totais recuperados (P=0,28) e oócitos viáveis (P=0,25). Assim como o tempo não alterou a quantidade de folículos recrutados (P=0,87), oócitos totais recuperados (P=0,42) e oócitos viáveis (P=0,44). A quantidade de oócitos grau I não foi influenciada pelo tratamento (Alto vs. Baixo AGNE; P=0,14). Porém, os dias pós-parto reduziram a sua quantidade (P=0,05). A quantidade de oócitos clivados por vaca aspirada (P=0,45) e a taxa de clivagem (P=0,95) não apresentaram diferenças estatísticas conforme as concentrações de AGNE (Alto vs. Baixo) no dia 44 pós-parto. Os dias pós-parto também não alteraram a quantidade de oócitos clivados por vaca aspirada (P=0,31) e a taxa de clivagem (P=0,80). Para a produção in vitro de embriões, a quantidade de blastocisto por vaca aspirada conforme as concentrações de AGNE (Alto = 0,4 vs. Baixo = 1,2; P=0,37) e os dias pós-parto (30±3 = 0,4; 44±3 = 0,7; 58±3 = 0,8; 72±3 = 0,9 e 86±3 = 1,2; P=0,39) não apresentaram diferenças estatísticas. Assim como, a taxa de blastocisto para os animais dos grupos (Alto AGNE = 6,2% vs. Baixo AGNE = 11,6%; P=0,51) e para os diferentes momentos pós-parto (30±3 = 4,8%; 44±3 = 8,9%; 58±3 = 10,7%; 72±3 = 10,0% e 86±3 = 12,8%; P=0,41). Conclui-se que a maior concentração de AGNE no dia 44 pós-parto em vacas Holandesas não influenciou as concentrações de β-hidroxibutirato e de glicose, assim como a qualidade e a produção in vitro de embriões. No entanto, o aumento dos dias pós-parto incrementou as concentrações de glicose e reduziu a quantidade de oócitos grau I de vacas holandesas submetidas à OPU/PIV até 90 dias após o parto. / The present study evaluated the influence of the days postpartum and the concentrations of non-esterified fatty acids (NEFA - High vs. Low) on concentrations of metabolites (β-hydroxybutyrate and glucose), oocyte quality and in vitro embryo production of Holstein cows during early lactation (90 days postpartum). The experiment was carried out in a commercial dairy farm (Santa Rita - Agrindus S/A), located at Descalvado - SP. At the calving moment, 30 Holstein cows were selected to be submitted to ovum pick-up (OPU) procedures each 14 days, in 5 different moments during the early lactation (30 ± 3, 44 ± 3, 58 ± 3, 72 ± 3 and 86 ± 3 days postpartum). Previously to the OPU session blood samples were collected for metabolite assay, body condition score (BCS) was recorded and the number of follicles able to be aspirated was also registered. The High and Low concentration of NEFA were stablished with the samples of day 44 ± 3 postpartum. The laboratory procedures for in vitro embryo production (in vitro maturation, fertilization and culture) were performed in the same laboratory (Bioembryo, Bauru - SP). Statistical analysis was performed by the GLM procedure of SAS. No effect was observed for different NEFA concentrations (High NEFA = 0.45 vs. Low NEFA = 0.52 mmol / L, P = 0.20), nor for days postpartum (30±3 = 0.54; 44±3 = 0.43; 58±3 = 0.43; 72±3 = 0.52 e 86±3 = 0.51 mmol/L; P=0.11) on β-hydroxybutyrate concentrations. Considering glucose concentrations there was no treatment effect (High NEFA = 61.1 vs. Low NEFA = 63.6 mg / dL, P = 0.26). However, the glucose concentrations were influenced by days postpartum (30±3 = 60.1; 44±3 = 63.0; 58±3 = 63.5; 72±3 = 62.1 e 86±3 = 63.0 mg/dL; P=0.03). Treatment (High vs. Low NEFA) did not impact the number of recruited follicles (P = 0.36), total oocytes recovered (P = 0.28) and viable oocytes (P = .25). As well as, time did not alter the amount of recruited follicles (P = 0.87), total oocytes recovered (P = 0.42) and viable oocytes (P = .44). The amount of grade I oocytes was not influenced by treatment (High NEFA vs. Low NEFA, P = 0.14). However, days postpartum reduced the quantity of grade I oocytes (P = 0.05). Also, no treatment effect (High and Low NEFA) was observed for number of cleaved oocytes per OPU session (P = 0.45) and cleavage rate (P = 0.95). In the same way, days postpartum had no influence in the amount of cleaved oocytes per OPU session (P = 0.31) and cleavage rate (P = 0.80). In addition, for the in vitro embryo production, the NEFA concentrations (High NEFA = 0.4 vs. Low NEFA = 1.2, P = 0.37) and days postpartum (30±3 = 0.4; 44±3 = 0.7; 58±3 = 0.8; 72±3 = 0.9 e 86±3 = 1.2; P=0.39) did not affect the number of blastocysts per OPU session. Also, the blastocyst rate was not influenced by treatment (High NEFA = 6.2% vs. Low NEFA = 11.6%, P = 0.51) and days postpartum (30±3 = 4.8%; 44±3 = 8.9%; 58±3 = 10.7%; 72±3 = 10.0% e 86±3 = 12.8%; P=0.41). It was concluded that high concentration of NEFA on day 44 postpartum in Holstein cows did not alter the concentrations of β- hydroxybutyrate and glucose, as well as, the oocyte quality and in vitro embryo production. However, the increase in days postpartum elevated the glucose concentrations and decreased the number of grade I oocytes of Holstein cows submitted to OPU and in vitro embryo production up to 90 days postpartum.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-05-04T12:12:28Z No. of bitstreams: 1 Pabola Santos Nascimento.pdf: 865543 bytes, checksum: 47ce2118a4d55e4ada483756d00b9ae6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-04T12:12:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pabola Santos Nascimento.pdf: 865543 bytes, checksum: 47ce2118a4d55e4ada483756d00b9ae6 (MD5) Previous issue date: 2014-08-28 / The use of sexed semen for in vitro embryo production (IVP) is a potentially effective means for obtaining the progeny with predetermined sex. For years, animal owners wanted a methodology that pre determine the sex of offspring for their herds. Rates of cleavage, morula and blastocyst seem to be affected not only by the damages caused by sexing, but it is believed that the bull factor, and other aspects that have not been fully elucidated, directly influencing its successful use. The aim of this study was to evaluate the influence of type of semen (sexed /conventional) and a bull factor over blastocyst rates when submitting bovine oocytes obtained from slaughterhouse to IVP, and also compare these results with analyzes of sperm kinetics. Oocytes (n = 959) were matured, fertilized with sexed and non-sexed semen from three 5/8 Girolando bulls. A straw of each type of semen was assessed with use of "computer-assisted semen analysis" (CASA) and fluorescence microscopy. Three replicates were performed during the experiment. Data were analyzed by SPSS 16.0 statistical program employing analysis of variance (ANOVA). The Student t test was used to detect differences between groups. The Chi-square test was used to analyze the results of embryo production. For all analyzes, values were considered significant (P <0.05). The results differed between sexed (21.10%) and non-sexed semen (31.06%) to blastocysts production. We conclude that in the present work sexed semen was less efficient in producing blastocyst when comparing non-sexed semen of the same bulls and when comparing semen types (sexed and non-sexed) from the same bull. Analyses of sperm kinetics and fluorescent probes were compatible with the fertilizing potential of samples of sexed and non-sexed semen of 5/8 Girolando bulls. / O uso de sêmen sexado em conjunto com a produção in vitro (PIV) de embriões é um meio potencialmente eficiente na obtenção da descendência com sexo predeterminado. Há anos, os proprietários dos animais desejaram uma metodologia que pré determinasse o sexo da prole para seus rebanhos. As taxas de clivagem, mórula e blastocisto parecem ser afetadas não só pela debilitação provocada na sexagem, mas acredita-se que pelo reprodutor em questão, e por outros fatores que não foram ainda totalmente elucidados, influenciando diretamente na sua utilização com sucesso. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influencia do tipo de sêmen (sexado/convencional) e do touro, nas taxas de blastocisto na PIV de oócitos bovinos obtidos em matadouro, e ainda comparar esses resultados com as análises da cinética espermática. Oócitos (N= 959) foram maturados, fertilizados com sêmen sexado e convencional de três touros da raça 5/8 Girolando. Uma palheta de cada tipo de sêmen foi avaliada com uso da “computer-assisted sêmen analysis” (CASA) e da microscopia de fluorescência. Foram realizadas três repetições durante o experimento. Os dados foram analisados pelo programa estatístico SPSS 16.0 empregando-se a análise de variância (ANOVA). O teste t-Student foi usado para detectar diferenças entre os grupos. O Qui-quadrado foi utilizado para análise dos resultados da produção de embriões. Para todas as análises, os valores foram considerados significativos (P< 0,05). Os resultados diferiram entre o sêmen convencional (31,06) e sexado (21,10%) para produção de blastocisto. Quando comparamos a produção de blastocisto individualmente nas amostras de sêmen sexado (27,69%; 17,93% e 25,56%, touros 1, 2 e 3 respectivamente) percebemos que T2 < T1 e T1=T3 e T2=T3. Concluimos que no presente trabalho o sêmen sexado foi menos eficiente na produção de blastocisto quando comparado ao sêmen convencional de forma geral e do mesmo touro. As análises da cinética espermática bem como as sondas fluorescentes foram compatíveis com o potencial fertilizante das amostras de sêmen sexado e convencional em touros da raça 5/8 Girolando.

