Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 435930.pdf: 928390 bytes, checksum: 7d9c63e8c3ebdc0a8df50f72dcdee9ab (MD5) Previous issue date: 2011-08-26 / Nanocomposites derived from carbon atoms have been the focus of interest in various industrial fields such as electronic engineering, pharmaceuticals, medical devices, cosmetics, food packaging and other, since its discovery in 1985. Fullerene C60 is a nanocomposite with 60 carbon atoms, which has been the subject of numerous studies for its ability to store atoms in the interior and accept various structural modifications. The importance of understanding all the possible effects of exposure to fullerenes is very great, since its production and its use is growing every day increasing environmental exposure to this compound. The cholinergic system has as its main neurotransmitter acetylcholine (ACh). The acetylcholinesterase (AChE, EC3.1.1.7) is an important regulatory enzyme that controls the transmission of nerve impulses across cholinergic synapses by hydrolysis of the ACh. AChE levels are controlled by the interaction of ACh with its receptors, and when the interaction is enhanced, the levels of AChE are increased. Therefore, AChE can be used as a marker of cholinergic function. In this study our goal was to determine whether intraperitoneal injections of fullerene C60 at the doses of 7.5, 15 and 30 mg/kg and the time of 6h, 12h and 24h of exposure would cause a change in the modulation of the cholinergic system. We observed that the dose of 30 mg/kg in the exposure time of 24 hours showed a 84% increase in enzyme activity compared with the vehicle control group. These results suggest a possible neurotoxic effect. Further studies should be conducted to extend these findings. / Nanocompostos derivados de ?tomos de carbono t?m sido foco de interesse para aplica??es em v?rios campos industriais, tais como engenharia eletr?nica, produtos farmac?uticos, dispositivos m?dicos, cosm?ticos, embalagens de alimentos, entre outros, desde seu descobrimento em 1985. O fulereno C60 ? um nanocomposto com 60 ?tomos de carbono que tem sido alvo de in?meros estudos por suas propriedades como a capacidade de armazenar ?tomos em seu interior e aceitar diversas modifica??es estruturais. A import?ncia de entendermos todos os poss?veis efeitos de uma exposi??o aos fulerenos ? muito grande, j? que a sua produ??o e sua utiliza??o est?o crescendo a cada dia aumentando a exposi??o do meio ambiente a este composto. O sistema colin?rgico tem como principal neurotransmissor a acetilcolina (ACh). A acetilcolinesterase (AChE, E.C.3.1.1.7) ? uma importante enzima regulat?ria que controla a transmiss?o de impulsos nervosos atrav?s da sinapse colin?rgica pela hidr?lise da ACh. Os n?veis de AChE s?o controlados pela intera??o da ACh com seus receptores, sendo que quando a intera??o ? acentuada, aumentam os n?veis de AChE Portanto, a AChE pode ser usada como um marcador da fun??o colin?rgica. Neste estudo nosso objetivo foi verificar se inje??es intraperitoneais de fulereno C60 nas doses de 7,5; 15 e 30 mg/kg e nos tempos de 6h, 12h e 24h de exposi??o causaria alguma altera??o na modula??o do sistema colin?rgico. Observamos que a dose de 30 mg/kg, no tempo de exposi??o de 24h, apresentou um aumento de 84% na atividade enzim?tica quando comparado com o grupo controle-ve?culo. Estes resultados sugerem um poss?vel efeito neurot?xico, embora estudos adicionais devam ser realizados para estender estes achados.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437677.pdf: 769775 bytes, checksum: c4cb9d9a52d21b8a9826564fdceb6ea8 (MD5) Previous issue date: 2012-01-13 / Biopharmaceutical drugs are mainly recombinant proteins produced by biotechnological tools. Currently on the market L-asparaginase preparations, derived either from Escherichia coli or Erwinia chrysanthemi, have been used as a therapeutic agent on the effective treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. The interest in Erwinia carotovora L-asparaginase type II stems from its significantly lower glutaminase- and similar asparaginase-activity compared to current therapeutic preparations, this is particularly important since the glutaminase-activity has been implicated in causing serious side effects. The aim of this work is to apply a combination of technologies to develop a productive and simplified process for production of homogeneous and active recombinant L-asparaginase II from Erwinia carotovora (rErAII) in E. coli as host cells. The shake flasks and bioreactor conditions for productive rErAII expression are described, as well as a one-step ion-exchange liquid chromatography purification protocol followed by enzyme kinetics and thermodynamics through isothermal titration calorimetry (ITC). By using a robust fed-batch technique with pre-determined exponential feeding rates the bioreactor culture system yielded 30.7 gram of dry cell weight and 0.9 gram of recombinant rErAII protein in soluble form per liter of culture broth. This was achieved in cultures maintained at 30 ?C, in Terrific Broth medium under isopropil ?