A ação de espécies reativas de oxigênio e/ou de nitrogênio (ERO/ERN), produzidas por neutrófilos através do complexo NADPH oxidase (Nox2) e óxido nítrico sintase (iNOS), estão diretamente associadas à capacidade microbicida de fagócitos. Entretanto, se a produção destes oxidantes escapa ao controle da homeostase bioquímica, ocorrem danos oxidativos aos tecidos circunvizinhos do foco inflamatório, quando, então, há necessidade de intervenção farmacológica. Neste trabalho foi testado o efeito dos nitróxidos piperídinicos 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Tempo) e 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Ac-Tempo) sobre a atividade de Nox2 de neutrófilos inflamatórios e suas consequências sobre a capacidade fungicida dos fagócitos. Neutrófilos isolados de cavidade peritoneal de camundongos foram incubados (37°C, 10 min) com Tempo (50-400 μM) ou Ac-Tempo (25-200 μM) e estimulados com Candida albicans (ATCC 10231) opsonizadas (107 C. albicans/105 neutrófilos). A atividade de Nox2 foi determinada polarograficamente, pelo consumo de oxigênio mensurado através de eletrodo de Clark, ou espectrofotometricamente, medindo-se a redução de citocromo c (550nm). A atividade de Nox2 (119,311,6 nmol de O2-•.min-1) foi diminuída pelo tratamento com ambos os nitróxidos, de forma dose-dependente, embora Ac-Tempo tenha sido mais eficaz (ED50 31 M) que Tempo (ED50 160 M). Paralelamente, foi verificada a fluorescência (λexc361, λemi440) emitida pelo grupo acridina após reação de espécies radicalares com Ac-Tempo, corroborando a hipótese de que nitróxidos depletam radicais produzidos por neutrófilos estimulados com C. albicans. O nitróxido Tempo não mostrou nenhuma ação direta sobre culturas de C. albicans, conforme análises de antifugigramas padrões. Entretanto, testes de capacidade microbicida de neutrófilos mostraram que o tratamento prévio das células com Tempo (300 µM) causou decréscimo de 80% na efetividade fungicida sobre C. albicans. Testes in vivo mostraram que Tempo administrado em dose oral única (26,52 mg/kg) foi capaz de diminuir o edema de pata originado em resposta à inoculação do fungo (107 C. albicans) cujo ponto máximo de efeito foi 18 horas após a administração do nitróxido, bem como determinou significativa diminuição de nitração de proteínas em tecido muscular das patas dos animais, conforme resultados de ensaios com anticorpos anti-nitrotirosina. Em conjunto, os resultados corroboram a premissa de que a atividade de Nox2 é essencial para a resposta do hospedeiro a C. albicans e que a administração de nitróxidos para modular a produção de oxidantes nos focos infecciosos pode diminuir a resposta do sistema imune à infecção fúngica. / Production of oxidants species by neutrophils through NADPH oxidase complex (Nox2) is directly associated with the microbicidal activity of phagocytes. In this work we tested the effect of the nitroxides 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-piperidine-1-oxil (Tempo) and 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine-1-oxil (Ac-Tempo) on the activity of inflammatory neutrophil Nox2 complex and the consequences on the fungicidal phagocytes capability. Neutrophils were incubated with Tempo (50-400 mM) or Ac-Tempo (25-200 mM) and stimulated with Candida albicans. Nox2 activity was determined polarographically by oxygen consumption measured by Clark electrode. Oxidase activity decreased by treatment with both nitroxides in a dose-dependent manner. However, Ac-Tempo was more effective (ED5044M) that Tempo (ED50160M). In parallel, the fluorescence intensity elicited by acridine after reaction with free radicals was determined. Neutrophils stimulation elicited significant fluorescent response in direct correlation with Ac-Tempo doses (R2=0.997), supporting the hypothesis that nitroxide is consumed by free radicals neutrophils-released. Fungicidal neutrophils activity assay explicited that pretreatment of cells with Tempo caused 80% decrease in the effectiveness on C. albicans death. Oral administration of a Tempo single dose was able to reduce paw edema elicited in response to inoculation of the fungus. Also, a significant decrease in protein nitration in paw tissues was found in this condition. Together, the results support the premise that Nox2 activity is essential for the host response against C. albicans and that nitroxides cause a decrease on the oxidant immune response to fungal infection.

