Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6061.pdf: 2759289 bytes, checksum: 4d8fe6131881c68e6839cfb16ac0fbd5 (MD5) Previous issue date: 2014-02-11 / Financiadora de Estudos e Projetos / Type 2 Diabetes Mellitus (DM2) is associated with insulin resistance and dysfunction of pancreatic &#946; cells. The regenerative cellular therapy, in particular with multi/pluripotent cells has been investigated as a potential therapeutic strategy for T2DM. Among them, mesenchymal stem cells (MSCs) due to their immunoregulatory role are important therapeutic candidates. The purpose of this study was to investigate the effect of multiple infusions of MSCs on blood glucose, insulin resistance and morphometry of the pancreatic islets of diabetic mice induced by high fat diet. Swiss mice were fed a standard diet or a high fat diet for eight weeks. Soon after, the diabetic animals were divided into diabetic group and transplanted MSCs group. The transplanted mice received 4 intraperitoneal infusions of cells (5-8 x 106 MSCs resuspended in buffer). Fasting plasma glucose (FPG) was determined weekly and glucose tolerance tests (GTT) and insulin (ITT) were performed at 1 , 2 , 3 , and 4 months after the infusions of MSCs. Four months after infusion of the MSCs, the animals were decapitated and the pancreas and the serum were collected for analysis. The animals that received MSCs were classified as responders (FPG < 180mg/dL) or non-responders (FPG > 180mg/dL). According to this criterion, 72.2 % and 27.8 % of transplanted animals were classified as responders and non-responders, respectively. Responders showed a significant decrease in GJ seven weeks after the infusion of MSCs compared with untreated diabetic group. Four months after MSCs, responders showed a significant decrease of GTT and ITT areas under the curve (AUC), compared with untreated diabetic group. Serum insulin concentration was significantly higher in diabetic animals compared with the control group. There was no statistical difference in the total area and volume of islet &#946; cells in diabetic animals and responders and non-responders. The relative volume of &#945; cells was significantly lower in diabetic animals and responders, compared to the control group and significantly higher in non-responders transplanted animals compared to diabetic animals. Apoptosis of islet cells was significantly greater in diabetic animals and non-responders, and significantly lower in responders, compared with the control and diabetic groups, respectively. Islet cell proliferation was significantly lower in diabetic animals compared to the control group. However, islet cell proliferation was not statistically different in transplanted animals compared to controls and diabetic animals. There was a positive correlation between apoptosis of the islet cells and fasting glucose and AUC of GTT and ITT, and a negative correlation of the proliferation of the islet cells and fasting glucose. The results demonstrate that multiple infusions of MSCs can decrease fasting glucose and apoptosis in pancreatic islets and increase insulin sensitivity in diabetic rats induced by high fat diet. / O Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) está associado à resistência insulínica e à disfunção das células &#946; pancreáticas. A terapia regenerativa celular, em especial, a utilização de células multi/pluripotentes, tem sido investigada como potencial estratégia terapêutica para o DM2. Dentre elas, as células-tronco mesenquimais (MSCs), por seu papel imuno-regulador são importantes candidatos terapêuticos. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito de múltiplas infusões de MSCs na regulação da glicemia, resistência à insulina e morfometria das ilhotas pancreáticas de camundongos diabéticos induzidos por dieta hiperlipídica. Foram utilizados camundongos Swiss alimentados com dieta padrão (grupo controle) ou dieta hiperlipídica durante 8 semanas. Logo após, os animais diabéticos foram subdivididos em grupo diabético e grupo transplantado com MSCs, e receberam 4 infusões intraperitoniais de 5 8 x 106 MSCs ressuspendidas em solução tampão. A glicemia de jejum (GJ) foi determinada semanalmente e os testes de tolerância à glicose (TTG) e à insulina (TTI) foram realizados 1, 2, 3, e 4 meses após as infusões de MSCs. Quatro meses após as infusões de MSCs, os animais foram decapitados e o soro e o pâncreas foram coletados para análises. Os animais que receberam as MSCs foram classificados em respondedores (GJ < 180mg/dL) ou não respondedores (GJ > 180mg/dL). Segundo este critério, 72,2% e 27,8% dos animais transplantados foram classificados como respondedores e não respondedores, respectivamente. Os animais respondedores apresentaram diminuição significativa de GJ sete semanas após a infusão de MSCs, comparado com grupo diabético não tratado. Quatro meses após as MSCs, os animais respondedores apresentaram diminuição significativa da área sob a curva (AUC) do TTG e TTI, comparado com grupo diabético não tratado. A insulinemia foi significativamente maior nos animais diabéticos comparado com o grupo controle. Não houve diferença estatística na área total da ilhota e no volume de células animais diabéticos, transplantados respondedores e não respondedores. O volume relativo das células &#945; foi significativamente menor nos animais édtiiacbos e animais transplantados respondedores, comparado ao grupo controle e significativamente maior nos animais transplantados não respondedores comparado aos animais diabéticos. A apoptose das células da ilhota foi significativamente maior nos animais diabéticos e transplantados não respondedores, e significativamente menor nos animais transplantados respondedores, comparado com os grupos controle e diabético, respectivamente. A proliferação das células da ilhota foi significativamente menor nos animais diabéticos, em comparação ao grupo controle. Entretanto, a proliferação das células da ilhota não foi estatisticamente diferente nos animais transplantados comparados aos animais controles e diabéticos. Houve correlação positiva da apoptose das células da ilhota e glicemia de jejum e AUC do TTG e TTI, e correlação negativa da proliferação das células da ilhota e glicemia de jejum. Os resultados demonstram que múltiplas infusões de MSCs podem diminuir a glicemia de jejum e a apoptose nas ilhotas pancreáticas e aumentar a sensibilidade à insulina de animais diabéticos induzidos por dieta hiperlipídica.

