Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Citocinas do tipo 2 estão presentes em fases mais avançadas do desenvolvimento de diversos tumores humanos, funcionando em alguns casos como fatores prognósticos de neoplasias. O desenvolvimento do melanoma murino B16F10 está relacionado a um aumento na produção de IL-10 por células NK e linfócitos T CD4+ e uma diminuição acentuada na produção de IFN- por essas células, nas fases mais avançadas da progressão tumoral. Embora o modelo singeneico do melanoma murino B16F10-Nex2 apresente baixa imunogenicidade in vivo, uma pequena porcentagem de camundongos C57Bl/6 são naturalmente resistentes ao desenvolvimento subcutâneo desse tumor, mesmo após mais de uma inoculação das células tumorais. Animais naturalmente resistentes produziram maiores concentrações de IFN- e animais susceptíveis ao tumor produziram maiores concentrações de interleucinas anti-inflamatórias, IL-10 e IL-6. Confirmando o papel imunoregulador negativo da IL-10 na resposta imune protetora natural desse modelo, camundongos geneticamente deficientes em IL-10 (IL-10KO) foram mais resistentes à implantação subcutânea de células B16F10-Nex2. Animais que resistiram à progressão tumoral produziram uma resposta protetora com perfil de citocinas do tipo 1 (IFN- e IL-12), e a proteção foi dependente de IFN- . Macrófagos e células dendríticas de animais IL-10KO após estímulo in vitro com antígenos do melanoma B16F10-Nex2 apresentaram maior produção de citocinas pró-inflamatórias (IFN- , TNF- e IL-12) e uma maior expressão de marcadores de ativação celular (MHCII, CD40, CD80 e CD86). Com a transferência adotiva de células dendríticas IL-10KO, mas não IL-10 competentes, associadas a um lisado de células B16F10-Nex2, animais C57Bl/6 foram protegidos contra o desenvolvimento tumoral, sugerindo que células dendríticas que não expressam IL-10 sejam responsáveis pela indução da resposta protetora natural mais eficiente observada em animais IL-10KO. Tendo em vista o papel imunossupressor da IL-10 na resposta protetora induzida pelo melanoma B16F10-Nex2, foi construído um vetor plasmidial eucariótico contendo o mini-gene referente à porção extracelular do receptor da IL-10 murina, a ser utilizado em protocolos de terapia gênica para neutralização da IL-10 in vivo pela expressão de um receptor decoy da interleucina. Animais tratados com o plasmídeo recombinante apresentaram aumento na sobrevida, em um efeito dependente de IFN- e potencializado pela associação de uma terapia gênica adjuvante para produção de IL-12. Células dendríticas de animais C57Bl/6 foram transfectadas com esse plasmídeo recombinante, associadas a antígenos tumorais e transferidas adotivamente à animais C57Bl/6, que foram subsequentemente desafiados com células tumorais subcutaneamente. Essas células, que tiveram o IL-10 neutralizado pelo receptor decoy, induziram resposta protetora significativamente mais eficiente que as células controle transfectadas com o plasmídeo vazio, sugerindo que essas células estejam envolvidas in vivo na indução da resposta protetora observada após a imunização com o plasmídeo recombinante e neutralização da IL-10 sistêmica. Concluímos que a terapia gênica desenvolvida foi eficaz na neutralização da IL-10 sistêmica, podendo ser aplicada como uma nova alternativa imunoterapêutica antitumoral. / Type 2 cytokines are increased in late phases of several human tumors, and in some cases are considered prognostic factors for these neoplasias. Late development phases of murine melanoma B16F10 correlate with an increased production of IL-10 by NK cells and CD4+ T lymphocytes, and also with a decreased production of IFN- by these cells. Syngeneic murine melanoma B16F10-Nex2 shows low immunogenicity in vivo, however, a small percentage of C57Bl/6 mice are naturally resistant to subcutaneous tumor development, even after several tumor cell inoculations. Naturally resistant animals produced higher concentrations of IFN- and tumor susceptible animals produced higher concentrations of anti-inflammatory cytokines, IL-10 and IL-6. The immunoregulatory role of IL-10 on the natural protective immune response induced in this model was confirmed by the increased resistance to tumor development observed in IL-10 genetically-deficient mice (IL- 10KO) subcutaneously inoculated with B16F10-Nex2 cells. A type 1 immune reponse (IFN- and IL-12) was induced in resistant IL-10KO animals, and the protection was IFN- -dependent. IL-10KO macrophages and dendritic cells stimulated in vitro with B16F10-Nex2 melanoma antigens secreted higher concentrations of proinflammatory cytokines (IFN- , TNF- e IL-12), and expressed an increased amount of surface activation markers (MHCII, CD40, CD80 e CD86). Adoptive transfer of IL-10KO dendritic cells, but not IL-10-competent cells, in association with tumor antigens, induced a protective response in C57Bl/6 mice, suggesting that IL-10-negative dendritic cells induce the efficient protective response observed in IL-10KO animals. As IL-10 showed a clear immunosuppressive role on the natural protective response induced by B16F10-Nex2 cells, we constructed an eukaryotic plasmidial vector carrying the murine IL-10 receptor extracellular portion gene, to be used in gene therapy protocols for IL-10 neutralization in vivo by the expression of a decoy receptor. Recombinant plasmid-treated animals showed an IFN- -dependent increased survival, and this protective effect was augmented by the association with an adjuvant IL-12 gene therapy Dendritic cells from C57Bl/6 animals were transfected with recombinant plasmid, adoptively transferred to C57Bl/6 mice, and treated animals were challenged subcutaneously with B16F10-Nex2 tumor cells. Interleukin-10-neutralized dendritic cells induced a significantly increased survival, as compared to IL-10-containing dendritic cells, suggesting that dendritic cells induce the protective response observed in vivo after recombinant plasmid immunization and systemic IL-10 neutralization. We concluded that gene therapy using a plasmid expressing the IL-10 receptor extracellular region was effective on systemic IL-10 neutralization, and this tool could be used as a novel antitumor immunotherapeutic alternative. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-07-15T17:38:36Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Diego Mota Lopes.pdf: 1953608 bytes, checksum: 35777944b1eff36bc60b886626dfbbb0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-15T17:38:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Diego Mota Lopes.pdf: 1953608 bytes, checksum: 35777944b1eff36bc60b886626dfbbb0 (MD5) / A resposta imune do tipo Th1 na leishmaniose cutânea (LC) ao tempo em que é responsável pelo controle da infecção, está associada com a lesão tecidual e patogênese da doença. Por outro lado, estudos tem mostrado que a resposta imune induzida por alguns antígenos do Schistosoma mansoni é capaz de modular a resposta inflamatória em doenças imuno-mediadas. O objetivo deste estudo foi avaliar o potencial do antígeno de S. mansoni Sm29 em alterar o perfil das células dendríticas derivadas de monócitos (MoDCs) em indivíduos com LC estimuladas in vitro com o antígeno solúvel de L. braziliensis (SLA). Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram obtidas utilizando gradiente de Ficoll-Hypaque. Foram avaliados doze pacientes com leishmaniose cutânea. Os monócitos foram cultivados na presença de GM-CSF e IL-4 para a diferenciação em células dendríticas (DC), e em seguida estimulados com antígeno Sm29 na presença ou ausência do antígeno SLA. A expressão de moléculas de superfície associadas a ativação celular e de citocinas pro e anti-inflamatórias foram avaliadas nas MoDCs pela técnica de citometria de fluxo. A frequência dos marcadores de ativação HLA-DR, CD80, CD83 e CD86 e das moléculas regulatórias IL-10 e seu receptor (IL-10R) foram maiores em culturas de MoDCs estimuladas com Sm29 e SLA em comparação com as culturas de células não estimuladas. Nossos resultados indicam que o antígeno Sm29 é capaz de aumentar a expressão in vitro de mediadores anti-inflamatórios (citocina e receptor de IL-10) sobre MoDCs de leishmaniose cutânea e marcadores de ativação. / Salvador

Introdução: O fator de transcrição FOXP3 está aumentado em pacientes com rejeição aguda do transplante renal, mas a sua influência na função e sobrevida do enxerto ainda não é clara. O objetivo deste estudo foi correlacionar a expressão gênica e protéica de FOXP3 com os desfechos do enxerto renal, e avaliar a sua associação com células apresentadoras do antígeno em biópsias do enxerto renal. Métodos: Foram avaliados 91 receptores de transplante renal submetidos à biópsia do enxerto por disfunção aguda ou crônica, classificados pela histologia de Banff. O RNAm de FOXP3 foi analisado por PCR em tempo real, e a proteína de FOXP3 e as células dendríticas CD83+ (CDs) por imuno-histoquímica. Todas as análises foram feitas em tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina. A magnitude de expressão de FOXP3 foi estabelecida por curva ROC. A função e a sobrevida do enxerto em 5 anos pós-transplante foram avaliados, assim como fatores preditores de perda do enxerto. Resultados: A correlação da expressão intra-enxerto do gene e da proteína de FOXP3 foi positiva e significativa (r=0.541, p<0.001). Tanto o RNAm quanto a proteína de FOXP3 estavam aumentados em pacientes com rejeição aguda (RA), em comparação com aqueles sem rejeição (SR) (p=0,039 e p<0,001, respectivamente) ou fibrose intersticial/atrofia tubular (FI/AT) (p=0,035 e p=0,034, respectivamente). Níveis elevados do RNAm de FOXP3 (≥ 2,36 log10 RNAm) ou da proteína (≥ 2,5 células FOXP3+/mm2) não se correlacionaram com variáveis demográficas ou do transplante, mas pacientes com FOXP3 RNAm elevado tiveram maiores taxas de filtração glomerular estimada (TFGe) e uma tendência de variação positiva da TFG ao final do seguimento. O número de CDs CD83+ tendeu a ser maior nas biópsias com FI/AT em comparação com SR (p=0,065), mas não na RA. Pacientes com alta expressão de FOXP3 apresentaram maior número de CDs CD83+ na biópsia: 0,86 (0,25-4,0) vs. 0,44 (0-1,12) células/mm2, p=0,032. A sobrevida cumulativa do enxerto em 5 anos não foi influenciada pela expressão do RNAm de FOXP3 (p = 0,69, log-rank test). Na análise de regressão Cox, RNAm e proteína de FOXP3 não foram preditores independentes da perda do enxerto, somente maior TFGe foi fator protetor contra perda do enxerto. Conclusões: Este estudo mostra que a análise molecular de FOXP3 em tecido parafinado do enxerto renal é possível, uma vez que o RNAm e proteína correlacionaram-se positiva e significativamente. Como esperado, houve uma expressão aumentada de FOXP3 em biópsias com RA. Bióspias com alta expressão de FOX3 tiveram maior densidade de células dendríticas. Nesta coorte, o FOXP3 não foi associado à melhor função ou sobrevida do enxerto renal. / Background. The transcription factor FOXP3 is increased in acute rejection in renal transplant recipients, but its influence in graft function and survival is not clear yet. The aim of this study was to correlate FOXP3 gene and protein expression with graft outcomes, and to evaluate its association with antigen presenting cells in kidney graft biopsies. Methods. We assessed 91 kidney transplant recipients undergoing allograft biopsy for acute or chronic dysfunction, classified by Banff histology. FOXP3 mRNA was analyzed by real-time PCR, and FOXP3 protein and dendritic cells (CD83+ DCs) by immunohistochemistry. All analyzes were done in formalinfixed, paraffin-embedded tissue. The magnitude of FOXP3 expression was established by the receiver operating characteristics (ROC) curve. Graft function and survival at 5 years post transplantation were assessed, as well as independent predictors of graft loss. Results. Intra-graft FOXP3 gene and protein expression were significantly correlated (r=0.541, p<0.001). Both FOXP3 mRNA and protein were increased in patients with acute rejection (AR) as compared to those with no rejection (NR) (p=0.039 and p<0.001, respectively) or interstitial fibrosis/tubular atrophy (IF/TA) (p=0.035 and p=0.034, respectively). FOXP3-RNAmhigh (≥ 2.36 log10RNAm ) or FOXP3-proteinhigh (≥ 2.5 FOXP3+ cells/mm2) did not correlate with demographic or transplant variables, but patients with FOXP3-RNAmhigh had higher glomerular filtration rates (GFR) and tended to have a positive delta of GFR at last follow up. CD83+ DCs tended to be increased in biopsies with IF/TA as compared to NR (p=0.065), but were not associated to AR. Patients with FOXP3-RNAmhigh had more CD83+ DCs on biopsy: 0.86 (0.25-4.0) vs. 0.44 (0-1.12) cells/mm2, p=0.032. The cumulative 5-year graft survival of these renal allografts was not influenced by FOXP3 mRNA expression (p=0.69, log-rank test). Neither FOXP3 mRNA or protein were predictors of graft survival, only higher eGFR at biopsy was a protective factor against graft loss. Conclusions: This study gives support for performing FOXP3 molecular analysis in archival tissue of renal graft biopsies, where FOXP3 mRNA and protein had a good correlation. As expected, there was an increased FOXP3 expression in biopsies with AR, and biopsies with FOXP3-RNAmhigh associated with greater number of dendritic cells. In this cohort, FOXP3 was not associated with better renal graft outcomes.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) maristela_hernadez_ioc_dout_2007.pdf: 1703579 bytes, checksum: c6aea9db2011c8948799e66defbf0152 (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os receptores da família LILR (Leukocyte Immunoglobulin- like Receptor) pertencem à superfarm1ia .das imunoglobulinas e são expressos em células de origem mielóide e linfóide. Os receptores inibidores (LILRB) apresentam longos domínios citoplasmáticos contendo de 2 a 4 domínios ITIM e são capazes de inibir ativação celular recrutando proteínas tirosinas fosfatases SHP-I. Já os receptores ativadores (LILRA) apresentam curto domínio citoplamático mas após associação com a cadeia gama do receptor Fc, que apresenta domínio ITAM, são capazes de transduzir sinais estimulatórios às células. Já foi demonstrado que LILRB I e LILRB2 podem inibir a citotoxidade de células NK e aumentar o limite de ativação de linfócitos T. Pouco se sabe a respeito da função dos receptores ativadores. No entanto. foi observado que LILRA2 estava com a expressão gênica aumentada nas lesões dos pacientes de hanseníase do polo lepromatoso. A função deste receptor foi investigada e os possíveis efeitos do Mycobacterium leprae sobre a ativação induzida por LILRA2 avaliados Foram realizados experimentos de "cross-linking" em células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC). Inicialmente, foi observado que após a estimulação àtravés de LILRA2 ocorria aumento no conteúdo de proteínas tirosina fosforiladas, sugerindo haver transdução de sinal. Também foi observado que as MDDC estimuladas via LILRA2 apresentavam marcadores de ativação celular, como a expressão de CD83, aumento na expressão de moléculas co-estimulatórias e do MHC. Foi observado ainda que a ativação de LILRA2 não induz a secreção de níveis significativos das citocinas. No entanto, um forte efeito sinergístico na secreção de TNF e IL-IO pode ser observado quando as células eram estimuladas via LILRA2 e TLR4 ou CD40. Foi observado ainda que após o "cross-linking", as MDDC apresentam forte capacidade aloestimulatória. A presencade células LILRA2+ CD68+ nas lesões dos pacientes lepromatosos foi detectada utilizando microscopia confocal. Nos experimentos subseqüentes foi avaliado se o M. leprae ativaria as MDDC e modularia a ativação induzida por LILRA2. Inicialmente observamos que as MDDC estimuladas com M. tuberculosis, mas não com M. leprae, secretam TNF Baixas concentrações de IL-IO foram encontradas nas culturas estimuladas com M. leprae quando comparadas às culturas estimuladas com M tuberculosis. E ainda, o M. tuberculosis, mas não o M. leprae, teve efeito sinergístico com LILRA2 na produção de TNF. Na tentativa de encontrar o ligante deste receptor, foi gerado um tetrâmero e sua ligação a diversos tipos celulares foi testada. Interação do tetrâmero com monócitos estimulados com IL-4 e também MDDC foi detectada. Embora experimentos de imunoprecipitação tenham sido realizados, o ligante não foi encontrado. Até o momento, já observamos que a LILRA2 pode favorecer a maturação de MDDC, pelo menos in vitro, e contribuir para aumentada produção de citocinas. O M. leprae não parece ser um potente ativador das células dendríticas e ainda pode limitar a ativação induzida por outros receptores. A elevada expressão de moléculas coestimulatórias, a presença de IL-I O e ausência de IL-12 nas MDDC estimuladas com M. leprae ou via LILRA2 sugere que estes podem estar envolvidos na indução de tolerância observada nos pacientes lepromatosos / LILR (Leukocyte Immunoglobulin- like Receptor) are a family of receptors from the immunoglobulin superfamily expressed on myeloid and lymphoid cells. LILR are characterized by either 2 or 4 homologous Immunoglobulin-like dom ais. One subset of receptors, LILRB, displays long citoplasmatic tails containing immuno receptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIM). These receptors inhibit cell activation by recruiting protein tyrosine phosphatase SHP-1. Another subset of receptors, LILRA, contains short cytoplasmatic domain that lack recognizable docking motifs for signalling mediators. These rece ptors associate with the gamma chain of the Fc receptor, which transduces stimulatory signals b y recruiting protein tyrosine kinases through a cytoplasmatic immunoreceptor tyrosine-based activat ion motif (ITAM). A third subset of receptors has no transmembrane domain and is secret ed as a soluble receptor. Some of these receptors, LILRB1 and LILRB2, are specific receptor s for MHC class I molecules. LILRBs have been shown to inhibit cell activation in several ex perimental systems. Little is know about the activating receptors. LILRA2 was found to be up-reg ulated in lesions of lepromatous leprosy patients. In order to clarify whether this receptor might influence the immune response in leprosy, the