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Characterisation of Nuclear Envelope-Associated Proteins (NEAPs) in Arabidopsis thaliana / Caractérisation des protéines associées à l'enveloppe nucléaire (NEAPs) chez Arabidopsis thalianaDétourné, Gwénaëlle 29 May 2019 (has links)
Au cours de l'évolution, les cellules eucaryotes ont acquis une enveloppe nucléaire (NE) renfermant et protégeant le génome organisé en chromatine, une structure où l'ADN s’enroule autour de protéines histones. La NE est composé de deux membranes : du côté nucléoplasmique, la membrane nucléaire interne (INM) et du côté cytoplasmique, la membrane nucléaire externe. La NE permet la communication entre les deux compartiments par le biais des complexes de pores nucléaires et relie le cytosquelette au nucléosquelette via le complexe LINC (LInker of Nucleoskeleton to Cytoskeleton). Ainsi, le nucléosquelette associé à l'INM est nécessaire pour transmettre des signaux au noyau et induire des changements dans l'organisation de la chromatine et finalement dans l'expression des gènes.Une nouvelle famille de protéines associées à l'enveloppe nucléaire (NEAP),proposées comme nouveaux composants du nucléosquelette de la plante, a récemment été mise en évidence dans la plante modèle Arabidopsis thaliana. Ces protéines sont codées par une famille de trois gènes et sont ciblées vers le noyau via un NLS où elles sont ancrées à l'INM via leur domaine transmembranaire C-terminal. Les protéines AtNEAPs possèdent également plusieurs longs domaines en spirale (coiled-coil) rappelant la structure des lamines chez les animaux. Cette thèse visait à réaliser une analyse fonctionnelle des AtNEAPs à l'aide de lignées mutantes T-DNA et CRISPR/Cas9. L'interactome AtNEAP a été étudié par des approches moléculaires (Yeast Two Hybrid), indiquant des interactions entre AtNEAPs pouvant former des homo- ou hétéro-dimères; ainsi que la localisation et la co-localisation in vivo couplées à de l’imagerie (apFRET), qui ont confirmé les interactions avec le facteur de transcription (TF) AtbZIP18. Les anticorps spécifiques à AtNEAP générés au cours de cette étude ont été utilisés pour confirmer l'expression in vivo. En outre, les résultats ont indiqué que les AtNEAPs font partie du nucléosquelette et jouent un rôle dans l’ancrage des TF à l’INM afin de maintenir la morphologie nucléaire et l’organisation de la chromatine. / During evolution, eukaryotic cells have acquired a nuclear envelope (NE) enclosingand protecting the genome, which is organized in chromatin, a structure wrapping DNAaround histone proteins. The NE is composed of two membranes: on the nucleoplasmic side,the Inner Nuclear Membrane (INM) and on the cytoplasmic side, the Outer NuclearMembrane. The NE allows communication between both compartments through Nuclear PoreComplexes and bridges the cytoskeleton to the nucleoskeleton through the LInker ofNucleoskeleton to Cytoskeleton complex. Thus, the nucleoskeleton associated with the INMis needed to transmit signals to the nucleus and induce changes in chromatin organisation andultimately gene expression.A novel family of NUCLEAR ENVELOPE ASSOCIATED PROTEINS (NEAPs)proposed to be new components of the plant nucleoskeleton has been recently evidenced inthe model plant Arabidopsis thaliana. AtNEAP proteins are encoded by a small gene familycomposed of three genes and are targeted through a nuclear localisation signal to the nucleuswhere they are anchored at the INM through their C-terminal transmembrane domain.AtNEAPs also possess several long coiled-coil domains reminiscent of the lamin structure inanimals. This thesis aimed at performing a functional analysis of AtNEAPs using T-DNAinsertion and CRISPR/Cas9 mutant lines. The AtNEAP interactome was investigated bymolecular approaches (Yeast Two Hybrid), which indicated AtNEAP interactions with eachother to form homo or hetero-dimers; as well as in vivo localisation and co-localisationcoupled to image analyses (apFRET, acceptor photobleaching Fluorescence ResonanceEnergy Transfer), which confirmed interactions with the transcription factor (TF) AtbZIP18.AtNEAP specific antibodies generated during this study were used to confirm expression invivo. Altogether, results indicated that AtNEAPs are part of the nucleoskeleton, with a role inanchoring TFs at the INM to maintain nuclear morphology and chromatin organisation.