RESUMO : O aumento na formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs) têm sido apontado como via responsável pelo comprometimento da função imunológica levando ao aumento da suscetibilidade à infecções em indivíduos diabéticos. Estes mecanismos podem envolver ativação do sistema NADPH oxidase, redução da capacidade fagocítica, interação entre os AGE formados e macromoléculas importantes para a função imune ou com receptores específicos para AGE (RAGEs) com aumento na produção de citocinas inflamatórias. O uso terapêutico das folhas de diversas espécies do gênero Passiflora é comum na medicina popular em diversos países, inclusive no Brasil. Porém, as informações científicas a respeito do uso de extratos de folhas de Passiflora edulis no tratamento do diabetes e de suas complicações, ainda não estão totalmente esclarecidas. Sendo assim, este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos destes extratos sobre a capacidade fagocítica e a produção de espécies reativas de oxigênio em macrófagos de ratos diabéticos. Ratos machos Wistar (300 ± 25g) foram tratados com aloxano (120mg/kg de peso corporal dissolvido em salina 0,9%, via intraperitoneal). O extrato etanólico foi obtido por maceração em solução hidroalcólica 70%(V/V), seguida de evaporação sob pressão reduzida e liofilização. Este foi diluídos em água e administrado por gavagem (200mg do extrato etanólico seco/kg de peso do animal), durante 8 semanas após a indução do diabetes. Os animais foram anestesiados e o sangue colhido por punção cardíaca para obtenção de soro e determinação da glicemia por método enzimático colorimétrico e dos níveis de AGEs por fluorescência. Aconcentração de frutosaminas foi determinada no soro por método colorimétrico. A ativação celular foi avaliada através da produção de ERO bem como da capacidade fagocítica de macrófagos peritoniais ativados com C albicans (ATCC69548) opsonizada. A produção de ERO foi determinada por quimioluminescência amplificada com luminol. Os ensaios para avaliação da capacidade fagocítica e microbicida foram realizados através da incubação dos fagócitos frente à Candida albicans (ATCC 69548) em diferentes intervalos de tempo. Foram consideradas como tendo atividade fagocítica as células que apresentaram uma ou mais C. albicans internalizadas. A atividade microbicida foi determinada através da avaliação da viabilidade das leveduras fagocitadas / The high production of advanced glycation end-products (AGEs) have been identified as reponsible for the impairment of immunological function, leading to an increase on susceptibility of infections on diabetic patients. This mechanisms can involve the NADPH oxidase activation, decrease of phagocytic capacity, interactions between the AGEs produced and important macromolecules to the immune function or with the receptor for advanced glycation end-products (RAGEs), increasing the production of inflammatory cytokines. The therapeutic use of leaves of several species of Passilfora is common in folk medicine in several countries, including Brazil. Nevertheless, some scientific information regarding the use of leaf extracts of Passiflora edulis in the treatment of diabetes and its complications, remains still unclear. Thus, the objective of this present work is to evaluate the effects of this extract on phagocytic capacity on macrophages in diabetic rats. Wistar male rats (300 ± 25g) were treated with alloxan (120 mg/kg body weight dissolved in saline 0,9% intraperitoneal). The ethanolic extract was obtained by maceration in wateralcohol solution 70% (v/v) followed by evaporation under reduced pressure and lyophilization. After this process, the extract was diluted in water and administered by gavage (200 mg of dry ethanolic extract/kg body weight), during 8 weeks after the diabetes induction. The rats were anesthetized and blood sample was collected by cardiac puncture to obtain the sérum for the determination of glucose by enzimatic colorimetric method and determination of AGEs levels by fluorescence. The concentration of fructosamine was determined by colorimetric method in serum. The cell activation was determined through the production of ROS and phagocytic capacity of peritoneal macrophages, activated with opsonized Candida albicans (ATCC69548). The production of ROS was determined by chemiluminescence activated with luminol. The evaluation of phagocytic capacity was performed through the incubation of the phagocytes with Candida albicans internalized. The microbicide activity was determined by evaluating the viability of phagocyted yeast / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Orientador: Aimée Maria Guiotti / Coorientadora: Cristiane Duque / Banca: Douglas Roberto Monteiro / Banca: Natália Leal Vizoto / Resumo: A estomatite protética é associada à colonização microbiana da base acrílica das próteses, favorecida pela higiene deficiente das mesmas e pelo alto nível de Candida spp. na cavidade oral. A Candida albicans é a espécie fúngica mais comumente associada à esta patologia oral, geralmente tratada com antifúngicos. O uso indiscriminado destas drogas pode promover resistência destas espécies e efeitos colaterais aos indivíduos. Assim, é desejável promover a saúde por meio de terapias naturais ou alternativas, tais como a utilização de microrganismos probióticos. O objetivo desta pesquisa foi avaliar in vitro, a influência de diferentes probióticos isolados e dois probióticos comerciais na inibição do crescimento do biofilme de C. albicans em resina acrílica ativada termicamente (RAAT) para base protética e verificar se os subprodutos dos biofilmes teriam um potencial de alteração da superfície das amostras de RAAT (Ra). 90 amostras de RAAT foram divididas em 9 grupos: GI- controle negativo (Candida albicans sem probiótico); GII- Candida albicans + Lactobacillus casei; GIII- Candida albicans + Lactobacillus rhamnosus; GIV- Candida albicans + Lactobacillus helveticus; GV- Candida albicans + Bifidobacterium lactis; GVI- Candida albicans + Bifidobacterium longum; GVII- Candida albicans + Lactobacillus fermentum; GVIII- Candida albicans + Microbiome e GIX- Candida albicans + Prolive. Biofilmes de C. albicans foram formados sobre as superfícies das amostras de RAAT na presença dos probi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Prosthetic stomatitis is associated with microbial colonization of the prosthesis base, favored by poor hygiene of the species and the high level of Candida spp. in the oral cavity. Candida albicans is a fungal species most commonly associated with oral pathology, usually treated with antifungal. Indiscriminate use can cause damage to species and side effects to individuals. Thus, it is desirable to promote health through natural or alternative therapies, such as the use of probiotic microorganisms. The objective of this research was to evaluate in vitro, the influence of different probiotics and two commercial probiotics on the inhibition of C. albicans biofilm growth in thermally activated acrylic resin (RAAT) for prosthetic base and to verify if biofilm byproducts would have potential alteration of the surface of RAAT (Ra) samples. 