Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-12-16T11:19:46Z No. of bitstreams: 1 michelemunkpereira.pdf: 1917144 bytes, checksum: 6ea13cf025292a61936d375b8b3710e2 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-12-16T11:29:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 michelemunkpereira.pdf: 1917144 bytes, checksum: 6ea13cf025292a61936d375b8b3710e2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-16T11:29:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 michelemunkpereira.pdf: 1917144 bytes, checksum: 6ea13cf025292a61936d375b8b3710e2 (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A maturação in vitro de oócitos é um processo importante para a produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito da interação do soro e tensão de oxigênio na maturação in vitro, sobre a maturação nuclear, viabilidade das células do cumulus, abundância de transcritos oocitários, desenvolvimento pré-implantacional e apoptose embrionária. Foram utilizados quatro grupos experimentais: G1 (10% soro de vaca no cio [SVC] em 20% de O2); G2 (0,1% álcool polivinílico [PVA] em 20% de O2), G3 (10% SVC em 5% de O2) e G4 (0.1% PVA em 5% O2). A proporção de oócitos em metáfase II, viabilidade das células do cumulus, taxa de blastocistos e número total de células não foi afetado (P>0,05) quando o soro foi substituído por PVA em 5% de O2, enquanto a taxa de blastocistos e número total de células foi maior (P<0.05) no grupo com soro comparado com PVA, ambos em 20% O2. O índice apoptótico foi menor em blastocistos produzidos a partir de oócitos maturados com PVA em 5% de O2 (G4) em relação aos de outros grupos (G1, G2 e G3), mas não foi encontrada diferença (P>0,05) na taxa de maturação, viabilidade das células do cumulus e de blastocistos. Foram encontradas diferenças (P<0,05) na quantidade de transcritos específicos em oócitos maturados sobre as diferentes condições. Conclui-se que a presença de soro durante a maturação é importante para o desenvolvimento embrionário em tensão de 20% de O2, e a suplementação com PVA em 5% de O2 fornece o melhor ambiente de maturação para os oócitos, resultando em blastocistos com baixo índice apoptótico. / In vitro maturation is an important step for in vitro embryo production. The objective of the present study was to investigate the effect of the interaction of serum and oxygen tension during in vitro maturation on nuclear maturation, viability of cumulus cells, oocyte transcript amount, preimplantation development and blastocyst apoptosis. Four experimental groups were designed: G1 (10% estrus cow serum [ECS] with 20% O2); G2 (0.1% polyvinyl alcohol [PVA] with 20% O2), G3 (10% ECS with 5% O2) e G4 (0.1% PVA with 5% O2). Proportion of metaphase II oocytes, viability of cumulus cells, blastocyst rates and the total cell number were not affected (P>0.05) when the ECS was replaced by PVA under 5% O2, whereas higher (P<0.05) blastocyst rate and total cell number were found with ECS than PVA, both under 20% O2. Apoptosis index were lower in blastocysts from oocytes matured with PVA under 5% O2 (G4) than blastocysts from other groups (G1, G2 and G3), but no differences (P>0.05) were found in nuclear maturation, viability of cumulus cells and blastocyst rate. Differences (P<0.05) in amount of specific transcripts were found in oocytes matured under different conditions. In conclusion, presence of serum during maturation is important for embryo development only when under 20% O2, and maturation with PVA and 5% O2 provides better environment for oocyte, resulting in blastocysts with low apoptosis index.

