O objetivo do estudo foi avaliar, in vitro, a influência da fotobiomodulação (PBM) na, viabilidade e migração, relacionados à acetilação das histonas, e na diferenciação de células-tronco da polpa de dentes permanentes humanos (hDPSCs); e, in vivo, sua influência no reparo radicular de molares de ratos com necrose pulpar e rizogênese incompleta. hDPSCs foram caracterizadas e utilizadas nos experimentos de três artigos científicos. A PBM foi empregada utilizando-se laser diodo InGaAlP (100mW, 660nm, 3J/cm2, energia total por aplicação 1J em 10s). Em todos os experimentos in vitro os grupos foram divididos de acordo com o uso da PBM e os intervalos de irradiação foram de 6 horas. A viabilidade destas células foi avaliada pelo ensaio de MTT e a migração pelo scratch. A acetilação das histonas das hDPSCs foi avaliada por imunofluorescência. Para avaliar o potencial de diferenciação e a deposição de tecido mineralizado, foram utilizados os meios adipogênico, condrogênico e osteogênico, complementado pelo ensaio de atividade ALP, em modelo 3D, em gel de agarose 0,3%. Nos ensaios de diferenciação também foi avaliada a condição nutricional (regular: 10% SFB; ou déficit: 5%SFB). Os resultados do MTT, scratch e da acetilação das histonas foram obtidos em até 24 horas e nos ensaios de diferenciação foram analisados em 7 e 14 dias. Para o experimento in vivo, molares inferiores de ratos Wistar foram expostos ao meio bucal por 3 semanas e, após, tratados com pasta antibiótica por uma semana. A seguir, os canais foram irrigados e divididos em 6 grupos (n=6): MTA; coágulo sanguíneo (CS); hDPSC; MTA+PBM; CS+PBM; hDPSC+PBM. Dois grupos não foram expostos ao meio bucal: Dente hígido+PBM (n=6), Dente hígido (controle positivo, n=3); e um grupo foi mantido exposto durante todo o período experimental: Dente necrótico (controle negativo, n=3). Durante 30 dias as irradiações foram feitas com intervalos de 24 horas. Após, os ratos foram eutanasiados e realizou-se avaliação histológica e imunohistoquímica. Os dados obtidos foram tabulados e analisados estatisticamente. A PBM aumentou a viabilidade das células (P<0.001). No ensaio de scratch o grupo PBM acelerou o fechamento do ferida até 12 horas (P<0.001) e esta fechou em 18 horas, sendo mais rápido que o controle (P<0.05). A PBM aumentou a acetilação das histonas (P<0.001); Após 14 dias, a PBM intensificou a diferenciação nos três meios empregados e na atividade ALP, comparado com os controles (P<0.05). No estudo in vivo, o controle negativo apresentou infiltrado de neutrófilos maior do que os demais grupos (P<0.05). Os grupos Controle negativo, Dente hígido e Dente hígido+PBM apresentaram menos condensação fibrosa (P<0.05). Todos os grupos formaram mais tecido mineralizado que o controle negativo (P<0.05). PBM+MTA, +CS ou +hDPSC formaram mais tecido mineralizado que os grupos não irradiados (P<0.05). MTA+PBM induziu apicificação (P<0.05). A marcação para BSP confirmou os achados histológicos relacionados a formação de tecido mineralizado e as hDPSCs, com e sem PBM, exibiram maior porcentagem de células positivas para BSP. Conclui-se que a PBM desempenhou papel importante, in vitro, aumentando a diferenciação, viabilidade e migração celular que estão relacionados a acetilação das histonas. Além disso, a PBM pode ser uma alternativa de tratamento adjuvante para dentes permanentes com necrose pulpar e rizogênese incompleta favorecendo o reparo radicular. / The aim of this study was to evaluate, in vitro, the influence of photobiomodulation (PBM) on viability and migration, related to histone acetylation, and differentiation of human dental pulp stem cells (hDPSCs); and, in vivo, its influence on the root repair of rat molars with pulp necrosis and open apex. The hDPSCs were characterized and used in the experiments of three scientific papers. The PBM was applied using InGaAlP diode laser (100mW, 660nm, 3J / cm2, total energy per application 1J in 10s). In all in vitro experiments, the groups were divided according to the use of PBM, with 6-hour irradiation intervals. The viability of these cells was assessed by MTT assay and migration by scratch. The histone acetylationof hDPSCs was evaluated by immunofluorescence. To evaluate the potential for differentiation and deposition of mineralized tissue, adipogenic, chondrogenic and osteogenic mediums were used, complemented by the ALP activity assay in 3D model, in 0.3% agarose gel. In differentiation assays, the nutritional status was also evaluated (regular: 10% FBS; or deficit: 5% FBS). The MTT, scratch and histone acetylation results were obtained until 24 hours, and the differentiation assays were analyzed at 7 and 14 days. For the in vivo experiment, lower molars of Wistar rats were exposed to oral environment for 3 weeks and then treated with antibiotic paste for one week. Next the root canals were irrigated and divided into 6 groups (n=6): MTA; BC (blood clot); hDPSC; healthy tooth+PBM; MTA+PBM; BC+PBM; hDPSC+PBM. In hDSPC groups, 1% agarose gel scaffold was used for cell support. Two groups were not exposed to the oral environment: healthy tooth+PBM (n=6), healthy tooth (positive control, n=3); and one stayed exposed during the role experimental period: necrotic tooth (negative control, n=3). For 30 days the irradiations were done at 24-hour intervals. Thereafter, the rats were euthanized and histological and immunohistochemical evaluations were performed. Data were tabulated and statistically analyzed. PBM increased cell viability (P<0.001). In the scratch assay, the PBM group accelerated wound closure up to 12 hours (P<0.001) and closed at 18 hours, being faster than the control (P<0.05). PBM increased histone acetylation (P<0.001). After 14 days, PBM improved the differentiation in the three mediums employed and the ALP activity, compared to the controls (P<0.05). In the in vivo study, the negative control had greater neutrophil infiltrate than the other groups (P<0.05). Negative Control, Healthy tooth and Healthy tooth+PBM groups presented less fibrous condensation (P<0.05). All groups formed more mineralized tissue than the negative control (P<0.05). PBM+MTA, +BC or +hDPSC formed more mineralized tissue than non-irradiated groups (P<0.05). MTA+PBM induced inoculation (P<0.05). BSP labeling confirmed the histological findings related to mineralized tissue formation and hDPSCs, with and without PBM, exhibited a higher percentage of BSP-positive cells. It is concluded that PBM played an important role, in vitro, increasing differentiation, viability and cell migration that are related to histone acetylation. Moreover, the PBM may be an adjutant treatment alternative for permanent teeth with pulp necrosis and open apex, favoring root repair.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento / Made available in DSpace on 2012-10-26T10:14:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 310126.pdf: 1850967 bytes, checksum: 67fb92bdbc93e0e23a85bccd9bcc6cb5 (MD5) / A Célula-tronco (CT) é definida pela capacidade de autorrenovação e habilidade de se diferenciar em diversos fenótipos celulares. Nos últimos anos, vários estudos têm buscado a identificação e caracterização de CTs em tecidos adultos e extra-embrionários visando o desenvolvimento de alternativas para regeneração e reparo tecidual. Dentre as fontes de CTs adultas destaca-se a placenta, que além de desempenhar um papel crucial no desenvolvimento fetal, também é um importante reservatório de CTs mesenquimais (CTMs). A diferenciação de CTMs é um fenômeno ainda não totalmente esclarecido e influenciado pela atuação de diversas moléculas e pelo microambiente. Um grupo de proteínas de adesão conservadas evolutivamente que pode estar envolvido neste processo é o da família NEPH. Composta por NEPH1, NEPH2 e NEPH3, estas proteínas fazem parte da superfamília das imunoglobulinas (IgSF) e regulam a morfogênese de diferentes tecidos. Os ortólogos de NEPH têm sido amplamente caracterizados em vertebrados, onde atuam em diversos processos como no desenvolvimento neural, formação de sinapses e fusão de mioblastos. Além disso, vários estudos descrevem a expressão de NEPH1 e NEPH2 em diversos tecidos, o que apoia a hipótese de que tal expressão possa estar envolvida na diferenciação de CTs. Com isso, o enfoque deste trabalho foi comparar os níveis de expressão dos genes NEPH entre CTMs obtidas da placenta humana, no estado indiferenciado assim como após a indução à diferenciação adipogênica. As células da placenta utilizadas neste estudo apresentaram a expressão de marcadores de CTMs, a morfologia fibroblastóide esperada, bem como foram capazes de se diferenciar para o fenótipo adipogênico quando cultivadas em meio indutivo, caracterizando uma população de CTMs. Os resultados obtidos por RT-PCR em tempo real demonstraram que tanto as CTMs indiferenciadas quanto as induzidas para adipogênese apresentaram a expressão dos genes NEPH1 e NEPH2, sendo a expressão do gene NEPH1 75% mais alta nas CTMs induzidas à adipogênese do que nas células indiferenciadas. Com isso, sugerimos um papel do gene NEPH1 no processo de diferenciação das CTMs da placenta humana para adipócito. / The stem cell (SC), by definition, is undifferentiated and has the ability of self-renewal. SCs are also able to differentiate into diverse cell lineages. In recent years, several studies have searching for the characterization of SCs in adult and extra-embryonic tissues that could guide to develop strategies for tissue regeneration and repair. Among these tissues the placenta is an important source of adult SCs, being a reservoir of mesenchymal SCs (MSCs). Several biological signals and the environment influence the differentiation of MSCs, although this phenomenon is not yet fully understood. The NEPH protein family, which includes NEPH1, NEPH2 and NEPH3, is a group of evolutionarily conserved adhesion molecules that may be involved in this MSCs differentiation. These proteins are part of the immunoglobulin superfamily (IgSF) and regulate the morphogenesis of different tissues. The role of NEPH orthologs have been extensively characterized in vertebrates, where they act in neural development, synapse formation and myoblasts fusion. Moreover, several studies have described the expression of NEPH1 and NEPH2 in several tissues, supporting the hypothesis that they might be involved in SCs differentiation. Thus, the objective of this study was to compare the expression of NEPH genes between undifferentiated and differentiated MSCs obtained from human placenta. The placental cells used is this study comprise a population of MSCs, being characterized by the typical fibroblastic morphology, expression of MSCs markers and ability to differentiate into adipocytes when cultured in an inductive medium. Real time RT-PCR analysis demonstrated that both undifferentiated MSCs and MSCs differentiated into adipocytes express NEPH1 and NEPH2 genes. However, the expression of NEPH1 gene was 75% higher in MSCs differentiated into adipocytes than in the undifferentiated cells. In summary, our results suggest that NEPH1 gene may play a role in the differentiation of MSCs into adipocytes.