90 RAAT samples were divided into 9 groups: GI- negative control (Candida albicans without probiotic); GII- Candida albicans + Lactobacillus casei; GIII- Candida albicans + Lactobacillus rhamnosus; GIV- Candida albicans + Lactobacillus helveticus; GV- Candida albicans + Bifidobacterium lactis; GVI- Candida albicans + Bifidobacterium longum; GVII- Candida albicans + Lactobacillus fermentum; GVIII- Candida albicans + Microbiome and GIX- Candida albicans + Prolive. Biofilms of C. albicans were formed on the surfaces of RAAT samples in the presence of probiotics, except for GI group. For biofilm quantification, the number of cultured cells in the RA... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Iguatemy Lourenço Brunetti / Banca: Cleverton Roberto de Andrade / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Resumo: As infecções do trato urinário (ITU) são afecções comuns, que podem resultar em níveis significantes de morbidade. Os agentes etiológicos associados a ITU são bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, além do fungo comensal Candida albicans. Além dos parâmetros clássicos associados à infecção, as ITU proporcionam o aumento na formação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, o que também acarreta injúria tecidual, bem como, também ocorre um alto índice de micro-organismos resistentes aos fármacos disponíveis na clínica médica, o que demanda na prospecção por novas abordagens terapêuticas complementares. No Brasil, a espécie Eugenia brasiliensis Lam. é conhecida como "berry brasileira" ou grumixama, e existem poucos relatos na literatura demonstrando sua atividade biológica. Este fator associados à escassez de estudos sobre a espécie brasileira E. brasiliensis, despertou o interesse em novos estudos relacionados à sua ação sobre microrganismos relacionados a ITU e atividade antioxidante. Os extratos utilizados neste estudo foram obtidos a partir da polpa do fruto liofilizado de E. brasiliensis com diferentes solventes, com objetivo de obter dados de sua composição fitoquímica, avaliar suas atividades antioxidantes, antimicrobianas e citotóxicas. Foram utilizados como padrões para os ensaios de atividade antioxidante o ácido elágico, quercetina, ácido gálico, ácido cafeico e trolox. Na caracterização química dos extratos foram determinados, os teores de flavonoides totai... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The urinary tract infections (UTI) are common disorders, which may result in significant levels of morbidity. The etiological agents associated with UTI are Gram-negative and Gram-positive, plus commensal Candida albicans fungus. In addition to the classics associated with infection parameters, the ITU provide increased formation of reactive oxygen and nitrogen species, which also causes tissue damage, as well as a high rate of resistant microorganisms to drugs available in clinical practice, which requires the prospecting for new medicinal approaches. In Brazil, the specie Eugenia brasiliensis Lam. are known as "brazilian berry" or grumixama, and there are few reports in the literature demonstrating your biologic activity. This factor associated with the lack of studies on the brazilian specie E .brasiliensis stir up interest in new research related to the activities of microorganisms related to ITU and antioxidant activity. The extracts used in this study were obtained from the fruit pulp lyophilized of E. brasiliensis with different solvents in order to get data from their phytochemical composition, evaluate their antioxidant activity, antimicrobial and cytotoxicity. For the evaluation of antioxidant activity it was used like standards acid elagic, quercetina, acid gallic, acid cafeico and trolox. In the chemical characterization of the extracts were determined, the contents of total flavonoids... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-06-18Bitstream added on 2014-06-13T20:01:20Z : No. of bitstreams: 1 ribeiro_pm_dr_sjc.pdf: 855430 bytes, checksum: 198f9ff557754ac8219dda6b2476ce7f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente trabalho foi identificar fenotipicamente e genotipicamente cepas de Candida dubliniensis entre os isolados e inicialmente identificados como Candida albicans pertencentes à coleção de amostras do laboratório de Microbiologia da Faculdade de Odontologia da UNESP/ São José dos Campos. Duzentas cepas de leveduras do gênero Candida, provenientes de trabalhos anteriores, isoladas de pacientes transplantados cardíacos sob terapia com imunossupressores, pacientes com tuberculose submetidos a antibioticoterapia prolongada, pacientes HIV positivos e indivíduos controle foram incluídas no estudo. As cepas foram submetidas aos seguintes testes fenotípicos: a) verificação da produção de tubo germinativo; b) formação e arranjo estrutural de clamidoconídeo em ágar fubá, em ágar tabaco, ágar girassol e ágar caseína; c) crescimento em temperatura de 45°C. Após a realização destes testes, todas as amostras foram submetidas à identificação genotípica por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), que demonstrou não haver C. dubliniensis entre as duzentas cepas testadas. Os resultados dos testes fenotípicos demonstraram que: a) todas as cepas produziram tubo germinativo; b) nos testes fenotípicos, o ágar fubá teve 76% de acordo de identificação com o método genotípico; o ágar tabaco, 92%; o ágar girassol, 92,5%; o ágar caseína, 85%; c) o crescimento a 45°C teve 86,5%. Concluiu-se que o ágar girassol foi o método fenotípico mais eficaz para diferenciação entre C. albicans e C. dubliniensis; nenhum dos métodos fenotípicos analisados se apresentou 100% eficaz; a identificação genotípica é necessária para diferenciação definitiva entre C. albicans e C. dubliniensis. / The aim of the present study was to identify phenotypically and genotypically Candida dubliniensis among the isolates initially identified as Candida albicans from the yeasts' collection of the laboratory of Microbiology of Faculdade de Odontologia - UNESP/ São José dos Campos. Two-hundred of Candida gender isolates from previous works obtained patients who underwent orthotopic cardiac transplantation under immunosuppressive therapy, tuberculosis patients submitted to antibiotic terapy, HIV-patients and healthy individuals were included in the study. The samples were submitted to the following phenotypic tests: 1) germ tube formation; 2) formation and structural arrangement of chlamydospores on cornmeal agar, tobacco agar, sunflower seed agar and casein agar; 3) inability to grow at 45°C. After these tests, all of the samples were analyzed by polymerase chain reactions (PCR) that demonstrated the absence of C. dubliniensis among the analyzed isolates. The results demonstrated that: 1) all isolates were positive for germ tube formation; 2) the porcentage of agreement in relation to the molecular method for each phenotipic test was respectively: on 76% cornmeal agar, 92% tobacco agar, 92.5% sunflower seed agar, 85% casein agar; 3) 86.5% inability to growth at 45°C. In conclusion, based on phenotypic characteristics, the sunflower seed agar was the more effective method for differentiation between C. albicans and C. dubliniensis; none of the phenotypic methods was 100% effective; molecular identification is necessary for definitive differentiation between C. albicans and C. dubliniensis.