Busca realizar una adecuada selección del número de embriones, así como del día y estadío de desarrollo embrionario que permitirá escoger embriones de alta calidad con la finalidad de conseguir una mayor incidencia de embarazos exitosos en pacientes con problemas de infertilidad y simultáneamente reducir la incidencia de embarazos multiples los cuales tienen mayores riesgos obstétricos y neonatales. Presenta un estudio observacional, descriptivo, retrospectivo y comparativo en el cual se revisaron 555 historias clínicas de pacientes a las que se les realizó la transferencia de un embrión único y que recibieron tratamiento por problemas de infertilidad en el Servicio de Ginecología de la Unidad de Fertilidad del Hospital de la Universidad de Hirosaki, Aomori, Japón; en el periodo comprendido desde enero de 1995 hasta Enero del 2006. Determina la incidencia de embarazos y recién nacidos vivos después de realizar la transferencia de un embrión en estadío de blastocisto el día 5 de desarrollo embrionario. Determina la frecuencia de embarazos y recién nacidos vivos después de realizar la tranferencia de un embrión único el día 3 y el día 4 de desarrollo embrionario. Evalúa que estadio de desarrollo embrionario proporciona la mayor incidencia de embarazos y recièn nacidos vivos. Se obtiene que el 14.3% de embarazos cuando se realizó la transferencia de un embrión el día 3 ( 4-16 blastómeras), 23.4 % de embarazos cuando se realizó la transferencia de un embrión el día 4 (estadío de Morula) y 45% de embarazos cuando se realizó la transferencia de un embrión el día 5 (estadío de blastocisto). El porcentaje de recién nacidos vivos fue de un 42.9% el día 3( 4-16 blastómeras), 42.3 % el día 4 (estadío de Morula) y 77.8% el día 5 (estadío de blastocisto). En cuanto a la paridad principalmene las pacientes fueron nulíparas: 75% (día 3), 69.2% (día 4) y 55.6% (día 5). Encuentra que el grupo etáreo más frecuente estuvo comprendido entre los 36 a 40 años con un 46.4% el día 3( 4-16 blastómeras), un 42.3% el día 4 (estadío de Morula) un 44.4% el día 5 (estadío de blastocisto). La técnica de reproduccion asistida más utilizada fue la fecundacion in vitro: 75% (día 3), 80.8% (día 4) y 77.8% (día 5). El factor de tubárico y masculino fueron los más frecuentes: 42.85% (día 3), 42.3% (día 4) y 66.6% (día 5). Concluye que realizar la transferencia de un embrión en el dia 5 y durante el estadío de blastocisto de desarrollo embrionario permite obtener un mayor número de embarazos y nacimientos vivos, asì como el menor nùmero de complicaciones obstètricas en las parejas con problemas de infertilidad. / Trabajo de investigación

Neste estudo foi analisada a expressão gênica e protéica, uterina e embrionária da quimiocina Ccl25 e de seu receptor Ccr9 nas fases iniciais da implantação embrionária (dias 3,5, 4,5, 5,5 e 7,5 de gestação). Por meio de reações imunohistoquímicas e de citometria de fluxo, foram identificadas as populações celulares envolvidas nesta expressão. Também, foram realizados ensaios de quimiotaxia com o silenciamento da expressão de Ccl25 (ODNs-Antisense) nas células trofoblásticas, para a avaliação das atividades desta quimocina. Nossos resultados sugerem o estabelecimento de uma comunicação embrião (células trofoblásticas) - endométrio (células do sistema immunológico), via Ccl25/Ccr9. Esses achados são relevantes para a compreensão das interações blastocisto/sistema immunológico materno no estabelecimento dos mecanismos imunoreguladores durante a implantação embrionária. / In this study, we analyzed the gene and protein, uterine and embryonic expression of Ccl25 chemokine and its receptor Ccr9 in early stages of embryo implantation (days 3.5, 4.5, 5.5 and 7.5 of gestation). By using immunohistochemistry and flow cytometric assays, cell populations involved in this expression were identified. In addition, chemotaxis assays were also performed after silencing of Ccl25 (ODNs-antisense) in trophoblast cells. . Our results suggest the establishment of an endometrium (immune cells) - embryo (trophoblast cells) dialogue via Ccl25/CCR9. These findings are relevant for understanding the interactions between blastocyst and maternal immune system in the establishment of immunoregulatory mechanisms during implantation.