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia / Made available in DSpace on 2012-10-26T10:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 304762.pdf: 556142 bytes, checksum: e9321f8494a89f03afcad3cd6a9ab4a9 (MD5) / A descoberta da presença de células-tronco em tecidos odontológicos abre uma nova frente de trabalho e de estudo aos cirurgiões-dentistas, uma vez que tecidos antes descartados poderão servir de base para a pesquisa científica e futura utilização clínica. Os avanços no conhecimento sobre células-tronco e na engenharia de tecidos têm aberto oportunidades para o estudo de novas estratégias para a regeneração de tecidos lesados ou perdidos na cavidade bucal. OBJETIVOS: Este trabalho teve como objetivos verificar a presença de células-tronco no saco pericoronário de dentes permanentes humanos subjacentes a dentes decíduos em fase final de rizólise e esfoliação, bem como isolar, expandir e caracterizar estas células-tronco. MATERIAL E MÉTODOS: O tecido da região central do saco pericoronário recobrindo a coroa do dente permanente, abaixo do decíduo em esfoliação, foi coletado com o auxílio de uma lâmina de bisturi. Também foi coletada a polpa do dente decíduo correspondente para o isolamento de células-tronco de polpa de dentes decíduos em esfoliação (SHED). As amostras do tecido pulpar e do saco pericoronário coletados foram colocados em cultura e as células-tronco isoladas pela técnica do explant. As células isoladas foram expandidas e submetidas à análise fenotípica por citometria de fluxo. Posteriormente, as mesmas foram avaliadas quanto ao potencial de diferenciação osteogênica, condrogênica e adipogênica. RESULTADOS: Os resultados das análises realizadas confirmaram que foi possível a obtenção de células-tronco a partir do saco pericoronário. As células-tronco do saco pericoronário do dente permanente subjacente ao decíduo em esfoliação (SUED) proliferaram em condições de cultura padrão e foram capazes de se diferenciarem em células de linhagem adipogênica, condrogênica e osteogênica. As células SUEDs e SHEDs tiveram marcação fenotípica semelhante e condizente com as marcações esperadas para células-tronco mesenquimais (MSCs). Foi necessário um tempo menor de cultura entre P0 e P1. nas amostras de saco pericoronário, em relação às amostras de polpa, talvez por permitir um volume tecidual inicial maior. CONCLUSÃO: Pode-se concluir que o saco pericoronário de dentes permanentes subjacentes aos decíduos em esfoliação possuem células-tronco mesenquimais indiferenciadas com capacidade de diferenciação em diversos tecidos, sendo mais uma fonte viável para a obtenção de células-tronco mesenquimais com mínima morbidade. / The discovery of stem cells in dental and oral tissues widens the possibility of work and study for dental surgeons, as tissues that were usually discharged can now be used as basis of scientific research and for future use in clinics. Advances in the knowledge of stem cells and tissue engineering represent opportunities for the study of new strategies to regenerate damaged or missing tissues of the oral cavity. AIMS: to evaluate the presence of stem cells in the pericoronal bag tissue of human permanent teeth underlying deciduous teeth at their final stage of root resorption and exfoliation, as well as to isolate, expand and characterize these stem cells. MATERIAL AND METHODS: Tissue from the central region of the pericoronal bag covering the crown of permanent teeth, underneath exfoliating deciduous teeth, was collected with the aid of a scalpel. Additionally, pulps of the corresponding deciduous teeth were collected for isolation of stem cells from exfoliated deciduous teeth (SHED). Samples of pulp and pericoronal bag tissues were separately put in culture medium and stem cells were isolated through the explant technique. The isolated cells were expanded and underwent both phenotypical and differentiation analyses. RESULTS: It was possible to obtain stem cells from the pericoronal bag of permanent teeth underlying exfoliated deciduous teeth (SUED), which proliferated in standard culture conditions and were able to differentiate in adipogenic, chondrogenic and osteogenic cell types. SUED and SHED cells showed similar phenotypic profiles that matched the expected features of mesenchymal stem cells (MSCs). A shorter time of culture between P0 and P1 was required in samples of pericoronal bag when compared with pulp samples, perhaps because it allows for a larger initial tissue volume. CONCLUSION: It can be concluded that the pericoronal bag of permanent teeth underlying deciduous teeth in exfoliation hold indifferentiatied mesenchymal stem cells in various tissues. Therefore, it is another viable source of mesenchymal stem cells with minimum morbidity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-06-25T20:17:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 315204.pdf: 3762352 bytes, checksum: 2e50a1c177ecfeca603e388d031c121b (MD5) / As células tronco mesenquimais (CTMs) apresentam características como a multipotencialidade, auto-renovação e rápida expansão in vitro que as colocam numa posição estratégica e promissora para o uso em terapias celulares e na medicina regenerativa. A pele representa uma fonte de CTMs abundante, acessível e menos suscetível a questionamentos éticos. Atualmente, as células tronco mesenquimais da derme humana (CTMDH) tem sido pesquisadas quanto a sua habilidade em agir na cura, regeneração e reparo do tecido lesionado. O comportamento celular está intimamente associado ao complexo microambiente tridimensional presente no tecido nativo. Nesse sentido, scaffolds, feitos de polímeros naturais ou sintéticos, biocompatíveis e biodegradáveis vem sendo desenvolvidos. O hidrogel de carragenana tem atraído grande interesse devido a sua estrutura 3D e biocompatibilidade, conseguindo