Submitted by CLAUDIA VILALVA CASSARO null (claudia.v.cassaro@gmail.com) on 2018-03-21T13:51:17Z No. of bitstreams: 1 dissertacao claudia_cassaroFINAL.pdf: 3809022 bytes, checksum: a5c8891039ce6bc569b42ee66058c846 (MD5) / Rejected by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: Necessário fazer as seguintes correções no arquivo submetido: problema 1: Assinalar a agência de fomento (no seu caso CAPES). problema 2: No campo número do financiamento: colocar o número do processo. Assim que tiver efetuado as correções submeta o arquivo em PDF novamente. Agradecemos a compreensão. on 2018-03-22T12:35:28Z (GMT) / Submitted by CLAUDIA VILALVA CASSARO null (claudia.v.cassaro@gmail.com) on 2018-03-22T15:52:41Z No. of bitstreams: 1 dissertacao claudia_cassaroFINAL.pdf: 3809022 bytes, checksum: a5c8891039ce6bc569b42ee66058c846 (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-03-23T12:00:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cassaro_cv_me_bot.pdf: 3809022 bytes, checksum: a5c8891039ce6bc569b42ee66058c846 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-23T12:00:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cassaro_cv_me_bot.pdf: 3809022 bytes, checksum: a5c8891039ce6bc569b42ee66058c846 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O reparo do tecido ósseo é um desafio antigo da ciência mundial. A partir das décadas de 70-80, os biomateriais passaram a ser explorados e hoje desempenham importante papel na engenharia tecidual. Estes, quando aplicados na enxertia óssea, devem ser bioativos, biocompatíveis e reabsorvíveis. A integração entre os diversos materiais de origem sintética e os arcabouços biológicos possui amplo espectro de uso. Dentre os arcabouços destacam-se os compostos à base de fibrina por suas propriedades hemostáticas, estabilidade e morfologia favorável à proliferação celular. A presente revisão abordou a estrutura e constituição do tecido ósseo e suas limitações no processo de reparo, a relevância da engenharia tecidual aplicada à esta finalidade e os biomateriais utilizados para otimizar tal processo, com ênfase especial aos materiais compostos por fosfatos de cálcio, células tronco mesenquimais e sua aplicação junto ao arcabouço biológico selante de fibrina, com destaque para o selante heterólogo de fibrina, agora denominado biopolímero de fibrina, um produto único e em fase de testes em experimentação animal e estudos clínicos. Propõe-se, ao final desta, uma nova abordagem para a regeneração de defeitos ósseos de ratos baseada na associação entre o selante heterólogo de fibrina, o fosfato de cálcio bifásico e células tronco mesenquimais. / Bone tissue repair is an ancient challenge of world science. From the 70s and 80s, biomaterials began to be explored and nowadays play an important role in tissue engineering. These, when applied in bone grafting, have to be bioactive, biocompatible and resorbable. The integration between the various materials of synthetic origin and biological scaffolds has a wide spectrum of use. Among these scaffolds, fibrin-based compounds are distinguished by their hemostatic properties, stability and morphology favorable to cell proliferation. The present review addressed the structure and constitution of bone tissue and its limitations in the repair process, the relevance of tissue engineering approaches applied to this purpose and the biomaterials used to optimize this process, with special emphasis on materials composed of calcium phosphates, mesenchymal stem cells and its application with the biological sealant fibrin scaffold, highlighting the heterologous fibrin sealant, now named as fibrin biopolymer, a unique product testing in animal experimentation and clinical studies. At the end of this, a new approach is proposed for the regeneration of rat bone defects based on the association between heterologous fibrin sealant, biphasic calcium phosphate and mesenchymal stem cells.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA160.pdf: 837445 bytes, checksum: f1dbe7c23f22405d7f87344ec22703cc (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / The mesenchymal stem cells are a great promise for the treatment of many both congenital as acquired diseases. However, when they are subject to continuous cultivation in the laboratory, the risks of contamination and genetic mutations increase, being necessary to keep them at cryogenic temperatures. For this, the use of cryoprotectant substances is indispensable. The DMSO is the preferred cryoprotector, but some studies claim that it can induce the differentiation of stem cells into neuronal cells, as well as having high toxicity at room temperature. Therefore, the aim of this study was to test alternative cryoprotectants to DMSO for cryopreservation of mesenchymal stem cells and compare their efficiency. For this, these cells were isolated from bovine adipose tissue by enzymatic digestion with collagenase 0.075% and placed in DMEM + 10% FBS culture medium at 37ºC with 5% of CO2. Then, the cells were frozen at a concentration of 106 cells/mL in DMEM + 10% FBS with three different treatments: (1) 10% ethylene glycol (EG), (2) 10% propylene glycol (PG) and (3) 10% dimethyl sulfoxide (DMSO). A part of mesenchymal stem cells were maintained in culture for use as controls in the tests performed. After stay for, at least, 48 hours in a liquid nitrogen cylinder, they were thawed in a water bath at 37ºC, determined the immediate cell survival by the exclusion of dead cells by the staining with Trypan blue 0.4% method and performed the cell growth curve and the population doubling time test (PDT). Was also done the cell viability test using the WST-1 reagent and determined the differentiation capacity of these cells in cells of bone and adipose tissues. The results were analyzed using the SAS statistical package, by GLM procedure, adopting a 5% significance level. There was no statistical difference between treatments with EG (72.9%) and PG (71.7%) about the immediate cell survival, however DMSO (86.4%) had a significantly higher result than the others. The three cryoprotectants showed no statistical difference among them in the formation of the cell growth curve, however, all were lower than the not cryopreserved control. As the PDT test, there was no significant difference among the three treatments (EG: 28 h; PG: 26.7 h; DMSO: 27.2 h), but all of them had a doubling time of their populations statistically higher than the control (21.3 h). The cell viability, through the WST-1 reagent, of the cells cryopreserved with EG, PG and DMSO were respectively 