O estabelecimento de cultivo de células-tronco embrionárias (ESC) ainda não foi realizado com sucesso. Verificação de marcadores de pluripotência e diferenciação nos três folhetos germinativos são necessárias para validação de uma linhagem celular pluripotente. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar o cultivo de ESC suínas usando Matrigel e comparar a expressão dos marcadores de pluripotência Oct-4, CD9 e &alpha;6-integrina em embriões. Blastocistos in vitro ou in vivo foram submetidos à imunocirurgia para cultura da massa celular interna, fixados para imunocitoquímica ou extração de RNA total para RT-PCR. Nenhuma colônia de ESC foi obtida usando co-cultivo em fibroblastos embrionários murinos (MEF) ou em Matrigel. Expressão de Oct-4, CD9 e &alpha;6-integrina foi detectada por PCR. Os produtos de PCR de CD9 e &alpha;6-integrina tiveram suas sequências nucleotídicas determinadas e comparadas com bases de dados públicas. O produto de CD9 foi idêntico à seqüência do CD9 suíno e o produto de &alpha;66integrina foi similar à humana e eqüina. Reação de Imunocitoquímica revelou a presença de Oct-4 no citoplasma de células da massa celular interna e do trofoblasto. CD9 e &alpha;6-integrina foram observados preferencialmente em células do trofoblasto. Não foi possível comparar a expressão dos marcadores de pluripotência entre ESC e embriões em suínos. Porém, este estudo descreve pela primeira vez a expressão de CD9 e &alpha;6-integrina em blastocistos suínos, os quais podem não estar relacionados com células pluripotentes embrionárias suínas. / Establishment of embryonic stem cell (ESC) culture in pigs has not been achieved. Verification of pluripotency markers and differentiation in the three embryonic layers are necessary for validation of a pluripotent cell line. The objective of this study was to establish and characterize porcine ESC culture using Matrigel and compare the expression of pluripotency markers Oct-4, CD9 and &alpha;6-integrin with embryos. In vitro or in vivo porcine blastocysts were submitted to immunosurgery for culture of inner cell mass, fixation for immunocytochemistry or total RNA extraction for RT-PCR. No ESC colonies were obtained using co-culture on mouse embryonic fibroblasts (MEF) or on Matrigel. Expression of Oct-4, CD9 and &alpha;6-integrin was detected by PCR. CD9 and &alpha;6-integrin PCR products had their nucleotide sequence assessed and compared with public nucleotide database. CD9 product was identical to CD9 porcine sequences and &alpha;6-integrin product was similar to human and equine &alpha;6-integrin. Immunocytochemistry revealed Oct-4 expression in cytoplasm of the inner cell mass and trophoblast cells. CD9 and &alpha;6-integrin were observed preferentially on trophoblast cells. It was not possible to compare expression of pluripotency markers between porcine ESC and embryos. However, this study describes for the first time expression of CD9 and &alpha;6-integrin in porcine blastocysts, which may not be related to pluripotent porcine embryonic cells.

Uma das maiores dificuldades das terapias de reprodução assistida é a seleção de células germinativas de boa qualidade para posterior fertilização e implantação. Atualmente, a seleção de oócitos se dá basicamente por avaliação morfológica, que não reflete satisfatoriamente a competência oocitária. Assim, a busca por bioindicadores da qualidade oocitária é necessária. O cumulus oophorus forma um conjunto de células somáticas que circundam o oócito no folículo antral,mantendo uma relação íntima com a célula germinativa, com comunicação direta via junções tipo GAP. As células do cumulus oophorus são descartadas após técnicas de fertilização in vitro, o que as torna um material de fácil acesso, livre de conflitos éticos. Uma série de metodologias de análise das células do cumulus foram propostas para identificação de anormalidades no oócito. Porém, nenhuma delas é rotineiramente utilizada na clínica. Os processos celulares das células do cumulus refletem as condições do microambiente folicular, e podem, assim, trazer evidências