Duzentos e quarenta e cinco neoplasias de glândula perianal de cães dos arquivos do Departamento de Patologia da FMVZ/ USP, de 1984 à 2004, foram revisadas histologicamente. A grande maioria dos casos (34%) foi classificada como adenoma moderadamente diferenciado, grupo II, em machos com mais de oito anos de idade o que reflete a dependência androgênica dessas neoplasias. A análise quantitativa da proliferação celular e apoptose nos diferentes tipos histológicos de neoplasias, hiperplasia e tecido normal dessas glândulas determinou um padrão paralelo de aumento de ambas as quantificações. Com os resultados do índice de crescimento ajustado obtivemos que, embora os carcinomas tenham um nível de proliferação celular muito maior que os adenomas (grupo I), esses têm um potencial de crescimento maior, levando-se em conta a apoptose. Investigamos, também, a expressão de Cx43, 26 e 32 nessas glândulas perianais com métodos imunoistoquímicos. A Cx 43 expressava-se em glândulas perianais normais, hiperplásicas, adenomas (grupo I) e adenomas moderadamente diferenciados. Nos adenomas pouco diferenciados (grupo II), a expressão estava reduzida e não se expressava nos carcinomas (grupo III). A Cx 26 acumulava-se no citoplasma nas glândulas normais, hiperplásicas, adenomas (grupo I) e adenomas moderadamente diferenciados (grupo II). Nos adenomas pouco diferenciados (grupo II), a expressão estava reduzida e, ausente, nos carcinomas. A Cx 32 não foi identificada em nenhum dos grupos (I, II e III) ou glândulas normais e hiperplásicas. Concluindo, Cx 43 e Cx26 são importantes para a homeostasia de glândula perianal normal, podendo estar associadas aos receptores de andrógenos presentes em suas células. Este foi o primeiro estudo mostrando a apoptose e sua influência na fase promocional da carcinogênese e, também, o primeiro estudo mostrando a expressão de Cx43, Cx 26 citoplasmática e ausência de expressão da Cx 32 em glândulas perianais normais, hiperplásicas e neoplásicas em cães / Two hundred and forty five neoplasms of the perianal glands of dogs from the archives of the Department of Pathology of the FMVZ/USP, 1984 to 2004, have been reviewed hystologically. Most of the cases (34%) were classified as moderately differentiated adenomas, group II, in males over 8 years of age, which showed an androgenic dependence of these neoplasms. The quantitative analysis of the cellular proliferation and apoptosis, in the different hystologic types of neoplasia, hyperplasia and normal tissue of these glands, determined a parallel pattern of increase in both quantifications. The values of the net growth index showed that although carcinomas have a much higher level of proliferation than adenomas (group I), these latter have a much higher potential of growth, taking into account the effect of the apoptosis. The occurrence of Cx 43, 26 and 32 in these perianal glands was also investigated by immunohystochemical methods. Cx 43 expression was present in normal, hyperplasic, adenomas (group I) and moderately differentiated adenomas perianal glands. In poorly differentiated adenomas (group II), the expression was reduced and was absent in carcinomas. Cx 26 was accumulated in the cytoplasm in normal, hyperplasic, adenomas (group I) and moderately differentiated adenomas glands. In poorly differentiated adenomas (group II), the expression was reduced and was absent in carcinomas. Cx 32 was not found in all groups (I, II, III), normal and hyperplasic glands. In conclusion, Cx 43 and Cx 26 are important for homeostasis of normal canine perianal glands, being able to be associated with the androgen receptors present in their cells. This was the first study showing the apoptosis and its influence on the promotional phase of carcinogenesis and, also, the first study showing the occurrence of Cx 43, cytoplasmatic Cx 26 and no expression of Cx 32 in normal, hyperplasic and neoplastic canine perianal glands

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O cérebro infantil humano submetido à hipóxia-isquemia (HI) apresenta perda de oligodendrócitos, hipomielinização, astrogliose, alterações no desenvolvimento cortical e no comportamento motor, incluindo a paralisia cerebral. O cerebelo desempenha um importante papel no controle motor e diversos danos vêm sendo observados em humanos e animais que sofreram HI. A excitotoxicidade glutamatérgica é frequentemente associada à HI e junções celulares podem ser responsáveis pela transferência de moléculas capazes de modular os danos decorrentes. Dados prévios de nosso grupo utilizando um modelo de HI pré-natal em ratos demonstraram danos permanentes na estrutura cerebelar, indicando que os efeitos deletérios da HI pré-natal podem ser mantidos até a vida adulta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os níveis de conexinas, receptores e transportadores de glutamato ao longo do desenvolvimento do cerebelo HI, e avaliar a configuração das junções celulares em culturas de astrócitos derivadas do cerebelo de ratos submetidos a esse modelo. Ratas no 18 dia de gestação, após anestesia, tiveram as quatro artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo HI). Animais controle tiveram os úteros expostos sem sofrer a obstrução (Grupo SH). A gestação prosseguiu e apenas filhotes nascidos a termo foram utilizados. Os animais foram decapitados aos 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16),23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) dias pós-natal. Os cerebelos foram submetidos à técnica de Western blotting utilizando os anticorpos anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP e anti-Cx43. Para a cultura de astrócitos foram utilizados cerebelos de animais P2. Após terem atingido confluência, as células foram fixadas e imunomarcadas com os anticorpos anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestina e anti-A2B5. Nossos resultados demonstram diferenças nos níveis de GluR3 durante o desenvolvimento do cerebelo SH e HI, havendo uma redução significativa da expressão desta subunidade no grupo HI em P9. Por outro lado, não foram verificadas alterações nos níveis de NR2B e de GFAP entre os grupos nas diferentes idades. Observou-se redução significativa de Cx43 em animais HI em P2 bem como nos astrócitos HI em cultura, os quais também apresentaram alterações morfológicas e diferenças na expressão do marcador A2B5. A alteração referente a GluR3 no grupo HI pode ser causada pela redução da arborização das células de Purkinje e pela redução