-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) induction and using E. coli C43 (DE3) as a host cell. The established one-step purification protocol yielded more than 5 mg of homogeneous rErAII per gram of dry cell weight, corresponding to 168 mg of rErAII protein per culture liter. The work shows that it is possible to produce an active homogeneous rErAII enzyme in the soluble cell fraction through IPTG-induced E. coli fed-batch cultivation. The rErAII proved to be a promising alternative therapy in the treatment of ALL, due to its lower glutaminase activity. When compared to well-established spectrophotometric assays, the straightforward calorimetric techniques for enzyme kinetics determination are accurate and precise either for purified enzymes or crude extracts. These data will contribute to biopharmaceutical companies interested in developing biosimilars, to healthcare policies, and quality control improvement. / Biof?rmacos s?o, na sua maioria, prote?nas recombinantes produzidas por ferramentas biotecnol?gicas. Prepara??es de L-asparaginase que atualmente est?o no mercado, derivadas de Escherichia coli ou Eravinia chrysanthemi, t?m sido utilizadas como agentes terap?uticos no tratamento efetivo de leucemia linfobl?stica aguda (ALI-) por mais de 40 anos. O interesse em L-asparaginase tipo 11 de Ertivinicr carotovora decorre da sua atividade de glutaminase reduzida e sua atividade de asparaginase similar quando comparada a prepara??es terap?uticas atualmente em uso. Isso ? particularmente importante uma vez que a atividade de glutaminase foi relacionada a s?rios efeitos colaterais. O objetivo desse trabalho ? aplicar uma combina??o de tecnologias para desenvolver um processo simplificado e produtivo para a produ??o de L-asparaginase II recombinante homog?nea e ativa de Envinia carolovora (rErAll) em c?lulas hospedeiras de E. coli. Neste trabalho s?o descritas as condi??es para a express?o produtiva de rErAll em agitador orbital e em biorreator, assim como um protocolo de purifica??o em uma ?nica etapa, por cromatografia l?quida de troca f?nica, seguida pela determina??o dos par?metros cin?ticos e termodin?micos da enzima atrav?s de calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC). Usando uma t?cnica robusta de batelada alimentada, com vaz?o em perfil exponencial pr?-determinado, o sistema de cultivo em biorreator rendeu 30,7 gramas de c?lulas secas e 0,9 gramas de prote?na rErAll na fra??o sol?vel por litro de meio de cultivo. Os resultados foram atingidos em cultivos mantidos a 30?C, em meio de cultura Terrific Broth sob indu??o de isopropil 0-D-tiogalactopiranosideo (IPTG) e utilizando E. coli C43 (DE3) como c?lula hospedeira. O protocolo de purifica??o de uma ?nica etapa rendeu aproximadamente 5 mg de rErAll homog?nea por grama de c?lula seca, correspondendo a 168 mg de prote?na rErAll por litro de meio de cultura. O trabalho demonstra que ? poss?vel produzir na fra??o celular sol?vel a enzima rErAII ativa e homog?nea, por meio de cultivos de E. coli em batelada alimentada sob a indu??o de IPTG. A rErAll mostrou ser uma terapia alternativa promissora para o tratamento de ALL devido a sua atividade de glutaminase reduzida. Quando comparada a ensaios espectrofotorn?tricos bem estabelecidos, as t?cnicas calorim?tricas diretas para determina??o de cin?tica enzim?tica s?o exatas e precisas, tanto para enzimas purificadas quanto para extratos brutos. Esses dados poder?o contribuir para ind?strias farmac?uticas interessadas em desenvolver biosimilares. para pol?ticas de sa?de e para o melhoramento do controle de qualidade de enzimas terap?uticas.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437675.pdf: 3014292 bytes, checksum: 10c5c967edfd4e61677f7867c8186a73 (MD5) Previous issue date: 2011-12-09 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis, which currently infects one-third of the world s population. Despite the availability of the Bacille Calmette-Gu?rin vaccine and effective short-course chemotherapy, the increasing global burden of TB has been linked to the co-infection with HIV, the emergence of multi, extensively and now totally drug-resistant strains. Furthermore, the capacity of M. tuberculosis to remain viable within infected hosts in a long-term asymptomatic infection is an additional problem for the control of TB. Nucleotides biosynthesis pathways provide promising molecular targets for the development of new vaccines and therapeutic strategies to control the global incidence of TB. Uracil phosphoribosyltransferase (UPRT) catalyzes the conversion of uracil and 5'-phosphoribosyl-a- 1'-pyrophosphate (PRPP) to uridine 5'-monophosphate (UMP) and pyrophosphate (PPi). UPRT plays an important role in the pyrimidine salvage pathway since its product (UMP) is a common precursor of all pyrimidine nucleotides. This work presents cloning, recombinant expression in Escherichia coli, and purification of the upp-encoded M. tuberculosis UPRT (MtUPRT). Mass spectrometry analysis and N-terminal amino acid sequencing confirmed the identity of homogeneous MtUPRT. The molecular mass of the native MtUPRT was shown to follow a monomer-tetramer association model by analytical ultracentrifugation. This enzyme did not show a pronounced regulation by GTP as this nucleotide did not affect enzyme kinetic parameters, and its binding was not detected by isothermal titration calorimetry (ITC). Initial velocity and ITC studies suggested that catalysis proceeds through a sequential ordered mechanism, in which PRPP binds first, followed by uracil binding, and PPi is the first product to be released, followed by UMP. ITC also showed that PRPP and UMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles indicated that groups with pK values of 5.7 and 8.1 are important for catalytic activity and a group with a pK value of 9.45 is involved in PRPP binding. Pre-steady-state kinetic data suggested that product release is not the rate-limiting step of the reaction catalyzed by MtUPRT. Kinetic fluorescence studies demonstrated two forms of enzyme in solution of which only one can bind to PRPP. Knockout of the upp gene showed that this gene is not essential for M. tuberculosis H37Rv in the employed experimental conditions and the absence of upp gene did not affect the mycobacterium growth. UPRT is expressed in both high and low oxygen conditions of M. tuberculosis H37Ra growth. MtUPRT is inhibited by an active metabolite of isoxyl, which does not seem to inhibit RNA polymerase, adenine phosphoribosyltransferase and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase. Minimum inhibitory concentration of isoxyl for M. tuberculosis mutant for upp gene, complemented and wild type strains was 12.8 μg/mL, meaning that the absence of the upp gene did not affect M. tuberculosis sensitivity