assim, mimetizar o microambiente encontrado pelas células in vivo. O presente trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um modelo para o cultivo de CTMDH, baseado na utilização do hidrogel produzido a partir de carragenana extraída da alga vermelha Kappaphycus alvarezii, cultivada no litoral do estado de Santa Catarina. Para isto, isolamos CTMDH a partir de fragmentos oriundos de cirurgias de lifting facial. Estas células foram cultivadas sob dois modelos: (1) CTMDH foram cultivadas sobre o hidrogel de carragenana; (2) CTMDH foram cultivadas encapsuladas em hidrogéis de carragenanas nativa e comercial (Sigma®). Os resultados do cultivo das CTMDH sobre o hidrogel de carragenana mostraram que nesta condição as células formaram dermo-esferas, as quais permaneceram em suspensão e num estado quiescente, com baixa taxa proliferativa. Devido a este comportamento atípico, as dermo-esferas foram transplantadas para placas de plástico. Nesta condição verificamos que as dermo-esferas conseguiram aderir e proliferar em superfície plástica. Elas também apresentaram marcação positiva para os marcadores de pluripotencialidade e para marcadores de CTMs diferenciadas. Além disso, estas células mantiveram a expressão dos antígenos característicos de CTMs e capacidade de diferenciação nos fenótipos adipogênico e osteogênico. Por outro lado, quando as CTMDH foram encapsuladas nos hidrogéis de carragenanas observou-se que as células apresentaram morfologia arredondada, apresentando pouca interação com gel. O ensaio de viabilidade por MTS e Qtracker demonstrou que no sétimo e oitavo dia há um aumento no número de células viáveis, porém no décimo quarto dia a viabilidade celular decai consideravelmente. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostrou que a microestrutura dos hidrogéis de carragenanas é composta por uma estrutura altamente porosa. Desta forma, concluímos que o modelo de cultivo sobre o hidrogel de carragenana não apresentou desempenho satisfatório para sustentar a adesão, proliferação e sobrevida das CTMDH. Por outro lado, verificamos que foi possível desenvolver um bom modelo 3D com a técnica de encapsulamento das CTMDH em hidrogéis de carragenanas nativa e comercial.<br> / Abstract : Mesenchymal stem cells (MSCs) exhibit features such as multipotentiality, self-renewal and rapid expansion in vitro that place them in a promising and strategic position for use in cell therapy and regenerative medicine. The skin represents an abundant source of MSCs, readily accessible and less susceptible to ethical questions. Currently, mesenchymal stem cells from human dermis (MSCHD) are being researched for its ability to act in healing, regeneration and injured tissue repair. The unique cell behavior is closely related to the complex three-dimensional microenvironment present in native tissue. Thus, scaffolds made of natural or synthetic polymers, biocompatible and biodegradable are being developed. Carrageenan hydrogel has attracted great interest due to its 3D structure and biocompatibility. This study aimed to develop a model for growing MSCHD based on the use of a hydrogel made from carrageenan, a polysaccharide extracted from red seaweed Kappaphycus alvarezii grown on the cost of the state of Santa Catarina. MSCHD were obtained from fragments originated from facial-lifting. These cells were cultured in two models: (1) MSCHD were cultured on carrageenan hydrogel; (2) MSCHD were cultured encapsulated in native and commercial (Sigma®) carrageenan hydrogels. The results revealed that MSCHD cultured on carrageenan hydrogel formed dermo-spheres, which remained in suspension and in a quiescent state, with low proliferative rate. Due to its unusual behavior the dermo-spheres were transplanted to plastic dishes. In this condition we found that the dermo-spheres were able to adhere and proliferate on the plastic surface. Furthermore, dermo-spheres showed positive staining for markers of pluripotency and MSC differentiation. In addition, these cells maintained the expression of characteristic antigens of MSC and the ability to differentiate into osteogenic and adipogenic phenotypes. On the other hand, when MSCHD were encapsulated in native and commercial carrageenan hydrogels, they exhibited a rounded morphology displaying little interaction with the gels. The viability test by MTS and Qtracker demonstrated that in the seventh and eighth day there was an increase in the number of viable cells. However, in the fourteenth day cell viability decreases considerably. Scanning electron microscopic (SEM) revealed that carrageenan hydrogels microstructure is composed of a highly porous structure. Thus, we conclude that the culture of MSCHD on carrageenan hydrogel had not provided satisfactory performance to support adhesion, proliferation and cell survival. On the other hand, we were able to develop a good 3D model using encapsulation technique of MSCHD in native and commercial carrageenan hydrogels.