no número de precursores de oligodendrócitos no cerebelo de animais HI em P9, já observadas em nosso laboratório. A diminuição de Cx43 indica que a passagem de substâncias por canais astrocitários pode estar reduzida e contribuir para a expansão dos danos persistentes descritos em HI. Alterações morfológicas e na expressão de marcadores da diferenciação de astrócitos podem refletir os potenciais efeitos de HI sobre a maturação destas células a longo-prazo. Nossos resultados apontam que a HI sistêmica pré-natal pode ser responsável por alterações que caracterizam a excitotoxicidade glutamatérgica. Ressaltamos também a importância da comunicação entre astrócitos como estratégia neuroprotetora nesta lesão. / Infant human brains submitted to hypoxia-ischemia show oligodendrocyte loss, hypomelination, astrogliosis, cortical development and motor behavior impairments, including cerebral palsy. Cerebellum plays a critical role in motor control and many damages have been demonstrated in humans and animals who suffered HI. Glutamatergic excitotoxicity is usually associated to HI and cellular junctions may be responsible for molecular traffic, being able to modulate HI harm effects. Previous data from our group using a modified model of prenatal HI in rats have shown long-lasting damages in cerebellar structure, indicating that deleterious effects of prenatal HI may be sustained until adult life. The objective of this study was to characterize connexin (Cx) and glutamate receptors and transporters levels during the development of HI cerebellum and to evaluate cellular junctions in astrocyte cultures derived from the cerebella of rats submitted to this same model. Rats on the 18th gestation day were anesthetized, had their uterine horns exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (HI group). Control animals had the uterine horns exposed but no arteries were clamped (SH group). Gestation proceeded after surgery and only pups born at term were used. The animals were decapitated at 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16), 23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) postnatal days. Cerebella were submitted to Western blotting using anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP and anti-Cx43 antibodies. P2 cerebella were used in astrocyte primary cultures. After they had achieved confluence, the cells were fixed and immunostained with anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestin and anti-A2B5 antibodies. Our results demonstrate differences in GluR3 levels along cerebellum development of SH and HI animals, with a significant decrease of this subunit expression in HI group at P9. On the other hand, we did not observe any variation in NR2B and GFAP levels between groups at different ages. We also observed a significant decreased Cx43 expression in HI group at P2 as well as in cultured astrocytes, which had morphological modifications and different A2B5 marker expression. The modification related to GluR3 receptor in HI group may be caused by impaired dendritic arborization or by a reduced number of oligodendrocyte progenitors in the cerebellum of HI animals at P9, already described in our laboratory. Cx43 reduction indicates that substances traffic through astrocytic channels may be impaired and contribute to lesion expansion of permanent damages observed in HI. Morphological and markers expression changes related to astrocyte differentiation may reflect potential effects of HI on cell maturation at long-term. Our results confirm that prenatal systemic HI may be responsible for changes that characterize glutamatergic excitotoxicity. We also reassure the importance of astrocyte communication as a neuroprotective strategy in this kind of lesion.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Desordens do sistema renal podem ser as causas da hipertensão arterial, a qual pode, por sua vez, causar doenças renais. A pressão sanguínea elevada é muito comum também nas doenças crônicas dos rins, e é, além disso, um conhecido fator de risco para uma mais rápida progressão da falha renal. A incidência de doenças renais crônicas está aumentando no mundo, e há uma grande necessidade de identificar as terapias capazes de deter ou reduzir a progressão da doença. Há crescente evidência de que as estatinas poderiam desempenhar um papel terapêutico. Além disso, tem sido demonstrado que a atividade física melhora a função renal em pacientes. Estudos ultra-estruturais em humanos e em ratos demonstraram a presença de junções gap dentro de todas as células do glomérulo e os podócitos demonstraram conter principalmente conexina-43 (Cx-43). O presente estudo tem como objetivo observar os efeitos da rosuvastatina e da atividade física de baixa intensidade na estrutura e ultra-estrutura renal e na expressão glomerular de Cx-43 em ratos normotensos (WKY) e em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Os ratos foram divididos aleatoriamente em oito grupos: WKY-C: animais normotensos que não receberam rosuvastatina; WKY-ROS: animais normotensos que receberam rosuvastatina 20mg/kg/dia por gavagem orogástrica; SHR-C: animais hipertensos que não receberam rosuvastatina; SHR-ROS: animais hipertensos que receberam rosuvastatina, como descrito no grupo WKY-ROS; SED-WKY: animais normotensos sedentários; EX-WKY: animais normotensos exercitados; SED-SHR: animais hipertensos sedentários; e, EX-SHR: animais hipertensos exercitados. Os animais dos grupos SHR-C, SHR-ROS e SED-SHR apresentaram níveis de pressão arterial maiores que os animais dos grupos WKY-C, WKY-ROS, SED-WKY, EX-WKY e EX-SHR. A massa corporal dos grupos de animais não diferiram significativamente durante o experimento. Não houve diferença nos níveis sanguíneos de uréia, creatinina, ácido úrico e creatinafosfoquinase entre os animas dos grupos estudados. No entanto, houve um aumento da excreção de proteína de 24 horas nos animais do grupo SHR-C. Houve um aumento na área capsular nos animais do grupo SHR-C. Por microscopia eletrônica de transmissão observou-se que nos animais SHR-C e SED-SHR a barreira de filtração glomerular, o diafragma de fenda e os podócitos estão alterados exibindo os vacúolos nos podócitos e pedicelos mais curtos e mais espessos. Por microscopia eletrônica de varredura, os animais SHR-C e SED-SHR exibiram pedicelos mais afilados, curtos e tortuosos. Um aumento da imunofluorescência para Cx-43 foi observada em células epiteliais viscerais dos glomérulos dos animais do grupo