Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6501.pdf: 1672444 bytes, checksum: 64754c3f12e26620a22bf55af9f8d5ff (MD5) Previous issue date: 2014-08-13 / The Brazilian cattle industry is presented as highlighted on the world stage and the significant participation of this productive sector in the economy means that there is concern with production losses, among which stands out those caused by infestation of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, main ectoparasite vector cattle and various diseases. The genetic variability for resistance to the cattle tick shows that this trait can be genetically improved. For the execution of this work, it was used a study of genome wide association (GWAS) for resistance to Rhipicephalus (Boophilus) microplus, performed by Dr. Fernando Flores Cardoso, with 260 Hereford and 500 Braford animals. The monitoring of the infestation was accomplished by counting tick females larger than 4.5 mm from one of the animal's body side, and the degree of infestation was evaluated for each animal by averaging at least two consecutive counts, with intervals of approximately thirty days, in the months of highest incidence of the parasite. The animals were genotyped using a 50K SNP chip, and it was found a total of 37,346 SNPs that passed in quality test. Among these markers, 178 showed significant effects and allowed the mining of 175 genes in these regions, at an interval of 200 Kb (100 Kb for each side of each marker). Most of these polymorphisms associated with the trait is located in regions without defined functions (intronic and intergenic), and only one of them is located in the splicing region. The most significant regions of the GWAS were identified on chromosomes 7, 21 and 23, which were found 72 genes in linkage disequilibrium with the molecular markers. Therefore, a functional annotation of the genes on these 3 chromosomes was performed, allowing the choice of 11 candidate genes for the study of various metabolic pathways in which they are inserted. Among these pathways, the most important are those related to immune responses, secretion and intracellular transport, calcium influx and epidermal growth and differentiation. / A bovinocultura brasileira apresenta-se como destaque no cenário mundial e a expressiva participação deste setor produtivo na economia faz com que haja preocupação com as perdas produtivas, dentre as quais destaca-se aquelas causadas pela infestação do carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus, principal ectoparasita de bovinos e vetor de diversas doenças. A variabilidade genética observada para a resistência dos bovinos ao carrapato permite que essa característica seja melhorada geneticamente, como forma alternativa de controle desses ectoparasitos. Para a execução do presente trabalho, foi utilizado um estudo de associação genômica ampla (GWAS) para a resistência ao carrapato R. microplus, o qual foi realizado pela equipe do Dr. Fernando Flores Cardoso (Embrapa Pecuária Sul), com 260 animais da raça Hereford e 500 animais da raça Braford. O monitoramento das infestações foi realizado por meio da contagem de fêmeas do carrapato com tamanho superior a 4,5 mm em um dos lados do corpo do animal, e o grau de infestação de cada animal foi avaliado pela média de pelo menos duas contagens consecutivas, com intervalos de aproximadamente trinta dias, conduzidas no sobreano, nos meses de maior incidência do parasito. Os animais foram genotipados com utilização de um chip de SNPs de 50 K e, após a realização do GWAS, verificou-se que um total de 37.346 SNPs passou nos teste de qualidade. Dentre esses marcadores, 178 SNPs apresentaram efeitos significativos e permitiram a mineração de 175 genes nessas regiões, em um intervalo de 200 Kb (100 Kb para cada lado de cada marcador). A maioria dos polimorfismos associados com a característica está localizada em regiões sem funções determinadas (intergênicas e intrônicas), apenas um deles encontra-se em região de splicing. Sendo assim, estes marcadores podem constituir mutações não causais que se encontram em desequilíbrio de ligação com mutações funcionais. As regiões mais significativas do GWAS foram identificadas nos cromossomos 7, 21 e 23, onde foram identificados 72 genes em desequilíbrio de ligação com os marcadores moleculares. Portanto, foi realizada uma anotação funcional dos genes localizados nesses 3 cromossomos, o que permitiu a seleção de 11 genes candidatos para um estudo mais aprofundado das vias metabólicas nas quais eles estão inseridos. Verificou-se que esses genes participam de processos importantes em vias já relacionadas com a resistência a carrapatos, tais como apresentação de antígenos, transporte e secreção intracelular e diferenciação da epiderme.