to isoxyl. Altogether, these data may be useful for a better understanding about the nucleotide biosynthesis pathway in M. tuberculosis and as a framework on which to base efforts towards the development of efficient prophylactic and therapeutic strategies to decrease the global incidence of this pathogen. / A tuberculose (TB) ? uma doen?a infecciosa causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, o qual atualmente infecta um ter?o da popula??o mundial. Apesar da disponibilidade da vacina Bacille Calmette-Gu?rin e da eficaz quimioterapia de curta dura??o, o aumento na incid?ncia global da TB est? relacionado ? co-infec??o com o HIV e ao surgimento de cepas multi, extensivamente e agora totalmente resistente a drogas. Al?m disto, a capacidade do M. tuberculosis de permanecer vi?vel dentro do hospedeiro infectado por longo per?odo em uma infec??o assintom?tica ? um problema adicional para o controle da TB. As rotas de bioss?ntese de nucleot?deos fornecem alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de novas vacinas e estrat?gias terap?uticas para controlar a incid?ncia global de TB no mundo. A uracil fosforribosil transferase (UPRT) catalisa a convers?o de uracil e 5 - fosforribosil-a-1 -pirofosfato (PRPP) a uridina 5 -monofosfato (UMP) e pirofosfato (PPi). A UPRT tem um papel importante na rota de salvamento das pirimidinas j? que seu produto (UMP) ? o precursor comum de todos os nucleot?deos pirim?dicos. Este trabalho apresenta a clonagem, express?o recombinante em E. coli, e a purifica??o da UPRT de M. tuberculosis codificada pelo gene upp (MtUPRT). Adicionalmente, foram realizadas an?lises de espectrometria de massas e sequenciamento N-terminal que confirmaram a identidade da MtUPRT homog?nea. A massa molecular da MtUPRT nativa seguiu um modelo de associa??o mon?mero-tetr?mero por ultracentrifuga??o anal?tica. Esta enzima n?o mostrou uma regula??o pronunciada por GTP j? que este nucleot?deo n?o afetou os par?metros cin?ticos da enzima, e a sua liga??o n?o foi detectada por calorimetria de titula??o isot?rmica (ITC). A velocidade inicial e os estudos de ITC sugeriram que a cat?lise procede atrav?s de um mecanismo ordenado sequencial, no qual o PRPP liga primeiramente, seguido pela liga??o de uracil, e PPi ? o primeiro produto a ser liberado, seguido pelo UMP. ITC tamb?m mostrou que a liga??o de PRPP e UMP s?o processos termodinamicamente favor?veis. O perfil de pH indicou que grupamentos com os valores de pK pr?ximos de 5,7 e 8,1 s?o importantes para a atividade catal?tica e um grupamento com valor de pK pr?ximo a 9,45 est? envolvido na liga??o do PRPP. Dados de cin?tica no estado pr?-estacion?rio sugeriram que a libera??o de produto n?o ? a etapa limitante da rea??o catalisada pela MtUPRT. Estudos de fluoresc?ncia demonstraram a exist?ncia de duas formas da enzima em solu??o, das quais apenas uma pode ligar ao PRPP. O nocaute do gene upp demonstrou que este gene n?o ? essencial para o M. tuberculosis H37Rv nas condi??es empregadas no experimento e a aus?ncia do gene upp n?o afetou o crescimento micobacteriano. A UPRT mostrou ser expressa tanto em altas como em baixas concentra??es de oxig?nio. A MtUPRT foi inibida por um metab?lito ativo do isoxyl, que n?o parece inibir as enzimas RNA polimerase, adenina fosforribosil transferase e hipoxantinaguanina fosforribosil transferase. A concentra??o inibit?ria m?nima de isoxyl para as cepas de M. tuberculosis mutante para o gene upp, complementada e tipo selvagem foi de 12,8 μg/mL, o que significa que a aus?ncia do gene upp n?o afetou a sensibilidade do M. tuberculosis ao isoxyl. Assim, estes dados podem ser ?teis para um melhor entendimento sobre a via de bioss?ntese de nucleot?deos em M. tuberculosis e podem servir como base para o desenvolvimento de estrat?gias terap?uticas e preventivas eficientes para diminuir a incid?ncia global deste pat?geno.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437812.pdf: 154195 bytes, checksum: 6d937534253a5ebf131f023920cdd572 (MD5) Previous issue date: 2011-11-11 / Background: Age related reductions in contextual memory can impair daily functioning of older adults and have an important impact on their quality of life. Thus, the understanding of the neurobiological correlates of this memory decline is important to the establishment of effective cognitive interventions in healthy older adults. Objective: The current study was aimed to investigate the effects of aging and prefrontal cortex (PFC) function on contextual memory performance under different encoding conditions in a naturalistic experimental paradigm. Methods: Young (n=34, aged 20 - 35 years) and older adult men (n=31; aged 54 - 87 years) matched for education completed a recognition memory task for context (location of objects depicted in different rooms of a house) with or without an incidental binding cue at encoding. In addition, Wisconsin Card Sorting Test (WCST) was carried out to assess PFC function. Results: Results for contextual memory performance showed significant main effects of aging and encoding condition. Older adults performed significantly poorer than young controls in the encoding condition without incidental binding cue. The introduction of the incidental binding cue at encoding significantly improved the context recognition scores in young and older adults. A significant association between WCST scores and the performance for contextual memory were found only in the task without binding cue and just for the older adult men. Conclusion: The main findings indicate that the age related deficits on contextual memory are associated to age related impairments of PFC function, as indicated by the WCST. However, contextual memory of older adults improved with cognitive support at encoding and became independent of the scores on WCST, suggesting that incidental associative binding instructions at encoding can mitigate PFC deficits. / Introdu??o: Redu??es na mem?ria contextual relacionadas ? idade podem prejudicar o funcionamento di?rio dos idosos e t?m um impacto importante na sua qualidade de vida. Assim, a compreens?o dos correlatos neurobiol?gicos deste decl?nio da mem?ria ? importante para o estabelecimento de interven??es cognitivas eficazes em idosos saud?veis. Objetivo: O presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos do envelhecimento e da fun??o do c?rtex pr?