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2013 / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:05:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 319594.pdf: 1052362 bytes, checksum: 0a20e8a17447a2c7e3f68fb2d8cfd7ad (MD5) / A formação dentária ocorre através de interações sequenciais entre o epitélio oral e o mesênquima facial. O epitélio oral dá origem aos ameloblastos, enquanto a formação da polpa dentária é derivada das células mesenquimais. A maior parte do tecido mesenquimal na região cefálica é formado pelas células da crista neural (CN). A CN compreende uma população de células altamente multipotentes. Células tronco com característica da CN vem sendo encontradas em vários tecidos adultos como na polpa dentária humana de dentes permanentes. As células tronco encontradas na polpa dentária apresentam potencial de utilização para fins terapêuticos em diversas áreas médicas. Neste trabalho, avaliamos o potencial de diferenciação celular da polpa dentária, in vivo e in vitro, durante o desenvolvimento embrionário e em adultos. Para esse fim, lâminas histológicas de dentes de ratos foram analisadas, através de imunohistoquímica, em 3 fases do desenvolvimento: idade fetal de 17 dias (F17), 4 dias após o nascimento (D4) e em idade adulta. As análises ocorreram por imunohistoquímica para os marcadores de pluripotencialidade (Oct4 e Nanog) e de CN (Sox10, HNK1 e p75). Além disso, células da polpa dentária humana obtida de terceiros molares de indivíduos adultos foram analisadas por RT-PCR para os mesmos marcadores de pluripotencialidade e para os marcadores de CN Sox10, p75, Nestina e Snail. Estas células foram ainda cultivadas em meio de cultura padrão (aMEM acrescido de SFB a 10%) e meio indutivo neural (MCTN) e analisadas por imunocitoquímica para os marcadores de pluripotencialidade descritos acima, marcadores neurais (Nestina e ßTubulina III) e marcador mesodermal (aSMA) e ainda para a capacidade de originar Unidades Formadoras de Colônias (UFCs). Os resultados demonstram que as células da PD de ratos expressam os marcadores de pluripotencialidade Oct4 e Nanog, assim como o marcador de CN Sox10, em F17, D4 e no adulto. Marcação para p75 e HNK1 foram observados em D4 e no adulto respectivamente. Os resultados demonstraram ainda que as células da PD adulta de humanos apresentam expressão gênica dos marcadores de pluripotencialidade analisados e de CN Sox10, Snail e Nestina. Após cultivo, a células de apresentam expressão proteica de OCT4, dos marcadores neurais (ectodermais) ßTubulinaIII e Nestina, e de músculo liso (mesodermal) aSMA. Além disso, as células de PD apresentam capacidade clonogênica, originando colônias com potencial ectomesenquimal (com células positivas para aSMA, ßTubulinaIII e Nestina). O cultivo em meio indutivo neural promoveu alterações morfológicas, e diminuição na proporção de células positivas para aSMA. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a PD contém população de células multipotentes, clonogênicas com potencial ectomesenquimal, aparentando estarem presentes desde o início do desenvolvimento até a fase adulta. Ao mesmo tempo, essas células apresentam potencial de diferenciação neural. Desse modo, nossos dados demonstram que as células da PD apresentam um real potencial terapêutico.

Tese (doutorado)- Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:06:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317837.pdf: 1961780 bytes, checksum: 885bb54ecd406938422355f7772f13f4 (MD5) Previous issue date: 2013 / As células-tronco (CTs) são células indiferenciadas com habilidade de se autorrenovar, e que em condições apropriadas podem gerar diversos tipos celulares maduros. As células da placenta possuem características morfológicas, imunofenotípicas e funcionais, similares as células tronco mesenquimais (CTMs) da medula óssea (MO), porém é improvável que estas células possuam o mesmo potencial de diferenciação e proliferação de CTs embrionárias. Estas células são ainda de origem fetal e podem ser superiores a CTs somáticas em muitos aspectos. Juntamente com o seu fácil acesso, ausência de problemas éticos e abundância celular, as CTMs da placenta podem ser uma alternativa atrativa de progenitores de CTs para pesquisa básica e aplicações clínicas. O Acidente Vascular Cerebral (AVC) é uma das principais causas de morte e incapacitação no Brasil, trazendo altos custos para o Sistema Único de Saúde (SUS), sendo então de grande importância estudos que permitam melhorar este quadro. Também é importante o estudo do microambiente, pois este e as CTs regulam-se de forma dinâmica e também, torna-se relevante o estudo de fatores de crescimento que podem estar envolvidos na diferenciação das CTMs onde são escassos os estudos. Nesta tese investigamos o potencial de diferenciação das CTMs de placenta humana, in vitro e in vivo, utilizando modelo de co-cultura e AVC respectivamente. Para alcançarmos nossos objetivos, foram realizadas culturas de CTMs de placenta humana, bem como cultura mistas de cerebelo e córtex de ratos neonatos. Foram realizados experimentos de co-cultura para verificação da importância do microambiente neural na diferenciação de CTMs, bem como injeção de CTMs em animais que sofreram lesão causada pelo AVC para possível regeneração da área lesionada. Também investigamos os fatores de crescimento expressos pelas culturas mistas que poderiam estar envolvidos no processo de diferenciação de CTMs para fenótipo neural. As análises dos experimentos se deram por RT-PCR e imunofluorescência, utilizando marcadores de células precursoras neurais, células gliais e neurônios. Nossos resultados demonstram que as CTMs quando em microambiente favorável, têm a potencialidade para diferenciar-se em fenótipos neurais, estes resultados são vistos quando as CTMs são co-cultivadas com culturas mistas de cerebelo e córtex de ratos neonatos, bem como quando injetadas no encéfalo de animais lesionados experimentalmente por AVC, demonstrando a potencialidade das CTMs da placenta humana na diferenciação neural. Além de apresentarem expressão gênica, estas células possuem a expressão protéica de Nestina, GFAP e B-Tubulina III e também as alterações morfológicas necessárias na diferenciação. Sugerimos a participação na diferenciação o fator de crescimento EGF e transcrição FOXD3 que deixam