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal ectoparasita bovino e causa importantes perdas econômicas nas criações de bovino. O controle imunológico é estudado como um método alternativo para seu controle, no entanto, uma vacina eficaz ainda necessita ser desenvolvida. A proteína BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese, já tendo sido testada como imunógeno vacinal. O propósito deste estudo foi avaliar se a inoculação de plasmídeos para expressão em células eucarióticas (BYCr-PC e BYCr-PME) contendo a região codificante para a proteína BYC poderiam gerar uma resposta imune específica. A região codificante da proteína BYC foi amplificada por PCR e clonada em dois vetores de expressão eucariotos (pcDNA3 e pME18Neo). Os clones, BYCr-PC e BYCr-PME foram utilizados para testes de inoculação de camundongos BALB/C por via intramuscular. Os camundongos receberam duas inoculações de 100 μg das construções (BYCr-PC ou BYCr-PME) e os controles negativos receberam somente PBS, pcDNA3 ou pME18Neo. A produção de anticorpos, após a inoculação, foi avaliada por Western Blotting e ELISA, sendo detectados anticorpos contra a proteína BYC nos camundongos inoculados com a construção BYCr-PC. A imunolocalização da proteína BYC nas amostras de músculo no local da inoculação foram realizadas com o monoclonal BrBm5 (anti-BYC). Estes resultados mostraram que a inoculação com o plasmídeo BYCr-PC induz a produção de anticorpos específicos e possibilita testar o uso de uma vacina de DNA como um método alternativo para o controle de carrapatos. / The Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick is the major bovine ectoparasite and causes important economical losses on cattle breeding. The immunologic control has been studied as an alternative method for the tick control. However, an effective vaccine remains to be developed. BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) is an aspartic proteinase found in eggs that is involved in the embryogenesis of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and it has been proposed as a probable antigen in vaccine development. The purpose of this study was to evaluate whether the immunization containing rBYC (rBYC-PC and rBYC-PME) could elicit a specific anti-BYC immune response in vivo. The cDNA of BYC was amplified by PCR and it was cloned into two eukaryotic expression vectors (pcDNA3 and pME18Neo). The clones, rBYC-PC and rBYC-PME, were produced in large scale for immunoassays. To evaluate the immunogenicity of BYC, BALB/c mice were immunized with DNA vaccine by intramuscular injection. The mice received two intramuscular inoculations of 100μg plasmids DNA (rBYCPC or rBYC-PME) and the negative controls received only PBS, pcDNA3 or pME18Neo. The production of antibody after the immunizations was evaluated by Western Blotting and ELISA. Antibodies against BYC in mice inoculated with rBYC-PC were detected. Immunolocalization of the rBYC protein in muscle samples from the injection site with rBYCPC was detected with monoclonal BrBm5 anti-BYC. These results show that DNA immunization produced specific anti-BYC antibodies and suggest that a DNA vaccine could prove useful to develop an alternative method for tick control.

A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes. / The oviposition is a vulnerable stage of the tick life cycle. Rhipicephalus microplus, as all Ixodidae and Argasidae, has a specialized gland, the Gene’s organ, which produce a wax that is smeared on egg surface during oviposition. In addition to restricting excessive water loss, wax acts as a barrier to attack by invading organisms. In R. microplus, as in other ticks, there are few studies showing antimicrobial activity in eggs. Moreover, there is no report of antibiofilm activity in tick eggs nor in any other arthropod. The objective of our study was to evaluate the hypothesis of the existence of defense mechanisms against bacterial biofilms in R. microplus eggs. The eggs wax water/methanol extract showed activity against Pseudomonas aeruginosa biofilm without affecting its viability. This extract also presented an antibiotic effect against Staphylococcus epidermidis. We have identified the molecule anti-biofilm and antibiotic as N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine (boophiline). In the search for possible mechanisms responsible by antibiofilm effect of boophiline against P. aeruginosa, 14 genes were evaluated by qRT-PCR. We showed that boophiline inhibits the expression of fliC (flagellum) and cdrA (matrix structural component), whose products are necessary for biofilm formation in P. aeruginosa. Bis-(3’–5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an important second messenger, characteristic of Gram-negative bacteria. High intracellular levels of c-di-GMP promote a sessile mode of growth, while low levels promote motile behavior. In line with this, we found that boophiline increases swarming motility, which raised the question whether it acts by altering c-di-GMP levels. Interestingly, when c-di-GMP levels were increased by overexpression of a diguanilate cyclase, boophiline no longer inhibited biofilm formation. One explanation for these results is that boophiline interferes with a specific c-di-GMP-regulated pathway, which would explain we have not obtained a decrease in the total level of this second messenger. Conversely, boophiline had a bactericidal effect against S. epidermidis. Significant morphological changes were observed in the boophiline-treated cells, which appeared to be severely damaged. Boophiline was found to cause abnormal septum formation, bacterial membrane disruption, and extravasation of intracellular material. Additionally, our work also aimed to evaluate the potential antibiofilm and anti-protozoa of culture filtrates obtained from bacteria isolated of R. microplus tissues. Fourteen bacterial culture filtrates showed remarkable activity against of P. aeruginosa and S. epidermidis biofilms, and were cytotoxic against Tritrichomonas foetus. Our work is pioneer in demonstrating the existence of protection mechanisms in tick eggs against biofilms, and ticks-associated bacteria as producers of bioactive molecules. Furthermore, we demonstrated that boophiline is a new antibiofilm molecule, and is the first reported in the literature that a molecule inhibits cdrA. The data obtained in our study could stimulate new approaches in areas such as the physiology and control of arthropods, the genetics and physiology of microorganisms, and biofilm control.

A oviposição é um estágio vulnerável do ciclo de vida de carrapatos. Rhipicephalus microplus, como todos Ixodidae e Argasidae, possui uma glândula especializada, o órgão de Gené, que produz uma cera que é depositada na superfície do ovo durante a oviposição. Além de restringir a perda excessiva de água, a cera atua como uma barreira contra o ataque de organismos invasores. Em R.microplus, como em outros carrapatos, há poucos estudos demonstrando atividade antimicrobiana em ovos. Ainda mais, não há na literatura relato de atividade antibiofilme em ovos de carrapatos e nem mesmo em qualquer outro artrópode. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a hipótese da existência de mecanismos de defesa em ovos de R. microplus contra biofilmes bacterianos. O extrato água/metanol da cera dos ovos apresentou atividade contra o biofilme de Pseudomonas aeruginosa sem afetar a sua viabilidade. Esse extrato também demonstrou efeito antibiótico contra Staphylococcus epidermidis. Nós identificamos a molécula com ambas atividades (antibiofilme e antibiótica) como N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucina (boophiline). Na busca por possíveis mecanismos responsáveis pelo efeito antibiofilme de boophiline contra P. aeruginosa, 14 genes foram analisados por qRT-PCR. Boophiline inibe a expressão de fliC (flagelo) e cdrA (componente estrutural da matriz), cujos produtos são necessários para a formação do biofilme de P. aeruginosa. Monosfosfato de guanosina dimérico cíclico (c-di-GMP) é um importante segundo mensageiro característico de bactérias Gram-negativas. Altos níveis intracelulares de c-di-GMP promovem o estilo de vida séssil enquanto baixos níveis induzem o comportamento móvel. De acordo com essa afirmação, nós encontramos que boophiline aumenta a motilidade swarming de P. aeruginosa. Desta forma, nos questionamos se o mecanismo de ação de boophiline estaria envolvido com c-di-GMP já que o sistema quorum sensing não foi afetado pela molécula. Interessantemente, quando os níveis de c-di-GMP foram aumentados pela superexpressão de uma diguanilato ciclase, boophiline não inibiu efetivamente a formação de biofilme. Uma explicação para esse resultado é que boophiline interfere em uma via específica regulada por