-frontal (CPF) sobre o desempenho da mem?ria contextual em condi??es diferentes de codifica??o em um paradigma experimental naturalista. M?todos: Jovens (n = 34; 26,02 ? 0,64) e idosos (n = 31; 69,09 ? 1,26) do sexo masculino pareados por n?vel educacional. Os volunt?rios foram submetidos a uma tarefa de mem?ria de reconhecimento de contexto (localiza??o de objetos representados em diferentes salas de uma casa) com ou sem uma estrat?gia de codifica??o associativa. Al?m disso, o Teste Wisconsin de Classifica??o de Cartas (WCST) foi realizado para avaliar a integridade funcional do CPF. Resultados: Os resultados para o desempenho da mem?ria contextual mostrou efeitos significativos do envelhecimento e da estrat?gia de codifica??o. Os idosos tiveram um desempenho significativamente pior do que controles jovens na condi??o de codifica??o sem estrat?gia de codifica??o. A introdu??o da estrat?gia de codifica??o melhorou significativamente as pontua??es do reconhecimento do contexto nos jovens e idosos. A associa??o significativa entre as pontua??es WCST e o desempenho da mem?ria contextual foram encontrados apenas nos idosos sem estrat?gia de codifica??o. Conclus?o: As principais conclus?es indicam que os d?ficits na mem?ria contextual e dist?rbios da fun??o do CPF est?o relacionados com a idade, como indicado pelo WCST. No entanto, a mem?ria contextual dos idosos melhorou, com o a introdu??o da estrat?gia de codifica??o associativa e tornou-se independente da pontua??o no WCST, sugerindo a estrat?gia de codifica??o associativa pode atenuar os d?ficits do CPF.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 437833.pdf: 963349 bytes, checksum: 9fc7ce9b6fb62b2118fc694c4bf21677 (MD5) Previous issue date: 2012-03-02 / Hyperargininemia is a rare disease caused by an innate error of the metabolism (EIM) biochemically characterized by the accumulation of arginine in body tissues due to arginase deficits. Mental retardation and other neurological symptoms are common in hyperargininemic patients. Several mechanisms have been proposed to describe the neurotoxicity of hiperargininemia, such as changes in antioxidant enzyme systems and neurotransmission. The purinergic system is an important pathway for which uses extracellular nucleotides and nucleosides as signaling molecules. The extracellular ATP degradation and the consequent adenosine production are performed by a cellular surface enzyme family known as ectonucleotidases, which include the NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphoohydrolases) and the ecto-5?-nucleotidase. Adenosine is a neuromodulator that acts through the activation of P1 metabotropic receptors (A1, A2A, A2B, A3) and plays a role as an endogenous neuroprotector. Thus, the NTPDase and ecto-51-nucleotidase control the levels of nucleotides and nucleosides, modulating the purinergic system. Whereas the zebrafish is an important tool for the study of developmental biology and the hiperargininemia is a disease that occurs in the early stages of development, the objective of this study was to evaluate the effects of arginine exposure in zebrafish larvae on different biochemical, behavioral, and molecular parameters. The results showed that exposure to arginine at a concentration of 0.1 mM in larvae of the zebrafish from to 7 days post-fertilization (dpf) was capable of changing ectonucleotidase activities, promoting an increase of ATP, ADP, and AMP hydrolysis and as causing morphological changes, such as larvae body size reduction, but did not alter the locomotor activity of animals. Acute arginine exposure (1h) in adult zebrafish was not able to alter the activity of ectonucleotidases. These data demonstrate that arginine can affect the ectonucleotidase activities and morphological parameters in zebrafish larvae, suggesting that the purinergic system is a target for neurotoxic effects induced by arginine in the early stages of developmental. / Hiperargininemia ? uma doen?a rara causada por um erro inato do metabolismo (EIM) bioquimicamente caracterizado pelo ac?mulo de arginina nos tecidos devido ? defici?ncia de arginase. Retardo mental e outras doen?as neurol?gicas s?o sintomas comuns em pacientes hiperarginin?micos. Diversos mecanismos foram propostos para descrever a neurotoxicidade da hiperargininemia, tais como, altera??es nos sistemas enzim?ticos antioxidantes e de neurotransmiss?o. O sistema purin?rgico ? uma importante rota de sinaliza??o celular que utiliza nucleot?deos e nucleos?deos extracelulares como mol?culas sinalizadoras. A degrada??o do ATP extracelular ? realizada por uma fam?lia de enzimas localizadas na superf?cie celular conhecidas como ectonucleotidases, que inclui as NTPDases (nucleos?deo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5?