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Application of crispr/cas9-based reverse genetics in leishmania braziliensis: Conserved roles for hsp100 and hsp23Adaui, Vanessa, Kröber-Boncardo, Constanze, Brinker, Christine, Zirpel, Henner, Sellau, Julie, Arévalo, Jorge, Dujardin, Jean Claude, Clos, Joachim 01 October 2020 (has links)
The protozoan parasite Leishmania (Viannia) braziliensis (L. braziliensis) is the main cause of human tegumentary leishmaniasis in the New World, a disease affecting the skin and/or mucosal tissues. Despite its importance, the study of the unique biology of L. braziliensis through reverse genetics analyses has so far lagged behind in comparison with Old World Leishmania spp. In this study, we successfully applied a cloning-free, PCR-based CRISPR–Cas9 technology in L. braziliensis that was previously developed for Old World Leishmania major and New World L. mexicana species. As proof of principle, we demonstrate the targeted replacement of a transgene (eGFP) and two L. braziliensis single-copy genes (HSP23 and HSP100). We obtained homozygous Cas9-free HSP23-and HSP100-null mutants in L. braziliensis that matched the phenotypes reported previously for the respective L. donovani null mutants. The function of HSP23 is indeed conserved throughout the Trypanosomatida as L. major HSP23 null mutants could be complemented phenotypically with transgenes from a range of trypanosomatids. In summary, the feasibility of genetic manipulation of L. braziliensis by CRISPR–Cas9-mediated gene editing sets the stage for testing the role of specific genes in that parasite’s biology, including functional studies of virulence factors in relevant animal models to reveal novel therapeutic targets to combat American tegumentary leishmaniasis. / Alexander von Humboldt-Stiftung / Revisión por pares
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Identification de voies de résistance aux inhibiteurs de tyrosine kinase dans la leucémie myéloïde chronique par criblage CRISPR-Cas9. / Genome-wide CRISPR-Cas9 Screening to Identify Pathways Involved in Tyrosine Kinase Inhibitor Resistance in Chronic Myeloid LeukemiaLewis, Matthieu 12 April 2019 (has links)
La caractérisation des tumeurs malignes et la compréhension des mécanismes de résistance aux traitements anticancéreux sont essentielles pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Les criblages génétiques, devenus encore plus puissants avec la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9, le séquençage nouvelle génération et la bioinformatique, sont des outils formidables pour décrypter de nouveaux mécanismes cellulaires, dont la résistance au traitement. La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un syndrome myéloprolifératif qui est caractérisé par l’anomalie génétique t(9;22). Cette aberration chromosomique est à l’origine du gène de fusion BCR-ABL1 qui code l’oncogène du même nom responsable de la prolifération anarchique des cellules. L’imatinib mesylate, un inhibiteur de tyrosine kinase, élimine de manière spécifique les cellules leucémiques en ciblant et en bloquant l’activité kinase de cette protéine. Malheureusement, comme pour tout type de thérapie ciblée, une résistance au traitement survient chez certains patients. Afin de repérer des nouvelles voies de résistance à cet inhibiteur de tyrosine kinase, nous avons effectué un criblage génétique avec la librairie « genome-scale CRISPR knock-out » (GeCKO v2) in vitro dans la lignée cellulaire K562. Nous avons découvert plusieurs gènes qui semblent être essentiels pour la réponse au traitement par imatinib, tels que les facteurs pro-apoptotiques BIM et BAX, ou le répresseur de la voie des MAPK, SPRED2. Le rétablissement spécifique de l’apoptose dans les cellules BIM knock-out (KO) par des BH3-mimétiques, ou l’inhibition ciblée de la voie MAPK dans la lignée SPRED2 KO sensibilise de nouveau les lignées résistantes. Dans ce travail, nous avons découvert des mécanismes de résistance déjà connus (l’apoptose, la voie MAPK…) mais nous avons également démontré l’implication de voies peu connues telles que le complexe Mediator, la maturation de ARNm et l’ubiquitinylation de protéines. Spécifiquement cibler ces lésions génétiques avec des thérapies ciblées combinées peut permettre de surmonter les phénotypes de résistance et ouvre la porte à l’utilisation de l’oncologie de précision. / The characterization of malignant tumour growth and the understanding of resistance mechanisms to treatment in cancer is of utmost importance for the discovery of novel “druggable” targets. Efficient genetic screening, now even more possible with the convergence of CRISPR-Cas9 gene editing technology, next-generation sequencing and bioinformatics, is an important tool for deciphering novel cellular processes, such as resistance to treatment in cancer. Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder characterised by the t(9;22) genetic abnormality, which encodes the driver of CML, the BCR-ABL1 fusion protein. Imatinib mesylate, a tyrosine kinase inhibitor, specifically eliminates CML cells by targeting and blocking the kinase activity of this protein, yet, as for all targeted therapies in cancer, resistance to treatment exists. In order to discover alternative BCR-ABL1 independent mechanisms of imatinib resistance, we utilized the genome-scale CRISPR knock-out library GeCKO v2 to screen for imatinib sensitising genes in vitro on K562 cells. We revealed genes that seem essential for imatinib induced cell death, such as pro-apoptotic genes (BIM, BAX) or MAPK inhibitor SPRED2. Specifically re-establishing apoptotic capabilities in BIM knock-out (KO) cells with BH3-mimetics, or inhibiting MAP-kinase signalling in SPRED2 KO cells with MEK inhibitors restores sensitivity to imatinib, overcoming resistance phenotypes. In this work, we discovered previously identified pathways (apoptosis, MAP-kinase signalling) and novel pathways that modulate response to imatinib in CML cell lines, such as the implication of the Mediator complex, mRNA processing and protein ubiquitinylation. Targeting these specific genetic lesions with combinational therapy can overcome resistance phenotypes and paves the road for the use of precision oncology.
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Etudes des translocations chromosomiques en utilisant les méthodes d'édition du génome : des mécanismes moléculaires à l’oncogenèse / Cancer Translocations Induction Using Genome Editing : from Molecular Mechanisms to OncogenesisBabin, Loélia 27 September 2019 (has links)
Les translocations chromosomiques sont associées à un grand nombre de cancers. Les translocations chromosomiques sont impliquées dans la tumorigenèse par différents mécanismes : elles conduisent soit à une dérégulation d’un oncogène, soit à la formation d’un nouvel oncogène de fusion. Cependant, le lien direct entre l'apparition d'une translocation chromosomique et la formation d'une tumeur n'est pas totalement établi. Par exemple, plusieurs translocations associées au cancer ont été détectées dans le sang d’individus sains voire dans le sang de cordon des bébés avec une prévalence bien supérieure à celle de la maladie. Ceci suggère que la seule formation de la translocation ne suffit pas toujours à induire l’oncogenèse. La plupart des travaux de recherche antérieurs reposaient sur la surexpression de la protéine de fusion, oncogène supposé. Ces approches présentent de nombreuses limites, la translocation chromosomique est alors absente de même que le contexte chromosomique natif du gène de fusion (promoteur endogène, statut de la chromatine, etc.) ou les éventuels effets d’haplo-insuffisance qui ne sont pas récapitulés. La molécule d’ADN étant organisée de manière non aléatoire dans le noyau, les réarrangements chromosomiques sont également susceptibles d’affecter le statut épigénétique, la réplication et la transcription du chromosome dérivatif entier, en plus des segments d’ADN nouvellement juxtaposés. Or la technologie CRISPR/Cas9, permet de reproduire la translocation chromosomique in situ, après avoir induit deux cassures double-brin simultanées. Ce travail de thèse a porté spécifiquement sur la translocation t(2,5) (p23, q35) qui induit l’expression de la protéine de fusion NPM1-ALK fréquemment rencontrée dans le lymphome anaplasique à grandes cellules (ALCL). Nous avons reproduit la t(2,5) à la fois dans des lignées cellulaires mais aussi dans des cellules T primaires à la fin de ma thèse. Nous avons pu montrer des modifications significatives du timing de réplication des cellules qui portent la translocation en comparaison des cellules isogéniques de départ (par la méthode du Répli-seq) pouvant avoir un impact sur l’homéostasie des cellules tumorales. En parallèle, nous avons mis en évidence la formation d'ARN circulaires de fusion spécifiques, exprimés à partir du gène de fusion, spécifiques des lignées tumorales. Ces ARN