66.65%, 71.42% and 83.62%. PG did not differ statistically from the other cryoprotectants, but the DMSO showed a significant difference from the EG. And both cells subjected to three treatments as those used as controls were able to differentiate into cells of bone and adipose tissues. It follows therefore that cryopreservation influences in the cell survival, cell multiplication rate and cell viability, but still can be used to store the mesenchymal stem cells, because the damage caused don t make them unviable. And both EG and PG may be used as an alternative to DMSO for the cryopreservation of these cells, since they presented technically viable results / As células tronco mesenquimais representam uma grande promessa para o tratamento de inúmeras doenças tanto congênitas quanto adquiridas. Porém, quando submetidas ao cultivo contínuo em laboratório, os riscos de contaminações e de mutações genéticas aumentam, sendo necessário então mantê-las em temperaturas criogênicas. Para isso, é imprescindível o uso de substâncias crioprotetoras. O DMSO é o crioprotetor de eleição, porém alguns trabalhos afirmam que este pode induzir a diferenciação das células tronco em células neuronais, além de apresentar alta toxicidade em temperatura ambiente. Portanto, o objetivo deste estudo foi testar crioprotetores alternativos ao DMSO para a criopreservação das células tronco mesenquimais e comparar a eficiência dos mesmos. Para tanto, estas células foram isoladas, a partir de tecido adiposo bovino, através da digestão enzimática com colagenase a 0,075% e colocadas em meio de cultivo DMEM + 10% SFB a 37ºC com 5% de CO2. Em seguida, as células foram congeladas na concentração de 106 células/mL em DMEM + 10% SFB com três tratamentos diferentes: (1) 10% Etilenoglicol (EG), (2) 10% Propilenoglicol (PG) e (3) 10% Dimetilsulfóxido (DMSO). Uma parte das células tronco mesenquimais foi mantida em cultivo para ser utilizada como controle nos testes realizados. Após permaneceram por, pelo menos, 48 horas em botijão de nitrogênio líquido, foram descongeladas em banho-maria a 37ºC, determinada a sobrevivência celular imediata através do método de exclusão de células mortas por coloração com azul de Tripan a 0,4% e realizados a curva de crescimento celular e o teste de Population Doubling Time (PDT). Também foi feito o teste de viabilidade celular através do reagente WST-1 e determinada a capacidade de diferenciação destas células em células dos tecidos ósseo e adiposo. Os resultados foram analisados pelo pacote estatístico SAS, por meio do procedimento GLM, adotando-se um nível de significância de 5%. Não houve diferença estatística entre os tratamentos com EG (72.9%) e PG (71,7%) quanto a sobrevivência celular imediata, entretanto o DMSO (86,4%) apresentou um resultado significativamente superior em relação aos demais. Os três crioprotetores não demonstraram diferença estatística entre si na formação da curva de crescimento celular, porém, todos foram inferiores ao controle não criopreservado. Quanto ao PDT, também não houve diferença significante entre os três tratamentos (EG: 28 h; PG: 26,7 h; DMSO: 27,2 h), mas todos apresentaram um tempo de duplicação de suas populações estatisticamente maior do que o controle (21,3 h). A viabilidade celular, através do reagente WST-1, das células criopreservadas com EG, PG e DMSO foram, respectivamente, 66,65%, 71,42% e 83,62%. O PG não diferiu estatisticamente dos demais crioprotetores, mas o DMSO apresentou diferença significativa em relação ao EG. E tanto as células submetidas aos três tratamentos como as utilizadas como controle conseguiram se diferenciar em células dos tecidos ósseo e adiposo. Conclui-se, portanto, que a criopreservação influencia na sobrevivência, na taxa de multiplicação e na viabilidade celular, mas mesmo assim pode ser utilizada para armazenar as células tronco mesenquimais, já que os danos causados não inviabilizam as mesmas. E tanto o EG como o PG podem ser utilizados como uma alternativa ao DMSO na criopreservação destas células, pois durante os experimentos realizados apresentaram resultados tecnicamente viáveis

Glicocorticoides e outras drogas imunossupressoras são comumente utilizados para o tratamento de condições inflamatórias, como as Doenças Inflamatórias Intestinais (DIIs). Apesar dos avanços na terapia medicamentosa, a remissão da doença ainda é difícil de ser mantida. Devido às suas propriedades imunomodulatórias, as Células-Tronco Mesenquimais (MSCs – Mesenchymal Stem Cells) têm emergido como reguladoras da resposta imune, e sua viabilidade e propriedades migratórias são essenciais para o sucesso da terapia celular. Entretanto, pouco se conhece sobre os efeitos das drogas convencionalmente utilizadas no tratamento das DIIs no comportamento das MSCs. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade, a morfometria nuclear, a polaridade celular, a distribuição da actina-F e da FAK (Focal Adhesion Kinase), e o comportamento migratório das MSCs na presença das drogas Azatioprina (AZA) e Dexametasona (DEXA). As células foram isoladas de membranas coriônicas humanas e caracterizadas pela diferenciação em adipócitos e osteócitos, bem como pela expressão de um painel de marcadores de superfície. As MSCs foram previamente tratadas com AZA ou DEXA por 24h ou 7d nas concentrações de 1μM ou 10μM, respectivamente. Ambas as drogas não afetaram a viabilidade celular analisada por MTT (3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) e morfometria nuclear. Entretanto, a análise do índice de polaridade resultou em uma morfologia mais alongada após o tratamento com AZA, enquanto células mais arredondadas foram observadas na presença de DEXA. Os filamentos de actina foram marcados por Rodamina-Faloidina e sua análise mostrou que a AZA preservou parcialmente a formação de lamelipódios e aumentou a presença de fibras de estresse ventrais, enquanto que a DEXA inibiu a formação de lamelipódios, evidenciou uma maior presença de fibras de estresse ventrais e diminuiu a estabilidade das protrusões de membrana, observadas em vídeo. Através da análise de microscopia de série temporal, foi observado que as células sob o efeito da AZA por 7d migraram por maiores distâncias e tiveram um aumento em sua velocidade de migração (24,35%; P < 0,05; n = 4), ao passo que a DEXA diminuiu a velocidade migratória em 24h e 7d (-28,69% e -25,37%, respectivamente; P < 0.05; n = 4) e diminuiu a distância alcançada pelas células. Em conclusão, nossos dados sugerem que as drogas AZA e DEXA podem afetar diferentemente a morfologia e o comportamento