O presente estudo avaliou a influência das concentrações de ácidos graxos não esterificados (AGNE Alto vs. Baixo) no dia 44±3 pós-parto, e dos dias pós-parto nas concentrações de metabólitos (&#496;-hidroxibutirato e glicose) e na qualidade oocitária e produção in vitro de embriões de vacas Holandesas no início da lactação (até 90 dias pós-parto). O experimento foi realizado na Fazenda Santa Rita (Agrindus S/A) localizada no município de Descalvado SP. A partir da data do parto foram selecionadas 30 vacas Holandesas para serem aspiradas a cada 14 dias em cinco diferentes momentos no início da lactação (30±3, 44±3, 58±3, 72±3 e 86±3 dias pós-parto). No momento da aspiração folicular (OPU), foram realizadas as colheitas de sangue para dosagem dos metabólitos, a avaliação do escore de condição corporal (ECC) e a contagem dos folículos visualizados. Os procedimentos de produção in vitro de embriões (maturação, fertilização e cultivo) foram realizados no laboratório da Bioembryo, localizado no município de Bauru - SP. A análise estatística foi realizada pelo procedimento GLM do SAS. Não se observou efeito de tratamento (Alto AGNE = 0,45 vs. Baixo AGNE = 0,52 mmol/L; P=0,20) e de tempo (30±3 = 0,54; 44±3 = 0,43; 58±3 = 0,43; 72±3 = 0,52 e 86±3 = 0,51 mmol/L; P=0,11) para as concentrações de &#946;-hidroxibutirato. Para as concentrações de glicose não se verificou efeito do tratamento (Alto AGNE = 61,1 vs. Baixo AGNE = 63,6 mg/dL; P=0,26). No entanto, observou-se efeito de tempo para as concentrações de glicose (30±3 = 60,1; 44±3 = 63,0; 58±3 = 63,5; 72±3 = 62,1 e 86±3 = 63,0 mg/dL; P=0,03). O tratamento (Alto vs. Baixo AGNE) não influenciou a quantidade de folículos recrutados (P=0,36), oócitos totais recuperados (P=0,28) e oócitos viáveis (P=0,25). Assim como o tempo não alterou a quantidade de folículos recrutados (P=0,87), oócitos totais recuperados (P=0,42) e oócitos viáveis (P=0,44). A quantidade de oócitos grau I não foi influenciada pelo tratamento (Alto vs. Baixo AGNE; P=0,14). Porém, os dias pós-parto reduziram a sua quantidade (P=0,05). A quantidade de oócitos clivados por vaca aspirada (P=0,45) e a taxa de clivagem (P=0,95) não apresentaram diferenças estatísticas conforme as concentrações de AGNE (Alto vs. Baixo) no dia 44 pós-parto. Os dias pós-parto também não alteraram a quantidade de oócitos clivados por vaca aspirada (P=0,31) e a taxa de clivagem (P=0,80). Para a produção in vitro de embriões, a quantidade de blastocisto por vaca aspirada conforme as concentrações de AGNE (Alto = 0,4 vs. Baixo = 1,2; P=0,37) e os dias pós-parto (30±3 = 0,4; 44±3 = 0,7; 58±3 = 0,8; 72±3 = 0,9 e 86±3 = 1,2; P=0,39) não apresentaram diferenças estatísticas. Assim como, a taxa de blastocisto para os animais dos grupos (Alto AGNE = 6,2% vs. Baixo AGNE = 11,6%; P=0,51) e para os diferentes momentos pós-parto (30±3 = 4,8%; 44±3 = 8,9%; 58±3 = 10,7%; 72±3 = 10,0% e 86±3 = 12,8%; P=0,41). Conclui-se que a maior concentração de AGNE no dia 44 pós-parto em vacas Holandesas não influenciou as concentrações de &#946;-hidroxibutirato e de glicose, assim como a qualidade e a produção in vitro de embriões. No entanto, o aumento dos dias pós-parto incrementou as concentrações de glicose e reduziu a quantidade de oócitos grau I de vacas holandesas submetidas à OPU/PIV até 90 dias após o parto. / The present study evaluated the influence of the days postpartum and the concentrations of non-esterified fatty acids (NEFA - High vs. Low) on concentrations of metabolites (&#946;-hydroxybutyrate and glucose), oocyte quality and in vitro embryo production of Holstein cows during early lactation (90 days postpartum). The experiment was carried out in a commercial dairy farm (Santa Rita - Agrindus S/A), located at Descalvado - SP. At the calving moment, 30 Holstein cows were selected to be submitted to ovum pick-up (OPU) procedures each 14 days, in 5 different moments during the early lactation (30 ± 3, 44 ± 3, 58 ± 3, 72 ± 3 and 86 ± 3 days postpartum). Previously to the OPU session blood samples were collected for metabolite assay, body condition score (BCS) was recorded and the number of follicles able to be aspirated was also registered. The High and Low concentration of NEFA were stablished with the samples of day 44 ± 3 postpartum. The laboratory procedures for in vitro embryo production (in vitro maturation, fertilization and culture) were performed in the same laboratory (Bioembryo, Bauru - SP). Statistical analysis was performed by the GLM procedure of SAS. No effect was observed for different NEFA concentrations (High NEFA = 0.45 vs. Low NEFA = 0.52 mmol / L, P = 0.20), nor for days postpartum (30±3 = 0.54; 44±3 = 0.43; 58±3 = 0.43; 72±3 = 0.52 e 86±3 = 0.51 mmol/L; P=0.11) on &#946;-hydroxybutyrate concentrations. Considering glucose concentrations there was no treatment effect (High NEFA = 61.1 vs. Low NEFA = 63.6 mg / dL, P = 0.26). However, the glucose concentrations were influenced by days postpartum (30±3 = 60.1; 44±3 = 63.0; 58±3 = 63.5; 72±3 = 62.1 e 86±3 = 63.0 mg/dL; P=0.03). Treatment (High vs. Low NEFA) did not impact the number of recruited follicles (P = 0.36), total oocytes recovered (P = 0.28) and viable oocytes (P = .25). As well as, time did not alter the amount of recruited follicles (P = 0.87), total oocytes recovered (P = 0.42) and viable oocytes (P = .44). The amount of grade I oocytes was not influenced by treatment (High NEFA vs. Low NEFA, P = 0.14). However, days postpartum reduced the quantity of grade I oocytes (P = 0.05). Also, no treatment effect (High and Low NEFA) was observed for number of cleaved oocytes per OPU session (P = 0.45) and cleavage rate (P = 0.95). In the same way, days postpartum