WKY-ROS e nas células parietais e viscerais dos glomérulos dos animais do grupo SHR-ROS, se comparado com os grupos WKY-C e SHR-C. Por outro lado, os animais dos grupos SED-SHR e EX-SHR exibiram diminuição da expressão de Cx-43, comparados aos animais SED-WKY e EX-WKY. Em conclusão, podemos supor que os efeitos renais da rosuvastatina e da atividade física de baixa intensidade podem ser ferramentas terapêuticas para melhorar a estrutura e conseqüentemente a função renal em indivíduos hipertensos / Disorders of the renal system may be the cause of hypertension, which can in turn cause kidney disease. The high blood pressure is also very common in chronic kidney diseases, and is also a known risk factor for faster progression of renal failure. The incidence of chronic kidney disease is increasing worldwide, and there is a great need to identify therapies to stop or slow the progression of the disease. There is growing evidence that statins could play a therapeutic role. Moreover, it has been shown that physical activity improves renal function in patients. Ultrastructural studies in humans and rats have shown the presence of gap junctions in all cells of the glomerular podocytes and also to contain mainly connexin-43 (Cx-43). This study aims to observe the effects of rosuvastatin and low-intensity physical activity on the structure and ultrastructure of kidney and glomerular expression of Cx-43 in normotensive rats (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR). The rats were randomly divided into eight groups: WKY-C: normotensive animals not receiving rosuvastatin, WKY-ROS: normotensive animals that received rosuvastatin 20mg/kg/day by orogastric gavage, C-SHR: hypertensive animals not receiving rosuvastatin; SHR -ROS: hypertensive rats that received rosuvastatin, as described in ROS-WKY group, WKY-SED: sedentary normotensive, WKY-EX: normotensive rats exercised, SHR-SED: sedentary hypertensive rats, and EX-SHR: hypertensive rats exercised . The animals in groups C-SHR, SHR-SED and SHR-ROS had blood pressure levels higher than the animals in groups WKY-C, ROS-WKY, WKY-SED, EX-SHR and EX-WKY. The body mass of groups of animals did not differ significantly during the experiment. There was no difference in urea, creatinine, uric acid and creatine phosphokinase blood levels among animals of the studied groups. However, there was an increased excretion of 24 hours protein in SHR-C group. There was an increase in the capsule in group SHR-C. Transmission electron microscopy showed that in SHR-C and SED-SHR glomerular filtration barrier, the slit diaphragm and podocyte were altered. By scanning electron microscopy, the C-SHR and SED-SHR animals exhibited thinner, shorter and more tortuous pedicels. An increase in immunofluorescence for Cx-43 was observed in visceral epithelial cells of the glomeruli of group and in WKY-ROS and in visceral and parietal cells of the glomeruli of SHR-ROS group, compared with WKY-C and SHR- C. On the other hand, SHR-SED and EX-SHR animals exhibited decreased expression of Cx-43 compared with WKY-SED and EX-WKY animals. In conclusion, we can assume that the renal effects of rosuvastatin and low-intensity physical activity can be therapeutic tools to improve the structure and consequently renal function in hypertensive subjects

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / O cérebro infantil humano submetido à hipóxia-isquemia (HI) apresenta perda de oligodendrócitos, hipomielinização, astrogliose, alterações no desenvolvimento cortical e no comportamento motor, incluindo a paralisia cerebral. O cerebelo desempenha um importante papel no controle motor e diversos danos vêm sendo observados em humanos e animais que sofreram HI. A excitotoxicidade glutamatérgica é frequentemente associada à HI e junções celulares podem ser responsáveis pela transferência de moléculas capazes de modular os danos decorrentes. Dados prévios de nosso grupo utilizando um modelo de HI pré-natal em ratos demonstraram danos permanentes na estrutura cerebelar, indicando que os efeitos deletérios da HI pré-natal podem ser mantidos até a vida adulta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os níveis de conexinas, receptores e transportadores de glutamato ao longo do desenvolvimento do cerebelo HI, e avaliar a configuração das junções celulares em culturas de astrócitos derivadas do cerebelo de ratos submetidos a esse modelo. Ratas no 18 dia de gestação, após anestesia, tiveram as quatro artérias uterinas obstruídas por 45 minutos (Grupo HI). Animais controle tiveram os úteros expostos sem sofrer a obstrução (Grupo SH). A gestação prosseguiu e apenas filhotes nascidos a termo foram utilizados. Os animais foram decapitados aos 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16),23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) dias pós-natal. Os cerebelos foram submetidos à técnica de Western blotting utilizando os anticorpos anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP e anti-Cx43. Para a cultura de astrócitos foram utilizados cerebelos de animais P2. Após terem atingido confluência, as células foram fixadas e imunomarcadas com os anticorpos anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestina e anti-A2B5. Nossos resultados demonstram diferenças nos níveis de GluR3 durante o desenvolvimento do cerebelo SH e HI, havendo uma redução significativa da expressão desta subunidade no grupo HI em P9. Por outro lado, não foram verificadas alterações nos níveis de NR2B e de GFAP entre os grupos nas diferentes idades. Observou-se redução significativa de Cx43 em animais HI em P2 bem como nos astrócitos HI em cultura, os quais também apresentaram alterações morfológicas e diferenças na expressão do marcador A2B5. A alteração referente a GluR3 no grupo HI pode ser causada pela redução da arborização das células de Purkinje e pela redução no número de precursores de oligodendrócitos no cerebelo de animais HI em P9, já observadas em nosso laboratório. A diminuição de Cx43 indica que a passagem de substâncias por canais astrocitários pode estar reduzida e contribuir para a expansão dos danos persistentes descritos em HI. Alterações morfológicas e na expressão de marcadores da diferenciação de astrócitos podem refletir os potenciais efeitos de HI sobre a maturação destas células a longo-prazo. Nossos resultados apontam que a HI sistêmica pré-natal pode ser responsável por alterações que caracterizam a excitotoxicidade glutamatérgica. Ressaltamos também