function of this receptor was investigated. Cro ss-linking of LILRA2 on dendritic cell (DC) caused an up-regulation on protein tyrosine phospho rylation, suggesting LILRA2 stimulates intracellular signaling. Upon cross-linking, DC exp ress high levels of MHC I and II and co- stimulatory molecules, but cytokines were not detec ted on culture supernatant. However, a strong synergistic effect on TNF and IL-10 production was observed when cells were simultaneously stimulated by LILRA2 and TLR4 or CD40. LILRA2 activ ated DC also induced allogeneic T lymphocytes proliferation. By double immunofluoresc ence labeling, it was identified that LILRA2 is expressed on macrophage-like CD68+cells i n lepromatous leprosy skin lesions. The capacity of M. leprae to induce DC activation and/or to modulate LILRA2- induced activation was further investigated. In functional experiments it was observed that M. tuberculosis but not M. leprae stimulated cells induce TNF secretion. IL-10 was d etected on M. leprae -stimulated cultures, albeit at lower level than that of M. tuberculosis -stimulated cells. M. leprae had no synergistic effect on LILRA2 activated cells. To id entify LILRA2 ligand, a tetramer was generated and it’s binding to different cell types was tested. The tetramer interacted with IL-4 stimulated monocytes and DC. Although Immunoprecipi tation experiments were preformed, the ligand was not successfully identified. The data ob tained so far indicates that LILRA2 activation enhances DC maturation markers expression and cytok ine secretion by activated DC. M. leprae is not a potent DC activator. The high surface levels of co-stimulatory molecules, the presence of IL-10 and absence of IL-12 suggest that DC stimulat ed by M. leprae or LILRA2 are only partially activated and they might contribute to lepromatous leprosy tolerance

Made available in DSpace on 2016-03-04T14:02:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 priscila_andrade_ioc_dout_2014.pdf: 6946480 bytes, checksum: 1eca06682311d8d83fb18d7d32053a36 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Na hanseníase, a reação reversa (RR) é considerada um fenômeno de reativação imune, no qual uma resposta inflamatória abrupta se inicia, comprometendo a pele e os nervos periféricos. A RR ocorre ao longo do espectro da hanseníase, sendo descrita, inclusive, nas formas anérgicas lepromatosas (LL) subpolares. É sugerido que nas formas reacionais, células imunes da pele como macrófagos e células dendríticas, se tornam ativadas espontaneamente e iniciam uma resposta imune contra componentes do Mycobacterium leprae (ML), o que levaria a quebra da imunossupressão pré-existente. O objetivo desse estudo é caracterizar as populações celulares que constituem as lesões de pele L-lep (BL e LL) antes e no início da RR, assim como, determinar a programação genética envolvida na quebra da anergia tecidual nesse grupo durante esse episódio. O início da RR altera drasticamente a organização e morfologia da lesão L-lep, levando ao aparecimento de novas estruturas e tipos celulares, como células epitelioides, granulomas e uma grande diversidade fenotípica de macrófagos e células dendríticas. O marcador de células dendríticas plasmocitoides, CD123, foi mais expresso em lesões de pele RR do que no tecido não reacional, com a população CD123+ exibindo tanto marcadores fenotípicos de macrófagos quanto de células dendríticas. Por sua vez, o ML pôde induzir a expressão dessa molécula in vitro A análise de expressão gênica mostrou um aumento dos níveis de RNA mensageiro da interleucina-3 (IL-3), fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), fator de necrose tumoral-\03B1 (TNF\03B1), interferon-\03B3 (IFN-\03B3), indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), interleucina-15 (IL-15), receptor de vitamina D (VDR), quimiocina CXCL10 e receptor Toll-like 2 (TLR2) nas lesões RR quando em comparação com o grupo L-lep. Em síntese, nosso estudo demonstrou que o microambiente da lesão RR favorece a diferenciação e plasticidade celular, além de exibir uma variedade de populações mielomonocíticas, destacando o papel das células CD123+ e de um eixo de ativação dependente de IL-3 durante a RR / In leprosy, type 1 reaction (T1R) is considered a Th1 immune reactivation in which a sudden inflammatory response takes place that compromises t he skin and peripheral nerves. T1R occurs across the leprosy clinical spectrum and has even been d escribed in the anergic subpolar lepromatous (LL) forms. It is hypothesized that in the T1R forms, skin immune cells such as macrophages and dendritic cells (DCs) become activated, which in turn could initiate a local innate immune response against the exi sting Mycobacterium leprae (ML) components, overwhelm ing the predominant immunosuppressive state. The aim of the present study is to characterize the skin cellular populations that constitute the BL and LL (L - lep) skin lesion before and during the T1R epis ode , as well as to determine the gene programming involved in the disruption of the tissue immunosuppression brought about by this phenomenon. The outset of T1R drastically alters the morphological landscape of the LL skin lesion, leading to the appearance of new structures and cell types such as epithelioid granulomas and a wide variety of macrophagic and DC phenotypes. The plasmacytoid DC marker, CD123, was more intensely expressed in T1R skin lesions than in non - reactional tissue, with CD123 + cells exhibiting both macrophag ic and DC phenotypic markers. In turn, ML, but not TNF - α, was able to increase CD123 expression while gene expression analyses demonstrated IL - 3, M - CSF , GM - CSF , TNF α , IFN - γ , IDO , IL - 15 , VDR , CXC L 10, and TLR2 upregulation in the T1R lesions in comparison to the non - reactional group. In summary , our study showed that the T1R lesion environment favors cell differentiation and plasticity in addition to displaying a high diversity of myelomonocytic populations and highlighting the role of CD123 + cells and the IL - 3 axis during the progression of T1R.