Made available in DSpace on 2017-03-14T14:10:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-11. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-14T14:42:44Z : No. of bitstreams: 1 000874673_20170911.pdf: 818016 bytes, checksum: 898364a16badcde0704d015be3994940 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-09-11T13:56:02Z: 000874673_20170911.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-09-11T13:56:51Z : No. of bitstreams: 1 000874673.pdf: 1470716 bytes, checksum: 97c5956d3d97debe1ce5a25d65262a7d (MD5) / Este estudo teve por finalidade: I. estabelecer um protocolo reprodutível utilizando a metodologia dos halos de precipitação em meio Ágar para avaliação da produção de fosfolipase e proteinase pela espécie Candida albicans (C. albicans); II. analisar a expressão dos fatores de virulência de Ca após inativação fotodinâmica (IF) mediada pela curcumina (CUR). No primeiro estudo utilizou-se 30 isolados clínicos e uma cepa de referência de C. albicans para obtenção de suspensões celulares (108ufc/mL) que foram plaqueadas nos meios específicos. Três variáveis independentes (nº de replicatas, cor de fundo e instrumento de leitura) originaram oito protocolos de leitura. A reprodutibilidade intra e interexaminadores da medida de produção de enzima (Pz) foi avaliada por meio do Coeficiente de Correlação Intraclasse (CCI). A enzima proteinase apresentou dois protocolos com ―Boa‖ reprodutibilidade intraexaminador (CCI ≥ 0,71) para todos os examinadores e o protocolo que utilizou leituras em triplicata sobre as fotografias contra luz natural atribuiu maior reprodutibilidade interexaminador para os valores de Pz-proteinase. Três protocolos com ‗Boa' concordância intraexaminador de Pz-fosfolipase foram selecionados para a análise interexaminador. Tanto as leituras em paquímetro como as realizadas em computador, em triplicata, mostraram reprodutibilidade ‗Muito Boa'. No estudo II, a concentração de CUR a 0,1µM foi utilizada associada a iluminação LED para promover dose subletal de IF. O grupo tratamento (C+L+) teve suas células fotossensibilizadas com CUR e iluminadas. O grupo controle positivo consistiu de amostras que receberam apenas CUR (C+L-), e o controle negativo não recebeu nem CUR nem luz (C-L-). A capacidade de adesão foi avaliada por meio das unidades formadoras de colônias (ufc/mL) e do método XTT. A formação de biofilme foi analisada ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / This study aimed to: I. to establish a reproducible protocol using the agar-Based methodology to evaluate the production of the phospholipase and proteinase by the species Candida albicans (C. albicans); II. to analyze the expression of virulence factors after photodynamic inactivation (PDI) mediated by curcumin (CUR). In the first study 30 clinical isolates and a reference strain of the C. albicans were used to obtain cell suspensions (108CFU/mL) that were plated in specific media. Three independent variables (number of replicates, background color and reading instrument) originated eight reading protocols. The intra- and inter-examiner reproducibilityof the enzyme production measure (Pz) was assessed using the intraclass correlation coefficient (ICC). The enzyme proteinase presented two protocols with good intra-rater reproducibility (ICC≥0.71) and the readings in triplicate against natural light showed the highest inter-examiner reproducibility for Pz-proteinase values. Three protocols with 'Good' intra-rater agreement for Pz-phospholipase were selected for interexaminer analysis. Caliper and computer readings, performed in triplicate, showed 'Very Good' reproducibility. In Study II, CUR at 0,1μM was used with LED light to promote sublethal dose of the PDI. The treatment group (C+L+) had its cells photosensitized with CUR and illuminated. The control group consisted of the samples that received only CUR (C+L-), and another which received neither CUR or light (C-L-). The adhesion ability was evaluated by means of CFU/mL and the XTT method. Biofilm formation was analyzed by means of CFU/mL, XTT and Crystal Violet (CV). The ability to secrete degradative enzymes was evaluated by the agarbased method and a colorimetric method. The results CFU/mL, XTT, CV were evaluated using a one-way multivariate analysis of the variance (MANOVA) and when statistically significant effects were detected, One... (Complete abstract electronic access below)

Orientador: Antonio Olavo Cardoso Jorge / Banca: Reginaldo Bruno Gonçalves / Banca: Silvana Cai / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Cristiane Yumi Koga-Ito / Resumo: O objetivo do presente trabalho foi identificar fenotipicamente e genotipicamente cepas de Candida dubliniensis entre os isolados e inicialmente identificados como Candida albicans pertencentes à coleção de amostras do laboratório de Microbiologia da Faculdade de Odontologia da UNESP/ São José dos Campos. Duzentas cepas de leveduras do gênero Candida, provenientes de trabalhos anteriores, isoladas de pacientes transplantados cardíacos sob terapia com imunossupressores, pacientes com tuberculose submetidos a antibioticoterapia prolongada, pacientes HIV positivos e indivíduos controle foram incluídas no estudo. As cepas foram submetidas aos seguintes testes fenotípicos: a) verificação da produção de tubo germinativo; b) formação e arranjo estrutural de clamidoconídeo em ágar fubá, em ágar tabaco, ágar girassol e ágar caseína; c) crescimento em temperatura de 45°C. Após a realização destes testes, todas as amostras foram submetidas à identificação genotípica por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), que demonstrou não haver C. dubliniensis entre as duzentas cepas testadas. Os resultados dos testes fenotípicos demonstraram que: a) todas as cepas produziram tubo germinativo; b) nos testes fenotípicos, o ágar fubá teve 76% de acordo de identificação com o método genotípico; o ágar tabaco, 92%; o ágar