migratório das MSCs, possivelmente afetando o resultado da terapia celular. O protocolo de migração celular utilizado neste estudo foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa, sendo que um artigo científico contendo todas as etapas do protocolo foi escrito para que outros laboratórios possam utilizá-lo de maneira simples e eficaz. / Glucocorticoids and other immunosuppressive drugs are commonly used to treat inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Disease (IBD) and, despite few improvements, the remission of IBD is still difficult to maintain. Due to its immunomodulatory properties, Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have emerged as regulators of immune response, and its viability and activation of migratory properties are essential for a successful cell therapy. However, little is known about the effects of immunosuppressant drugs used on IBD treatment on MSCs behavior. In this way, the aim of this study was to evaluate MSCs viability, nuclear morphometry, cell polarity, F-actin and FAK (Focal Adhesion Kinase) distribution and cell migration properties in the presence of the immunosuppressive drugs Azathioprine (AZA) or Dexamethasone (DEX). MSCs were isolated from human chorionic membranes and characterized through adipogenic and osteogenic differentiations, as well as a panel of surface markers. Cells were previously treated with AZA or DEX for 24 hrs or 7 days at 1μM and 10μM, respectively. Both drugs had no effects on cell viability analyzed through MTT (3-(4,5- dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) and nuclear morphometry. However, polarity index analysis showed that AZA treatment induced a more elongated cell shape while a greater presence of rounded cells was observed under DEX exposure. F-actin was stained by Rhodamine-Phalloidin and showed that AZA could partially preserve lamellipodia formation and increase the presence of ventral actin stress fibers, while DEX inhibited lamellipodia formation and increased the presence of ventral actin stress fibers while decreasing protrusion stability, observed in video. Through time-lapse microscopy, it was observed that after 7 days of treatment, AZA improved cell the spatial trajectory (ST) and increased migration speed (24.35%, P < 0.05, n = 4) while DEX impaired ST and migration speed after 24 hrs and 7 days treatment (- 28.69% and -25.37%, respectively; P < 0.05, n = 4). In conclusion our data suggests these immunosuppressive drugs can differently affect MSCs morphology and migration capacity, possibly impacting the success of cell therapy. The migration protocol used in this study was successfully established by our group, leading to the writing of a protocol paper to facilitate the usage of this technique by other laboratories in a simple and efficient manner.

Introdução: A célula NK possui uma importante função no sistema imune inato de defesa primária contra vírus e patógenos e também realiza a imunovigilâcia tumoral. Muitos estudos clínicos tem avaliado o uso dessas células na imunoterapia adotiva. A expansão e a ativação da célula NK requer sinais e estímulos para manter a sua sobrevivência. Atualmente existem muitos protocolos para a expansão e ativação da célula NK, porém não existe uma definição do melhor método para uso clínico. Objetivo: O estudo tem como objetivo avaliar a melhor forma para expansão das células NK isoladas de células mononucleares do sangue de cordão umbilical e placentário.Método: Foram avaliadas cinco diferentes condições para expansão de células NK de mononucleares isoladas do sangue do cordão umbilical e placentário. Foram testados protocolos utilizando as interleucinas (IL), IL-2, IL-3, IL-15; com ou sem a presença do co-cultivo com células-tronco mesenquimais do cordão umbilical (CTM-CU) e, também o co-cultivo com células apresentadoras de antígeno artificiais ligadas a IL-21 à membrana (mbIL21 APC). Resultados: Os protocolos utilizando co-cultivo com APC mbIL21 foram superiores aos demais quanto à capacidade de expansão de células NK (CD3-, CD56+, CD16+). O protocolo de co-cultura de APC, CTM-CU e estímulo com IL-2 apresentaram um aumento significativo de NK (CD3-, CD56+, CD16+) quando comparado ao protocolo de APC/IL-2 sem CTM-CU (p<0,05). Conclusão: A expansão ex vivo de células NK na presença das APC e CTM-CU apresentaram uma proporção estatisticamente superior de célula NK CD16+ quando comparada com condições de cultivo com apenas a APC, tendo essas células NK potencial para utilização na imunoterapia adotiva associada com anticorpos monoclonais ou anticorpos bi-específicos. / Background: Natural killer (NK) cells play a major role in innate immunity, especially against viral pathogens, and are also a part of the immune surveillance of tumors. Several clinical trials have evaluated the use of these cells for adoptive cell immunotherapy. Ex vivo expansion of NK cells, however, is a complex process which requires multiple cell signals to ensure cell survival, proliferation, and activation. There are many protocols used for NK cell expansion and activation, however, there is a lack of evidence regarding which method is the most effective for clinical grade NK cells expansion. Objective: The main purpose of this study is to evaluate an optimal protocol for the ex vivo expansion of NK cells isolated from umbilical cord blood mononuclear cells (CB-MNC). Methods: Five different conditions for the expansion of umbilical cord-derived NK cells were evaluated. Each protocol was a different combination of interleukins (IL-2, IL-3, and IL-15) with or without the presence of feeder cells or artificial antigen presenting cells (aAPCs). Feeder cells utilized were umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UC-MSC), and aAPCs were membrane-bound IL-21 artificial APCs (mbIL21 aAPCs). Results: Protocols employing mbIL21 aAPCs demonstrated greater expansion of natural killer cells (CD3- CD56+) than the other protocols. The protocol employing aAPCs, IL-2 and UC-MSC feeder cells had a statistically significant higher proportion of CD16+ NK cells when compared to the protocol without the MSC feeder cells, but there was no significant difference in the expansion of total natural killer cells concerning these two protocols. Conclusion: Ex vivo expansion of NK cells in the presence of aAPCs and UC-MSC feeder cells yielded a significant higher proportion of CD16+ NK when compared to the aAPCs only culture condition, and could be a better product for NK adoptive immunotherapy in conjunction with monoclonal or bi-specific antibodies.