-nucleotidase. A adenosina ? um neuromodulador que atua atrav?s da ativa??o de receptores metabotr?picos do tipo P1 (A1, A2A, A2B, A3) e pode agir como um neuroprotetor end?geno. As NTPDases hidrolisam nucleot?deos tri- e difosfatados originando a adenosina. Assim, as NTPDases e ecto-5 -nucleotidase controlam os n?veis de nucleot?deos e nucleos?deos, modulando o sistema purin?rgico. Considerando que o peixe-zebra ? uma importante ferramenta para o estudo da Biologia do Desenvolvimento e que a hiperargininemia ? uma doen?a que ocorre nas fases iniciais do desenvolvimento, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com arginina em larvas de peixezebra em diferentes par?metros bioqu?micos, comportamentais e moleculares. Foram avaliados os efeitos da exposi??o in vivo de larvas e adultos de peixe-zebra na atividade das ectonucleotidases e na locomo??o. Os resultados obtidos demonstraram que a exposi??o ? arginina na concentra??o de 0.1 mM em larvas de peixe-zebra do 3? ao 7? dia p?s-fertiliza??o (dpf) foi capaz de alterar a atividade das ectonucleotidases, promovendo um aumento na hidr?lise de ATP, ADP e AMP, assim como causar altera??es moleculares e morfol?gicas, como diminui??o do tamanho corporal, por?m n?o alterou a atividade locomotora dos animais. A exposi??o aguda (1h) a arginina em peixes zebra adultos n?o foi capaz de alterar a atividade das ectonucleotidases. Esses dados demonstram que a arginina pode afetar a atividade das ectonucleotidases e par?metros morfol?gicos em larvas de peixe-zebra, sugerindo que o sistema purin?rgico ? um alvo para os efeitos neurot?xicos induzidos pela arginina, nas fases iniciais do desenvolvimento.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 438061.pdf: 2839596 bytes, checksum: 6a94dcd2e48c0f8aa666231a6a1d1a83 (MD5) Previous issue date: 2012-01-27 / This study aimed to evaluate the antiproliferative effect of catechin, as if it has the capacity to reverse the phenotype of GRX cells, and the mechanisms involved in these outcomes. We evaluated the growth and cell proliferation in hepatic stellate cell line activated, the GRX, which were treated with catechin, and cocoa extract, and between the possible mechanisms involved in cell growth was assessed by cell necrosis release of lactate dehydrogenase, apoptosis, by expression of caspase 3 and PARP, as well as the expression of autogagia LC3. The cell cycle was measured by the expression of p53 and p27, as well as inflammatory pathways of IL-6 and COX-2 were assessed by RTPCR Real-time quantification and fibrogenic factor TGF-β. The phenotypic reversion was determined by the presence of fat in the cells with Oil-Red, as well as the expression of PPAR γ, an important regulator of adipogenesis. We evaluated the total collagen and collagen type 1 cells after treatment. It can be seen that both catechin as the cocoa extract decreased the cell growth and proliferation and that this decrease was not due to necrosis and even the activation of apoptosis and autophagy. Catechin induced cell cycle arrest by the reduction of p53 and p27, as well as decreasing the expression of inflammatory proteins such as IL-6 and COX-2 and TGF-β factor fibrogenic. The phenotypic reversion, can observe the presence of fat droplets in the cells after treatment with catechin and cocoa extract, as well as a reduction in collagen type I and an increase in expression following treatment with PPAR γ catechin. In conclusion, catechin decreases cell growth GRX, probably anti-inflammatory activity and for stopping the cell cycle. Catechin decreases the synthesis of TGF-β by cells demonstrating the potential antifibrotic effect. It also presents the property to revert the activated phenotype of GRX cells to a quiescent state and this mechanism may be via activation of PPAR gamma metabolic pathway. / O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito antiproliferativo da catequina, assim como, se esta apresenta capacidade de reverter o fen?tipo das c?lulas GRX, e quais os mecanismos envolvidos nestes desfechos. Foi avaliado o crescimento e prolifera??o celular em linhagem de c?lulas estreladas hep?ticas ativadas, as GRX, as quais foram tratadas com catequina e extrato de cacau, e entre os poss?veis mecanismos envolvidos no crescimento celular foi avaliada necrose celular pela libera??o da lactato desidrogenase, apoptose, pela express?o de Caspase 3 e PARP, assim como, autogagia pela express?o de LC3. O ciclo celular foi avaliado pela express?o de p53 e p27, assim como, as rotas inflamat?rias da IL-6 e COX-2 foram avaliadas por RT-PCR em tempo real e a quantifica??o do fator fibrog?nico TGF-β. A revers?o fenot?pica foi avaliada pela presen?a de gordura nas c?lulas, por Oil-Red, assim como, pela express?o de PPARγ, um importante fator regulador da adipog?nese. Foi avaliado o col?geno total e o col?geno do tipo 1 nas c?lulas ap?s os tratamentos. Pode-se observar que tanto a catequina como o extrato de cacau diminuiu o crescimento e prolifera??o celular e que esta diminui??o n?o foi por necrose e nem mesmo pela ativa??o da apoptose e autofagia. A catequina induziu uma parada no ciclo celular, pela redu??o da p53 e p27, assim como, diminuiu a express?o de prote?nas inflamat?rias como a IL-6 e COX-2 e o fator fibrog?nico TGF-β. Quanto a revers?o fenot?pica, pode-se observar a presen?a de got?culas de gordura nas c?lulas ap?s tratamento com catequina e extrato de cacau, assim como, uma diminui??o do col?geno tipo I e um aumento na express?o de PPARγ ap?s tratamento com catequina. Em conclus?o, a catequina diminui o crescimento das c?lulas GRX, provavelmente por atividade anti-inflamat?ria e por parar o ciclo celular. A catequina diminui o s?ntese de TGF-β pelas c?lulas demostrando um potencial efeito antifibr?tico. Apresenta ainda, a propriedade de reverter o fen?tipo ativado das c?lulas GRX para um estado quiescente e este mecanismo pode ser via ativa??o da rota metab?lica PPARγ.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 438119.pdf: 1374944 bytes, checksum: ed0d2c4ba08c684fb0fe51136bb75979 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Endosulfan is a broad spectrum organochlorine pesticide that is still widely used in many developing countries. Following application endosulfan can get to watercourses through surface runoff from agricultural fields and disturb the nontarget aquatic animals including freshwater fish species. Given that the activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) is one of the most recurrently used biomarkers of exposure to pesticides and there are controversial results concerning the effects of endosulfan exposure and AChE activity in fish, the aim of the present study was to evaluate the effects of endosulfan in brain AChE activity and its gene expression pattern using adult zebrafish (Danio rerio) as an animal model. Moreover, we have analyzed the effects of endosulfan exposure in different parameters of zebrafish swimming activity and in long-term memory formation. After 96 hours of exposition, fish in the 2.4 μg endosulfan/L group presented a significant decrease in AChE activity (9.44 ? 