had no influence in the amount of cleaved oocytes per OPU session (P = 0.31) and cleavage rate (P = 0.80). In addition, for the in vitro embryo production, the NEFA concentrations (High NEFA = 0.4 vs. Low NEFA = 1.2, P = 0.37) and days postpartum (30±3 = 0.4; 44±3 = 0.7; 58±3 = 0.8; 72±3 = 0.9 e 86±3 = 1.2; P=0.39) did not affect the number of blastocysts per OPU session. Also, the blastocyst rate was not influenced by treatment (High NEFA = 6.2% vs. Low NEFA = 11.6%, P = 0.51) and days postpartum (30±3 = 4.8%; 44±3 = 8.9%; 58±3 = 10.7%; 72±3 = 10.0% e 86±3 = 12.8%; P=0.41). It was concluded that high concentration of NEFA on day 44 postpartum in Holstein cows did not alter the concentrations of &#946;- hydroxybutyrate and glucose, as well as, the oocyte quality and in vitro embryo production. However, the increase in days postpartum elevated the glucose concentrations and decreased the number of grade I oocytes of Holstein cows submitted to OPU and in vitro embryo production up to 90 days postpartum.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-09-16T11:53:05Z No. of bitstreams: 1 ribrioivantavarespereirabatista.pdf: 1023205 bytes, checksum: 9149da7ed1e431e5565e4816dc74a814 (MD5) / Approved for entry into archive by Diamantino Mayra (mayra.diamantino@ufjf.edu.br) on 2016-09-26T20:21:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ribrioivantavarespereirabatista.pdf: 1023205 bytes, checksum: 9149da7ed1e431e5565e4816dc74a814 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-26T20:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ribrioivantavarespereirabatista.pdf: 1023205 bytes, checksum: 9149da7ed1e431e5565e4816dc74a814 (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A suplementação do ácido linoléico conjugado trans-10, cis-10 no meio de cultivo, representa uma importante alternativa para aumento da sobrevivência dos embriões após a criopreservação. No entanto este isômero de CLA no cultivo in vitro sem antioxidante pode aumentar a taxa apoptótica. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da adição CLA trans-10, cis-12 no cultivo in vitro de embriões sem antioxidante. Zigotos bovinos (n = 1.694) foram divididos em dois tratamentos: (T1) grupo controle, zigotos cultivados no meio CR2aa suplementado com soro fetal (n = 815); (T2) zigotos cultivados no meio CR2aa suplementado com soro fetal mais 100 µM CLA trans-10, cis-12. Os embriões foram avaliados quanto a desenvolvimento, quantidade de lípides e criotolerância. Transcritos dos RNA mensageiros (RNAm) dos genes selecionados foram mensurados pelo Real Time PCR. Suplementação de CLA trans-10, cis-12 não afeta significativamente a taxa de blastocisto (31,8% e 34,1% T1 e T2, respectivamente, p = 0,20) e nível dos RNAm dos genes relacionados com stress celular, apoptose e síntese de novo de ácido graxo. Quantidade de lípides e transcritos do RNAm do gene 1-acilglicerol-3-fosfato oaciltransferase 1 enzima relacionado a síntese de triglicérides foram significativamente reduzidos nos embriões cultivados na presença de CLA trans-10, cis-12 em comparação com o grupo controle. Teve aumento significativo na taxa de re-expansão dos blastocistos cultivados na presença de CLA trans-10, cis-12, após o descongelamento (34.4 e 56.3% para T1 e T2, respectivamente p = 0,002). Essa diferença não persistiu na taxa de eclosão (14,0% e 16,5% para T1 e T2, respectivamente, P = 0,62). Esses resultados mostram que o CLA trans-10, cis-12 reduz o acúmulo de lípides nos embriões pela redução nos níveis dos transcritos do gene 1-acilglicerol-3-fosfato o-aciltransferase 1 sem afetar a qualidade do embrião. Adicionalmente, este ácido graxo aumenta a taxa de re-expansão, no entanto, não melhora a taxa de eclosão. / Supplementation of conjugated linoleic acid trans-10, cis-10 in the culture medium, represents an important alternative to increasing the survival of embryos after cryopreservation. However the addition of culture media with CLA trans-10, cis-12 without antioxidant may increase the apoptotic rate. The aim of this study was to evaluate the effect of adding CLA trans-10, cis-12 in vitro culture of embryos without antioxidant. Bovine zygotes (n = 1,694) were divided into two treatments: (T1) control group, zygotes cultured in CR2aa medium supplemented with fetal calf serum (n = 815), (T2) zygotes cultured in CR2aa medium supplemented with fetal calf serum plus 100 µM CLA trans-10, cis-12. Embryos were evaluated for development, amount of lipids and cryotolerance. Transcripts of messenger RNA (mRNA) of selected genes were measured by real time PCR. Supplementation of CLA trans-10, cis-12 did not significantly affect the blastocyst rate (31.8% and 34.1% T1 and T2, respectively, p = 0,20) and the mRNA level of genes related to cell stress, apoptosis and de novo synthesis of fatty acid . Lipids and transcripts of the mRNA of the gene 1-acilglicerol-3-phosphate o-acyltransferase 1 enzyme related to the synthesis of triglycerides were significantly reduced in embryos cultured in the presence of CLA trans-10, cis-12 in comparison the control group. Had increased rate re-expansion of blastocysts cultured in the presence of CLA trans-10, cis-12, after thawing (34.4 and 56.3% for T1 and T2, respectively p = 0,002). This difference did not persist in the hatching rate (14.0 and 16.5% for T1 and T2, respectively, P = 0,62). These results show that the CLA trans-10, cis-12 reduces the accumulation of lipids in the embryos by reducing the levels of gene transcripts acilglicerol-1-3-phosphate oacyltransferase 1 without affecting the quality of the embryo. Additionally, this fatty acid increases the rate re-expansion, but does not improve the hatching rate.

Embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) apresentam diferenças quando comparados aos produzidos in vivo. Esta particularidade reduz as taxas de viabilidade in vitro e in vivo após a criopreservação, limitando o emprego comercial da preservação dos embriões PIV. Várias estratégias vêm sendo propostas para aumentar a viabilidade e desenvolvimento desses embriões criopreservados. Alguns estudos utilizam a exposição dos embriões a um estresse subletal, como a alta pressão hidrostática (HHP), previamente a procedimentos que reduzem a viabilidade embrionária, o que aumenta a tolerância desses indivíduos à criopreservação. Os objetivos deste experimento foram determinar as taxas de viabilidade de blastocistos bovinos PIV previamente expostos à alta pressão gasosa (HGP) de 27,5 MPa por 120 min e após submetidos à congelação ou vitrificação. A avaliação da viabilidade foi mediante determinação das taxas de re-expansão e eclosão após criopreservação.Oócitos morfologicamente viáveis obtidos a partir de ovários de frigorífico foram maturados in vitro durante 24 h a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2 com umidade relativa do ar saturada e fecundados (dia 0) com sêmen criopreservado capacitado in vitro Após 20 h, os presuntivos zigotos foram submetidos a cultivo in vitro em meio SOF condicionado a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2, 5% O2 e 90% N2, com umidade relativa do ar saturada. Os blastocistos (dia 7) foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: expostos à HGP e congelados, PC; controle congelação, CC; expostos à HGP e vitrificados, PV; controle vitrificação, CV. Os embriões foram expostos ou não à HGP de 27,5 MPa por 120 min e em seguida colocados em cultivo por 120 min. Após esse período os blastocistos foram submetidos à congelação ou à vitrificação. A taxa de re-expansão dos blastocistos avaliada em 24 h do grupo CV (59,6%) foi maior que a dos embriões dos grupos CC (45,2%) e PC (46,3%) (P<0,05), mas não diferiu da taxa de re-expansão dos embriões do grupo PV (48,1%). As taxas de eclosão foram: PC, 21,5%; CC, 24,6%; PV, 35,3%; CV, 30,8%. Os blastocistos do grupo PV apresentaram maiores taxas de eclosão do que os embriões do grupo PC. Em conclusão, o tratamento com HGP não interferiu no desenvolvimento in vitro dos blastocistos que foram submetidos à congelação ou à vitrificação. Levando em consideração os blastocistos eclodidos sobre o total de re-expandidos, o tratamento com HGP incrementou a taxa de eclosão in vitro dos embriões que foram submetidos à vitrificação. / In vitro bovine embryos (IVP) present differences when compared to those produced in vivo. This particularity reduces in vitro and in vivo survival rates after cryopreservation, limiting the commercial use of IVP embryos preservation. Several strategies have been proposed to increase viability and development of these cryopreserved embryos. Some studies use embryo exposure to sublethal stress prior to in vitro procedures, such as high hydrostatic pressure (HHP), which increases tolerance of these individuals to a new stressor, such as cryopreservation. Objectives of this experiment were to determine viability rates of bovine blastocysts produced in vitro previously exposed to high gaseous pressure (HGP) of 27.5 MPa for 120 minutes and after subjected to freezing or vitrification. Morphologically viable oocytes obtained from bovine ovaries were matured in vitro for 24 hours at 38.5°C in 5% CO2 atmosphere with saturated air humidity and in vitro fertilized (day 0) with cryopreserved semen (inseminating dose 1x106 / ml) After 20 hours, presumptive zygotes were cultured in vitro at 38.5°C in an atmosphere of 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 with saturated air humidity. Blastocysts obtained on day 7 were divided into 4 groups: exposed to HGP and frozen (FP); freezing control (FC); exposed to HGP and vitrified (VP); vitrification control (VC). These groups were exposed or not to 27.5 MPa HGP for 120 minutes then in vitro cultured for more 120 min. After this period, blastocysts were subjected to freezing or vitrification. Re-expansion rate was higher (P<0.05) for CV (59,6%) compared to CC (45,2%) and CV (46,3%), not differing from PV (48,1%). Blastocysts from group VP presented higher hatching rates than embryos from group FP (P<0.05) (35,3% vs. 21,5%, respectively). In conclusion, exposure of blastocysts to HGP before vitrification or conventional freezing did not interfered on in vitro embryo survival rates. However, considering hatched blastocysts over the total re-expanded, HGP increased hatching rates of vitrified embryos.

Embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) apresentam diferenças quando comparados aos produzidos in vivo. Esta particularidade reduz as taxas de viabilidade in vitro e in vivo após a criopreservação, limitando o emprego comercial da preservação dos embriões PIV. Várias estratégias vêm sendo propostas para aumentar a viabilidade e desenvolvimento desses embriões criopreservados. Alguns estudos utilizam a exposição dos embriões a um estresse subletal, como a alta pressão hidrostática (HHP), previamente a procedimentos que reduzem a viabilidade embrionária, o que aumenta a tolerância desses indivíduos à criopreservação. Os objetivos deste experimento foram determinar as taxas de viabilidade de blastocistos bovinos PIV previamente expostos à alta pressão gasosa (HGP) de 27,5 MPa por 120 min e após submetidos à congelação ou vitrificação. A avaliação da viabilidade foi mediante determinação das taxas de re-expansão e eclosão após criopreservação.Oócitos morfologicamente viáveis obtidos a partir de ovários de frigorífico foram maturados in vitro durante 24 h a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2 com umidade relativa do ar saturada e fecundados (dia 0) com sêmen criopreservado capacitado in vitro Após 20 h, os presuntivos zigotos foram submetidos a cultivo in vitro em meio SOF condicionado a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2, 5% O2 e 90% N2, com umidade relativa do ar saturada. Os blastocistos (dia 7) foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: expostos à HGP e congelados, PC; controle congelação, CC; expostos à HGP e vitrificados, PV; controle vitrificação, CV. Os embriões foram expostos ou não à HGP de 27,5 MPa por 120 min e em seguida colocados em cultivo por 120 min. Após esse período os blastocistos foram submetidos à congelação ou à vitrificação. A taxa de re-expansão dos blastocistos avaliada em 24 h do grupo CV (59,6%) foi maior que a dos embriões dos grupos CC (45,2%) e PC (46,3%) (P<0,05), mas não diferiu da taxa de re-expansão dos embriões do grupo PV (48,1%). As taxas de eclosão foram: PC, 21,5%; CC, 24,6%; PV, 35,3%; CV, 30,8%. Os blastocistos do grupo PV apresentaram maiores taxas de eclosão do que os embriões do grupo PC. Em conclusão, o tratamento com HGP não interferiu no desenvolvimento in vitro dos blastocistos que foram submetidos à congelação ou à vitrificação. Levando em consideração os blastocistos eclodidos sobre o total de re-expandidos, o tratamento com HGP incrementou a taxa de eclosão in vitro dos embriões que foram submetidos à vitrificação. / In vitro bovine embryos (IVP) present differences when compared to those produced in vivo. This particularity reduces in vitro and in vivo survival rates after cryopreservation, limiting the commercial use of IVP embryos preservation. Several strategies have been proposed to increase viability and development of these cryopreserved embryos. Some studies use embryo exposure to sublethal stress prior to in vitro procedures, such as high hydrostatic pressure (HHP), which increases tolerance of these individuals to a new stressor, such as cryopreservation. Objectives of this experiment were to determine viability rates of bovine blastocysts produced in vitro previously exposed to high gaseous pressure (HGP) of 27.5 MPa for 120 minutes and after subjected to freezing or vitrification. Morphologically viable oocytes obtained from bovine ovaries were matured in vitro for 24 hours at 38.5°C in 5% CO2 atmosphere with saturated air humidity and in vitro fertilized (day 0) with cryopreserved semen (inseminating dose 1x106 / ml) After 20 hours, presumptive zygotes were cultured in vitro at 38.5°C in an atmosphere of 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 with saturated air humidity. Blastocysts obtained on day 7 were divided into 4 groups: exposed to HGP and frozen (FP); freezing control (FC); exposed to HGP and vitrified (VP); vitrification control (VC). These groups were exposed or not to 27.5 MPa HGP for 120 minutes then in vitro cultured for more 120 min. After this period, blastocysts were subjected to freezing or vitrification. Re-expansion rate was higher (P<0.05) for CV (59,6%) compared to CC (45,2%) and CV (46,3%), not differing from PV (48,1%). Blastocysts from group VP presented higher hatching rates than embryos from group FP (P<0.05) (35,3% vs. 21,5%, respectively). In conclusion, exposure of blastocysts to HGP before vitrification or conventional freezing did not interfered on in vitro embryo survival rates. However, considering hatched blastocysts over the total re-expanded, HGP increased hatching rates of vitrified embryos.

Embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) apresentam diferenças quando comparados aos produzidos in vivo. Esta particularidade reduz as taxas de viabilidade in vitro e in vivo após a criopreservação, limitando o emprego comercial da preservação dos embriões PIV. Várias estratégias vêm sendo propostas para aumentar a viabilidade e desenvolvimento desses embriões criopreservados. Alguns estudos utilizam a exposição dos embriões a um estresse subletal, como a alta pressão hidrostática (HHP), previamente a procedimentos que reduzem a viabilidade embrionária, o que aumenta a tolerância desses indivíduos à criopreservação. Os objetivos deste experimento foram determinar as taxas de viabilidade de blastocistos bovinos PIV previamente expostos à alta pressão gasosa (HGP) de 27,5 MPa por 120 min e após submetidos à congelação ou vitrificação. A avaliação da viabilidade foi mediante determinação das taxas de re-expansão e eclosão após criopreservação.Oócitos morfologicamente viáveis obtidos a partir de ovários de frigorífico foram maturados in vitro durante 24 h a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2 com umidade relativa do ar saturada e fecundados (dia 0) com sêmen criopreservado capacitado in vitro Após 20 h, os presuntivos zigotos foram submetidos a cultivo in vitro em meio SOF condicionado a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2, 5% O2 e 90% N2, com umidade relativa do ar saturada. Os blastocistos (dia 7) foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: expostos à HGP e congelados, PC; controle congelação, CC; expostos à HGP e vitrificados, PV; controle vitrificação, CV. Os embriões foram expostos ou não à HGP de 27,5 MPa por 120 min e em seguida colocados em cultivo por 120 min. Após esse período os blastocistos foram submetidos à congelação ou à vitrificação. A taxa de re-expansão dos blastocistos avaliada em 24 h do grupo CV (59,6%) foi maior que a dos embriões dos grupos CC (45,2%) e PC (46,3%) (P<0,05), mas não diferiu da taxa de re-expansão dos embriões do grupo PV (48,1%). As taxas de eclosão foram: PC, 21,5%; CC, 24,6%; PV, 35,3%; CV, 30,8%. Os blastocistos do grupo PV apresentaram maiores taxas de eclosão do que os embriões do grupo PC. Em conclusão, o tratamento com HGP não interferiu no desenvolvimento in vitro dos blastocistos que foram submetidos à congelação ou à vitrificação. Levando em consideração os blastocistos eclodidos sobre o total de re-expandidos, o tratamento com HGP incrementou a taxa de eclosão in vitro dos embriões que foram submetidos à vitrificação. / In vitro bovine embryos (IVP) present differences when compared to those produced in vivo. This particularity reduces in vitro and in vivo survival rates after cryopreservation, limiting the commercial use of IVP embryos preservation. Several strategies have been proposed to increase viability and development of these cryopreserved embryos. Some studies use embryo exposure to sublethal stress prior to in vitro procedures, such as high hydrostatic pressure (HHP), which increases tolerance of these individuals to a new stressor, such as cryopreservation. Objectives of this experiment were to determine viability rates of bovine blastocysts produced in vitro previously exposed to high gaseous pressure (HGP) of 27.5 MPa for 120 minutes and after subjected to freezing or vitrification. Morphologically viable oocytes obtained from bovine ovaries were matured in vitro for 24 hours at 38.5°C in 5% CO2 atmosphere with saturated air humidity and in vitro fertilized (day 0) with cryopreserved semen (inseminating dose 1x106 / ml) After 20 hours, presumptive zygotes were cultured in vitro at 38.5°C in an atmosphere of 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 with saturated air humidity. Blastocysts obtained on day 7 were divided into 4 groups: exposed to HGP and frozen (FP); freezing control (FC); exposed to HGP and vitrified (VP); vitrification control (VC). These groups were exposed or not to 27.5 MPa HGP for 120 minutes then in vitro cultured for more 120 min. After this period, blastocysts were subjected to freezing or vitrification. Re-expansion rate was higher (P<0.05) for CV (59,6%) compared to CC (45,2%) and CV (46,3%), not differing from PV (48,1%). Blastocysts from group VP presented higher hatching rates than embryos from group FP (P<0.05) (35,3% vs. 21,5%, respectively). In conclusion, exposure of blastocysts to HGP before vitrification or conventional freezing did not interfered on in vitro embryo survival rates. However, considering hatched blastocysts over the total re-expanded, HGP increased hatching rates of vitrified embryos.