A lesão medular é considerada uma patologia incapacitante, para a qual até o momento não há tratamento eficaz. A lesão medular resulta em perda de tecido, incluindo tratos de fibras mielinizadas que carregam informações motoras e sensoriais. Além dos déficits sensitivos e motores, existem as alterações viscerais e tróficas relacionadas com o nível da lesão e o tipo de lesão. O treino locomotor em esteira e o transplante de células-tronco têm sido utilizados como estratégias de recuperação no intuito de otimizar a recuperação da lesão medular experimental em ratos, porém, vêm sendo abordadas separadamente. O objetivo deste estudo é avaliar a eficácia do treino locomotor em esteira, do transplante de células-tronco mesenquimais de dente decíduo humano (SHEDs), e da combinação entre os tratamentos avaliando a recuperação da função motora e a regeneração medular após a lesão medular traumática em ratos Wistar machos utilizando o equipamento NYU Impactor. Os objetivos específicos foram comparar os efeitos do transplante de SHEDS com o treino locomotor em esteira e a combinação entre os tratamentos quanto à recuperação da função motora e histológica; demonstrar a possível diferenciação das SHEDs transplantadas, bem como a sua integração no tecido da medula lesada. Os resultados obtidos demonstram que o transplante de SHEDs e a combinação entre os tratamentos favorece a recuperação da função motora após a lesão medular em ratos Wistar, enquanto apenas o tratamento com o treino locomotor não se mostra eficaz. Observamos neuroproteção do tecido medular evidenciada pela redução da cavidade cística nos animais tratados com a combinação de transplante de SHEDs e o treino locomotor. Houve redução da cicatriz glial e aumento na expressão de neurofilamento médio (NF-M) no grupo SHEDs. As células transplantadas sobreviveram e se integraram ao tecido, não havendo indícios de diferenciação em astrócitos e/ou neurônios. Houve um aumento na cicatriz glial no grupo lesão e no grupo lesão tratado com treino locomotor, associado a maiores áreas de cavidade cística e baixa expressão de NF-M. A partir de nossos resultados, podemos concluir que o transplante de SHEDs, assim como a combinação entre transplante de SHEDs e treino locomotor, promovem a recuperação da função motora após lesão medular por contusão. Apesar da sobrevivência e integração das SHEDs ao tecido, não houve diferenciação em astrócitos e/ou neurônios. Apenas o transplante celular foi capaz de reduzir a cicatriz glial e manter a expressão de neurofilamento. / Spinal cord injury is a disabling traumatic condition and available therapeutic approaches are poorly effective. Spinal cord injury results in loss of tissue, including myelinated fiber tracts that carry sensory and motor information. In addition to motor and sensory deficits, there are visceral and trophic changes related to the level of injury and type of injury. In the search for new treatments, stem cells transplants and treadmill training have been studied separately to minimize spinal injury in experimental rats. The objective of this study is to evaluate the effectiveness of treatments between treadmill training, the transplantation of human exfoliated deciduous teeth (SHEDs), and the combination of treatments for functional recovery and regeneration of injured spinal cord in an experimental model of contusion spinal cord injury in rats Wistar reproduced by NYU Impactor device. The main goals were compare the effects of SHEDs transplantation with treadmill training and the combination of treatments for functional recovery and histology; demonstrate the possible differentiation of cells implanted, as well as their integration into the damage tissue. The results demonstrate that transplantation of SHEDs and combination of treatments promotes functional recovery after spinal cord injury in rats, while treatment with only the treadmill training is not efficient. Reduction of cystic cavity in the animals treated with the combination of transplantation and treadmill training was observed as an evidence of neuroprotection. We observed glial scar reduction and increased expression of neurofilament medium (NF-M) in the SHEDs group. The transplanted cells survived and integrated into the tissue, with no evidence of differentiation into astrocytes and/or neurons. Larger areas of cystic cavity, increase in glial scar and low expression of NF-M was seen in the treadmill training group. From our results, we conclude that transplantation of SHEDs, as well as the combination of transplant and treadmill training promotes functional recovery after spinal cord injury. Although the survival and integration of SHEDs on tissue, differentiation in astrocyte and/or neuron of transplanted the cells was not detected. Only cell transplantation was able to reduce the glial scar and to maintain the expression of neurofilament.