circulaires pourraient donner naissance à de nouveaux biomarqueurs diagnostic/pronostic dans le futur. Ces travaux permettront de mieux comprendre les conséquences des translocations chromosomiques oncogéniques dans les cellules humaines et pourraient mener vers de nouvelles orientations thérapeutiques à l’avenir. / Chromosomal translocations are associated with a wide range of cancers. These chromosomal rearrangements are implicated in tumorigenesis by different mechanisms: either they lead to oncogene upregulation or tumor suppressor downregulation. However, the direct link between the appearance of one chromosomal translocation and tumor formation is not always clear. For example, several cancer translocations have been found in PBMCs or in cord blood cells from healthy individuals, suggesting that translocation formation alone is not always sufficient to drive oncogenesis. Most of previous research works on cancer translocation relied on studies using overexpression of the fusion protein. These approaches do not reproduce the chromosome arm translocation nor the chromosomal context of the fusion gene (endogenous promotor, chromatin status etc…) or do not recapitulate a potential haplo-insufficiency of the translocated cells. Because the DNA molecule is organized non-randomly in the nucleus, chromosomal rearrangements are also likely to impact the epigenetic, replication and transcriptional status of the whole rearranged chromosome in addition to the newly juxtaposed gene segments. Using CRISPR/Cas9 technology, we can recapitulate chromosomal translocation in situ, after inducing 2 concurrent double-strand breaks. In this work, we focus on t(2,5)(p23,q35) leading to NPM1-ALK fusion protein frequently found in Anaplasic Large Cell Lymphoma (ALCL). We could recapitulate t(2;5) in cell lines but more importantly in human primary T cells from healthy donors. We showed significant modifications on Replication Timing in model cell lines compare to isogenic non-translocated cells (using Repli-seq analysis). Importantly, these changes might have a direct impact on tumor cell homeostasis. In parallel, we also highlighted the formation of specific fusion circular RNAs expressed from the fusion gene also found in tumor cells. These circular RNAs could give rise to new diagnostic/prognostic biomarkers in the future. This work will lead to a better understanding of the consequences of cancer translocation in human cells and could give new directions for therapeutics in future.
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Rôle des facteurs de transcription PHOX2B, GATA3 et HAND2 dans l’identité et l’oncogenèse du neuroblastome / Role of the PHOX2B/GATA3/HAND2 Transcription Factors in Neuroblastoma Identity and OncogenesisPeltier, Agathe 02 December 2019 (has links)
Le neuroblastome est cancer du jeune enfant se développant au sein du système nerveux périphérique sympathique. Cette tumeur est caractérisée par sa grande hétérogénéité clinique : allant de formes régressant spontanément aux tumeurs de haut-risque, réfractaires aux traitements les plus agressifs. La survie à long terme des patients présentant un neuroblastome de haut-risque reste par ailleurs inférieure à 50%, ce qui souligne la nécessité de trouver de nouveaux traitements afin d’améliorer leur prise en charge thérapeutique.Récemment, en définissant le paysage épigénétique des cellules de neuroblastome, nous avons observé la présence de super-enhancers (SE). La caractérisation du paysage des SE dans les lignées de neuroblastome nous a permis de révéler l’hétérogénéité cellulaire du neuroblastome, composée de deux identités distinctes : noradrénergique et mésenchymateuse. Chacune des identités cellulaires est caractérisée par un circuit de régulation transcriptionnelle (CRC) : les facteurs PHOX2B, HAND2 et GATA3 définissent l’identité noradrénergique alors que les facteurs de la famille AP-1 gouvernent l’identité mésenchymateuse. Nous avons par ailleurs montré la différence de sensibilité aux chimiothérapies classiquement utilisées en clinique entre ces deux types cellulaires, avec une résistance accrue des cellules mésenchymateuses.Mon travail de thèse porte sur la caractérisation du rôle des facteurs de transcription PHOX2B et GATA3 dans l’établissement et le maintien de l’identité noradrénergique des cellules de neuroblastome. J’ai réalisé leur knock-out par CRISPR-Cas9 dans la lignée noradrénergique SH-SY5Y. L’inactivation de PHOX2B ne