girassol, 92,5%; o ágar caseína, 85%; c) o crescimento a 45°C teve 86,5%. Concluiu-se que o ágar girassol foi o método fenotípico mais eficaz para diferenciação entre C. albicans e C. dubliniensis; nenhum dos métodos fenotípicos analisados se apresentou 100% eficaz; a identificação genotípica é necessária para diferenciação definitiva entre C. albicans e C. dubliniensis. / Abstract: The aim of the present study was to identify phenotypically and genotypically Candida dubliniensis among the isolates initially identified as Candida albicans from the yeasts' collection of the laboratory of Microbiology of Faculdade de Odontologia - UNESP/ São José dos Campos. Two-hundred of Candida gender isolates from previous works obtained patients who underwent orthotopic cardiac transplantation under immunosuppressive therapy, tuberculosis patients submitted to antibiotic terapy, HIV-patients and healthy individuals were included in the study. The samples were submitted to the following phenotypic tests: 1) germ tube formation; 2) formation and structural arrangement of chlamydospores on cornmeal agar, tobacco agar, sunflower seed agar and casein agar; 3) inability to grow at 45°C. After these tests, all of the samples were analyzed by polymerase chain reactions (PCR) that demonstrated the absence of C. dubliniensis among the analyzed isolates. The results demonstrated that: 1) all isolates were positive for germ tube formation; 2) the porcentage of agreement in relation to the molecular method for each phenotipic test was respectively: on 76% cornmeal agar, 92% tobacco agar, 92.5% sunflower seed agar, 85% casein agar; 3) 86.5% inability to growth at 45°C. In conclusion, based on phenotypic characteristics, the sunflower seed agar was the more effective method for differentiation between C. albicans and C. dubliniensis; none of the phenotypic methods was 100% effective; molecular identification is necessary for definitive differentiation between C. albicans and C. dubliniensis. / Doutor

Les β-1,2 oligomannosides (β-Mans), dont la présence est relativement rare dans le monde vivant, font partie des facteurs de C. albicans contribuant à sa virulence. Ils sont retrouvés dans la paroi de la levure associés aux N-glycannes d’un haut polymère de mannoses lié à un peptide, le phosphopeptidomannane (PPM) et des mannoprotéines (MPs) ainsi qu’à la copule glycannique d’un glycolipide de la famille des mannose-inositol-phosphocéramides, le phospholipomannane (PLM). Les mécanismes de reconnaissance des β-Mans par l’hôte dépendent du degré de polymérisation des oligomannosides et des molécules qui les portent. Une famille de 9 enzymes, les β-1,2 mannosyltransférases (Bmts), permettent la biosynthèse des β-Mans de C. albicans. Ces enzymes ont des fonctions distinctes car leur activité a une spécificité assez stricte qui dépend du glycoconjugué et de l’étape de β-mannosylation. Le travail présenté dans cette thèse s’est appuyé sur la spécificité des Bmts, principalement celles initiant la biosynthèse des β-Mans (Bmt1: N-mannanes acido stables – Bmt2: N-mannanes acido labiles – Bmt5: PLM) pour définir i) le rôle respectif des β-Mans dans la virulence de C. albicans et ii) la contribution des différents glycoconjugués dans l’expression de surface des β-Mans. Une grande partie de l’étude a reposé sur la génération de doubles mutants (bmt1bmt2δ) et (bmt2bmt5δ) exprimant des β-Mans uniquement sur une fraction ou un type de glycoconjugué et d'un triple mutant (bmt1bmt2bmt5δ) n’exprimant plus de β-Mans. Nous avons tout d’abord réévalué la β-mannosylation des MPs qui était jusqu’à présent déduite de celle du PPM. En analysant les O-mannosides des mutants bmtsδ, nous avons pu mettre en évidence l’implication de Bmt1 et Bmt3, qui ajoutent respectivement le 1er et le 2ème β-mannose, dans la O-mannosylation des MPs. L’analyse de la β-mannosylation des MPs et d’une protéine recombinante chez le mutant bmt1δ a mis en évidence le rôle essentiel de Bmt1 dans ce processus. L’analyse en immunofluorescence des différents mutants a montré que seul le PPM et les MPs sont responsables de l’expression de surface des β-Mans. Cette expression a un impact inattendu sur la virulence dans des modèles murins de candidoses disséminées. Les souches exprimant des β-Mans en surface sont en effet moins virulentes que les mutants présentant des défauts de β-Mannosylation. Les mutants, principalement bmt1bmt2bmt5δ sont néanmoins moins virulents chez des souris n’exprimant plus la galectine 3, lectine reconnaissant les β-Mans. Ces résultats montrent le double rôle des β-Mans selon leur localisation et le conjugué qui les porte: d’une part ils permettent à l’hôte d’éliminer la levure via la galectine 3 et d’autre part ils peuvent contribuer à sa virulence via certainement le PLM. La β-mannosylation du PLM est indispensable pour l’activité inflammatoire du PLM sur les macrophages et sa modulation peut entraîner la résistance de la levure à certains antifongiques. La régulation de la β-mannosylation de ses glycoconjugués est un moyen pour C. albicans de s’adapter à différentes conditions. La β-mannosylation du PPM et des MPs est réduite à 37°C et lorsque le pH diminue, pouvant ainsi permettre à la levure d’être moins reconnue in vivo et d’échapper aux mécanismes de défense de l’hôte. Nous avons pu également mettre en évidence un mécanisme permettant à C. albicans de changer de sérotype en inactivant Bmt1. Ce mécanisme qui n’est pas encore parfaitement décrit, permet à la levure de mieux coloniser le tube digestif de souris. Nos résultats mettent ainsi en évidence d’une part l’expression complexe des β-Mans dans la paroi de C. albicans et leur rôle dans la virulence en fonction de leur localisation et d’autre part l’adaptation de la levure à différents environnements. / Β-1,2 oligomannosides (β-Mans) are rare in the living world and are considered as factors contributing to C. albicans virulence. They are