Uma potencial alternativa para o transplante de tecidos é a engenharia de tecidos. Células-tronco mesenquimais e scaffolds eletrofiados são comumente utilizados nesta área devido à capacidade multipotente de diferenciação destas células e à rede de poros interconectados destas estruturas fibrosas. Além disso, bioreatores de perfusão podem ser utilizados para melhorar o transporte de nutrientes e reduzir o acúmulo de metabolitos tóxicos. Neste contexto, uma maneira de estudar e otimizar o sistema de cultivo é utilizar técnicas de modelagem para descrever interações ou processos individuais envolvidos no crescimento celular. Deste modo, o objetivo geral deste estudo é realizar o cultivo de células-tronco mesenquimais da polpa de dente decíduo (DPSCs) utilizando scaffolds tridimensionais eletrofiados de policaprolactona (PCL), biorreatores e técnicas de modelagem. Inicialmente foram testadas diferentes misturas de solventes (clorofórmio e metanol), a fim de produzir scaffolds com poros adequados ao cultivo tridimensional. Os diâmetros de fibra e de poro foram determinados por microscopia eletrônica de varredura (MEV). O crescimento e o metabolismo das células foram avaliados através da determinação da atividade metabólica e das concentrações de glicose e lactato do meio de cultivo, e a infiltração celular foi observada com a marcação do núcleo celular. Depois de estabelecidos os parâmetros de eletrofiação, o efeito da perfusão direta no desprendimento de DPSCs de scaffolds eletrofiados de PCL foi estudado. A atividade metabólica das células foi determinada para diferentes tempos de adesão, vazões e densidades de semeadura, e a tensão de cisalhamento na parede do poro foi calculada para cada vazão. A morfologia das células foi avaliada através de imagens de microscopia confocal e MEV. Paralelamente, foram realizadas simulações utilizando o software OpenFOAM para estudar como os parâmetros e variáveis de entrada (concentração inicial de glicose, porosidade e espessura do scaffold) afetam as saídas (fração volumétrica de células e concentração de substrato) de um modelo de proliferação celular que considera a difusão e o consumo de glicose. As contribuições do teor de oxigêno na cinética de crescimento de Contois e da variação da porosidade com o tempo devido à degradação do polímero também foram avaliadas. Inicialmente, foi observado que apenas um tamanho de poro maior que o diâmetro da célula permitiu a infiltração das células no scaffold. Então, observou-se que o aumento do tempo de adesão acarretou em maior espalhamento das células e, assim como a diminuição da densidade de semeadura e da tensão de cisalhamento, resultou em uma redução do desprendimento das células sob perfusão. Quanto ao modelo fenomenológico, observou-se maior sensibilidade à concentração inicial de glicose e à porosidade do scaffold, e aos parâmetros adimensionais relacionados à proliferação e morte celular e ao consumo de nutrientes. Além disso, o número inicial de células apresentou maior impacto no transporte de massa do que no crescimento celular. Neste estudo, foi possível obter scaffolds eletrofiados e conduções de cultivo dinâmico adequadas ao cultivo tridimensional de DPSCs, e elucidar os efeitos da limitação do transporte de massa e do oxigênio no crescimento celular, e da degradação do polímero no transporte de massa. / A potential alternative to tissue transplant is tissue engineering. Mesenchymal stem cells and electrospun scaffolds are commonly used in this field due to the multipotent differentiation capacity of these cells and the interconnected pore network of these fibrous structures. In addition, perfusion bioreactors can be used to enhance nutrient transport and reduce the accumulation of toxic metabolites. In this context, one way to study and optimize the culture system is to use modeling techniques to describe interactions or individual processes involved in cell growth. Thus, the objective of this study is to perform the three-dimensional culture of mesenchymal stem cells of dental pulp (DPSCs) using electrospun polycaprolactone (PCL) scaffolds, bioreactors and modeling techniques. Initially, different solvent mixtures (chloroform and methanol) were tested to produce scaffolds with pores suitable to three-dimensional culture. Fiber and pore diameter was determined using a scanning electron microscope. Cell growth and metabolism were evaluated through the metabolic activity and the culture medium concentration of glucose and lactate, and the cell infiltration was observed with cell nuclei staining. After the establishment of the elesctrospinning parameters, the effect of direct perfusion on DPSCs detachment from PCL electrospun scaffolds was investigated. The metabolic activity of the cells was determined for different adhesion times, flow rates and seeding densities and the pore wall shear stress was calculated for each flow rate. The cell morphology was evaluated through scanning electron and confocal microscopy imaging. In parallel, simulations with the software OpenFOAM were performed to study how parameters and inputs (initial glucose concentration, porosity and thickness of the scaffold) affect the outputs (cell volume fraction and substrate concentration) of a model of cell proliferation and glucose diffusion and consumption. The contribution of the oxygen in the Contois growth kinetics and the porosity variation with time due to polymer degradation was also evaluated. Initially, it was observed that only a pore size higher than the cell diameter allowed the infiltration of the cells through the scaffold. Then, it was observed that a higher adhesion time leaded to higher cell spreading in static conditions and, similar to smaller seeding densities and shear stresses, reduced cell detachment under perfusion. Regarding the phenomenological model, it was observed that the model is more responsive to the initial glucose concentration and scaffold porosity, and to the dimensionless parameters related to cell proliferation, death and nutrient uptake. Furthermore, the initial cell number had a more significant impact on mass transport than on cell growth. In this study, it was possible to obtain an electrospun scaffold and dynamic culture conditions suitable for the three-dimensional culture of DPSCs, and to elucidate the effects of transport limitations and of oxygen on cell growth, and of polymer degradation on mass transport were elucidated.