c-di-GMP, o que explicaria não termos obtido um decréscimo no nível total deste segundo mensageiro. Contrariamente, boophiline foi bactericida contra S. epidermidis. Mudanças morfológicas significativas foram observadas em células tratadas com a molécula, as quais foram severamente danificadas. Boophiline levou a formação anormal de septo, rompimento da membrana bacteriana e extravasamento do material intracelular. Adicionalmente avaliamos o potencial antibiofilme e anti-protozoário de filtrados de cultura obtidos de bactérias isoladas de tecidos de R. microplus. Quatorze filtrados de cultura bacteriano apresentaram notável atividade contra o biofilme de P. aeruginosa e S. epidermidis e foram citotóxicos contra Tritrichomonas foetus. Nosso trabalho é pioneiro em demonstrar a existência de proteção contra biofilmes em ovos de carrapatos bem como de bactérias associadas a carrapatos como produtoras de moléculas bioativas. Além disso, nós demonstramos que boophiline é uma nova molécula antibiofilme, sendo a primeira vez relatado na literatura que um composto age inibindo cdrA. Os dados obtidos em nosso estudo poderiam estimular novas abordagens em áreas como fisiologia e controle de artrópodes, genética e fisiologia de microrganismos e controle de biofilmes. / The oviposition is a vulnerable stage of the tick life cycle. Rhipicephalus microplus, as all Ixodidae and Argasidae, has a specialized gland, the Gene’s organ, which produce a wax that is smeared on egg surface during oviposition. In addition to restricting excessive water loss, wax acts as a barrier to attack by invading organisms. In R. microplus, as in other ticks, there are few studies showing antimicrobial activity in eggs. Moreover, there is no report of antibiofilm activity in tick eggs nor in any other arthropod. The objective of our study was to evaluate the hypothesis of the existence of defense mechanisms against bacterial biofilms in R. microplus eggs. The eggs wax water/methanol extract showed activity against Pseudomonas aeruginosa biofilm without affecting its viability. This extract also presented an antibiotic effect against Staphylococcus epidermidis. We have identified the molecule anti-biofilm and antibiotic as N-(3-sulfooxy-25-cholest-5-en-26-oyl)-L-isoleucine (boophiline). In the search for possible mechanisms responsible by antibiofilm effect of boophiline against P. aeruginosa, 14 genes were evaluated by qRT-PCR. We showed that boophiline inhibits the expression of fliC (flagellum) and cdrA (matrix structural component), whose products are necessary for biofilm formation in P. aeruginosa. Bis-(3’–5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is an important second messenger, characteristic of Gram-negative bacteria. High intracellular levels of c-di-GMP promote a sessile mode of growth, while low levels promote motile behavior. In line with this, we found that boophiline increases swarming motility, which raised the question whether it acts by altering c-di-GMP levels. Interestingly, when c-di-GMP levels were increased by overexpression of a diguanilate cyclase, boophiline no longer inhibited biofilm formation. One explanation for these results is that boophiline interferes with a specific c-di-GMP-regulated pathway, which would explain we have not obtained a decrease in the total level of this second messenger. Conversely, boophiline had a bactericidal effect against S. epidermidis. Significant morphological changes were observed in the boophiline-treated cells, which appeared to be severely damaged. Boophiline was found to cause abnormal septum formation, bacterial membrane disruption, and extravasation of intracellular material. Additionally, our work also aimed to evaluate the potential antibiofilm and anti-protozoa of culture filtrates obtained from bacteria isolated of R. microplus tissues. Fourteen bacterial culture filtrates showed remarkable activity against of P. aeruginosa and S. epidermidis biofilms, and were cytotoxic against Tritrichomonas foetus. Our work is pioneer in demonstrating the existence of protection mechanisms in tick eggs against biofilms, and ticks-associated bacteria as producers of bioactive molecules. Furthermore, we demonstrated that boophiline is a new antibiofilm molecule, and is the first reported in the literature that a molecule inhibits cdrA. The data obtained in our study could stimulate new approaches in areas such as the physiology and control of arthropods, the genetics and physiology of microorganisms, and biofilm control.