a importância da comunicação entre astrócitos como estratégia neuroprotetora nesta lesão. / Infant human brains submitted to hypoxia-ischemia show oligodendrocyte loss, hypomelination, astrogliosis, cortical development and motor behavior impairments, including cerebral palsy. Cerebellum plays a critical role in motor control and many damages have been demonstrated in humans and animals who suffered HI. Glutamatergic excitotoxicity is usually associated to HI and cellular junctions may be responsible for molecular traffic, being able to modulate HI harm effects. Previous data from our group using a modified model of prenatal HI in rats have shown long-lasting damages in cerebellar structure, indicating that deleterious effects of prenatal HI may be sustained until adult life. The objective of this study was to characterize connexin (Cx) and glutamate receptors and transporters levels during the development of HI cerebellum and to evaluate cellular junctions in astrocyte cultures derived from the cerebella of rats submitted to this same model. Rats on the 18th gestation day were anesthetized, had their uterine horns exposed and the four uterine arteries were clamped for 45 minutes (HI group). Control animals had the uterine horns exposed but no arteries were clamped (SH group). Gestation proceeded after surgery and only pups born at term were used. The animals were decapitated at 2 (P2), 9 (P9), 16 (P16), 23 (P23), 30 (P30), 45 (P45) e 90 (P90) postnatal days. Cerebella were submitted to Western blotting using anti-NR2B, anti-GluR3, anti-EAAT1, anti-GFAP and anti-Cx43 antibodies. P2 cerebella were used in astrocyte primary cultures. After they had achieved confluence, the cells were fixed and immunostained with anti-Cx43, anti-GFAP, anti-nestin and anti-A2B5 antibodies. Our results demonstrate differences in GluR3 levels along cerebellum development of SH and HI animals, with a significant decrease of this subunit expression in HI group at P9. On the other hand, we did not observe any variation in NR2B and GFAP levels between groups at different ages. We also observed a significant decreased Cx43 expression in HI group at P2 as well as in cultured astrocytes, which had morphological modifications and different A2B5 marker expression. The modification related to GluR3 receptor in HI group may be caused by impaired dendritic arborization or by a reduced number of oligodendrocyte progenitors in the cerebellum of HI animals at P9, already described in our laboratory. Cx43 reduction indicates that substances traffic through astrocytic channels may be impaired and contribute to lesion expansion of permanent damages observed in HI. Morphological and markers expression changes related to astrocyte differentiation may reflect potential effects of HI on cell maturation at long-term. Our results confirm that prenatal systemic HI may be responsible for changes that characterize glutamatergic excitotoxicity. We also reassure the importance of astrocyte communication as a neuroprotective strategy in this kind of lesion.

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Hiroaki Kihara / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, 2017. / O estriado é a maior estrutura dos núcleos basais (NB), recebendo inputs sinápticos de várias regiões. Ele está envolvido no controle de várias funções, incluindo a motora, cognitiva e emocional, além de ser essencial para a organização e execução de ações voluntárias. Os canais de junções comunicantes (JC) são responsáveis por vários processos essenciais, incluindo a sincronização da atividade neuronal e a propagação da apoptose em doenças neurodegenerativas. Por outro lado, o papel da comunicação mediada por Cx no desenvolvimento do SNC permanece mal compreendido. Neste estudo investigamos a expressão gênica e os níveis proteicos da Cx36, Cx43 e Cx45 no estriado de ratos ao longo do desenvolvimento, na idade de E19 (embrionária) P5, P10 (pós-natais) e P60 (adulto), usando PCR em tempo real e wester blotting, respectivamente. Em seguida, examinamos os possíveis papéis dos canais de Cx36, principal Cx neuronal, no estriado em desenvolvimento. Para esta finalidade, realizamos injeções bilaterais in vivo de quinina, um bloqueador seletivo de Cx36, no estriado de ratos P0. Nossos resultados mostraram que Cx36, Cx43 e Cx45 possuem níveis de RNAm distintos durante o desenvolvimento do estriado. Nós observados que os níveis da expressão gênica da Cx36 e Cx45 foram mais altos durante o desenvolvimento quando comparados com P60 (P <0,05), enquanto Cx43 teve níveis mais baixos durante o desenvolvimento, nas idades de E19 e P5, em relação à P60 (P <0,05). O nível proteico da Cx36 em E19 foi maior quando comparado com todas as idades avaliadas e com o adulto (P <0,05). Por outro lado, nós observamos baixos níveis proteicos para Cx43 e Cx45 em todas as idades de desenvolvimento, comparado com P60 (P <0,05). Para analisar os dados de imuno-histoquímica, foram empregadas ferramentas matemáticas para avaliar em detalhe as alterações no padrão de distribuição das Cx36 e Cx45. Verificou-se que a distribuição dos diferentes tamanhos clusters/aglomerados decai semelhante a uma lei de potência, mas com diferentes valores exponenciais para P0 e P60, revelando tamanho de clusters maiores em P0 (P <0,05). Para Cx43, observou-se que esta proteína esteve distribuída uniformemente em toda a região do estriado, incluindo no interior das fibras que formam esta estrutura, padrão não observado para P60. Os resultados estatísticos mostraram uma diferença robusta comparando esses dois padrões de distribuição da proteína (P <0,0002). Nossos resultados da injeção in vivo demonstraram que os comportamentos motivados, como a alimentação, foram gravemente prejudicados nos filhotes. Além disto, a ontogênese de alguns reflexos motores foi adiada, como os comportamentos de aversão ao precipício e de geotaxia negativa. Finalmente, investigamos as conseqüências funcionais do bloqueio de Cx36 realizado no desenvolvimento pós-natal, avaliando o comportamento do rato adulto. Nossos experimentos mostraram que tanto o condicionamento do medo ao som quanto a coordenação motora foram afetados, revelando padrões distintos dos animais controle. Em conclusão a primeira parte do estudo, fomos capazes de revelar padrões de expressão distintos de Cxs em desenvolvimento do estriado, que provavelmente estão relacionados com processos fundamentais durante o desenvolvimento. Pudemos, também, determinar que a