Made available in DSpace on 2016-03-08T14:03:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 mariana_gandini_ioc_dout_2014.pdf: 15196987 bytes, checksum: 785cdc40cbdacbdb42278c64af49aee2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus dengue é um flavivírus causador de síndrome febril hemorrágica, sendo alguns casos graves evidenciados pelo acúmulo de plasma nas cavidades. Sugerese que a intensa replicação viral na fase aguda resultaria na intensa produção de mediadores inflamatórios, levando ao extravasamento plasmático. A imunidade inata é uma importante barreira na limitação da dispersão viral. As células dendríticas plasmacitoides (PDCs) e as células NK são fundamentais durante a fase inicial das infecções por suas características antivirais e citotóxicas contra células infectadas. O fenótipo \201CKiller\201D das PDCs (IKPDCs) resultaria da ativação viral e é caracterizado pela expressão membranar do ligante indutor de apoptose relacionado ao fator de necrose tumoral (TRAIL) e pela produção de interferons do tipo I. As células NK podem ser diretamente ativadas reconhecendo as células alvo ou, indiretamente ativadas pelas citocinas (como os interferons) tornando-se citotóxica, expressando TRAIL membranar. Apesar do papel antiviral, pouco se sabe sobre os mecanismos de ação dessas populações celulares durante a febre do dengue (FD). Nosso objetivo foi estudar o envolvimento das PDCs e células NK ativadas na imunopatologia da FD. Analisando as células de pacientes ex vivo, observamos maior frequência de IKPDCs nos casos brandos de FD, assim como de células NK TRAIL+. Outros marcadores de ativação como o marcador de degranulação CD107a e o receptor de reconhecimento padrão TLR3 foram expressos em maiores níveis nos pacientes comparando aos controles saudáveis As citocinas relacionadas a ativação celular - IFN\03B1, TRAIL solúvel e IL12 - foram correlacionadas com os quadros brandos. Em modelos in vitro, o DENV induziu a transformação das PDCs em IKPDCs, em via dependente dos endossomos e da dose viral. Além disso, as IKPDCs reduziram a detecção de antígenos virais em modelos de cocultura com monócitos humanos infectados, em mecanismo dependente da via dos interferons do tipo I e independente de TRAIL. As células NK foram capazes de expressar TRAIL durante estimulação in vitro tanto estimuladas pelo DENV2 quanto pelo IFN\03B1, sugerindo mecanismos de ativação indireta da população. Assim, observamos que o DENV pode ativar ambas as populações. A relação entre a maior ativação das PDCs e células NK promoveria maior limitação da dispersão viral, contribuindo para diminuir a intensidade da resposta inflamatória. Sugerimos então que a ativação do eixo antiviral PDCs-Células NK contribuiria para proteção dos quadros graves durante a dengue / Dengue virus is a flavivirus that can cause a hemorrhagic febrile syndrome, in which some severe cases are characterized by plasma accumulation in cavities. It is suggested that a high viral burden in the acute phase would lead to an enhanced production of inflammatory mediators, leading to plasma leakage. Innate immunity is an important barrier limiting viral spread. Plasmacytoid dendritic cells (PDCs) and NK cells are main actors in the beginning of infection because of their antiviral and cytotoxic features against infected cells. PDC killer phenotype (IKPDCs) is induced by viral activation and main profile is membrane expression of TNF-related apoptosis-inducer ligand (TRAIL) and type I interferon production. NK cells can be activated directly, by target recognition, or indirectly, by cytokines (like interferons) and become cytotoxic, expressing membrane TRAIL. Despite its antiviral role, the function of those cell populations during dengue fever (DF) is not largely known. Our aim was to study activated PDCs and NK cells involvement in DF immunopathology. DF patients’ cells analysis ex vivo presented higher frequency of IKPDCs and also higher frequency of TRAIL+NK cells in mild DF cases. NK activation markers such as CD107a degranulation marker and pattern recognition receptor TLR3 were upregulated in patients’ cells compared to healthy donors. Cytokines – IFNα, soluble TRAIL, IL12 – related to cell activation were upregulated in mild DF cases. In vitro models show DENV induced transformation of PDCs into IKPDCs, in endosome and viral-dependent pathways. Besides, IKPDCs could reduce viral antigen detection on co-culture models with human infected monocytes, in a type I interferon-dependent, TRAIL-independent mechanism. DENV-stimulated and IFNα-stimulated NK cells were able to express TRAIL in vitro, suggesting an indirect activation of cells. Therefore, we observed DENV-induced activation of both populations studied. A higher activation of PDCs and NK cells would promote limited viral spread, resulting in dimished inflammatory response. Then, we suggest that activation of antiviral axis PDCs-NK cells would promote protection against severity during dengue