O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal ectoparasita bovino e causa importantes perdas econômicas nas criações de bovino. O controle imunológico é estudado como um método alternativo para seu controle, no entanto, uma vacina eficaz ainda necessita ser desenvolvida. A proteína BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese, já tendo sido testada como imunógeno vacinal. O propósito deste estudo foi avaliar se a inoculação de plasmídeos para expressão em células eucarióticas (BYCr-PC e BYCr-PME) contendo a região codificante para a proteína BYC poderiam gerar uma resposta imune específica. A região codificante da proteína BYC foi amplificada por PCR e clonada em dois vetores de expressão eucariotos (pcDNA3 e pME18Neo). Os clones, BYCr-PC e BYCr-PME foram utilizados para testes de inoculação de camundongos BALB/C por via intramuscular. Os camundongos receberam duas inoculações de 100 μg das construções (BYCr-PC ou BYCr-PME) e os controles negativos receberam somente PBS, pcDNA3 ou pME18Neo. A produção de anticorpos, após a inoculação, foi avaliada por Western Blotting e ELISA, sendo detectados anticorpos contra a proteína BYC nos camundongos inoculados com a construção BYCr-PC. A imunolocalização da proteína BYC nas amostras de músculo no local da inoculação foram realizadas com o monoclonal BrBm5 (anti-BYC). Estes resultados mostraram que a inoculação com o plasmídeo BYCr-PC induz a produção de anticorpos específicos e possibilita testar o uso de uma vacina de DNA como um método alternativo para o controle de carrapatos. / The Rhipicephalus (Boophilus) microplus tick is the major bovine ectoparasite and causes important economical losses on cattle breeding. The immunologic control has been studied as an alternative method for the tick control. However, an effective vaccine remains to be developed. BYC (Boophilus Yolk Pro-Cathepsin) is an aspartic proteinase found in eggs that is involved in the embryogenesis of Rhipicephalus (Boophilus) microplus, and it has been proposed as a probable antigen in vaccine development. The purpose of this study was to evaluate whether the immunization containing rBYC (rBYC-PC and rBYC-PME) could elicit a specific anti-BYC immune response in vivo. The cDNA of BYC was amplified by PCR and it was cloned into two eukaryotic expression vectors (pcDNA3 and pME18Neo). The clones, rBYC-PC and rBYC-PME, were produced in large scale for immunoassays. To evaluate the immunogenicity of BYC, BALB/c mice were immunized with DNA vaccine by intramuscular injection. The mice received two intramuscular inoculations of 100μg plasmids DNA (rBYCPC or rBYC-PME) and the negative controls received only PBS, pcDNA3 or pME18Neo. The production of antibody after the immunizations was evaluated by Western Blotting and ELISA. Antibodies against BYC in mice inoculated with rBYC-PC were detected. Immunolocalization of the rBYC protein in muscle samples from the injection site with rBYCPC was detected with monoclonal BrBm5 anti-BYC. These results show that DNA immunization produced specific anti-BYC antibodies and suggest that a DNA vaccine could prove useful to develop an alternative method for tick control.

Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-19T17:11:18Z No. of bitstreams: 1 Marcia Paula Oliveira Farias.pdf: 458390 bytes, checksum: 177ae1686037c9ba17a91bd3068a2d56 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-19T17:11:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcia Paula Oliveira Farias.pdf: 458390 bytes, checksum: 177ae1686037c9ba17a91bd3068a2d56 (MD5) Previous issue date: 2007-02-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / This study was performed with the aim of to evaluate the “in vitro” acaricidal activity of the oil of the seed of andiroba against Boophilus microplus, Rhipicephalus sanguineus and Anocentor nitens; the biological activity of the third stage larvae (L3) of Musca domestica and the activity of the oil of the seed of andiroba on the larval culture of gastrointestinal nematodes of goat and sheep. The acaricidal activity in the related species of tick was carried by means of the engorged females immersion test, using groups of 10 engorged females with three repetitions for treatment; for the test with the third stage larvae (L3) of Musca domestica it had been formed four repetitions with 10 larvae for treatment. Strips of filter paper measuring 8.5 x 1.5cm (L x W) were soaked in 0.3ml of the solutions and controls, and next, they were introduced in test tubes, adding 1.30g of vermiculite, being the tubes closed with absorbent cotton. Daily observations were made for detection of mortality of larvae, formation of pupae and adults emergence. The activity of the oil of andiroba on larval culture of