present in the cell wall associated to N-glycans of a high mannose polymer linked to a peptide, the phosphopeptidomannan (PPM) and to mannoproteins (MPs) and they are part of the glycan moiety of a glycolipid from the mannose-inositol-phosphoceramid family, the phospholipomannan (PLM). Recognition of β-Mans by the host depends on their polymerization degree and molecules they are associated to. A family of nine enzymes, β-1,2 mannosyltransferases (Bmts), is involved in β-Mans biosynthesis of C. albicans. These enzymes have distinct functions with specificities of substrate and step of β-mannosylation. According to these specificities, especially for initiation of β-Mans biosynthesis (Bmt1: acid stable N-mannan- Bmt2: acid labile N-mannan- Bmt5: PLM), the thesis project was designed to define i) the respective role of β-Mans in C. albicans virulence and ii) the contribution of the different cell wall glycoconjugates in β-Mans surface expression. Double mutants (bmt1bmt2δ and bmt2bmt5δ) expressing β-Mans only on a fraction or a type of glycoconjugate and a triple mutant (bmt1bmt2bmt5δ) expressing no more β-Mans have been generated. We have first reassessed MPs β-mannosylation which was originally deduced from the PPM one. After analysis of O-mannosides from bmtsδ mutants, we have evidenced that Bmt1 and Bmt3 are involved in MPs O-mannosylation by adding the first and the second β-mannose, respectively. β-mannosylation of both MPs and a recombinant protein in bmt1δ mutant was checked and we evidenced an essential role of Bmt1 in this process. Immunofluorescence assays using the different mutants revealed that PPM and MPs are responsible for β-Mans surface expression. Expression of β-Mans at the cell surface had an unexpected impact on virulence in two murine models of disseminated candidiasis. Strains expressing superficial β-Mans were less virulent than mutants with β-mannosylation defects. These mutants, mainly bmt1bmt2bmt5δ, were nevertheless less virulent in mice which do not express galectin-3, lectin that binds β-Mans. These results show different biologic properties of β-Mans depending on their localization and the conjugate they are associated to: they can enable yeast clearance via galectin 3 but they can also contribute to virulence certainly via PLM. PLM β-mannosylation is essential for the glycolipid inflammatory activities in macrophages and its modulation can lead to yeast resistance to some antifungals. Regulation of glycoconjugates β-mannosylation enables C. albicans to adapt to different conditions. PPM and MPs β-mannosylation is reduced at 37°C and at lower pH, which can help C. albicans to counteract host defense in vivo as it is then less recognized by galectin 3. We have also evidenced a mechanism by which C. albicans can switch serotype after Bmt1 inactivation. This mechanism, not completely described, allows the yeast to better colonize the murine digestive tract. Our results highlight both the complex expression of β-Mans in C. albicans cell wall and their role in virulence according to their localization and the adaptation of the yeast to different environments.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-03-15T13:24:29Z No. of bitstreams: 1 PDF - Eveline Angélica Lira de Souza Sales Rocha.pdf: 1422937 bytes, checksum: 58aad769d854c0f77d20fd3b8bf4563f (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-21T21:05:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Eveline Angélica Lira de Souza Sales Rocha.pdf: 1422937 bytes, checksum: 58aad769d854c0f77d20fd3b8bf4563f (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-21T21:05:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Eveline Angélica Lira de Souza Sales Rocha.pdf: 1422937 bytes, checksum: 58aad769d854c0f77d20fd3b8bf4563f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-21T21:05:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Eveline Angélica Lira de Souza Sales Rocha.pdf: 1422937 bytes, checksum: 58aad769d854c0f77d20fd3b8bf4563f (MD5) Previous issue date: 2014-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / There is a great demand for new antifungals of different structural classes, acting selectively on new cellular targets with fewer side effects, accordingly medicinal plants are excellent sources for obtaining a wide variety of drugs. This study aimed to investigate the antifungal activity of the plant extract Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan and fitoquimicamente characterize it and set its thermal profile. Shells Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan were collected in the semiarid Paraiba (7º22 '25 "S, 35 ° 59' 32" W), the extract obtained by maceration, using a rotary evaporator and freeze region. For the Determination of Minimum Inhibitory Concentration technique microdilution broth and microorganisms Candida albicans (ATCC 18804), Candida krusei (ATCC 34135), Candida guillermondii (ATCC 6260), Candida parapsilosis (ATCC 22019), Candida tropicalis (ATCC 13803) and clinical strains was used recently isolated from Candida albicans (LM 11, LM 70, LM 410). The Determination of Minimum Fungicidal Concentration was performed by subculture on Sabouraud dextrose agar plates. The action on the cell wall of Candida albicans was investigated by determining the MIC of plant extract in the presence of sorbitol (0.8M), using the microdilution technique. Through scanning electron microscopy, we evaluated the cellular morphology of Candida albicans treated with the MIC of plant extract, the MIC of nystatin suspension (100,000 UI) and free treatment. The combined effect of the two substances (nystatin and vegetable extract Anadenanthera colubrina) studied was determined from the microdilution technique - checkerboard for derivation of Fractional Inhibitory Concentration Index (FIC Index) and by the method of counting viable cells (kinetics growth). In the latter, the following different concentrations