das condições oocitárias. Nosso grupo analisou as células do cumulus primeiramente por meio de abordagens de bioinformática, que revelaram processos celulares relacionados ao desenvolvimento de embriões até o estágio de blastocisto. Com base nestes resultados, análises de parâmetros bioquímicos e expressão gênica das células do cumulus foram realizadas e permitiram a identificação de possíveis biomarcadores da qualidade do oócito que levam em consideração as características clínicas das pacientes. Estas análises indicaram que expressão do gene PTGS2 e a atividade da enzima Glutationa-S-Transferase como indicadores da formação de blastocistos em pacientes com diferentes variáveis clínicas (backgrounds) analisados. Se confirmados, estes parâmetros poderão ser utilizados como biomarcadores no ambiente clínico, elevando as taxas de sucesso em técnicas de reprodução assistida. / One of the great challenges in assisted reproduction techniques is the selection of appropriate germ cells for fertilization and implantation. Nowadays, oocyte selection occurs basically through morphological evaluation, which does not reflect satisfactorily the oocyte competence. Therefore, the search for bioindicators of oocyte quality is necessary. The cumulus oophorus forms a set of somatic cells that surround the oocyte in the antral follicle, participating in the processes of oocyte maturation and folliculogenesis. These cells maintain an intimate relationship with the germ cell, with direct communication via GAP junctions. Cumulus oophorus cells are discarded in in vitro fertilization techniques, which makes them an easy-access material that can be collected in a free-of-ethicalissues way. A series of cumulus cell analysis methodologies were proposed to identify abnormalities in the oocyte. However, none of them is routinely used in clinical environment. The cellular processes of cumulus cells reflect the conditions of the follicular microenvironment, and may thus bring evidences of oocyte conditions. Our group analyzed cumulus cells in search of predictors of oocyte quality primarily through bioinformatics approaches, which revealed cellular processes related to the development of embryos up to the blastocyst stage. Based on these results, analyzes of biochemical parameters and gene expression of cumulus cells were performed and allowed the identification of possible biomarkers of oocyte quality that takes into consideration patients clinical variables. These analysis indicated PTGS2 expression and Glutathione-S-Transferase activity as indicators of blastocyst formation in all patient profiles (backgrounds) analyzed. If confirmed, these parameters may be used as biomarkers in clinical environment, improving assisted reproduction success rates.

Orientador: Marcelo Fabio Gouveia Nogueira / Resumo: Além de permitir a produção em larga escala de embriões, a maturação in vitro (MIV) não utiliza hormônios superestimulatórios, evitando prejuízos econômicos e efeitos iatrogênicos da superestimulação. Entretanto, a MIV ainda está aquém das expectativas devido à incapacidade em simular eventos fisiológicos que ocorrem in vivo. Um artefato da MIV consiste na retomada espontânea da meiose após a remoção do oócito do ambiente folicular. Sem o aparato molecular que retém a meiose, a maturação nuclear ocorre sem o estímulo hormonal fisiológico, impedindo a reorganização adequada das organelas durante a maturação citoplasmática, o que pode comprometer a competência oocitária in vitro. A temática primordial desta tese foi testar um sistema de pré-maturação oocitária (Pré-MIV), no qual dois fármacos (forskolin e 3-isobutil- metilxantina) são utilizados antes da MIV para retardar a meiose. O desempenho da Pré-MIV foi comparado à MIV convencional, em contexto comercial e de pesquisa. Em um primeiro momento, comparamos os sistemas convencional e Pré-MIV de forma holística, ou seja, testamos os sistemas comerciais completos. Aqui, o critério avaliativo foi a análise ultraestrutural de oócitos e blastocistos, e a análise da expressão de 96 genes relacionados à qualidade embrionária. Na segunda abordagem, adaptamos os fármacos da Pré- MIV em nossa MIV rotineira. Por estes fármacos afetarem o metabolismo lipídico, e, frente a importância deste no metabolismo energético celular, a segunda inv... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Uma das maiores dificuldades das terapias de reprodução assistida é a seleção de células germinativas de boa qualidade para posterior fertilização e implantação. Atualmente, a seleção de oócitos se dá basicamente por avaliação morfológica, que não reflete satisfatoriamente a competência oocitária. Assim, a busca por bioindicadores da qualidade oocitária é necessária. O cumulus oophorus forma um conjunto de células somáticas que circundam o oócito no folículo antral,mantendo uma relação íntima com a célula germinativa, com comunicação direta via junções tipo GAP. As células do cumulus oophorus são descartadas após técnicas de fertilização in vitro, o que as torna um material de fácil acesso, livre de conflitos éticos. Uma série de metodologias de análise das células do cumulus foram propostas para identificação de anormalidades no oócito. Porém, nenhuma delas é rotineiramente utilizada na clínica. Os processos celulares das células do cumulus refletem as condições do microambiente folicular, e podem, assim, trazer evidências das condições oocitárias. Nosso grupo analisou as células do cumulus primeiramente por meio de abordagens de bioinformática, que revelaram processos celulares relacionados ao desenvolvimento de embriões até o estágio de blastocisto. Com base nestes resultados, análises de parâmetros bioquímicos e expressão gênica das células do cumulus foram realizadas e permitiram a identificação de possíveis biomarcadores da qualidade do oócito que levam em consideração as características clínicas das pacientes. Estas análises indicaram que expressão do gene PTGS2 e a atividade da enzima Glutationa-S-Transferase como indicadores da formação de blastocistos em pacientes com diferentes variáveis clínicas (backgrounds) analisados. Se confirmados, estes parâmetros poderão ser utilizados como biomarcadores no ambiente clínico, elevando as taxas de sucesso em técnicas de reprodução assistida. / One of the great challenges in assisted reproduction techniques is the selection of appropriate germ cells for fertilization and implantation. Nowadays, oocyte selection occurs basically through morphological evaluation, which does not reflect satisfactorily the oocyte competence. Therefore, the search for bioindicators of oocyte quality is necessary. The cumulus oophorus forms a set of somatic cells that surround the oocyte in the antral follicle, participating in the processes of oocyte maturation and folliculogenesis. These cells maintain an intimate relationship with the germ cell, with direct communication via GAP junctions. Cumulus oophorus cells are discarded in in vitro fertilization techniques, which makes them an easy-access material that can be collected in a free-of-ethicalissues way. A series of cumulus cell analysis methodologies were proposed to identify abnormalities in the oocyte. However, none of them is routinely used in clinical environment. The cellular processes of cumulus cells reflect the conditions of the follicular microenvironment, and may thus bring evidences of oocyte conditions. Our group analyzed cumulus cells in search of predictors of oocyte quality primarily through bioinformatics approaches, which revealed cellular processes related to the development of embryos up to the blastocyst stage. Based on these results, analyzes of biochemical parameters and gene expression of cumulus cells were performed and allowed the identification of possible biomarkers of oocyte quality that takes into consideration patients clinical variables. These analysis indicated PTGS2 expression and Glutathione-S-Transferase activity as indicators of blastocyst formation in all patient profiles (backgrounds) analyzed. If confirmed, these parameters may be used as biomarkers in clinical environment, improving assisted reproduction success rates.