Experimentos anteriores realizados em nosso laboratório indicam que o sucesso gestacional é afetado pela poluição atmosférica. O presente estudo teve como objetivo avaliar os efeitos biológicos associados a uma curva dose resposta das partículas de exaustão do diesel (PED) sobre o desenvolvimento embrionário inicial e o potencial de implantação, utilizando-se como modelo a fertilização in vitro e o cultivo embrionário de camundongos. No Experimento 1, encontrou-se um efeito negativo dose-dependente sobre o desenvolvimento embrionário inicial, o processo de eclosão, a alocação das células e a morfologia da massa celular interna (MCI) dos blastocistos. A análise post-hoc revelou que o desenvolvimento precoce do embrião não foi afetado pelas concentrações de 0,2 µg/cm2 ou 2 µg/cm2, mas foi significativamente afetado pela concentração de 20 µg/cm2 de PED. O processo de eclosão foi prejudicado pelas concentrações de 2 µg/cm2 e 20 µg/cm2. A alocação das células da MCI e a relação entre as células da MCI e do trofectoderma foram significativamente afetadas por todas as concentrações. Adicionalmente, observou-se um efeito negativo sobre a morfologia da MCI para as concentrações de 2 µg/cm2 e 20 µg/cm2. O Experimento 2, apesar de não mostrar efeito significativo sobre o potencial de implantação, evidenciado pela capacidade de adesão dos blastocistos e crescimento trofoblástico, revelou que a morfologia da MCI no dia 8 de cultivo, as taxas de viabilidade e de apoptose celular e a expressão de Oct4 e Cdx2 foram significativamente afetadas. O teste HSD-Tukey demonstrou que a presença de PED (0,2 µg/cm2 e 2 µg/cm2) durante o desenvolvimento embrionário aumentou significativamente a taxa de células em apoptose dos embriões tanto no dia 5 quanto no dia 8 de cultivo e, embora a proporção de células viáveis no dia 8 tenha sido prejudicada por ambas as concentrações, apenas a exposição a 2 µg/cm2 de PED diminuiu a viabilidade celular no dia 5. Por outro lado, tanto a concentração de 0,2 µg/cm2 como a de 2 µg/cm2 tiveram um efeito negativo significativo sobre a qualidade da MCI no dia 8 e a taxa de expressão de Oct4 nos blastocistos e aumentaram a porcentagem de células desses blastocistos expressando Cdx2, adicionalmente, a razão Oct4/Cdx2 dos embriões expostos a 0,2 µg/cm2 e 2 µg/cm2 foi significativamente menor. Frente a esses resultados, presumi-se que as PED poderiam estar envolvidas nos mecanismos que levariam à diminuição do sucesso reprodutivo observado em camundongos expostos à poluição atmosférica ambiental / Previous experiments conducted in our laboratory demonstrate that successful pregnancy is affected by air pollution. The aim of this study was to evaluate the biological effects associated with a dose-response curve of the diesel exhaust particles (DEP) on early embryonic development and implantation potential, using mice in vitro fertilization and culture embryo as model. In Experiment 1, we found a negative dose-dependent effect on the embryonic development, hatching process, cell allocation and morphology of inner cell mass (ICM) of blastocysts. A post-hoc analysis revealed that the early development of the embryo was not affected by concentrations of 0.2 g/cm2 or 2g/cm2, but was significantly affected by the concentration of 20 g/cm2 of DEP. The hatching process was impaired by concentrations of 2 g/cm2 and 20 g/cm2. Cell allocation of ICM and the ratio between cells of ICM and trophectoderm were significantly affected by all concentrations. Addicionaly, we observed a negative effect on ICM morphology was observed for the 2 µg/cm2 and the 20 µg/cm2 concentrations. Experiment 2, despite showing no significant effect on implantation potential, as evidenced by the adhesion ability and trophoblast outgrowth, revealed that ICM morphology on day 8 of culture, rates of cell viability and apoptosis, and expression of Oct4 and Cdx2 were significantly affected. The Tukey HSD test showed that presence of DEP (0.2 g/cm2 and 2 g/cm2) during embryonic development increased significantly the rate of apoptotic cells in embryos as on day 5 as on day 8 of culture, although the proportion of viable cells on day 8 was impaired by both concentrations, only exposure to 2 g/cm2 PED decreased cell viability on day 5. On the other hand, both the concentration of 0.2 g/cm2 such as 2 g/cm2 had a significant negative effect on the quality of ICM on the day 8 and the rate of expression of Oct4 on blastocysts, and increased the percentage of cells from these embryos expressing Cdx2, also, Oct4/Cdx2 ratio were significantly lower in the blastocysts derived from embryos exposed to 0.2 g/cm2 and 2 g/cm2¬ concentrations. Given these results, the suggestion is that DEP could be involved in the mechanisms that lead to decreased reproductive success observed in mice exposed to environmental pollution

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição pré-concepcional de curta duração às partículas de exaustão do diesel (PED) e à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana, o desenvolvimento embrionário inicial e resultado gestacional utilizando um modelo experimental e um epidemiológico. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar os efeitos de dois meios de cultura comerciais no desenvolvimento de oócitos de camundongo fertilizados in vitro até o estágio de blastocisto. Zigotos obtidos de fêmeas de camundongo de 8 semanas de idade submetidas à indução da ovulação foram cultivados in vitro até o estágio de blastocisto em meio simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) ou meio G1/G2. A porcentagem de zigotos que se desenvolveu até o estágio de blastocisto 96 e 120 horas após a inseminação e que sofreu eclosão parcial ou completa no quinto dia de cultivo foi significativamente maior no grupo KSOM. O número médio de células da massa celular interna (MCI) foi 11,7 ± 4,0 e 9,2 ± 5,2 para os zigotos cultivados nos grupos KSOM e G1/G2, respectivamente, mostrando um número significativamente maior de células MCI em blastocistos derivados da cultura no meio KSOM. Concluímos que o meio KSOM comercialmente disponível é superior ao meio seqüencial G1/G2 para o cultivo de zigotos até o estágio de blastocisto no modelo de fertilização in vitro (FIV) em camundongos. No segundo projeto que compõe esta tese, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição de curta duração às PED sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais utilizando o modelo de FIV em camundongo. A instilação intranasal de água destilada (grupo controle), de PED nativas (grupo PED-N) ou de PED ácidoextraídas (grupo PED-AE), realizada uma vez ao dia por três dias, iniciada no primeiro dia de administração de gonadotrofinas, foi realizada em fêmeas de camundongo com oito semanas de idade. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a resposta ovariana a estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e trofoectoderma (TE), e a morfologia da MCI. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariado para a exposição às PED-N e PED-AE na coloração diferencial de blastocistos e na morfologia da MCI, mas não para a FIV ou desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular da MCI e a razão MCI/TE em blastocistos produzidos no grupo controle foram significativamente maiores do que em blastocistos produzidos nos grupos PED-N e PED-AE. O número total de células dos blastocistos foi similar entre os grupos. O escore que representa a morfologia da massa celular interna foi significativamente maior no grupo controle quando comparado àquele encontrado nos grupos PED-N e PEDAE. Baseando-se nesses resultados, nosso estudo sugere que a exposição de curta duração às PED pode afetar negativamente o processo reprodutivo através do distúrbio da especificação das linhagens celulares do embrião em estágio de blastocisto. Finalmente, a exposição a toxinas ambientais pode ser inevitável durante o período pré-concepcional em grandes centros urbanos e seus efeitos são desconhecidos. Portanto, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi avaliar os potenciais efeitos da exposição de curta duração à poluição ambiental particulada durante a fase folicular sobre os resultados clínicos, laboratoriais e gestacionais de casais submetidos à fertilização in vitro e transferência de embriões (FIVETE). Trezentos e quarenta e oito mulheres submetidas ao seu primeiro ciclo de FIVETE foram avaliadas retrospectivamente neste estudo coorte, casocontrole casado. A exposição ao material particulado ambiental (MP) durante a fase folicular de cada paciente foi estimada baseando-se em dados da poluição ambiental (1997-2006) categorizados em período Q1-3 ( 56,72 g/m3) e Q4 (>56,72 g/m3). Desse grupo, 177 pacientes que engravidaram (casos) foram comparadas com 354 mulheres que conceberam espontaneamente (controles). Os principais pontos