A síndrome de Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (MRKH) caracteriza-se pela aplasia congênita dos ductos Mullerianos. Devido a algumas características peculiares, as células-tronco mesenquimais estão sendo vistas como uma nova alternativa de tratamento em pacientes acometidos pela síndrome de MRKH. Considerando que alguns biomateriais servem como suporte estrutural e interferem positivamente na regeneração tecidual, a associação da linhagem celular de mucosa vaginal HMV-II e das MSC derivadas de tecido adiposo humano com biomateriais apresenta uma nova possibilidade na criação de neovagina. Nesta perspectiva, foram cultivadas células HMV-II com diferentes biomateriais (Membracel, Biofilme, Cellprene, PLGA PI quimicamente modificado) a fim de selecionar o melhor material alternativo. Ambas as células, associadas ao biomaterial selecionado, foram submetidas à análise morfológica, coloração ácido periódico-Schiff (PAS), expressão de marcadores epiteliais específicos por imunofluorescência e microcopia eletrônica de varredura (MEV). As células que interagiram com o biomaterial apresentaram marcadores epiteliais específicos e características morfológicas epiteliais. Estes resultados indicam que a interação do biomaterial com ambas as células testadas tem potencial capacidade para uma epitelização eficiente da neovagina. O crescimento das MSC com o biomaterial selecionado para implantação subsequente em pacientes com síndrome de MRKH pode representar uma alternativa válida e promissora para a reconstrução vaginal. / The Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (MRKH) syndrome is characterized by congenital aplasia of the Mullerian ducts. Because mesenchymal stem cells (MSCs) secrete paracrine factors, they have been seen as a new treatment option for several diseases. Considering that some biomaterials can be used as scaffolds and interfere positively in tissue regeneration, the association of human vaginal mucosa (HMV-II) cell line and MSCs with biomaterials appears as a new option for the creation of neovagina. In this study we cultured HMV-II cells with different biomaterials (Membracel, Biofilm, Cellprene, chemically modified PLGA PI) to select the best alternative material. For that both cells were cultured with the selected biomaterial and evaluated by morphological analysis, periodic acid-Schiff (PAS) staining, expression of epithelial markers by immunofluorescence and scanning electron microscopy (SEM). The analysis of the in vitro cell-biomaterial interactions showed specific epithelial markers and epithelial morphological features for both cells. These results indicate that the interaction of the biomaterial with the two tested cells has the potential capacity for an efficient epithelialization of the neovagina. Therefore, growth of MSCs with the selected biomaterial for subsequent implantation in patients with MRKH syndrome may represent a valid and promising alternative for vaginal reconstruction.

Muito se tem investido em pesquisa na compreensão dos processos e fenômenos envolvidos nas respostas imunes às infecções e, principalmente, no desenvolvimento de recursos e tecnologias a fim favorecer os avanços no tratamento da sepse. Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar os efeitos anti-inflamatórios das células-tronco mesenquimais (MSCs) quando administradas por duas diferentes vias: intraperitoneal (IP) e intravenosa (IV), determinando qual a melhor via de traramento, em modelo experimental murino de sepse. Foram utilizados 31 camundongos da linhagem C57Bl/6 para padronização do modelo de Ligadura e Perfuração do Ceco (CLP). Após os experimentos de estabelecimento do modelo, outros 60 animais foram distribuídos em nove grupos: grupo CONTROLE, grupo sepse sem tratamento (SEPSE), grupo SHAM, grupo sepse com administração de PBS via IV (SEPSE PBS IV), grupo sham com administração de PBS via IV (SHAM PBS IV), grupo sham com administração de MSCs via IV (SHAM MSC IV), grupo sham com administração de MSCs via IP (SHAM MSC IP), grupo sepse com administração de MSCs via IP (SEPSE MSC IP) e grupo sepse com administração de MSCs via IV (SEPSE MSC IV). Transcorridas 6 horas da indução da sepse pelo modelo CLP, padronizado com oclusão total do ceco seguida de uma única punctura com agulha 18G, os animais receberam o tratamento de acordo com o grupo que compunham. Após 24 horas do procedimento cirúrgico, procedeu-se a eutanásia dos animais para coleta dos órgãos, sangue e fluidos peritoneais. As amostras foram analisadas quanto aos parâmetros histológicos, hematológicos e inflamatórios, respectivamente. Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que: 1) O modelo CLP padronizado com oclusão total do ceco e uma punctura com agulha 18G induziu sepse aguda nos animais; 2) A administração das MSCs via IP foi atenuadamente mais eficaz na redução da concentração de leucócitos hematológicos e no quadro de trombocitopenia instalado nos animais com sepse induzida; 3) A injeção IP das MSCs diminuiu, com maior eficiência, a infiltração de células inflamatórias na região abdominal dos animais doentes. 4) As citocinas IL-6, TNF-α e IL- 10 obtiveram queda de suas concentrações séricas com a terapia nos animais dos grupos submetidos à indução da sepse. 