gastrointestinalnematodes was determined by the calculation of the percentages of reduction of infective larvae for gram of faeces, using three repetitions. For each experiment it had been used dilutions of 100%, 50%, 30%, 25% and 10% (T1, T2, T3, T4 and T5 respectively) of the oil of the seed of andiroba, using tween 80 as detergent. Two groups had been formed as controls, one with deionized water and another one with tween 80 + deionized water. For the test of reduction of gastrointestinal infective larvae of nematodes, another group was added as positive control (doramectina). The results showed effectiveness of 100% for all the dilutions tested in the three species of ticks. In the test with L3 of de M. domestica, eight days after the accomplishment of the test, it was observed in the 100% concentration 20.0% of larval mortality and 62.5% of inhibition of emergency of adults, values significantly higher than those got in the other treated groups.In the test of reduction of gastrointestinal infective larvae of nematodes, effective reduction (> 90%) was obtained for 100%, 50% and 30% treatments in goat, and for all the treatments for sheep. / Avaliou-se “in vitro” a atividade acaricida do óleo da semente da andiroba contra Boophilus microplus, Rhipicephalus sanguineus e Anocentor nitens; a atividade biológica do óleo da semente de andiroba em larvas de terceiro estágio (L3) de Musca domestica e a atividade do óleo da semente da andiroba sobre o cultivo de larvas de nematóides gastrintestinais caprinos e ovinos. A atividade acaricida nas referidas espécies de carrapatos foi realizada por meio do teste de imersão de fêmeas ingurgitadas, utilizando-se grupos de 10 fêmeas ingurgitadas com três repetições por tratamento; para o teste com L3 de Musca domestica quatro repetições compostas por 10 larvas de terceiro estágio foram formadas. Tiras de papel filtro medindo 8,5 x 1,5cm (C x L) foram embebidas em 0,3ml das soluções do óleo de andiroba e controles, em seguida, colocadas dentro de tubos de ensaio, acrescentando-se 1,30g de vermiculita, introduzindo-se, então, as 10 larvas e vedando-se com algodão hidrófilo. Fez-se observação diária para detecção de mortalidade de larvas, pupação e emergência de adultos. A atividadedo óleo de andiroba sobre cultivos de L3 de nematóides gastrintestinais foi determinada pelo cálculo dos percentuais de redução de larvas infectantes por gramas de fezes (LPG), utilizando-se três repetições. Para cada experimento empregaram-se diluições de 100%, 50%, 30%, 25% e 10% (T1, T2, T3, T4 e T5 respectivamente) do óleo da semente de andiroba, utilizando-se tween 80 como dispersante. Formaram-se dois grupos controle, um com água destilada e outro com tween 80 + água destilada. Para o teste de redução de larvas infectantes de nematóides gastrintestinais, acrescentou-se um grupo controle positivo (doramectina). Os resultados revelaram eficácia de 100% para todas as diluições testadas nas três espécies de carrapatos. No teste com L3 de Musca domestica, após oito dias da realização do teste, na concentração de 100% obteve-se 20,0% de mortalidade larval e 62,5% de inibição de emergência de adultos, valoressignificativamente superiores aos obtidos nos demais tratamentos. No teste de redução do LPG de nematóides gastrintestinais, os resultados revelaram redução altamente efetiva (> 90%) no número de larvas totais para os tratamentos 100%, 50% e 30% em caprinos e em todos os tratamentos para a espécie ovina.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-12-15T13:04:14Z No. of bitstreams: 1 marinamarquespardini.pdf: 1130678 bytes, checksum: 6b0cced1c7d41de2488ba773203968cd (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-12-15T14:16:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marinamarquespardini.pdf: 1130678 bytes, checksum: 6b0cced1c7d41de2488ba773203968cd (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-15T14:16:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marinamarquespardini.pdf: 1130678 bytes, checksum: 6b0cced1c7d41de2488ba773203968cd (MD5) Previous issue date: 2008-06-05 / As infestações por carrapatos em bovinos reduzem a produtividade do gado de corte e leiteiro causando grandes perdas econômicas à pecuária. Os prejuízos acarretam desde debilidade física e transmissão de doenças ao rebanho, como anaplasmose e babesiose, até a morte dos indivíduos mais vulneráveis. Os carrapatos permanecem por longos períodos fixados em seus hospedeiros sendo expostos ao sistema de defesa do bovino, o que provoca inflamação e ativa elementos da resposta imune humoral e celular do hospedeiro. Em contrapartida, componentes imunogênicos da glândula salivar do carrapato modulam a resposta bovina para perfis de citocinas favoráveis à hematofagia. Existem poucos