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-28Bitstream added on 2015-05-14T16:59:08Z : No. of bitstreams: 1 000823842_20160728.pdf: 48543 bytes, checksum: 0a0e4c6e3217335eb5c3eedceb8b2a73 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-07-29T12:53:53Z: 000823842_20160728.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-29T12:54:47Z : No. of bitstreams: 1 000823842.pdf: 2103625 bytes, checksum: bf645c43dd091bc121630fa032a1e708 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivou-se com este estudo comparar os efeitos da congelação lenta vs vitrificação sobre a viabilidade, ultraestrutura e expressão gênica de blastocistos caninos produzidos in vivo. A coleta dos embriões foi realizada por lavagem uterina 12 dias após a primeira IA. A congelação lenta foi realizada em máquina programável e a vitrificação pela técnica do cryotop. O cultivo in vitro (CIV) foi realizado por 24 horas, em meio SOFaa acrescido de 20% de soro fetal bovino. A reexpansão embrionária foi avaliada 24 horas após a CIV e a viabilidade embrionária avaliada com o uso das sondas Hoscht 33342 e Iodeto de propídeo. A extração e amplificação do RNA foram realizadas segundo recomendações do fabricante. Foram utilizados 70 blastocistos separados nos grupos Co, Co24, Cg, Cg24, Vi e Vi24. No experimento I foram utilizados 34 embriões. Não foi evidenciada reexpansão da blastocele após 24 horas de CIV nos grupos Cg24 e Vi24, já no grupo Co24, 100% dos embriões reexpandiram. Não foi verificada diferença na intensidade da fluorescência do Hoescht entre os grupos Co, Cg e Vi, em ambos os momentos de avaliação, 0 e 24 horas. Quando comparada a intensidade do iodeto de propídeo (IP) foi observada diferença significativa entre o grupo Co em relação aos grupos Cg e Vi, independente da metodologia de criopreservação. Observou-se uma redução na quantidade de gotas lipídicas após 24 horas de CIV comparando-se os grupos Co e Co24. No grupo Vi foram observadas mitocôndrias alongadas, integridade da membrana dos blastômeros e nuclear, reticulo endoplasmático liso, vesículas de digestão, microvilosidades, junções do tipo tight e desmossomas. No Experimento II, foram utilizados 36 embriões para a avaliação da expressão gênica. Todos os genes estudados, com excessão do LIF, foram expressos. Entretanto, não houve diferença na expressão dos genes BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 e ... / The purpose of this study was to compare the effects of slow freezing versus vitrification in canine embryo produced in vitro: viability, ultra structure and gene expression. Embryos collection was performed using uterus flush technique 12 days after the first AI. For slow freezing protocol we used a programmed machine and vitrification was performed using cryotop. In vitro culture (IVC) was conducted for 24 hours using SOFaa added with 20% of fetal bovine serum. Embryo expansion was evaluated 24 hours after in vitro culture (IVC) and embryo viability was evaluated using Hoscht 33342 and iodine propidium (PI). Extraction and amplification of the RNA was performed according to manufacturer recommendations. We used 70 blastocysts divided in groups: Co, Co24, Cg24, Vi and Vi24. In experiment I 34 embryos were used. No blastocoele expansion was observed after 24 hr of IVC in groups Cg24 and Vi24, however 100% of embryos expanded in Co24. No difference was observed in Hoescht staining intensity between Co, Cg and Vi groups, which were observed at the 0 and 24 hr periods. The iodine propidium (PI) intensity in Co was different when compared to Cg and Vi, independent of the cryopreservation method used. A reduction in the quantity of lipid drops was observed after 24 hr of IVC when comparing groups Co and Co24. In group Vi, elongated mitochondria, membrane and nuclear integrity of blastomere, smooth endoplasmic reticulum, vesicle digestion, microvilli, tight junctions and types of desmosomes were observed. In experiment II, 36 dog embryos were used for gene expression evaluation. All studied genes, except LIF were expressed. However no difference between gene expression of BAX, Bcl2, AQP3, Na+/K+-ATPases α1, Na+/K+-ATPases β1 and LIFr were observed at 0 and 24h in all groups. We concluded that the vitrification technique was the best method to cryopreserve canine embryo when we observe ultrastructure. However, it was not possible ... / FAPESP: 11/08798-6