de ser expressos em culturas mistas de córtex após o co-cultivo com CTMs. Este trabalho demonstrou que CTMs de placenta humana possuem interação com o microambiente indutivo, podendo apresentar morfologia neural; e quando enxertadas em animais que sofreram lesão isquêmica, podem migrar para o local da lesão e diferenciar em células neurais in situ, podendo assim ter utilização terapêutica na medicina regenerativa. <br> / Abstract : Stem cells (SCs) are undifferentiated cells with the ability to self-renew and under appropriate conditions may generate various differentiated cell types. Placental cells have morphological, functional and immunophenotypic similar to mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow (BM), but it is unlikely that these cells have the same potential for differentiation and proliferation of embryonic SCs. These cells are also of fetal origin and may be superior to somatic SCs in many ways. Along with its easy access, lack of ethical problems and cell abundance, MSCs from the placenta can be an attractive alternative for parents of SCs for basic research and clinical applications. The Cerebral Vascular Accident (CVA) is a major cause of death and disability in Brazil, bringing high costs to the National Health System (SUS), which is of great importance studies to improve this situation. Also important is the study of microenvironment, as this and SCs are regulated dynamically and also becomes relevant to the study of growth factors that may be involved in the differentiation of MSCs where there are few studies. We investigated the differentiation of human placenta MSCs in vitro and in vivo using co-culture model and experimental stroke in mice respectively. We performed cultures of MSCs from human placenta and carried out co-cultures on rat cerebellum or cortex cells from newborn rats. In co-culture assays the importance of the microenvironment was checked as an inducer for neural differentiation of MSCs. Alternatively the graft of MSCs in mice with moderate brain injury in experimental stroke to test for possible regeneration of damaged area. We also investigated growth factors expressed by mixed cultures that could be involved in the differentiation of MSCs to neural phenotype. We analyzed the expression or neural markers in MSCs by RT-PCR and immunohistochemistry. Our results demonstrated that MSCs in contact to brain microenvironment have the potential to differentiate to neural phenotypes. MSCs expressed nestin, GFAP and Tubulin III-B. These results were observed when MSCs were co-cultured with mixed cultures of cerebellum and cortex from newborn rats or when they were injected into the brain of animals injured by experimental stroke. This seemed to be under control of EGF and the transcription factor FoxD3 that failed to be expressed in mixed cultures of cortex after co-culture with MSCs. This work demonstrated that MSCs from human placenta have inductive interaction with the microenvironment may present neural morphology, and when grafted into animals undergoing ischemic injury, can migrate to the site of injury and differentiate into neural cells in situ and may thereby have therapeutic use in regenerative medicine.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:36:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 339917.pdf: 1826007 bytes, checksum: 243c62e86307b651b7169fb44f9ec134 (MD5) Previous issue date: 2016 / Para inibir a diferenciação e manter as características das células-tronco, proteínas inibidoras da ligação de DNA (ID) antagonizam os fatores de transcrição basic helix-loop-helix (bHLH). A ubiquitinização da proteína ID ocorre em diferentes tecidos, mas em muitos neoplasmas esta consegue escapar da degradação. O complexo proteico USP1/WDR48 pode estar envolvido nesse processo. Paralelamente, a proteína p53, guardiã do genoma humano, controla a auto renovação neoplásica. Este estudo objetivou associar a expressão imuno-histoquímica das proteínas p53, USP1 e WDR48 aos dados clínico-histopatológicos de Carcinomas Epidermóides Intrabucais (CEI). Trinta casos de CEI, grupo teste, e 40 casos de Hiperplasia Fibrosa (HF), grupo controle, foram utilizados para as análises imuno-histoquímicas (anticorpos anti-p53, anti-USP1 e anti-WDR48). A expressão destes marcadores foi dividida em 4 categorias (núcleo+, citoplasma+, núcleo e citoplasma+ e células-). As fichas de biópsia, laudos e prontuários foram avaliados. A classificação histopatológica (Bryne et al., 1992) foi realizada por meio de lâminas com coloração HE. Após, os dados foram submetidos a análise estatística (Kruskal Wallis). Os resultados imuno-histoquímicos apresentaram diferença estatisticamente significante entre os três marcadores (p53, USP1 e WDR48) (p=0,0001 para todos os grupos), e também entre as lesões (CEI ou HF) em 5 grupos (p=0,0000; 0,0028; 0,0010; 0,0000; 0,0413), sendo que, na maiora das vezes, a expressão em HF foi inferior à expressão em CEI. Nenhuma associação com os achados clínicos foi identificada (TNM), mas observou-se com os histopatológicos. Os CEIs bem diferenciados foram os que obtiveram as menores médias de expressão dos marcadores. Conclui-se que parece haver uma associação entre a expressão das proteínas investigadas e CEI, bem como com o grau de malignidade deste tipo de lesão, porém não com as suas características clínicas. Deste modo, os marcadores p53, USP1 e WDR48 têm potencial determinante de prognóstico e tratamento de CEI.