estudos sobre mecanismos imunes que guiam a interação parasito-hospedeiro e determinam o sucesso ou não do parasitismo. Trabalhos recentes apontam para importância de fatores genéticos relacionados à resistência ao carrapato em determinadas raças bovinas, além de estudos que mostram o papel crítico das citocinas na prevenção e progressão de quadros patológicos. O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta imunológica de bovinos infestados artificialmente pelo carrapato Boophilus microplus através de ensaios de proliferação celular e detecção de óxido nítrico (NO) e interferon-gama (IFN-) em células mononucleares do sangue periférico a fim de verificar diferentes níveis de resistência bovina. Seis bovinos mais resistentes e seis mais susceptíveis de uma população F2 de 332 animais, originária do cruzamento de F1 (½ Holandês : ½ Gir), foram selecionados com base na contagem de carrapatos e valor genético. Amostras de sangue foram coletadas nos pontos 0, 5º e 12º dias pós-infestação para cultura de células e estimulação in vitro com antígenos do B. microplus. A proliferação celular e os níveis de NO e IFN- foram avaliados respectivamente pelos métodos de MTT, Griess e ELISA. As células dos animais resistentes (R) tenderam ao aumento de proliferação no 5º dia quando estimuladas com antígenos do carrapato retornando aos níveis iniciais no 12° dia. Já nos animais susceptíveis (S), a estimulação pareceu inibir a proliferação das células no dia 0 e não alterou os índices do 5° e 12° dia. Apesar disso, não houve diferença significativa na proliferação celular entre os grupos R e S. Quando as células obtidas no dia 0 foram cultivadas na ausência de estímulo, os níveis de NO dos animais R tenderam a ser mais altos que dos animais S. A estimulação com antígenos de carrapato pareceu inibir a produção de NO no 5º dia por células de animais R. Também não houve diferença significativa nas produções de NO e de IFN- entre os grupos R e S. Os resultados sugerem que o NO possa ter um papel no início da resposta imune que delineia o mecanismo de resistência ao carrapato, uma vez que as alterações mais importantes foram detectadas até o 5º dia após a infestação. É possível que o mecanismo de resistência esteja associado à regulação negativa da resposta imune a fim de não incitar a modulação desta pelo carrapato, porém sendo eficaz o suficiente para eliminá-lo. A avaliação da resposta imunológica nos primeiros momentos após a fixação do carrapato no couro bovino, bem como um acompanhamento mais detalhado dos pontos temporais da infestação poderia fornecer dados mais conclusivos. / Tick infestations in cattle reduce its beef and dairy productivity causing great economic losses to livestock. The potential damages are physical weakness, transmission of diseases to the herd, as anaplasmosis and babesiosis, and even vulnerable animals deaths. Thus, the tick control has been considered priority in tropical regions worldwide. The ticks remain fixed to their hosts for long periods being exposed to the cattle defense system; it causes inflammation and activates the host’s humoral and cellular immune response. Nevertheless, immunogenic components of the salivary gland of cattle tick modulate the response to profiles of cytokines that promote the blood-feeding. There are few studies approaching immune mechanisms that lead to host-parasite interaction and determine the success or unsuccessful of parasitism. Recent works suggest the importance of genetic factors related to the resistance to ticks in Bos taurus and Bos indicus breeds. In addition, studies show the critical role of cytokines in the prevention and progression of diseases. The aimed of this work was to evaluate the immune response in cattle artificially infested by Boophilus microplus through cell proliferation assays and detection of nitric oxide (NO) and interferon-gamma (IFN-) in peripheral blood mononuclear cells, in order to establish different resistance levels in Girolando breed. Six tick-resistant and six tick-susceptible animals from a F2 population of 332 animals originated from crossing cattle F1 (½ Holstein : ½ Gir) were selected based on the ticks counting and breeding value. Blood samples were collected for cell culture and stimulation in vitro with antigens of B. microplus in the points 0, 5 and 12 days after infestation. The cell proliferation and the NO and IFN- levels were evaluated by MTT, Griess and ELISA, respectively. There was a tendency of increasing proliferation of resistant animals (R) cells in the 5th day when they were stimulated with the tick antigens, returning to initial levels at 12th day. In the other hand, for the susceptible animals (S) the stimulation seemed to inhibit proliferation of cells in day 0, and did not