de avaliação incluíram a resposta ovariana às gonadotrofinas, o número de oócitos recuperados e as taxas de fertilização, de clivagem, de qualidade embrionária, de implantação, de gestação, de abortamento e de nascidos vivos. Nenhum efeito da exposição a níveis elevados de MP durante a fase folicular foi observado nos resultados clínico e laboratorial, na transferência embrionária ou no sucesso dos ciclos de tratamento das pacientes submetidas à FIVETE. Mulheres expostas ao período Q4 durante a fase folicular do ciclo de concepção apresentaram um risco significativamente maior de abortamento, independentemente do método de concepção (razão de chance: 2,58; intervalo de confiança de 95%: 1,63 4,07), quando comparado àquele de mulheres expostas ao período Q1-3. O risco de perda da gestação aumentou 3% por unidade de aumento do valor médio do MP na fase folicular (p= 0,000). Os resultados apresentados aqui fornecem evidências para uma relação causal entre a breve exposição a níveis elevados de MP ambiente durante o período pré-concepcional e a perda gestacional inicial, independentemente do método de concepção e está associada a um aumento de 2,6 vezes no risco de abortamento. Apesar da ausência de efeitos dessa exposição sobre os resultados clínicos e laboratoriais e sobre o sucesso do tratamento, a FIVETE foi incapaz de reduzir esse risco / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of short-term preconceptional exposure to diesel exhaust particles and particulate air pollution on ovarian function, early embryo development and pregnancy outcome using experimental and epidemiological models. The objective of the first project was to examine the effects of two commercial media on the development of mouse ova fertilized in vitro to the blastocyst stage. One-cell embryos obtained from eight-week old superovulated mice were cultured in vitro up to the blastocyst stage in potassium-enriched simplex optimized medium (KSOM) or G1/G2 media. The percentage of zygotes that developed to the blastocyst stage 96 and 120 hours after insemination and that partially or completely hatched by day five of culture was significantly higher in the KSOM group. The mean number of inner cell mass (ICM) cells was 11.7 ± 4.0 and 9.2 ± 5.2 for zygotes cultured in KSOM and G1/G2 groups respectively, revealing a significantly higher cell number in the ICM of blastocysts derived from culture in KSOM medium. I concluded that commercially available KSOM medium is superior to sequential G1/G2 media for culturing one-cell embryos up to the blastocyst stage in the mouse IVF model. In the second project the objective was to evaluate the effects of short-term exposure to diesel exhaust particles on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the mouse IVF model. Intranasal instillation of distilled water (control group), native diesel exhaust particles (N-DEP group) or acid-extracted diesel exhaust particles (AE-DEP) once a day, for three days starting on the first day of gonadotrophin administration was performed on eight-week old female mice. Reproductive endpoints evaluated included ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and trophectoderm (TE), and ICM morphology. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for exposure to NDEP and AE-DEP on blastocyst differential staining and ICM morphology but not on IVF or embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the control group were significantly higher than in blastocysts produced in N-DEP and AE-DEP groups. The total cell count was similar among groups. The score that represents ICM morphology was significantly higher in the control group when compared to that found in N-DEP and AE-DEP groups. Based on these results this study suggests that short-term exposure to DEP may negatively affect the reproductive process by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, exposure to environmental toxins may be unavoidable during the preconceptional period in large urban centers and its effects are unknown. Thus, the purpose of the third project was to assess the potential effects of short-term exposure to particulate air pollution during the follicular phase on clinical, laboratory, and pregnancy outcomes for couples undergoing IVF/ET. Three hundred forty-eight patients undergoing their first IVF/ET cycle were evaluated in this retrospective cohort-matched casecontrolled single-center study. Exposure to ambient particulate matter (PM) during the follicular phase for each patient was estimated based on air pollution data (1997-2006) categorized in Q1-3 ( 56.72 g/m3) and Q4 (>56.72 g/m3) periods. From this group 177 women who became pregnant (cases) were compared with 354 who had conceived spontaneously (controls). Main outcome measures included response to gonadotrophins, number of oocytes retrieved, fertilization, cleavage, embryo quality, implantation, pregnancy, miscarriage, and live birth rates. No effects of follicular phase exposure to high levels of PM on clinical, laboratory, embryo transfer or treatment outcome were found in women undergoing IVF/ET. Women exposed to Q4 level PM during the follicular phase of the conception cycle had significantly higher risk of miscarriage, regardless of the method of conception (odds ratio, 2.58; 95% confidence interval: 1.63-4.07) when compared to women exposed to Q1-3 level PM. The risk of miscarriage increased 3% per unit increase in follicular phase PM average level (p=0.000). The results presented here provide evidence of a causal role for brief exposure to high levels of ambient PM during the preconceptional period in early pregnancy loss, regardless of the method of conception, with a 2.6-fold increase in risk of miscarriage. Despite the absence of effects of this exposure on clinical, laboratory, and treatment outcome, IVF/ET was unable to reduce this risk

Um Projeto Temático de Pesquisa foi desenvolvido no Laboratório de Poluição Ambiental do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com o objetivo de avaliar os efeitos da exposição aguda/crônica ao ar ambiente de um grande centro urbano sobre a saúde. Dentro deste projeto, uma linha de pesquisa foi dedicada ao estudo dos efeitos dessa exposição sobre a saúde reprodutiva feminina. Evidências de estudos epidemiológicos e experimentais implicam os fatores ambientais na infertilidade humana e resultado obstétrico adverso. Contudo, poucos estudos foram conduzidos até o presente para avaliar um possível efeito da exposição à poluição ambiental particulada sobre a saúde reprodutiva feminina. Portanto, o objetivo dos projetos da minha linha de pesquisa é fornecer dados que possam demonstrar os possíveis efeitos da exposição pré-concepcional de curta duração às partículas de exaustão do diesel (PED) e à poluição ambiental particulada sobre a função ovariana, o desenvolvimento embrionário inicial e resultado gestacional utilizando um modelo experimental e um epidemiológico. O objetivo do primeiro projeto desta tese foi avaliar os efeitos de dois meios de cultura comerciais no desenvolvimento de oócitos de camundongo fertilizados in vitro até o estágio de blastocisto. Zigotos obtidos de fêmeas de camundongo de 8 semanas de idade submetidas à indução da ovulação foram cultivados in vitro até o estágio de blastocisto em meio simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) ou meio G1/G2. A porcentagem de zigotos que se desenvolveu até o estágio de blastocisto 96 e 120 horas após a inseminação e que sofreu eclosão parcial ou completa no quinto dia de cultivo foi significativamente maior no grupo KSOM. O número médio de células da massa celular interna (MCI) foi 11,7 ± 4,0 e 9,2 ± 5,2 para os zigotos cultivados nos grupos KSOM e G1/G2, respectivamente, mostrando um número significativamente maior de células MCI em blastocistos derivados da cultura no meio KSOM. Concluímos que o meio KSOM comercialmente disponível é superior ao meio seqüencial G1/G2 para o cultivo de zigotos até o estágio de blastocisto no modelo de fertilização in vitro (FIV) em camundongos. No segundo projeto que compõe esta tese, o objetivo foi avaliar os efeitos da exposição de curta duração às PED sobre a fertilização, desenvolvimento embrionário e segregação das linhagens celulares em blastocistos pré-implantacionais utilizando o modelo de FIV em camundongo. A instilação intranasal de água destilada (grupo controle), de PED nativas (grupo PED-N) ou de PED ácidoextraídas (grupo PED-AE), realizada uma vez ao dia por três dias, iniciada no primeiro dia de administração de gonadotrofinas, foi realizada em fêmeas de camundongo com oito semanas de idade. Os pontos de avaliação reprodutivos analisados incluíram a resposta ovariana a estimulação, taxa de fertilização, desenvolvimento embrionário, taxas de formação e de eclosão dos blastocistos, contagem celular total e proporção da