comunicação feita pelos canais Cx36 desempenham papéis essenciais no desenvolvimento do SNC, como revelado por nossas observações no estriado. / The striatum is the largest structure of the basal ganglia (BG), receiving synaptic input from multiple regions. It is involved in the control of various aspects of motor, cognitive, and emotional functions, besides being essential for the organization and execution of voluntary actions. Gap junction (GJ) channels are responsible for several essential processes, including synchronization of neuronal activity and spreading of apoptosis in neurodegenerative diseases. On the other hand, the role of Cx-mediated communication in the development of the CNS remains poorly understood. In this study we investigated gene expression and protein levels of Cx36, Cx43 and Cx45 in the striatum of rats along its developmental ages of E19 (embrionary), P5, P10 (postnatal day) and P60 (adult) using real time PCR and western blotting, respectively. We next examined the possible roles of Cx36 channels, the main neuronal Cx, in the developing striatum. To this end, we performed in vivo bilateral injections of quinine, a selective Cx36 blocker, in the striatum of P0 rats. Our results showed that Cx36, Cx43 and Cx45 have distinct mRNA expression during the development of striatum. We observed that Cx36 and Cx45 gene expression levels were higher during the development when compared to P60 (P<0.05), while Cx43 was lower in developmental ages of E19 and P5 (P<0.05) comparing to P60. Cx36 protein levels at E19 were higher when compared with all evaluated ages and to P60 (P<0.05). On the other hand, we observed lower protein levels of Cx43 and Cx45 along all development ages compared to P60 (P<0.05). For immunofluorescence, we employed mathematical analyses to evaluate in detail changes in Cx36 and Cx45 distribution of clusters size evaluation. It was found that the distribution of the clusters size decays similarly with a power law, but with different exponent values for P0 and P60, revealing larger mean clusters at P0 (P<0.05). For Cx43, we observed that this protein was uniformly distributed in the whole striatum, including inside the fibers that forms this structure, pattern not seen for P60. Statistical results showed a robust difference comparing those two patterns of protein distribution (P<0.0002). Our results from in vivo injection showed that motivated behaviors, such as feeding, were severely impaired in rat pups. Moreover, ontogenesis of some motor reflexes was delayed, as supported by cliff avoidance and negative geotaxis behavior tests. Finally, we focused on the functional consequences of Cx36 blockade performed in postnatal development by evaluating adult behavior. Our experiments showed that both tone fear conditioning and motor coordination were affected, revealing distinct from control animals. In conclusion from first part of this study, we were able to disclose distinct expression patterns of Cxs in developing striatum, which are probably related to fundamental processes during the development. We were, also, able to determine that communication provided by Cx36 channels play essential roles in the developing of the CNS, as revealed by our observations in the striatum.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Desordens do sistema renal podem ser as causas da hipertensão arterial, a qual pode, por sua vez, causar doenças renais. A pressão sanguínea elevada é muito comum também nas doenças crônicas dos rins, e é, além disso, um conhecido fator de risco para uma mais rápida progressão da falha renal. A incidência de doenças renais crônicas está aumentando no mundo, e há uma grande necessidade de identificar as terapias capazes de deter ou reduzir a progressão da doença. Há crescente evidência de que as estatinas poderiam desempenhar um papel terapêutico. Além disso, tem sido demonstrado que a atividade física melhora a função renal em pacientes. Estudos ultra-estruturais em humanos e em ratos demonstraram a presença de junções gap dentro de todas as células do glomérulo e os podócitos demonstraram conter principalmente conexina-43 (Cx-43). O presente estudo tem como objetivo observar os efeitos da rosuvastatina e da atividade física de baixa intensidade na estrutura e ultra-estrutura renal e na expressão glomerular de Cx-43 em ratos normotensos (WKY) e em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). Os ratos foram divididos aleatoriamente em oito grupos: WKY-C: animais normotensos que não receberam rosuvastatina; WKY-ROS: animais normotensos que receberam rosuvastatina 20mg/kg/dia por gavagem orogástrica; SHR-C: animais hipertensos que não receberam rosuvastatina; SHR-ROS: animais hipertensos que receberam rosuvastatina, como descrito no grupo WKY-ROS; SED-WKY: animais normotensos sedentários; EX-WKY: animais normotensos exercitados; SED-SHR: animais hipertensos sedentários; e, EX-SHR: animais hipertensos exercitados. Os animais dos grupos SHR-C, SHR-ROS e SED-SHR apresentaram níveis de pressão arterial maiores que os animais dos grupos WKY-C, WKY-ROS, SED-WKY, EX-WKY e EX-SHR. A massa corporal dos grupos de animais não diferiram significativamente durante o experimento. Não houve diferença nos níveis sanguíneos de uréia, creatinina, ácido úrico e creatinafosfoquinase entre os animas dos grupos estudados. No entanto, houve um aumento da excreção de proteína de 24 horas nos animais do grupo SHR-C. Houve um aumento na área capsular nos animais do grupo SHR-C. Por microscopia eletrônica de transmissão observou-se que nos animais SHR-C e SED-SHR a barreira de filtração glomerular, o diafragma de fenda e os podócitos estão alterados exibindo os vacúolos nos podócitos e pedicelos mais curtos e mais espessos. Por microscopia eletrônica de varredura, os animais SHR-C e SED-SHR exibiram pedicelos mais afilados, curtos e tortuosos. Um aumento da imunofluorescência para Cx-43 foi observada em células epiteliais viscerais dos glomérulos dos animais do grupo WKY-ROS e nas células parietais e viscerais dos glomérulos dos animais do grupo SHR-ROS, se comparado com os grupos WKY-C e SHR-C. Por outro lado, os animais dos grupos SED-SHR e EX-SHR exibiram diminuição da expressão de Cx-43, comparados aos animais SED-WKY e EX-WKY. Em conclusão, podemos supor que os efeitos renais da rosuvastatina e da atividade física de baixa intensidade podem ser ferramentas terapêuticas para melhorar a estrutura e conseqüentemente a função renal em indivíduos hipertensos / Disorders of the renal system may be the cause of hypertension, which can in turn cause kidney disease. The high blood pressure is also very common in chronic kidney diseases, and is also a known risk factor for faster progression of renal failure. The incidence of chronic kidney disease is increasing worldwide, and there is a great need to identify therapies to stop or slow the progression of the disease. There is growing evidence that statins could play a therapeutic role. Moreover, it has been shown that physical activity improves renal function in patients. Ultrastructural studies in humans and rats have shown the presence of gap junctions in all cells of the glomerular podocytes and also to contain mainly connexin-43 (Cx-43). This study aims to observe the effects of rosuvastatin and low-intensity physical activity on the structure and ultrastructure of kidney and glomerular expression of Cx-43 in normotensive rats (WKY) and spontaneously hypertensive rats (SHR). The rats were randomly divided into eight groups: WKY-C: normotensive animals not receiving rosuvastatin, WKY-ROS: normotensive animals that received rosuvastatin 20mg/kg/day by orogastric gavage, C-SHR: hypertensive animals not receiving rosuvastatin; SHR -ROS: hypertensive rats that received rosuvastatin, as described in ROS-WKY group, WKY-SED: sedentary normotensive, WKY-EX: normotensive rats exercised, SHR-SED: sedentary hypertensive rats, and EX-SHR: hypertensive rats exercised . The animals in groups C-SHR, SHR-SED and SHR-ROS had blood pressure levels higher than the animals in groups WKY-C, ROS-WKY, WKY-SED, EX-SHR and EX-WKY. The body mass of groups of animals did not differ significantly during the experiment. There was no difference in urea, creatinine, uric acid and creatine phosphokinase blood levels among animals of the studied groups. However, there was an increased excretion of 24 hours protein in SHR-C group. There was an increase in the capsule in group SHR-C. Transmission electron microscopy showed that in SHR-C and SED-SHR glomerular filtration barrier, the slit diaphragm and podocyte were altered. By scanning electron microscopy, the C-SHR and SED-SHR animals exhibited thinner, shorter and more tortuous pedicels. An increase in immunofluorescence for Cx-43 was observed in visceral epithelial cells of the glomeruli of group and in WKY-ROS and in visceral and parietal cells of the glomeruli of SHR-ROS group, compared with WKY-C and SHR- C. On the other hand, SHR-SED and EX-SHR animals exhibited decreased expression of Cx-43 compared with WKY-SED and EX-WKY animals. In conclusion, we can assume that the renal effects of rosuvastatin and low-intensity physical activity can be therapeutic tools to improve the structure and consequently renal function in hypertensive subjects

A expressão da conexina 32 e 43 nas células gigantes trofoblásticas foi analisada em condições de cultura celular com e sem influência de hormônios sexuais. Placentônios bovinos foram coletados de vacas prenhes em abatedouro nos diferentes períodos gestacionais e divididos em três grupos, primeiro terço (I), segundo terço (II), terceiro terço (III) e transportados ao laboratório em condições assépticas à temperatura de 4ºC em solução de PBS com antibiótico. No laboratório as células foram isoladas e cultivadas em meio D-MEM com 10% SFB por cinco dias. As detecções das conexinas 32 e 43 foram realizadas através de munofluorescencia, pelo método de amplificação da tiramida-fluoresceina, utilizando anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho, anti-conexina 32 e 43 de camundongo. Os resultados mostraram que as células gigantes trofoblásticas expressam conexinas 32 e 43 nos três períodos gestacionais com exceção da Cx32 no primeiro terço gestacional sem adição de hormônios, a qual passou a expressar fluorescência após a adição de hormônios. A distribuição da Cx43 evoluiu com a progressão da gestação, permanecendo limitada ao interior das células gigantes trofoblásticas, sem formar junções comunicantes. O terceiro terço gestacional mostra a Cx43 na CGTT localizada no interior do núcleo. A adição de hormônios ao meio de cultura vem confirmar que a progesterona e o estrógeno podem ter um papel no controle da Cx32. Para Cx43 onde se adicionou progesterona os níveis de expressão foram baixos no início aumentando no decorrer da gestação, o mesmo foi encontrado para o conjugado de progesterona/ estrógeno. Para o estrógeno no grupo I os níveis de expressão foram menores se comparados aos três grupos diminuindo no grupo II e voltando a aumentar no grupo III. / The trophoblast cells expression of connexins 32 and 43 was studied in cell culture conditions with or without influence of sexual hormones. Bovine placentomes were collected from pregnant cows in slaughterhouses in different gestational periods and so divided into three groups, first term (I), second term (II), and third term (III), and transported to the laboratory in aseptic conditions at a temperature of 40C in PBS solution with antibiotics. At the laboratory the cells were isolated and cultivated in D-MEM environment with 10% SFB for five days. The detections of connexins 32 and 43 were achieved through immunofluorescence, by the tyramide-fluorescein amplification method, using a rabbit polyclonal primary antibody anti-connexin 32 and 43 of mice. The results showed that the trophoblast cells expressed connexins 32 and 43 in the three gestational periods with an exception of the Cx32 at the first gestational period. However, after the addition of sexual hormones, they began to express the connexins in the cytoplasm in the first stage. The distribution of the Cx43 evolved with the progression of the gestation, remaining limited to the trophoblast`s cells interior, without formation of gap junctions. The third gestational term shows the Cx43 located inside the nuclei of the CGTT. Addition of hormones in the culture environment confirmed that estrogen and progesterone may have an important action controlling Cx32. For Cx43, the expression was low after prosterone was added to the culture medium, but increased as the gestation evolved, the same was found for a combined compost of estrogen\\ progesterone. For estrogen, in group I the expression levels were inferior when compared to the three groups decreasing in group II and increasing again in group III. We may conclude that the sexual hormes, specially estrogen, affect the expression of connexins in trophoblastic cells.