<br> / Abstract: To inhibit differentiation and maintain stem cell fate, Inhibitors of DNA binding (IDs) antagonize basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors. ID ubiquitination occurs in differentiated tissues, but IDs in many neoplasms appear to escape degradation. The protein complex USP1/WDR48 can be involved in this process. At the same time, p53 protein, human genome guardian, controls the neoplastic self renewal. When occurs loss of function of the tumor suppressor gene TP53 there is the possibility of cancer development. This study aimed to associate the immunohistochemical expression of p53, USP1, WDR48 and clinical-histopathological characteristic of OSCC (oral squamous cell carcinoma). Thirty OSCC cases, test group, and 40 FH cases (fibrous hyperplasia), control group, were used for immunohistochemical analysis (anti-p53, anti-USP1 and anti-WDR48). The expression of these markers was divided into 4 categories (nucleus+; cytoplasm+, nucleus and cytoplasm+ and cells-). Biopsy form, histopathological results and patients? records were evaluated. The histopathological classification (Bryne et al., 1992) was performed using HE staining. After that, data were subjected to statistical analysis (Kruskal Wallis). The immunohistochemical results revealed a statistically significant difference among the three markers (p53, USP1 and WDR48) (p=0,0001 to all groups), and also between the lesions (OSCC or FH) in 5 groups (p=0,0000; 0,0028; 0,0010; 0,0000; 0,0413). The expression in FH was less commonly found than expression in OSCC. No association with clinical findings was identified (TNM), but it was noted regarding histopathological issues. Well differentiated OSCC achieved the lowest average of expression of the markers. We may conclude that, possibly, exist an association between these proteins and OSCC, its immunolocalization can be connected with malignant grading. However, the association with clinical findings cannot be determined. The p53, USP1 and WDR48 have the potential to define OSCC prognosis and treatment.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005-12-01Bitstream added on 2014-06-13T18:41:57Z : No. of bitstreams: 1 canesin_apmn_dr_jab.pdf: 426303 bytes, checksum: 79ecce7fa832f238b8b7aa1be1546c03 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As células-tronco promovem a reconstituição hematopoética e de outros tecidos, estando presentes no embrião, sangue periférico, medula óssea e sangue do cordão umbilical (SCU). Os modelos experimentais de células-tronco do sangue periférico e da medula óssea, em cães, têm propiciado informações relevantes para transplantes de células-tronco em humanos. Entretanto, não existe estudo sobre o SCU canino. O objetivo deste ensaio foi padronizar um método de coleta de SCU de cães sadios e quantificar as células sangüíneas e células-tronco CD34+ do SCU. No presente protocolo, a coleta de SCU de 40 cães neonatos foi realizada para contagem das células sangüíneas, com o auxílio de um contador automático de células, bem como das células-tronco, CD34+, utilizando-se do citômetro de fluxo. O método de coleta do SCU na porção justaplacentária dos vasos umbilicais permitiu a quantificação das células sangüíneas e células-tronco. Os valores hematológicos do SCU, exceto o VCM e o número de plaquetas, apresentaram-se reduzidos com relação àqueles de cães recém-nascidos e adultos. Apesar do volume escasso de SCU (1325 mL), a quantidade de células-tronco do cordão umbilical canino (3,38l2,72 CD34+ x106/kg) é semelhante àquela reportada para medula óssea, bem como para o sangue periférico mobilizado de cães adultos, sendo coincidente com aquela preconizada para reconstituição hematopoética. / Stem cells promote the reconstitution of the hematopoietic and others tissues, and are present in the embryo, peripheral blood, bone marrow and umbilical cord blood (UCB). The experimental models of bone marrow and peripheral blood stem cells in dogs provide important information for stem cells transplants in humans. However, there are no studies on the UCB cells of dogs. This experiment aimed at standardizing the collection method and at quantifying blood and stem cells in the umbilical cord of dogs aiming at hematological recuperation. In this assay, UCB of 40 neonates dogs was collected for blood cell count in automatic cell counter and stem cell CD34+ count in flow cytometer. The method of UCB collection at the juxta-placental portion of the umbilical vessels allowed UCB blood and stem cell CD34+ quantification. The hematological values of UCB, except for the Mean Corpuscular Volume and platelet count, were reduced as compared to the reference values of the peripheral blood of healthy neonate and adult dogs. Despite the small volume of UCB (1325 mL), the quantity of stem cells in the canine umbilical cord (3.38l2.72 CD34+ x106/kg) is similar to that reported in the bone marrow and mobilized peripheral blood of adult dogs, coinciding with the amunt recommend for hematopoietic reconstitution.