of the extract and nystatin products association (CIM; CIM/4; CIM/8) were analyzed. Nonparametric tests Fridman and the Kruskal Wallis test (p <0.05) were performed. In phytochemical screening, we determined the content of total polyphenols, total flavonoids and condensed tannins by spectrophotometry. The thermal profile was traced with the determination of termograviméricas curves (TG) and differential scanning calorimetry (DSC). The toxicity was assessed by quantitation of erythrocyte lysis suffering with different concentrations of plant extract (0.25, 0.5, 1, 2, 4 mg / ml). It was observed that the A.colubrina have fungistatic potential against all tested strains pattern, and fungicidal against recent clinical isolates of Candida albicans. An increase of 1 mg/ml to 8mg/ml of MIC in the presence of sorbitol suggests that this statement acts by modifying the fungal cell wall. The SEM images show the reduction in the amount of yeast cells after treatment with the plant extract and changes in the fungal cell wall. The FIC index was calculated at 0.375, indicating synergism between the nystatin and the plant extract. Kinetics was observed maintaining the synergism between the products tested over time (p <0.05). 53.18% of total polyphenols were determined, 8.73% from 0.28% condensed tannins and flavonoids. The TG curve A.colubrina extract showed the presence of three stages of thermal decomposition, the more significant weight loss was observed between the extract temperatures and 229,17ºC 657,39ºC with loss of 37.44%. The DSC curves of the extract showed that the thermal processes occur at temperatures between 52,37 °C to 195,5°C. In toxicity testing, none of the tested concentrations became effective cytotoxic concentration 50% (EC50). It is concluded that the plant extract from the bark of Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan is a promising resource in getting a new drug for treatment of oral candidiasis. / Existe uma grande demanda por novos antifúngicos de diferentes classes estruturais, agindo seletivamente sobre novos alvos celulares, com menos efeitos colaterais, nesse sentido as plantas medicinais são excelentes fontes para obtenção de uma grande variedade de drogas. Objetivou-se investigar a atividade antifúngica do extrato vegetal de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan, bem como caracterizá-lo fitoquimicamente e definir seu perfil térmico. Foram coletadas cascas de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan na região do semiárido paraibano (7º22' 25" S, 35º 59' 32"W), obtido o extrato através de maceração, rotaevaporação e liofilização. Para a Determinação da Concentração Inibitória Mínima foi utilizada a técnica de Microdiluição em Caldo e os microrganismos Candida albicans, (ATCC 18804), Candida krusei (ATCC 34135), Candida guillermondii (ATCC 6260), Candida parapsilosis (ATCC 22019), Candida tropicalis (ATCC 13803) e cepas clínicas recentemente isoladas de Candida albicans (LM 11, LM 70, LM 410). A Determinação da Concentração Fungicida Mínima foi realizada através de subcultivos em placas contendo ágar Sabouraud dextrose. A ação sobre a parede celular de Candida albicans foi investigada através da determinação da CIM do extrato vegetal na presença de sorbitol (0,8M), utilizando a técnica de microdiluição. Através de Microscopia Eletrônica de Varredura, avaliou-se a morfologia celular de Candida albicans tratada com a CIM do extrato vegetal, a CIM da suspensão de nistatina (100.000UI) e livre de tratamento. O efeito combinado das duas substâncias (nistatina e extrato vegetal de Anadenanthera colubrina) estudadas foi determinado a partir da técnica de microdiluição - checkerboard para derivação do Índice de Concentração Inibitória Fracionada (Índice CIF) e através do método de contagem de células viáveis (cinética do crescimento). Nessa última, foram analisadas as seguintes concentrações variadas do extrato, nistatina e associação dos produtos (CIM/8; CIM/4; CIM). Foram realizados os testes não paramétricos de Fridman e o teste de Kruskal Wallis (p<0,05). Na prospecção fitoquímica, determinou-se o teor de polifenóis totais, de flavonoides totais e de taninos condensados através de espectrofotometria. O perfil térmico foi traçado com a determinação das curvas termograviméricas (TG) e calorimetria exploratória diferencial (DSC). A toxidez foi avaliada através da quantificação de hemácias que sofrem lise celular frente à diferentes concentrações de extrato vegetal (0,25, 0,5, 1, 2, 4 mg/ml). Observou-se que a A.colubrina tem potencial fungistático frente todas as cepas padrão testadas, e, fungicida frente aos isolados clínicos recentes de Candida albicans. O aumento de 1mg/ml para 8mg/ml da CIM na presença de sorbitol sugere que esse extrato age modificando a parede celular do fungo. As imagens em MEV evidenciam a redução na quantidade de células fúngicas após o tratamento com o extrato vegetal e alterações na parede celular fúngica. O índice de FIC calculado foi de 0,375, indicando sinergismo entre a nistatina e o extrato vegetal. Na cinética, observou-se a manutenção do sinergismo entre os produtos testados ao longo do tempo (p<0,05). Foram determinados 53,18% de polifenois totais, 8,73% de taninos condensados e 0,28% de flavonoides. A curva TG do extrato A.colubrina, mostrou a ocorrência de três etapas de decomposição térmica, a perda de massa mais significativa do extrato foi observada entre as temperaturas de 229,17ºC e 657,39ºC, com perda de 37,44%. As curvas DSC do extrato mostraram que os processos térmicos ocorreram no intervalo de temperatura entre 52,37 ºC a 195,52ºC. No teste de toxidez, nenhuma das concentrações testadas chegou a ser a concentração citotóxica efetiva 50% (EC50). Conclui-se que o extrato vegetal da casca de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan é um recurso promissor na obtenção de um novo fármaco para tratamento de candidose oral.