O presente trabalho estudou a expressão da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas, em especial nas células trofoblásticas gigantes binucleadas. Foram utilizadas 12 amostras de placenta bovina, divididas em três grupos segundo a fase gestacional, primeiro terço, segundo terço e terceiro terço da gestação. O tecido placentário foi fixado em solução metacarn e, posteriormente, submetido ao método tradicional de inclusão em parafina. A detecção da conexina 43 foi realizada através de imuno-histoquímica, pelo método de amplificação da tyramida, utilizando como anticorpo primário policlonal a imunoglobulina de coelho anti-conexina 43 de camundongo. Os resultados deste trabalho indicaram que as células trofoblásticas gigantes bovinas são capazes de expressar a conexina 43 nas três fases da gestação. A distribuição da conexina 43 evoluiu com a progressão da gestação, mas ficou limitada ao interior das células trofoblásticas gigantes bovinas, sem formar marcações pontuais na membrana citoplasmática que pudessem indicar a formação de junções comunicantes. A avaliação de diferentes protocolos histológicos e imuno-histoquímicos permitiu estabelecer a melhor metodologia para a preservação do arranjo tecidual da placenta bovina e a identificação da conexina 43 nas células trofoblásticas gigantes bovinas / The present study has researched the expression of Connexin-43 in bovine trophoblast giant cells, especially in binucleate trophoblast giant cells. Twelve samples of bovine placenta were used, divided into three groups according to the gestational phase, first part, second part and third part of gestation. The placental tissue was fixed in Methacarn solution and later submitted to the traditional method, that is, embedded in paraffin. The detection of Connexin-43 was done through immunohistochemistry by the tyramide amplification method, using as polyclonal primary antibody, rabbit immunoglobuline anti-mouse Connexin-43. The results of this study have revealed that the bovine trophoblast giant cells are capable of the expression of Connexin-43 in the three phases of gestation. The distribution of Connexin-43 evolved as gestation progressed, but was limited to the interior of the bovine trophoblast giant cells without punctate markings in the cytoplasmic membrane which could indicate the formation of communicating junctions. The assessment of different histological and immunohistochemical protocols allowed us to establish the best methodology for the preservation of the tissue arrangement of bovine placenta and the identification of Connexin-43 in the bovine trophoblast giant cells

O infarto do miocárdio (IM), uma das principais causas de morte nas sociedades industrializadas, é sempre acompanhado por uma notável alteração da modulação autonômica, caracterizada por hiperatividade simpática e diminuição do tono parassimpático ao coração. O bloqueio da atuação do simpático cardíaco tem sido amplamente utilizado como estratégia terapêutica eficaz para redução da morbi-mortalidade em pacientes com IM. Entretanto, há evidências de que o restabelecimento da função parassimpática ao coração pode ser igualmente benéfica, uma vez que a diminuição do parassimpático cardíaco é um fator de risco independente de morte súbita. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da inibição da acetilconinesterase plasmática (AChE), por meio da administração endovenosa do brometo de piridostigmina (PIR), sobre o eletrocardiograma (ECG), hemodinâmica e modulação autonômica apos o IM agudo em ratos. Ratos foram anestesiados com uretana e mantidos a uma temperatura de 36-37 ºC. Tiveram eletrodos subcutâneos para registro do ECG implantados, e a artéria e veia femoral cateterizadas para medida direta de PA e administração de drogas, respectivamente. Experimentos preliminares foram realizados para determinação de uma dose de PIR que não causasse grande repercussão hemodinâmica. A atividade da acetilcolinesterase plasmática, bem como o tono autonômico cardíaco também foram avaliados em ratos normais. Em outro protocolo, ratos anestesiados, sob registro contínuo do ECG e PA, tiveram o ramo descendente anterior da artéria coronária esquerda ligado para provocar um extenso IM e, após 10 min, foram tratados com PIR (0,25 mg/kg, i.v) ou salina (solução fisiológica 0,9%), e os registros foram acompanhados por 4 h. Ratos controles tiveram o tórax aberto, mas a artéria coronária foi mantida intacta. Ao final, os ratos tiveram o coração retirado para avaliação da extensão da isquemia miocárdica e para o estudo da conexina 43. A administração endovenosa de PIR foi efetiva em reduzir a atividade da AChE e provocou uma discreta redução da FC (438±8 para 387±10 bpm), sem alteração da PA. Ratos tratados com PIR tiveram menor tono simpático e maior tono vagal cardíaco que os ratos que receberam salina. O tratamento com PIR diminuiu a incidência de arritmias nos animais com IM e aumentou a porcentagem de ratos que sobreviveram até a 4ª hora após o infarto (72 vs 58% nos não tratados). A PIR também preveniu o aumento do intervalo QTc, observado após o IM em ratos não tratados (=-2±4, vs 33±13 ms). A quantidade de conexina 43 foi marcadamente reduzida pelo IM em ratos não tratados (0,7±0,1 vs 2,2±0,4 ua), redução esta que não ocorreu nos ratos com IM tratados com PIR (1,3±0,3 ua). Por fim, foi realizado um ensaio, in vitro, em cardiomiócitos da linhagem H9c2 em cultura, e foi observado que a PIR preveniu a degradação da Cx43 induzida por meio isquêmico durante 4 horas. Portanto, a administração aguda de PIR provocou uma bradicardia pouco intensa, sem repercussões hemodinâmicas importantes, aumentou o tono vagal cardíaco, preveniu