Orientador : Prof. Dr. Waldemiro Gremski / Co-orientador : Prof. Dr. Carlos Ricardo Soccol / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 20/12/2006 / Inclui referências : f. 87-95 / Área de concentração: Saúde animal e humana / Resumo: No infarto do miocárdio e na doença de Chagas existem alguns mecanismos fisiopatológicos em comum: perda de cardiomiócitos devido à isquemia, à redução da contratilidade e à disfunção cardíaca. A terapia celular vem propondo o tratamento para a falência cardíaca usando vários tipos celulares. Objetivos: Desenvolver e avaliar o método de co-cultivo de mioblastos esqueléticos e célulastronco mesenquimais para a terapia celular no infarto do miocárdio (IM) e na doença de Chagas (DC). Materiais e métodos: IM- 39 ratos completaram o estudo após um mês, 17 ratos receberam a terapia com o produto celular do co-cultivo e 22 ratos, receberam apenas meio na cicatriz. Na DC- 15 ratos completaram o estudo após um mês, 07 ratos receberam o produto celular de co-cultivos autólogos e 08 receberam apenas o meio. Todos os animais realizaram ecocardiograma antes e após um mês de terapia. Os parâmetros analisados foram: fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE); volume sistólico e diastólico finais. A análise estatística pela ANOVA. O cocultivo de mioblastos esqueléticos e células-tronco mesenquimais mantido por um período de 14 dias (DMEN, 15% SFB, 1% Antibiótico, IGF-I e dexametasona). Análises histológicas, de rotinas, foram realizadas. Resultados: Entre as provas funcionais verificou-se no grupo IM FEVE, nos animais, que receberam células do co-cultivo de 23,52 8,67 a 31,45 8, 87 (p=0,006) e no grupo 26,68 6,92 a 22,32 6, 94 (p=0,004) e no grupo DC FEVE, nos animais que receberam células do cocultivo de 31,10 5,78 a 53,37 5, 84 (p<0,001) e no grupo controle, 36,21 3,70 a 38,19 7,03 (p= 0,426). O exame histológico revelou, nos modelos de miocardiopatia estudados, miogênese e angiogênese naqueles animais, que receberam o produto celular de co-cultivo. Conclusão: Estes resultados validam o produto celular do co-cultivo de mioblastos esqueléticos e de células-tronco mesenquimais para o tratamento dessas duas doenças. DESCRITORES: Células musculares esqueléticas, células-tronco, regeneração, miocárdio. / Abstract: In myocardial infarction and Chagas's disease some physiopathological aspects are common: cardiomyocyte loss due to ischemia leads to a reduction of contractility and heart function. Cell therapy has been proposed for the treatment of heart failure through transplant of various cells types. Objective: To develop and to evaluate the method of co-culture of skeletal muscle (SM) and mesenchymal stem cells (MSC) for cell therapy of heart failure in Myocardial Chagas's disease (MCD) and myocardial post-infarction (MI). Materials and methods: MI- 39 rats completed the study at one month. 17 rats received co-cultured cell therapy and 22 rats, only medium in the scar. MCD- 15 rats completed the study at one month. 7 rats received autogenous coculture cell therapy and 8 animals received only medium. All animals underwent ecocardiographic analysis at baseline and one month. The measures of Left Ventricular Ejection Fraction (LVEF), Left Ventricular End Systolic and Dyastolic Volume were registered and analyzed by ANOVA. The co-culture method of SM and MSC cells was performed at 14 days (medium culture: DMEN, with 15% FCS and 1% Antibiotic, IGF-I and dexamethasone). Standard stain analysis was done in the cells and tissue. Functional Results: MI- LVEF in the animals that had received the cocultured cells: 23,52 8,67 to 31,45 8, 87 p=0,006 versus control group: 26,68 6, 92 to 22,32 6, 94 p=0,004 and MCD- LVEF in animals that received the co-cultured cells: 31,10 5,78 to 53,37 5, 84 p<0,001 versus control group: 36,21 3,70 to 38,19 7,03 p= 0,426. Histopathogical Results: In both experimental model diseases, the analysis of the animals receiving co-cultured cells demonstrated a presence of myogenesis and angiogenesis. Conclusion: The results validate the product of the SM and MSC co-culture process for treatment in these diseases. KEY WORDS: Skeletal muscle cells, stem cell, regeneration, myocardium.

Resumo: A diferenciação celular é acompanhada por mudanças no perfil da expressão gênica. Mecanismos epigenéticos envolvendo estrutura da cromatina e arquitetura nuclear regulam estas alterações. A diferenciação adipogênica de células-tronco mesenquimais isoladas da medula óssea (CTMs-MO) ou de tecido adiposo (CTMs-TA) foi utilizada como modelo para investigar estes mecanismos. A análise da lâmina nuclear, dos nucléolos e das histonas modificadas me/2me/3meH3K4, 3meH3K9, 3meH3K27, H2AZ e acH3 permitiu estabelecer um modelo inicial das alterações ocorridas. Os efeitos dos mecanismos epigenéticos na diferenciação adipogênica foram investigados utilizando-se os agentes modificadores de cromatina tricostatina A (TSA), um inibidor de histona desacetilases, e 5-aza-2'-deoxicitidina (5azadC), um agente desmetilante. Culturas subconfluentes de CTMs foram tratadas com 5, 50 ou 500 nM de TSA ou com 1, 10 ou 100 nM de 5azadC durante dois dias antes de se iniciar a indução da adipogênese. Após 14 dias, a diferenciação foi quantificada pela absorbância do corante Oil Red O e a expressão dos genes adipogênicos PPARG e FABP4, e do gene anti-adipogênico GATA2 foi avaliada por qPCR. O tratamento com 500 nM de TSA significativamente aumentou a expressão de acH3, embora a proliferação celular tenha diminuído nesta concentração. A TSA significativamente reduziu a adipogênese, exceto o tratamento com 5 nM em CTMs-MO. No entanto, houve associação parcial entre diferenciação e expressão gênica. O tratamento com 5azadC significativamente diminuiu a diferenciação adipogênica em todas as condições avaliadas e isto resultou na regulação negativa de PPARG e FABP4, e positiva de GATA2. Embora o conteúdo de DNA não tenha mudado nos tratamentos com 5azadC, a proliferação celular foi reduzida 24 horas após o término dos tratamentos. A resposta aos tratamentos foi mais acentuada em CTMs-TA do que em CTMs-MO, sugerindo a existência de distintas memórias epigenéticas conforme a origem celular. Como a assinatura epigenética afeta a diferenciação, ao se conhecer qual a linhagem-alvo preferencial daquela fonte de CTM, é possível direcionar seu uso nas terapias celulares. Assim, cada tipo celular teria uma aplicação específica visando melhorar a eficiência do processo de diferenciação.