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-23T21:08:48Z No. of bitstreams: 1 2016_NataliaGilJaramillo.pdf: 4120292 bytes, checksum: fb6ec765888c19b556a05de5def2b1e4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-10-17T16:31:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_NataliaGilJaramillo.pdf: 4120292 bytes, checksum: fb6ec765888c19b556a05de5def2b1e4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-17T16:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_NataliaGilJaramillo.pdf: 4120292 bytes, checksum: fb6ec765888c19b556a05de5def2b1e4 (MD5) / As células dendríticas (DCs) são um dos mais importantes componentes do sistema imunológico e desempenham funções essenciais como reconhecimento do antígeno no local da infecção bem como sua internalização e apresentação de forma eficiente. Estas células tem papel central na ligação das respostas imunes naturais e adquiridas contra Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. As DCs podem modular a resposta imunológica do hospedeiro, dependendo da sua subpopulação, do seu nível de maturação, das citocinas presentes no meio e do receptor dessas células envolvido nas interações com o T. cruzi, influenciando o desenvolvimento das formas clínicas da doença. Dentro desde contexto, esta dissertação apresenta a padronização da obtenção de DCs provenientes de monócitos de três doadores voluntários e otimização da diferenciação da forma tripomastigota metacíclica (TM) do parasito in vitro para posterior interação entre ambas as células e extração do RNA total para sequenciamento e montagem do transcriptoma por duplicata. Entre as cepas G e CL Brener de T. cruzi, a 2ª mostrou um melhor rendimento no que diz respeito a velocidade de crescimento em cultura, porcentagens finais de metaciclogênese e taxa de infecção. Durante a obtenção e diferenciação das DCs, três técnicas foram aplicadas para confirmação, incluindo citometria de fluxo, visualização em microscópio óptico e de fluorescência. O tempo estabelecido para interação parasito-célula hospedeira foi de 12 h, depois de transcorrido esse tempo obteve-se 39% de taxa de infecção, média de 2,4 amastigotas/DC infectada e 80% de DCs infectadas ativadas contra 47% das células controle. O passo seguinte foi a extração do RNA total das amostras controle e infectadas para sequenciamento e a montagem dos reads. Os resultados provenientes deste processo mostram ser confiáveis devido à cobertura satisfatória dos reads dentro do genoma humano com ~23.000.000 reads por amostra, e ao coeficiente de correlação próximo a 1 entre as duplicatas, fortes indícios da qualidade dos dados. A obtenção de uma visão detalhada da biologia das células apresentadoras de antígenos após os contatos iniciais com T. cruzi poderá proporcionar novos alvos para o tratamento da doença e ajudará no entendimento da evolução diferencial da doença nos pacientes e nos mecanismos de resistência e tolerância ao T. cruzi. / Dendritic cells (DCs) are one of the most important components of human immunologic system and are able to develop essential functions like antigen recognition at the infection site and its internalization and presentation are accomplished with high efficiency. These cells play a central role in linking natural and acquired immune response against Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. DCs can modulate host immunologic response depending on their subset, maturation level, cytokine milieu and DC receptor involved in the interactions with T. cruzi, influencing the development of the disease clinic forms. Therefore, this dissertation presents the standardization of DCs derived from monocyte obtained from three voluntaries and the optimization of in vitro metacyclic trypomastigote form differentiation to proceed to interaction between both cells and subsequently total RNA extraction for sequencing and transcriptome assembly. Among G and CL Brener T. cruzi strains, the second yielded more with respect to culture grow velocity, final metacyclogenesis percentages and infection rate. During DCs obtainment and differentiation, three technics were applied to confirmation, including flow cytometry and optic or fluorescence microscopy visualization. A parasite-host cell interaction time of 12 h was established and after it, infection rates of about 39%, an average of 2.4 amastigotes/infected DC were obtained and also 80% of DCs from infected assays were activated. The next step was extraction of total RNA from control and infected samples for sequencing and assembly of the reads accordingly to human reference genome. These results showed good reliability because of the satisfactory human genome coverage obtained with ~23,000,000 reads per sample, and correlation coefficient of ~1 between duplicates, which are strong indications of data quality. A detailed vision of antigen presenting cells biology after initial contacts with T. cruzi could provide new targets for the disease treatment and it will help understanding the differential evolutions of Chagas disease in patients and in resistance and tolerance to parasite.