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-03-17T14:03:25Z No. of bitstreams: 1 PDF - Nathália Alexandra de Oliveira Cartaxo.pdf: 1587194 bytes, checksum: 60766da222502f8476607dd32500b432 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-22T13:35:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Nathália Alexandra de Oliveira Cartaxo.pdf: 1587194 bytes, checksum: 60766da222502f8476607dd32500b432 (MD5) / Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-22T13:35:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Nathália Alexandra de Oliveira Cartaxo.pdf: 1587194 bytes, checksum: 60766da222502f8476607dd32500b432 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:35:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Nathália Alexandra de Oliveira Cartaxo.pdf: 1587194 bytes, checksum: 60766da222502f8476607dd32500b432 (MD5) Previous issue date: 2014-04-22 / The aim of this study was to characterize the vegetable raw material, as well as analyze the phytochemical profile, cytotoxicity and antimicrobial activity of the leaf extract of Syzygium cumini (L.) Skeel on microorganisms associated with dental biofilm. The characterization was performed by the determination of physicochemical properties: particle size, apparent uncompressed density, pH, ash content and loss on drying powder of Syzygium cumini plant drug L. Skeels and application of analytical techniques (electron microscopy scanning, thermal analysis - Differential scanning calorimetry (DSC) and Termogravimetry (TG), X-ray diffraction and infrared spectroscopy) to characterize and implement a quality control of the lyophilized extract of leaves jambolan, which has antimicrobial property. In addition, was determined the antimicrobial activity of the extract of Syzygium cumini (L.) Skeel on microorganisms associated with dental plaque, as well as the phytochemical profile and cytotoxicity. The antimicrobial activity was performed by microdilution broth. Was determined Minimum Inhibitory Concentration (MIC), Minimum Bactericidal Concentration (MBC) and Minimum Fungicidal Concentration (MFC) of the lyophilized extract against Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus parasanguis (ATCC 903), Streptococcus oralis (ATCC 10557), Streptococcus salivarius (ATCC 7073) and Candida albicans (ATCC 10231). Phytochemical analysis was performed by spectroscopy in the visible region and was quantified polyphenols, flavonoids, condensed tannins and total saponins. Cytotoxicity was measured by the hemolysis method. The results demonstrate that particle size of the powder leaves of S. cumini is thick, the pH is acidic and has good density. The ash content and loss on drying were within the parameters recommended by the Pharmacopoeia. The analysis of the extract showed a typical feature of plant extracts, in other words, the particles showed amorphous property. Furthermore, such particles could be observed in the microscopy irregularly shaped, forming agglomerates of different sizes and morphology. In thermal characterization of the extract, five events of decomposition, presented by TG and DSC curves occurred; this had endothermic characteristic. The IR spectrum suggested various functional groups of compounds present in the lyophilized extract in different absorption bands.For Streptococcus, S. cumini was only active against S. mutans and S. oralis (MIC 1mg/mL).The extract showed potential antifungal activity against C. albicans, demonstrating strong fungistatic and fungicidal activity. The quantification of secondary metabolites obtained satisfactory results, especially with high concentrations of total polyphenols and saponins. The extract showed low cytotoxicity. Therefore, the profile of leaves of S. cumini was drawn, showing up in general good physico-chemical, chemical and thermal characteristics. S. cumini has a good antimicrobial potential, with acceptable levels of phytochemicals and compounds with low cytotoxicity and is therefore recommended for use with safety and efficacy in the prevention and treatment of diseases resulting biofilm. / O objetivo desse estudo foi caracterizar a matéria prima vegetal, bem como analisar o perfil fitoquímico, a citotoxicidade e a atividade antimicrobiana do extrato de folhas de Syzygium cumini (L.) Skeel sobre microrganismos associados ao biofilme dental. A caracterização foi realizada por meio da determinação de propriedades físicoquímicas: granulometria, densidade aparente não compactada, pH, teor de cinzas e teor de água do pó da droga vegetal de Syzygium cumini L. Skeels e aplicação de técnicas analíticas (microscopia eletrônica de varredura, análise térmica– Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Termogravimetria (TG), difração de raio-X e espectroscopia de infravermelho - IV) para caracterizar e verificar a autenticidade do extrato liofilizado de folhas de jambolão, que possui propriedade antimicrobiana. Além disso, determinou-se a atividade antimicrobiana do extrato de Syzygium cumini(L.) Skeel sobre microrganismos associados ao biofilme dental, assim como o perfil fitoquímico e a citotoxicidade. A atividade antimicrobiana foi realizada através da técnica de microdiluição em caldo. Determinou-se a Concentração Inibitória Mínima (CIM), Concentração Bactericida Mínima (CBM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) do extrato liofilizado frente a Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus parasanguis (ATCC 903), Streptococcus oralis (ATCC 10557), Streptococcus salivarius (ATCC 7073) e Candida albicans (ATCC 10231). A análise fitoquímica foi realizada por espectroscopia na região visível e quantificou-se polifenóis, flavonóides, taninos condensados e saponinas totais. A citotoxicidade foi realizada pelo método de hemólise. Os resultados de granulometria demonstram que o pó de folhas de S. cumini é grosso, apresenta boa densidade e o pH é ácido. O teor de cinzas e o teor de água estiveram dentro dos parâmetros preconizados pela Farmacopeia. A análise do extrato mostrou uma característica típica de extratos vegetais, ou seja, as partículas apresentaram propriedade amorfa. Além disso, essas partículas puderam ser observadas nas microscopias com formatos irregulares, formando aglomerados de diferentes tamanhos e morfologia. Na caracterização térmica do extrato, ocorreram cinco eventos térmicos, apresentados por curvas de DSC e TG, de caráter endotérmico. O espectro de IV sugeriu diversos grupos funcionais dos compostos presentes no extrato liofilizado, em distintas bandas de absorção. Para Streptococcus, Syzygium cumini só foi ativo frente a Streptococcus mutans e aStreptococcus oralis(CIM de 1mg/mL). O extrato apresentou grande potencial antifúngico sobre C. albicans, demonstrando forte atividade fungistática e fungicida. A quantificação de metabólitos secundários obteve resultados satisfatórios, especialmente com altas concentrações de saponinas e polifenóis totais. O extrato apresentou baixa citotoxicidade. Portanto, o perfil de folhas de S. cumini foi traçado, mostrando-se no geral com boas características físico-químicas, químicas e térmicas. S. cumini é uma planta com bom potencial antimicrobiano, com aceitáveis concentrações de compostos fitoquímicos e com baixa citotoxicidade, sendo por isso recomendada a sua utilização com segurança e eficácia na prevenção e tratamento de doenças decorrentes do biofilme dental.