altered the rates of 5th and 12th day. There was no significant difference between the cell proliferation of the groups R and S. When the cells obtained in the day 0 were cultured in the absence of stimulation, the levels of NO of animals R tended to be higher than that of the animals S. The stimulation with tick antigens inhibited the NO production by cells of animals R in the 5th day. In addition, there was no significant difference in NO and IFN- production between the groups R and S. The results suggest that NO may play a role in the early immune response that outlines the mechanism of resistance to ticks, since the most important changes were detected until the 5th day after the infestation. It is possible that the resistance mechanism is associated to the downregulation of immune response in order not to encourage the modulation by the ticks, although being effective enough to eliminate it. An evaluation of the immune response in the first moments after the tick fixation to cattle leather, as well as a more detailed monitoring of the temporal points of the infestation, could provide more conclusive data.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_alvaro_carlos_menezes_arteche.pdf: 1268541 bytes, checksum: 48cb8939395a534c09b30fdb0ec17ef9 (MD5) Previous issue date: 2011-11-21 / This study analyzed, by reaction to indirect immunofluorescence and individual weighting, the levels of protection and weight-gain in beef calves from birth to the age of eight month, which received two doses of vaccine against tick fever and were maintained free from ticks, compared to naturally infested calves in extensive management conditions with continuous grazing in a rural property situated in the municipality of Santana do Livramento Espinilho / RS. Two groups were randomly gathered, n=30, from which Group I (test) was kept free from ticks from birth to weaning and received two doses of the attenuated, trivalent, refrigerated vaccine against tick fever. Groupe II (control) followed the property s traditional management, which reflects the one used in the region, allowing the tick infestation by the animals. Weight control was accomplished in the first day (d0) and in the last day of the experiment (d180). The serology revealed that 100% of the vaccinated animals presented titles equal to 1:5120 for the three parasites Anaplasma marginale, Babesia bovis e Babesia bigemina (p≤0,025), whereas in the control group the highest titles were 1:2560 in four animals for A. marginale, 1:1280 in four animals for B. bovis and 1:1280 in two animals for B. bigemina (p≤ 0,025). Group I got a mean weight-gain of 30,5 kg more than the control group at the end of the experiment (p≤0,025). The results obtained show that keeping animals free from tick, from birth to weaning, and maintaining them vaccinated against tick fever is safer, more efficient and economically and technically more advantageous than the traditional management system carrapateamento (natural tick infestation). / Avaliaram-se, pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e de pesagens individuais, os níveis de proteção e ganho de peso de terneiros de corte do nascimento ao desmame com oito meses de idade que receberam duas doses de vacina contra tristeza bovina e foram mantidos livres de carrapatos em comparação a terneiros naturalmente infestados em condições de manejo extensivo com pastoreio contínuo em propriedade rural localizada no município de Santana do Livramento-Espinilho/RS. Formaram-se dois grupos aleatóriamente, n=30, sendo o GRUPO I (teste) mantido livre de carrapatos desde o nascimento até o desmame e com duas doses da vacina atenuada, trivalente e refrigerada contra tristeza bovina. O GRUPO II, controle, seguiu o manejo tradicional da propriedade, que reflete o da região, permitindo que os animais fossem infestados por carrapatos. As pesagens foram realizadas no primeiro dia do experimento (d0) e no último dia do experimento (d180). A sorologia revelou que 100% dos animais vacinados apresentaram títulos maiores ou iguais a 1:5120 para os três parasitos Anaplasma marginale, Babesia bovis e Babesia bigemina (p≤0,025) enquanto que no grupo controle os títulos máximos foram 1:2560 em quatro animais para A. marginale, 1:1280 em quatro animais para B. bovis e 1:1280 em dois animais para B. bigemina. Houve diferença significativa entre os dois grupos (p≤0,025). O grupo I obteve 30,5 Kg a mais de ganho médio de peso que o grupo controle no final do experimento (p≤0,025). Com os resultados obtidos, conclui-se que é mais eficiente, seguro e vantajoso econômica e tecnicamente manter os animais livres de carrapatos, desde o nascimento até o desmame, e vacinados contra tristeza bovina, do que com o manejo tradicional carrapateamento .