Orientador: Silvana Regina Perez Orrico / Resumo: Diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica importante caracterizada pela ausência de secreção e/ou ação deficiente da insulina, resultando em hiperglicemia crônica e persistente que é a principal característica do DM. A influência do diabetes sobre as doenças periodontais é amplamente documentada e reconhecida demonstrando que a desregulação da resposta imune associada ao diabetes afeta a interação microbiota-hospedeiro no periodonto, aumentando a severidade e extensão da destruição dos tecidos periodontais. Considerando o papel crucial das células dendríticas (DC) no desenvolvimento e regulação da resposta imune e da relativa escassez de informação sobre a influência específica de concentrações elevadas de glicose nas células imunes, investigou-se a hipótese de que a elevada glicose influencia a biologia de DCs. Especificamente, avaliamos a influência da alta de glicose sobre a proliferação e viabilidade, a apoptose, a maturação, a quimiotaxia, a migração para os linfonodos (homing), atividade fagocitária, expressão de mediadores inflamatórios e produção de espécies reativas de oxigénio (ROS). Foram utilizadas células dendríticas de linhagem murina (DC2.4), que foram expostas a concentração elevada (25 mM) ou normal (11,1 mM) de glicose, por períodos que variaram de 24 a 72 h. A exposição à alta glicose reduziu a proliferação mas não afetou a viabilidade, a sobrevivência ou a maturação de células DC2.4 induzida por LPS; no entanto a susceptibilidade à apoptose foi aume... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Diabetes mellitus (DM) is a major metabolic disorder characterized by the absence of secretion and/or impaired insulin action, resulting in chronic and persistent hyperglycemia which is the main characteristic of DM. The effect of diabetes on periodontal diseases is widely recognized and documented demonstrating that dysregulation of the immune response associated with diabetes affects microbial-host interaction in the periodontium, increasing the severity and extent of the destruction of the periodontal tissues. Considering the crucial role of dendritic cells (DCs) in the development and regulation of immune response and the relative scarcity of information on the specific influence of high glucose concentrations on immune cells, we investigated the hypothesis that high glucose influences the biology of DCs. Specifically, we assessed the influence of high glucose on proliferation and viability, apoptosis, maturation, chemotaxis, migration to the lymph nodes (homing), phagocytic activity, expression of inflammatory mediators and production of reactive oxygen species (ROS). We used a murine dendritic cell line (DC2.4), which was exposed to high (25 mM) or normal (11.1 mM) glucose concentrations for periods ranging from 24 to 72 h. Exposure to high glucose reduced proliferation but did not affect viability, survival or LPS-induced maturation of DC2.4 cells; however susceptibility to apoptosis was increased. High glucose also reduced phagocytic activity, chemotaxis and homing to lymph nodes in vivo. On the other hand, production of ROS and gene expression of inflammatory mediators were increased by high glucose. Collectively, the effects of high glucose on dendritic cell biology are consistent with a decrease on immune activating role of DCs and an exacerbation of local inflammation. / Doutor

Made available in DSpace on 2015-10-29T01:04:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000475919-Texto+Parcial-0.pdf: 381957 bytes, checksum: c63b236b74973994f585b6bd7db08855 (MD5) Previous issue date: 2015 / Introduction : Respiratory Syncytial Virus (RSV) is a major cause of viral lower respiratory tract infection in children under two years of age. Memory CD8 T cell response to VSR does not provide an efficient and long-lasting immune response, so there are recurrent infections throughout life. The role of mTOR (mammalian target of rapamycin) and the purinergic receptor P2X7 in the memory CD8 T cell response during RSV infection has not been investigated. Objectives : To analize the effect of rapamycin on dendritic cells (DCs) during RSV infection, as well as to evaluate the role of P2X7 purinergic receptor in CD8 memory T cells response during RSV infection. Methodology : Bone marrow derived dendritic cells (BMDCs) differentiated from C57BL/6 P2X7-/- and C57BL/6 mice were infected with VSR virus and used to activate T cells purified from C57BL/6 P2X7-/- and C57BL/6 mice in vitro for 96 hours. In addition, BMDCs differentiated from C57BL/6 mice received 20ng/ml rapamycin during 1h prior infection. The following parameters were evaluated: BMDC cell death by apoptosis, memory cells markers by flow cytometry and RNA viral quantitation was performed by real time PCR. Results : Rapamycin treatment in RSV infected BMDCs decreases the frequency of CD8+CD44high cells and increases the level of viral RNA in DCs, but the rapamycin does not affect the viability of the infected dendritic cells. Furthermore, when BMDCs were treated with rapamycin, an increase of BMDC survival occurred, depending on the contact with the T cells. The absence of purinergic receptor P2X7 in T cells leads to a decrease in the frequency of CD8+CD122+KLRG1-, however the absence of purinergic receptor in infected BMDCs increases the frequency of CD8+CD122+ KLRG1- T cells. Conclusion : Our study suggests that P2X7 receptor is involved in memory CD8 T cell response. In addition our data indicated that mTOR inhibition increases the survival of BMDCs in a mechanism dependent on T-cell contact and also suggests that rapamycin treatment on dendritic cells during VSR infection affect CD8 T cell differentiation. / Introdução : O Vírus Sincicial Respiratório (VSR) é um dos principais causadores de infecção viral do trato respiratório inferior em crianças menores de dois anos de idade. A resposta de células T CD8 de memória para VSR não apresenta uma resposta imune eficiente e duradoura, por isso são recorrentes as infecções durante a vida. Até o momento não se tem o conhecimento sobre o envolvimento do mTOR (mammalian target of rapamycin) e do receptor purinérgico P2X7 na resposta de células T CD8 de memória durante a infecção de VSR. Objetivos : Investigar o efeito da rapamicina nas células dendríticas (DCs) durante a infecção viral, bem como, avaliar o efeito do receptor purinérgico P2X7 nas células dendríticas (DCs) infectadas com o vírus VSR na resposta de células T CD8 de memória. Metodologia : Células dendríticas diferenciadas de medula óssea (BMDCs) de camundongos C57BL/6 P2X7-/- e C57BL/6 infectadas com VSR foram utilizadas para ativar células T purificadas de camundongos C57BL/6 P2X7-/- e C57BL/6 durante 96 horas. Além disso, um grupo de BMDCs de camundongos C57BL/6 recebeu 20ng/mL de rapamicina durante 1h antes da infecção. As DCs foram marcadas para investigação de morte celular por apoptose, as células T marcadas para análise células de memória e a quantificação do RNA viral foi realizada através de PCR em tempo real. Resultados : O tratamento com o inibidor de mTOR nas BMDCs infectadas pelo VSR diminuiu a geração de células T CD8+ CD44high e aumentou os níveis de RNA viral nas DCs, porém a rapamicina não influenciou a viabilidade das células dendríticas infectadas. Quando as BMDCs foram tratadas com rapamicina, houve um aumento de sobrevivência das células, dependente do contato com as células T. Na ausência do receptor purinérgico P2X7 nas células T, ocorreu uma diminuição na frequência das células T CD8+CD122+KLRG1-, entretanto a ausência do receptor purinérgico nas BMDCs infectadas aumentou a frequência destas células T CD8+CD122+KLRG1-.Conclusão : Nosso estudo sugere que o receptor P2X7 está envolvido na resposta de células T CD8 de memória durante a infecção pelo VSR. Além disso, sugere-se que as células dendríticas tratadas com rapamicina durante a infecção com VSR prejudica a diferenciação de células T CD8.