1.038 μmol SCh.h-1.mg protein-1; p = 0.0205) when compared to the control group (15.87 ? 1.768 μmol SCh.h-1.mg protein-1; p = 0.0205). The downregulation of brain AChE activity is not directly related with the transcriptional control as demonstrated by the RT-qPCR analysis. Our results reinforce AChE activity inhibition as a pathway of endosulfan-induced toxicity in brain of fish species. In addition, exposure to 2.4 μg endosulfan/L during 96 hours impaired all exploratory parameters evaluated: decreased line crossings (273.7 ? 28.12 number of line crossings compared to the control group 344.6 ? 21.30, p=0.0483), traveled distance (23.44 ? 2.127 meters compared to the control group 29.39 ? 1.585, p=0.0281), mean speed (0.03 ? 0.003 meters/seconds compared to the control group 0.04 ? 0.002, p=0.0275) and body turn angle (69,940 ? 4,871 absolute turn angle compared to the control group 88,010 ? 4,560 p=0.0114). These results suggest that endosulfan exposure significantly impairs animals' exploratory performance, and potentially compromises their ecological and interspecific interaction. Our results also showed that the same endusulfan exposure did not compromise animals' performance in the inhibitory avoidance apparatus. These findings provide further evidence of the deleterious effects of endosulfan exposure in the nervous system. / Endosulfan ? um pesticida organoclorado de amplo espectro ainda utilizado largamente em muitos pa?ses subdesenvolvidos. As aplica??es repetidas de endosulfan podem se incorporar aos cursos de ?gua por meio da lixivia??o dos solos das planta??es e atingir animais aqu?ticos, incluindo esp?cies de peixes. Dado que a atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) ? um dos biomarcadores de exposi??o aos pesticidas mais utilizados de forma recorrente e h? resultados controversos envolvendo os efeitos da exposi??o ao endosulfan e a atividade da AChE em peixes , o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do endosulfan na atividade da AChE cerebral e seu padr?o de express?o g?nica utilizando zebrafish adulto (Danio rerio) como modelo experimental. Al?m disso, n?s analisamos os efeitos da exposi??o ao endosulfan em diferentes par?metros de locomo??o do zebrafish e na forma??o da mem?ria de longo prazo. Ap?s 96h de exposi??o, os peixes do tempo com 2,4 μg/L de endosulfam apresentaram um decr?scimo significante na atividade da AChE (9.44 ? 1.038 μmol SCh.h-1.mg prote?na-1; p = 0.0205) quando comparados com o grupo controle (15.87 ? 1.768 μmol SCh.h-1.mg prote?na-1; p = 0.0205). A regula??o inibit?ria da atividade da AChE cerebral n?o est? diretamente relacionada com o controle transcricional como demostrado pela an?lise de RT-qPCR. Nossos resultados refor?am a inibi??o da atividade da AChE como via da toxicidade induzida pelo endosulfan em c?rebro de de peixe. Al?m disso, a exposi??o de 2,4 μg/L do endosulfan durante 96h prejudicou todos os par?metros explorat?rios avaliados: linhas cruzadas (273.7 ? 28.12 n?mero de linhas cruzadas em compara??o com o grupo controle: 344.6 ? 21.30, p=0.0483), dist?ncia viajada (23.44 ? 2.127 metros comparados com o grupo controle 29.39 ? 1.585, p=0.0281), velocidade m?dia (0.03 ? 0.003 metros/segundos comparados com o grupo controle 0.04 ? 0.002, p=0.0275) e mudan?as de ?ngulo (69,940 ? 4,871 mudan?as de ?ngulo absolutas comparadas com o grupo controle 88,010 ? 4,560 p=0.0114). Esses resultados sugerem que a exposi??o ao endosulfan prejudica significativamente a performance explorat?ria dos animais e, potencialmente, compromete suas intera??es interespec?ficas e ecol?gicas. Nossos resultados tamb?m demonstraram que a mesma exposi??o ao endosulfan n?o compromete a performance dos animais no aparato de esquiva inibit?ria. Esses achados fornecem evid?ncias adicionais de efeitos delet?rios da exposi??o ao endosulfan no sistema nervoso.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 438124.pdf: 1241897 bytes, checksum: 68c450ddba15c588f04067f7bd75dae9 (MD5) Previous issue date: 2012-03-02 / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive tumor of the CNS and most deadly primary tumors. Despite the malignant gliomas are generally treated with radiotherapy, often they exhibit a significant radioresistance that limits the treatment success. It can be postulated that molecular changes commonly observed in these tumors contribute to this resistance. The nucleotide ATP is an important signaling molecule in CNS and it is a selective P2X7 purinergic receptor (P2X7R) ligand at high concentrations. Some studies have reported that P2X7R is responsible for ATP-induced cell death in various cell types, but some human glioma cells were resistant to death induced by ATP. In addition to ATP resistance, patients with GBM develop spontaneous antitumor immune responses. These studies show the requirement for an exogenous induction of the immune system to generate an antitumor response. IL-17 is a pro-inflammatory cytokine and its role in cancer is already unknown. Herein, we first aimed to characterize a radiosensitive human glioma cell line for sensitivity to ATP and to investigate whether activation of the P2X7R could be involved in the death of this cell line. Furthermore, aimed to elucidate the IL-17 receptor susceptibility to irradiation, as well as, elucidate the effect of IL-17 and a possible interaction between this cytokine and P2X7R in human glioma cells. The human glioma cell lines U-138 MG and U-251 MG were resistant to death when treated with either ATP (5 mM) or BzATP (100 μM), a selective P2X7R agonist, whereas in the radiosensitive M059J glioma cell line, the high ATP (5 mM) or BzATP (100 μM), significantly diminished the cell viability (32.4% ? 