Submitted by Eduardo Montanari Razza null (32896431829) on 2017-04-24T13:06:14Z No. of bitstreams: 1 Tese_E_M_Razza.compressed.pdf: 2567237 bytes, checksum: 79286963f030ebbfef3c6033007b2f31 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-04-25T20:37:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 razza_em_dr_bot.pdf: 2567237 bytes, checksum: 79286963f030ebbfef3c6033007b2f31 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-25T20:37:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 razza_em_dr_bot.pdf: 2567237 bytes, checksum: 79286963f030ebbfef3c6033007b2f31 (MD5) Previous issue date: 2017-02-20 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Além de permitir a produção em larga escala de embriões, a maturação in vitro (MIV) não utiliza hormônios superestimulatórios, evitando prejuízos econômicos e efeitos iatrogênicos da superestimulação. Entretanto, a MIV ainda está aquém das expectativas devido à incapacidade em simular eventos fisiológicos que ocorrem in vivo. Um artefato da MIV consiste na retomada espontânea da meiose após a remoção do oócito do ambiente folicular. Sem o aparato molecular que retém a meiose, a maturação nuclear ocorre sem o estímulo hormonal fisiológico, impedindo a reorganização adequada das organelas durante a maturação citoplasmática, o que pode comprometer a competência oocitária in vitro. A temática primordial desta tese foi testar um sistema de pré-maturação oocitária (Pré-MIV), no qual dois fármacos (forskolin e 3-isobutil- metilxantina) são utilizados antes da MIV para retardar a meiose. O desempenho da Pré-MIV foi comparado à MIV convencional, em contexto comercial e de pesquisa. Em um primeiro momento, comparamos os sistemas convencional e Pré-MIV de forma holística, ou seja, testamos os sistemas comerciais completos. Aqui, o critério avaliativo foi a análise ultraestrutural de oócitos e blastocistos, e a análise da expressão de 96 genes relacionados à qualidade embrionária. Na segunda abordagem, adaptamos os fármacos da Pré- MIV em nossa MIV rotineira. Por estes fármacos afetarem o metabolismo lipídico, e, frente a importância deste no metabolismo energético celular, a segunda investigação focou na quantificação lipídica de oócitos e blastocistos, além de avaliar o perfil lipídico de membrana dos blastocistos produzidos, dada sua relação com seu potencial de criopreservação. Coletamos amostras de células do cumulus e blastocistos e, respectivamente, verificamos a expressão de 96 genes associados à competência oocitária e 96 genes relacionados à qualidade embrionária. Resultados indicaram que a Pré-MIV afetou a ultraestrutura de oócitos e que o perfil de expressão gênica de blastocistos foi afetado pelo tratamento, mas com variações quanto ao sistema de produção utilizado. Além disso, a Pré-MIV aumentou o conteúdo lipídico de oócitos, mas diminuiu nos blastocistos, afetando positivamente o perfil lipídico de membranas do embrião. Finalmente, a Pré-MIV também afetou a expressão gênica de células do cumulus (positivamente) e de blastocistos (diferencialmente). / Besides allowing for the large-scale in vitro production of embryos, the in vitro maturation (IVM) dismiss the use of superstimulation hormones, preventing excessive financial expenses and avoiding iatrogenic effects of ovarian overstimulation. However, the outcome of IVM is still below expectations due to the inability in simulating the physiological events occurring in vivo. An artifact of IVM consists on the spontaneous resumption of meiosis after oocyte removal from the follicular environment. In this regard, without the molecular apparatus for arresting meiosis, the nuclear maturation is triggered irrespective of the physiological hormonal stimulation. As a result, the cytoplasmic maturation, i.e., the adequate reorganization of organelles in the oocyte is bypassed, compromising the oocyte competence. The general idea in this thesis was to test the pre-maturation system (Pre-IVM), in which two drugs (forskolin and 3- isobutyl-methylxanthine) are used prior to IVM to sustain meiotic arrest. The Pre-IVM performance was compared to the conventional IVM in the context of either commercial routines or research laboratories. At first, we aimed to compare the conventional IVM and the Pre-IVM in a holistic way, i.e., challenging each other using commercial systems. In this approach, we evaluated the ultrastructural aspects of oocytes and blastocysts, and associated with the expression of 96 genes related to embryo quality. In the second approach, we adapted the Pre-IVM drugs in our own IVM. Those drugs are known to affect the lipid metabolism, which is extremely relevant for the cellular energy metabolism in oocytes and embryo. Hence, we focus on the lipid quantification in oocytes and blastocysts, and, in addition, we assessed the membrane lipid profile of