Made available in DSpace on 2016-01-15T01:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000477024-Texto+Completo-0.pdf: 18287406 bytes, checksum: a76247b63c9874ac8f9c628b100c9e0b (MD5) Previous issue date: 2015 / Dendritic cells (DCs) are the major antigen-presenting cells. They provide three main signals to fully activate T cells. Signal one is when the complex peptide:MHC (p:MHC) expressed by DC is recognized by T cell receptor; signal two is the expression of co-stimulatory molecules from the B7 family (CD80 and CD86). The third signal consists in the cytokines produced by DCs, which will bias the quality of T cell response. Once one of this signal is blocked/interrupted, T cells are not fully activated. T cells are involved in the eradication of pathogens, but also in the pathogenesis of several disorders and, strategies that modulate signal two are being used to treat these disorders. Novel therapies that inhibit the second signal (checkpoint blockade) or T cell modulation by these molecules have being used/tested to manage tumors, autoimmune disorders and transplant rejection. Our group demonstrated that the M. tuberculosis protein DnaK (prokaryote Hsp70) has an immunosuppressive role on DCs, and can suppress rejection in a murine skin allograft model. Nevertheless, the molecular mechanism involved in this response need to be further elucidated. In the present work, we demonstrated that the treatment of murine DC with DnaK could decrease the basal levels TNF-α, IFN-γ and MCP-1 produced by these cells. This modulation was concomitant with a downregulation of the transcription factors C/EBPβ and C/EBPδ in a TLR2-ERK-STAT3-IL-10-dependent way. Beyond the signal three, DnaK could also downregulate the expression of MHC II (signal one) and CD86 (signal theree) on DCs, through the induction of a molecule called MARCH1. We developed an-situ treatment of skin grafts with DnaK prior the transplant. We observed that this treatment prolongs allograft survival with a decreased alloimmunity, and this dependent on MARCH1.The molecular pathway TLR2-ERK-STAT3-IL-10 was required for MARCH1 induction by DnaK. Moreover, we found that DnaK modulates a specific skin migratory DC – the CD103+ DCs. This is the major subset involved in skin allograft rejection. We tested in which innate receptors DnaK could bind and found that DnaK could not bind directly on TLR2, but in the LOX-1 and Siglec-E receptor, in a LOX-1/Siglec-E/TLR2 complex. Finally, from the data obtained we patented a new formulation and method to treat allografts prior the transplantation. Thus, DnaK tolerizes dendritic cells through the modulation of the three signals required to activate T cells. We believe that consists an innovative strategy to treat inflammatory disorders, rejection, asthma and sepsis. / Células dendríticas (DCs) são as principais células apresentadoras de antígenos e fornecem três sinais principais para a ativação completa das células T. O primeiro sinal consiste na apresentação do complexo peptídeo:MHC; o segundo sinal é a expressão de moléculas co-estimulatórias da família B7, como o CD80 e CD86, e o terceiro consiste no conjunto de citocinas produzidas pelas DCs que irão moldar o tipo de resposta T que será gerada. Uma vez que algum desses dois sinais é interrompido as células T não são ativadas de forma completa e, ainda, podem entrar em anergia ou apoptose. As células T estão envolvidas não apenas em respostas de defesa, mas também em uma série de patologias, e estratégias que visam sua ativação ou inibição vem sendo usadas no manejo dessas doenças. Terapias que visam a inibição do segundo sinal (checkpoint blockade) ou a modulação das células T pelas moléculas co-inibitórias tem sido testadas e utilizadas para tumores, autoimunidade e transplantes. Nosso grupo demonstrou que a proteína DnaK (Hsp70 procariótica) de M. tuberculosis tem papel imunossupressor em células dendríticas e in vivo, podendo diminuir a rejeição de transplantes cutâneos em camundongos. Porém, os mecanismos envolvidos nessa resposta ainda precisam ser elucidados. No presente trabalho, mostramos que a DnaK foi capaz de diminuir a expressão basal de TNF-α, IFN-γ e MCP-1 em DCs de camundongos. Essa modulação foi concomitante com a diminuição de dois fatores de transcrição – C/EBPβ e C/EBPδ – de maneira dependente da via molecular TLR2-ERK-STAT3-IL-10 nas DCs. Além do terceiro sinal, a DnaK pode modular a expressão dos níveis de MHC II (primeiro sinal) e CD86 (segundo sinal) nas DCs, através da indução de uma molécula chave chamada MARCH1. Em um modelo murino de aloenxerto cutâneo, o tratamento local com a DnaK, antes do transplante, prolongou a sobrevida do enxerto e diminuiu a aloimunidade de maneira dependente de MARCH1.A indução de MARCH1 pela DnaK foi dependente da via molecular TLR2-ERK-STAT3-IL-10 nas DCs. Além disso, demonstramos que a DnaK modula exclusivamente um subtipo de DC migratório da pele – as DCs CD103+. Também observamos que esse subtipo de DC é o principal subtipo celular envolvido na rejeição de transplantes de pele, gerando um conceito biológico novo nessa área. Mapeamos os receptores inatos nos quais a DnaK pode se ligar. Testamos dez receptores inatos e vimos que essa proteína não se liga diretamente no TLR2, mas sim nos receptores LOX-1 e Siglec-E, formando o complexo LOX-1/Siglec-E/TLR2. Finalmente, a partir dos dados obtidos nessa tese, formulamos uma composição e um método para a modulação do enxerto antes da realização do transplante, e depositamos uma patente junto ao INPI. Portanto, a DnaK pode tolerizar as células dendríticas através da modulação dos três sinais necessários para a ativação das células T. Acreditamos que essa estratégia pode ser utilizada no tratamento de patologias inflamatórias, incluindo a rejeição a transplantes.