o prolongamento do intervalo QTc, diminuiu a incidência de arritmias, e preveniu a degradação da Cx43 nos corações dos ratos infartados. / Myocardial infarction (MI), a leading cause of death in industrialized societies, is always accompanied by a remarkable change in cardiovascular autonomic modulation, characterized by sympathetic overactivity and decreased vagal tone to the heart. The blockade of the cardiac sympathetic activity has been widely used as an effective therapeutic strategy to reduce morbidity and mortality in patients with MI. However, there is evidence that improvement of parasympathetic function can also be beneficial since reduction of cardiac vagal function is an independent risk factor for sudden death. The aim of this study was to evaluate the influence of inhibition of plasma acetilconinesterase (AChE), by intravenous administration of pyridostigmine bromide (PYR) on the electrocardiogram (ECG), hemodynamics and cardiovascular autonomic modulation shortly after MI in rats. Rats were anesthetized with urethane and maintained on a heating pad. Subcutaneous electrodes to record the ECG were installed and catheters were inserted into femoral artery and vein for measurement of blood pressure and drug administration, respectively. Preliminary experiments were performed to determine a dose of PYR that would not cause major hemodynamic consequences. Plasma AChE activity, and cardiac autonomic tone were also evaluated in normal rats. Then, anesthetized rats under continuous recording of ECG and BP, had the anterior descending branch of the left coronary artery ligated to elicit extensive MI and, after 10 min, were treated with PYR (0.25 mg/kg, iv) or saline (0.9% NaCl) and monitored for the next 4 h. Control rats had the chest open, but coronary artery was kept intact. At the end, the rats had the heart removed to determine the size of myocardial isquemia and to study connexin 43. Intravenous administration of PYR was effective in reducing AChE activity of and caused a mild reduction in HR (438±8 to 387±10 bpm) with no change in BP. Also, rats treated with PYR had lower sympathetic and higher cardiac vagal tone as compared to untreated rats. The treatment with PYR decreased the incidence of arrhythmias after MI and increased the percentage of rats that survived until the 4th hour after infarction (72 vs 58 % in untreated). PYR also prevented the increase in QTc interval observed after MI in untreated rats (=-2±4 vs 33±13 ms). The amount of connexin 43 was markedly reduced by MI in untreated rats (2.24±0.46 vs 0.72±0.14 au), nevertheless, this reduction was not observed in infarcted rats that received PYR (1.31±0.29 au). Finally, an in vitro assay was performed on the line H9c2 cardiomyocytes in culture, and it was observed that PYR prevented the degradation of Cx43 induced by ischemic medium for 4 hours. Therefore, the acute administration of PYR caused mild bradycardia without hemodynamic repercussions, increased vagal tone, prevented the prolongation of the QTc interval and decreased the incidence of arrhythmias and prevented the degradation of Cx43 in infarcted rat hearts.

A neuroproteção é um dos tópicos mais relevantes aplicados à neurociência. As junções comunicantes (JC), formadas pelas conexinas (Cx) estão envolvidas na neurodegeneração após lesão. Estudos com animais KO apresentam resultados contraditórios sobre papel das JCs. O objetivo deste trabalho foi analisar o papel das Cxs a partir do trauma mecânico na retina, modelo que permite a visualização do foco, penumbra, e áreas adjacentes à lesão. Observamos regulação distinta das Cx36 e Cx43 durante a neurodegeneração. A Cx36 não se alterou e a Cx43 apresentou desorganização e aumento da imunorreatividade após 7 dias, concomitantemente com GFAP. Células amácrinas apoptóticas encontram-se acopladas a células vizinhas por Cx36. O papel funcional das JCs foi avaliado, utilizando bloqueadores, para verificar a viabilidade/morte de células. Carbenoxolone (CBX), reduziu o espalhamento da apoptose, após 4h, enquanto a quinina, teve o mesmo efeito após 1h. A distribuição de núcleos apoptóticos confirmou que a utilização de bloqueadores de JCs reduz a propagação da apoptose. A quinina, mas não o CBX, diminuiu a expressão de caspases iniciais e efetoras. O controle da permeabilidade de canais de JCs pode participar de estratégias de neuroproteção. / The neuroprotection stands out as one of the most pursued hot topics in applied neurosciences. The gap junctions (GJ), formed by connexin (Cx) are involved in neurodegeneration injury. Studies using KO animal models endowed apparently contradictory results in relation to the role of coupling in neuroprotection. The aim of this study was to analyze the role of Cx-mediated communication in focal lesion induced by mechanical trauma in the retina, a model that alow the visualization of the focus, penumbra and adjacent areas. We observed distinct regulation of Cx36 and Cx43 during neurodegeneration. The Cx36 did not change during the lesion progression and Cx43 showed disorganized pattern and upregulated after 7 days, the same as GFAP. Apoptotic amacrine cells are coupled with health neighborhood cells by Cx36. The functional role of GJ was evaluated using blockers to verify the viability/cell death. Carbenoxolone (CBX) reduced the spread of apoptosis after 4h while quinine had the same effect after 1h. The distribution of apoptotic nuclei confirmed that the use of GJ blockers reduced the propagation of apoptosis. Quinine, but not CBX, decreases initial and effector caspases expression. The control of GJ channels permeability can participate in neuroprotection strategies.