the blastocysts, since it is directly related to embryo cryopreservation potential. We collected cumulus cells and blastocysts and assessed the expression of 96 genes of oocyte competence and 96 genes of embryo quality. Results indicated that the Pre-IVM affected oocyte ultrastructure, the gene expression of blastocysts was differentially affected, but there was variation according to the systems used. Also the Pre- IVM increased the lipid content in oocytes and reduced in blastocysts. The membrane lipid profile of blastocysts was positively modulated by the Pre-IVM. Finally, the Pre-IVM affected the gene expression of cumulus (positively) and blastocysts (differentially). / FAPESP: 2012/23409-9 / FAPESP: 2015/02557-8

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-29Bitstream added on 2014-06-13T20:59:31Z : No. of bitstreams: 1 monteiro_ba_me_botfmvz.pdf: 1690076 bytes, checksum: 2290265393e1a80a119df41bc5967502 (MD5) / Células-tronco embrionárias (CTEs) são células pluripotentes derivadas da massa celular interna, obtidas de blastocistos pré-implantados. Devido à sua pluripotência podem se diferenciar nos derivados das três camadas germinativas, endoderma, ectoderma e mesoderma, tanto in vitro como in vivo. O objetivo deste trabalho foi isolar e cultivar células da MCI de blastocistos equinos frescos e refrigerados, e caracterizar o cultivo destas células por meio da expressão dos marcadores Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Para tal foram utilizadas 10 éguas, das quais foram obtidos 40 embriões, divididos em dois grupos, sendo o Grupo 1 de embriões frescos, totalizando 26 embriões, e o Grupo 2 de embriões refrigerados, totalizando 14 embriões. No grupo 1 de embriões frescos, 73,1% das MCIs aderiram à monocamada dois dias após o cultivo, 65,4% mantiveram-se aderidas 4 dias após o cultivo, 19,2% foram submetidas à primeira passagem e nenhuma foi submetida à segunda passagem. Já no Grupo 2 de embriões refrigerados, 85,7% das MCIs aderiram á monocamada 2 dias após o cultivo, 85,7% das células permaneceram aderidas à monocamada 4 dias após o cultivo, 21,4% foram submetidas à primeira passagem, e 7,1% à segunda passagem. As colônias de CTEs equinas obtidas de embriões frescos foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 e TRA-1-81. Já as colônias de CTEs obtidas de embriões refrigerados foram marcadas com os anticorpos Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 e SSEA-4. As células da MCI quando isoladas dos blastocistos equinos frescos e refrigerados, foram capazes de formar colônias semelhantes à colônias de CTEs. Quando cultivadas sobre monocamada de fibroblastos equinos e inativadas com Mitomicina C, apresentaram crescimento celular e foram capazes de formar colônias de CTEs... / Embryonic stem cells are pluripotent cells, derived from inner cell mass, obtained from pre-implanted blastocysts. Because of their pluripotency, they can differentiate into derivatives of three germ layers, endoderm, ectoderm and mesoderm, both in vitro as in vivo. The aim of this study was to isolate and culture inner cell mass (ICM) cells from fresh and cooled equine blastocysts and characterize stem cells culture obtained from fresh and cooled equine embryos, by the expression of pluripotency markers as Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. For this, 10 mares were used, from which were obtained 40 embryos, divided into two different groups, Group 1 from fresh embryos, with a total of 26 embryos, and Group 2 from cooled embryos, with a total of 14 embryos. In Group 1 of fresh equine embryos, 73,1% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 65,4% maintained adhered four days after culture, 19,2% were submitted to first passage and none were submitted to second passage. Whereas in the Group 2 of cooled embryos, 85,7% of ICM adhered to monolayer two days after culture, 85,7% maintained adhred to the monolayer 4 days after culture, 21,4% were submitted to first passage and 7,1% to second passage. The equine embryonic like-stem cells obtained from fresh embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60 and TRA-1-81. While the embryonic like-stem cells obtained from cooled embryos were stained with the antibodies Oct-4, SSEA-1, SSEA-3 and SSEA-4. The ICM cells when isolated from fresh and cooled equine blastocysts were capable to form embryonic stem cells-like colonies. When they were cultured under an equine fibroblasts monolayer and inactivated with Mitomycin C, showed cellular development and were able to form colonies. Equine embryonic... (Complete abstract click electronic access below)