4.1 and 24.6% ? 4.0, respectively). The M059J lineage expresses significantly higher P2X7R levels when compared to the U-138 MG and U-251 cell lines (0.40 ? 0.00; 0.28 ? 0.01 and 0.31 ? 0.01, respectively) and irradiation upregulated P2X7R expression in all lineages. Additionally, the selective P2X7R antagonist A740003 (10 ?M) significantly decreased the cell death caused by irradiation. We provided novel evidence indicating that M059J human glioma cell line is ATP-P2X7R sensitive, pointing out the relevance of the purinergic P2X7R in glioma radiosensitivity. The IL-17 receptor was significantly more expressed after irradiation (2 Gy), showing a possible participation of the IL-17/R on the irradiation susceptibility. The treatment with IL-17 (10 ng/ml) diminished approximately 62% the human glioma cell lines viability. Other preliminary result showed that the P2X7R antagonist was able to partially reverse the toxicity caused by IL-17 in these cell lines. Our data show an antitumor role of this cytokine and corroborate to the idea of a possible interaction between IL-17/P2X7R. This work prospects for studies to be conducted to better understanding the action of IL-17 in gliomas and interaction IL-17/P2X7R / O glioblastoma multiforma (GBM) ? considerado o mais agressivo tumor do sistema nervoso central (SNC), e o mais letal entre os tumores prim?rios. Apesar dos gliomas malignos serem geralmente tratados com radioterapia, muitas vezes estes exibem uma significativa radioresist?ncia que limita o sucesso do tratamento. Pode-se postular que mudan?as moleculares comuns observadas nestes tumores contribuem para essa resist?ncia. O nucleot?deo ATP ? uma importante mol?cula de sinaliza??o no SNC e um ligante seletivo do receptor purin?rgico P2X7 (P2X7R) em altas concentra??es. Estudos mostram que o P2X7R ? respons?vel pela morte induzida pelo ATP em v?rios tipos de c?lulas, por?m, algumas c?lulas de glioma humano mostram-se resistentes ? morte induzida pelo ATP. Al?m da resist?ncia ao ATP, pacientes com GBM espontaneamente desenvolvem resist?ncia a respostas imunes antitumorais. Estudos levantam a necessidade de uma indu??o ex?gena do sistema imunol?gico a fim de gerar uma resposta antitumoral. A IL-17 ? um citocina pr?-inflamat?ria e seu papel no c?ncer ainda ? desconhecido. O presente trabalho primeiramente objetivou caracterizar uma linhagem de glioma humano radiossens?vel quanto ? sensibilidade ao ATP e investigar se a ativa??o do P2X7R poderia estar envolvida na morte destas c?lulas. Al?m disso, visou elucidar a susceptibilidade do receptor da IL-17 ? radioterapia, bem como, o efeito da IL-17 e uma poss?vel intera??o entre esta citocina e o P2X7R em c?lulas de glioma humano. As linhagens celulares de glioma humano U-138 MG e U-251 MG mostraram-se resistentes ? morte, quando tratadas com ATP (5 mM) ou BzATP (100 ?M), agonista seletivo do P2X7R. Na linhagem de glioma radiossens?vel M059J, o tratamento com alta concentra??o de ATP (5 mM) ou com BzATP (100 ?M), diminuiram significativamente a viabilidade celular (32,4% ? 4,1 e 24,6 ? 4,0%, respectivamente). A linhagem M059J expressou n?veis significativamente maiores do P2X7R quando comparada com as linhagens celulares U-138 MG e U-251 MG (0.40 ? 0.00; 0.28 ? 0.01 e 0.31 ? 0.01, respectivamente) e a irradia??o aumentou a express?o do P2X7R em todas linhagens. Al?m disso, o antagonista seletivo do P2X7R, A740003 (10 μM), diminuiu significativamente a morte celular causada pela irradia??o. Nesta primeira parte do trabalho, fornecemos novas evid?ncias indicando que a linhagem de glioma humano M059J ? sens?vel ao ATP-P2X7R, apontando a relev?ncia do P2X7R na radiossensibilidade do glioma. Na segunda parte deste trabalho, observou-se que o receptor da IL-17 foi significativamente mais expresso ap?s a irradia??o (2 Gy) mostrando uma poss?vel participa??o da via IL-17/R na susceptibilidade ? irradia??o. O tratamento com a IL-17 (10 ng/ml) diminuiu em aproximadamente 62% a viablidade de linhagens celulares U-138 MG e M059J de glioma humano. Outros resultados preliminares mostraram que o antagonista do P2X7R foi capaz de reverter parcialmente a toxicidade causada pela IL-17 nestas linhagens. Nossos dados demonstram um papel antitumoral desta citocina e corroboram com a id?ia de uma poss?vel intera??o entre a IL-17/P2X7R. Este trabalho deixa perspectivas de estudos a serem realizados para melhor compreender a a??o da IL-17 nos gliomas e a intera??o IL-17/P2X7R

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 438254.pdf: 475511 bytes, checksum: 55b686575a0c7ed0d039db86576374f6 (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / Ewing?s sarcoma is a highly aggressive tumor of bone and soft tissues. It affects mainly children and young adults. In about 88% to 95% there is the occurrence of a translocation between the EWS gene (22q12 locus) and two members of ETS transcription factors family: FLI1 (11q24 locus) or ERG (21q22). The most common translocation involves gene EWS and FLI1. This translocation leads to the formation of EWS/FLI1chimeric aberrant transcription factor. The EWS/FLI1 regulates the NR0B1 gene promoter through a direct binding to GGAA microsatellites sequences. Our objective was to identify and describe the molecular structure of GGAA motifs in NR0B1 promoter in unrelated Ewing's Sarcoma patients and healthy subjects from South Brazilian population. Were identified 21 different alleles in the 224 subjects. All alleles had at least 4 to 5 consecutive GGAA motifs. The 24.2, corresponding to (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)10 sequence, was the most frequent in our population, being present in 50.4% of subjects. Allele 24.2 could be associated to Ewing's sarcoma development since it was significantly more frequent among