5) O tratamento com MSCs melhorou o grau de peritonite, necrose e ulcerações observadas na histologia do ceco dos animais, com melhores resultados encontrados no grupo SEPSE MSC IP. / Much has been invested on research regarding comprehension of the processes and phenomena that are involved in immune responses to infections and mainly on resources and technologies development in order to support advances in the treatment of sepsis. This study has been performed in order to evaluate the anti-inflammatory effects of mesenchymal stem cells (MSCs) when administered by two different routes: intraperitoneal (IP) and intravenous (IV), to determine which is the best treatment route, in an experimental murine model of sepsis. Thirty-one C57Bl/6 strain mice have been used to standardize the Cecal Ligation and Perforation (CLP) model. After the establishment of CLP, 60 animals were allocated into nine groups: CONTROL group, sepsis group without treatment (SEPSE), SHAM group, sepsis group with intravenously administration of PBS (SEPSE PBS IV), sham group with intravenously administration of PBS (SHAM PBS IV), sham group with intravenously administration of MSCs (SHAM MSC IV), sham group with intraperitoneal administration of MSCs (SHAM MSC IP), sepsis group with intraperitoneal administration of MSCs (SEPSE MSC IP), and sepsis group with intravenously administration of MSCs (SEPSE MSC IV). 6 hours after the induction of sepsis by CLP model, standardized with total occlusion followed by a single cecal puncture with a 18G needle, the animals received the treatment according to the group they belonged to. 24 hours after the surgical procedure the animals were sacrificed in order to get the organs, blood and peritoneal fluid. The samples were analyzed for histological, haematological and inflammatory parameters, respectively. Basing on the results it was concluded that:1) The CLP model standardized with total occlusion followed by a single cecal puncture with a 18G needle induced acute sepsis in the animals; 2) The intraperitoneal administration of MSCs was slightly better in reducing the hematological concentration of leukocytes and the installed picture of thrombocytopenia in sepsis groups; 3) the intraperitoneal injection of MSCs decreased, with greater efficiency, the inflammatory cells infiltration in the abdominal cavity of sepsis groups. 4) The IL-6, TNF-α and IL-10 cytokines had their serum concentrations decline with therapy, in the groups subjected to induction of sepsis. 5) Treatment with MSCs improved the severity of peritonitis, necrosis and ulceration observed in cecum histology, with better results in the SEPSIS MSC IP group.

Células-tronco mesenquimais derivadas de medula óssea (CTMs-MO) e de tecido adiposo (CTMs-TA) são uma ferramenta atrativa para a reparação do tecido ósseo baseada na terapia celular. No presente estudo, foi investigado o potencial osteogênico e adipogênico de CTMs-MO e CTMs-TA, assim como o efeito da intercomunicação entre osteoblastos e adipócitos na expressão do fenótipo celular. CTMs-MO e CTMs-TA de ratos foram cultivadas em meios de crescimento, osteogênico e adipogênico para avaliar a diferenciação osteoblástica e adipocítica. Adicionalmente, osteoblastos e adipócitos foram cocultivados de forma indireta para investigar o efeito dos adipócitos sobre os osteoblastos e vice versa. CTMs-MO e CTMs-TA apresentaram potencial tanto osteogênico quanto adipogênico em condições não indutoras de diferenciação. No entanto, quando expostas ao meio osteogênico, as CTMs-MO exibiram maior expressão gênica de RUNX2, fosfatase alcalina e osteocalcina, expressão proteíca de RUNX2 e maior formação de matriz extracelular mineralizada comparadas às CTMs-TA. Por outro lado, em condições adipogênicas, as CTMs-TA apresentaram maior expressão gênica de PPAR&gamma;, proteína adipocítica 2 e resistina, expressão proteíca de PPAR&gamma; e maior formação de acúmulo lipídico comparadas às CTMs-MO. A presença de adipócitos em coculturas indiretas inibiu a expressão do fenótipo osteoblástico, enquanto os osteoblastos não apresentaram um efeito marcante sobre a expressão do fenótipo adipocítico. Em conclusão, o presente estudo mostrou que as CTMs-MO são mais osteogênicas enquanto as CTMs-TA são mais adipogênicas. Adicionalmente, foi observado que a intercomunicação entre osteoblastos e adipócitos pode afetar negativamente o reparo ósseo. Assim, postulamos que o maior potencial osteogênico das CTMs-MO as tornam a escolha mais adequada para a indução do reparo ósseo baseado na terapia celular. / Mesenchymal stem cells from bone marrow (BM-MSCs) and adipose tissue (AT-MSCs) are attractive tools for cell-based therapies to repair bone tissue. In the present study, we investigated the osteogenic and adipogenic potential of BM-MSCs and AT-MSCs as well as the effect of crosstalk between osteoblasts and adipocytes on cell phenotype expression. Rat BM-MSCs and AT-MSCs were cultured either in growth, osteogenic or adipogenic medium to evaluate osteoblast and adipocyte differentiation. Also, osteoblasts and adipocytes were indirectly cocultured to investigate the effect of adipocytes on osteoblast differentiation and vice versa. BM-MSCs and AT-MSCs exhibit osteogenic and adipogenic potential under non-differentiation-inducing conditions. However, when exposed to osteogenic medium, BM-MSCs exhibited higher gene expression of RUNX2, alkaline phosphatase and osteocalcin, RUNX2 protein expression and more extracellular matrix mineralization compared with AT-MSCs. Conversely, under adipogenic conditions, AT-MSCs displayed higher gene expression of PPAR&gamma;, fatty acid binding protein 4 and resistin, PPAR&gamma; protein expression and more lipid accumulation compared with BM-MSCs. The presence of adipocytes as indirect coculture repressed the expression of osteoblast phenotype while osteoblasts did not exert remarkable effect on adipocyte phenotype expression. In conclusion, the present study showed that BM-MSCs are more osteogenic while AT-MSCs are more adipogenic. Also, we observed that the crosstalk between osteoblasts and adipocytes may negatively impact bone repair. Thus, we postulate that the higher osteogenic potential of BM-MSCs makes them the first choice for inducing bone repair in cell-based therapies.