alocação celular à MCI e trofoectoderma (TE), e a morfologia da MCI. A resposta ovariana não foi afetada pelo protocolo de exposição. Um efeito multivariado para a exposição às PED-N e PED-AE na coloração diferencial de blastocistos e na morfologia da MCI, mas não para a FIV ou desenvolvimento embrionário, foi observado. A contagem celular da MCI e a razão MCI/TE em blastocistos produzidos no grupo controle foram significativamente maiores do que em blastocistos produzidos nos grupos PED-N e PED-AE. O número total de células dos blastocistos foi similar entre os grupos. O escore que representa a morfologia da massa celular interna foi significativamente maior no grupo controle quando comparado àquele encontrado nos grupos PED-N e PEDAE. Baseando-se nesses resultados, nosso estudo sugere que a exposição de curta duração às PED pode afetar negativamente o processo reprodutivo através do distúrbio da especificação das linhagens celulares do embrião em estágio de blastocisto. Finalmente, a exposição a toxinas ambientais pode ser inevitável durante o período pré-concepcional em grandes centros urbanos e seus efeitos são desconhecidos. Portanto, o propósito do terceiro projeto que compõe esta tese foi avaliar os potenciais efeitos da exposição de curta duração à poluição ambiental particulada durante a fase folicular sobre os resultados clínicos, laboratoriais e gestacionais de casais submetidos à fertilização in vitro e transferência de embriões (FIVETE). Trezentos e quarenta e oito mulheres submetidas ao seu primeiro ciclo de FIVETE foram avaliadas retrospectivamente neste estudo coorte, casocontrole casado. A exposição ao material particulado ambiental (MP) durante a fase folicular de cada paciente foi estimada baseando-se em dados da poluição ambiental (1997-2006) categorizados em período Q1-3 ( 56,72 g/m3) e Q4 (>56,72 g/m3). Desse grupo, 177 pacientes que engravidaram (casos) foram comparadas com 354 mulheres que conceberam espontaneamente (controles). Os principais pontos de avaliação incluíram a resposta ovariana às gonadotrofinas, o número de oócitos recuperados e as taxas de fertilização, de clivagem, de qualidade embrionária, de implantação, de gestação, de abortamento e de nascidos vivos. Nenhum efeito da exposição a níveis elevados de MP durante a fase folicular foi observado nos resultados clínico e laboratorial, na transferência embrionária ou no sucesso dos ciclos de tratamento das pacientes submetidas à FIVETE. Mulheres expostas ao período Q4 durante a fase folicular do ciclo de concepção apresentaram um risco significativamente maior de abortamento, independentemente do método de concepção (razão de chance: 2,58; intervalo de confiança de 95%: 1,63 4,07), quando comparado àquele de mulheres expostas ao período Q1-3. O risco de perda da gestação aumentou 3% por unidade de aumento do valor médio do MP na fase folicular (p= 0,000). Os resultados apresentados aqui fornecem evidências para uma relação causal entre a breve exposição a níveis elevados de MP ambiente durante o período pré-concepcional e a perda gestacional inicial, independentemente do método de concepção e está associada a um aumento de 2,6 vezes no risco de abortamento. Apesar da ausência de efeitos dessa exposição sobre os resultados clínicos e laboratoriais e sobre o sucesso do tratamento, a FIVETE foi incapaz de reduzir esse risco / A thematic research project to evaluate the health effects of acute/chronic exposure to ambient air in a large urban center was developed at the Air Pollution Laboratory in the Department of Pathology at the University of São Paulo School of Medicine. Within this project a specific research line was committed to the study of the effects of this exposure on female reproductive health. Evidence from epidemiological and experimental studies implied environmental factors as possible contributors to human infertility and poor obstetric outcome. However, very few studies evaluating a possible effect of exposure to particulate air pollution on female reproductive health have been conducted so far. Thus, the aim of the projects in my research line was to provide data that could show the possible effects of short-term preconceptional exposure to diesel exhaust particles and particulate air pollution on ovarian function, early embryo development and pregnancy outcome using experimental and epidemiological models. The objective of the first project was to examine the effects of two commercial media on the development of mouse ova fertilized in vitro to the blastocyst stage. One-cell embryos obtained from eight-week old superovulated mice were cultured in vitro up to the blastocyst stage in potassium-enriched simplex optimized medium (KSOM) or G1/G2 media. The percentage of zygotes that developed to the blastocyst stage 96 and 120 hours after insemination and that partially or completely hatched by day five of culture was significantly higher in the KSOM group. The mean number of inner cell mass (ICM) cells was 11.7 ± 4.0 and 9.2 ± 5.2 for zygotes cultured in KSOM and G1/G2 groups respectively, revealing a significantly higher cell number in the ICM of blastocysts derived from culture in KSOM medium. I concluded that commercially available KSOM medium is superior to sequential G1/G2 media for culturing one-cell embryos up to the blastocyst stage in the mouse IVF model. In the second project the objective was to evaluate the effects of short-term exposure to diesel exhaust particles on fertilization, embryo development, and cell lineage segregation in preimplantation blastocysts using the mouse IVF model. Intranasal instillation of distilled water (control group), native diesel exhaust particles (N-DEP group) or acid-extracted diesel exhaust particles (AE-DEP) once a day, for three days starting on the first day of gonadotrophin administration was performed on eight-week old female mice. Reproductive endpoints evaluated included ovarian response to superovulation, fertilization rate, embryo development, blastocyst and hatching rates, total cell count, and proportion of cell allocation to ICM and trophectoderm (TE), and ICM morphology. Ovarian response was not affected by the exposure protocol. A multivariate effect for exposure to NDEP and AE-DEP on blastocyst differential staining and ICM morphology but not on IVF or embryo development was found. Cell counts in ICM and ICM/TE ratios in blastocysts produced in the control group were significantly higher than in blastocysts produced in N-DEP and AE-DEP groups. The total cell count was similar among groups. The score that represents ICM morphology was significantly higher in the control group when compared to that found in N-DEP and AE-DEP groups. Based on these results this study suggests that short-term exposure to DEP may negatively affect the reproductive process by disrupting the lineage specification at the blastocyst stage. Finally, exposure to environmental toxins may be unavoidable during the preconceptional period in large urban centers and its effects are unknown. Thus, the purpose of the third project was to assess the potential effects of short-term exposure to particulate air pollution during the follicular phase on clinical, laboratory, and pregnancy outcomes for couples undergoing IVF/ET. Three hundred forty-eight patients undergoing their first IVF/ET cycle were evaluated in this retrospective cohort-matched casecontrolled single-center study. Exposure to ambient particulate matter (PM) during the follicular phase for each patient was estimated based on air pollution data (1997-2006) categorized in Q1-3 ( 56.72 g/m3) and Q4 (>56.72 g/m3) periods. From this group 177 women who became pregnant (cases) were compared with 354 who had conceived spontaneously (controls). Main outcome measures included response to gonadotrophins, number of oocytes retrieved, fertilization, cleavage, embryo quality, implantation, pregnancy, miscarriage, and live birth rates. No effects of follicular phase exposure to high levels of PM on clinical, laboratory, embryo transfer or treatment outcome were found in women undergoing IVF/ET. Women exposed to Q4 level PM during the follicular phase of the conception cycle had significantly higher risk of miscarriage, regardless of the method of conception (odds ratio, 2.58; 95% confidence interval: 1.63-4.07) when compared to women exposed to Q1-3 level PM. The risk of miscarriage increased 3% per unit increase in follicular phase PM average level (p=0.000). The results presented here provide evidence of a causal role for brief exposure to high levels of ambient PM during the preconceptional period in early pregnancy loss, regardless of the method of conception, with a 2.6-fold increase in risk of miscarriage. Despite the absence of effects of this exposure on clinical, laboratory, and treatment outcome, IVF/ET was unable to reduce this risk