patients. Differences in the global configuration of NR0B1 promoter GGAA microsatellites (size, sequence, amount and position of GGAA repeats and single 'A' base insertions) could result in differences in Ewing's sarcoma susceptibility. These results would provide insights for the understanding of tumorigenesis. / O sarcoma de Ewing ? um tumor altamente agressivo que afeta ossos e tecidos moles. Ele acomete principalmente crian?as e adultos jovens. Em torno de 88% a 95% dos casos verifica-se a ocorr?ncia de uma transloca??o entre o gene EWS (l?cus 22q12) e dois membros da fam?lia do fator de transcri??o ETS: o FLI1 (11q24) ou o ERG (21q22). A transloca??o mais frequente envolve os genes EWS e FLI1. Esta transloca??o leva ? forma??o do fator de transcri??o quim?rico aberrante EWS/FLI1. O fator EWS/FLI1 regula o promotor do gene NR0B1 atrav?s de uma liga??o direta a sequ?ncias de microssat?lites GGAA. Nosso objetivo foi identificar e descrever a estrutura molecular de motivos GGAA no promotor de NR0B1 em pacientes com Sarcoma de Ewing n?o relacionados e n?o afetados da popula??o sul brasileira. Foram identificados 21 alelos diferentes em 224 indiv?duos estudados. Todos os alelos tiveram, pelo menos, de 4 a 5 motivos consecutivos GGAA. O alelo 24.2, correspondente a sequ?ncia (GGAA)7A(GGAA)7A(GGAA)10, foi o mais freq?ente em nossa popula??o, estando presente em 50,4% de todos os indiv?duos. O alelo 24.2 pode estar associado ao desenvolvimento do Sarcoma de Ewing, dado que sua frequ?ncia foi significativamente mais alta entre afetados. Diferen?as na configura??o global dos microssat?lites GGAA no promotor de NR0B1 (em rela??o ? tamanho, sequ?ncia, quantidade e posi??o das repeti??es GGAA e inser??es de base ?nica A ) podem resultar em diferente susceptibilidade ao sarcoma de Ewing. Tais resultados poder?o fornecer subs?dios para uma melhor compreens?o da tumorig?nese.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 438584.pdf: 476074 bytes, checksum: 0144120e5040772f4dc29057d0403105 (MD5) Previous issue date: 2011-03-24 / Iron accumulation in the brain has been associated to the pathogenesis of neurodegenerative disorders. We have previously demonstrated that iron overload in the neonatal period results in severe and persistent memory deficits in adult rats. Here, using the animal model of cognitive impairment induced by iron overload we tested the effects of NaBut in ameliorating memory. Rats received vehicle or 10.0 mg/kg Fe+2 orally at postnatal days 12-14. When animals reached the age of 2 months, they received an acute intraperitoneal injection of vehicle or NaBut (1.2 g/kg) immediately after the training session in either novel object recognition or inhibitory avoidance tasks. Retention test sessions were performed 24 hours after training. Animals that received iron in the neonatal period showed severe memory deficits. A single acute injection of NaBut was able to recover memory deficits in iron-treated rats. The results provide evidence that NaBut may be considered for the treatment of cognitive decline associated with neurodegenerative disorders. / O excesso de ferro no enc?falo tem sido relacionado com a patog?nese de diversas doen?as neurodegenerativas, como por exemplo, as doen?as de Alzheimer e de Parkinson. Reconhece-se o per?odo neonatal como cr?tico para o estabelecimento do conte?do normal de ferro no c?rebro adulto, podendo, de forma determinante alterar a distribui??o cerebral deste metal de acordo com o grau de absor??o apresentado. Estudos realizados anteriormente em nosso laborat?rio indicaram que a administra??o de ferro no per?odo neonatal prejudica severamente a mem?ria em ratos adultos. Muitos estudos demonstram que a transcri??o g?nica ? um processo necess?rio para a plasticidade e a consolida??o da mem?ria de longa dura??o. A acetila??o das histonas ocorre nos res?duos lisina, neutralizando sua carga positiva, diminuindo a afinidade entre a prote?na e o DNA, levando o relaxamento da estrutura da cromatina, permitindo o recrutamento da maquinaria transcricional. A deacetila??o das histonas ? um processo revers?vel, que ocorre pela a??o das histonas deacetilases (HDACs), as quais representam a principal via de manipula??o farmacol?gica do epigenoma, com promissores valores terap?uticos. Nos ?ltimos anos ocorreu um aumento no n?mero de estudos sugerindo que o Butirato de s?dio (NaBut), um inibidor espec?fico de HDACs, apresenta um poss?vel potencial como agente terap?utico no tratamento de doen?as neurodegenerativas. No entanto, a caracteriza??o de seus efeitos ? limitada pela falta de estudos utilizando modelos animais adequados que reproduzam aspectos de doen?as neurodegenerativas. Portanto, o objetivo deste estudo foi determinar se os d?ficits de mem?ria induzidos pelo tratamento neonatal com ferro podem ser revertidos pela administra??o de NaBut. Para tanto, ratos machos receberam ve?culo (5% de sorbitol em ?gua) ou ferro (10,0 mg/kg) via oral do 12? ao 14? dia p?s-natal. Ao atingirem a idade adulta, ambos os grupos foram divididos em grupos experimentais que receberam inje??es agudas de NaBut (1,2g/Kg) ou ve?culo por via intraperitoneal, imediatamente ap?s a sess?o de treino nas tarefas de esquiva inibit?ria e reconhecimento do objeto novo. Os resultados mostraram que uma inje??o aguda imediatamente ap?s a sess?o de treino n?o afetou a mem?ria em ratos controles, mas foi capaz de reverter os d?ficits de mem?ria induzidos pelo tratamento neonatal com ferro, tanto na tarefa de reconhecimento de objeto quanto na tarefa de esquiva inibit?ria. A partir dos resultados obtidos nos testes de mem?ria de reconhecimento de objeto, e no teste relacionado ? mem?ria aversiva, a esquiva inibit?ria, podemos sugerir que o NaBut apresenta resposta satisfat?ria como modulador da mem?ria, permitindo-nos inferir sua potencialidade como agente terap?utico para o tratamento dos preju?zos de mem?ria que acompanham muitas doen?as neurodegenerativas.