modifie ni le programme transcriptionnel ni le phénotype des cellules, arborant une identité noradrénergique. En revanche, les cellules inactivées pour GATA3 possèdent un phénotype cellulaire mésenchymateux ainsi que des capacités de migration, d’invasion et de résistance aux chimiothérapies. Le knock-out de PHOX2B et GATA3 entraine une diminution de la prolifération cellulaire, traduisant le phénomène d’addiction transcriptionnelle des cellules cancéreuses. La caractérisation du paysage épigénétique des cellules inactivées pour GATA3 démontre leur reprogrammation de l’identité noradrénergique vers l’identité mésenchymateuse avec l’effondrement des SE noradrénergiques ainsi que l’acquisition de SE mésenchymateux. GATA3 est donc indispensable pour le maintien de l’identité noradrénergique in vitro.Les résultats générés lors de ma thèse montrent que les facteurs de transcription impliqués dans un même CRC possèdent des rôles distincts dans l’identité cellulaire. La caractérisation de la dynamique de reprogrammation ainsi que des facteurs impliqués dans ce processus nous permettrons de mieux comprendre les phénomènes de plasticité cellulaire à l’origine de la progression tumorale et de la rechute thérapeutique des patients. / Neuroblastoma is a pediatric tumor of the peripheral sympathetic nervous system characterized by its diversity of clinical presentations from spontaneous regression to highly aggressive tumors. Currently, the overall survival of high-risk neuroblastoma patients remains under 50% which highlight the need to find new therapeutic approaches to improve patient outcome.Recently, we defined the epigenetic landscape of neuroblastoma cell lines and observed the presence of super-enhancers (SE). The characterization of the SE landscape let us to define the heterogeneity of neuroblastoma cell identity with the presence of noradrenergic and mesenchymal cells. Both cell identities are governed by a core regulatory circuitry (CRC), composed by PHOX2B-HAND2-GATA3 in the noradrenergic cells and by AP-1 transcription factors in the mesenchymal cells. We also demonstrate the different behaviors of the cells regarding chemotherapy treatments with a higher resistance of the mesenchymal cells.My thesis aimed at deciphering the role of PHOX2B and GATA3 transcription factors in the establishment and the maintenance of the noradrenergic identity of neuroblastoma cells. To do this, PHOX2B and GATA3 were knock-out by CRISPR-Cas9 in the noradrenergic SH-SY5Y cell line. PHOX2B knock-out has no major impact neither on the transcriptomic profile nor the phenotype of the cells. PHOX2B knock-out cells still maintain their noradrenergic identity. In contrast, GATA3 knock-out cells harbor a mesenchymal phenotype showing higher ability to migrate, invade and being pore resistant to chemotherapy than control SH-SY5Y cells. Both PHOX2B and GATA3 knock-out decrease the SH-SY5Y cell proliferation in vitro and in vivo, which highlight the transcriptional dependency of the noradrenergic cells for their identity-related transcription factors. The characterization of the epigenetic landscape of GATA3 knock-out cells revealed their reprograming from the noradrenergic to the mesenchymal identity with the loss of noradrenergic SE and the acquisition of mesenchymal SE. These results demonstrate that GATA3 is essential for the maintenance of the noradrenergic identity in vitro.Altogether, these results show that transcription factors involved in a CRC can have distinct role in the cell identity. The characterization of the reprogramming dynamics as well as the factors involved in this process will allow us to better understand the cellular plasticity involved in the tumor progression and patient relapse.
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Development of biophysical test systems for behavioral responses in green algaBaidukova, Olga 13 October 2023 (has links)
Die Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein Modellorganismus, der nach der Entdeckung von zwei Photorezeptoren, den Kanalrhodopsinen, eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung der Optogenetik spielte. Kanalrhodopsine sind lichtinduzierte Ionenkanäle, die für das photoinduzierte Verhalten von Chlamydomonas verantwortlich sind. Aufgrund der Herausforderungen bei der gentechnischen Modifizierung in diesem Organismus konnte ihre Funktion in Phototaxis und photophober Reaktion bisher nicht umfassend untersucht werden.
In dieser Arbeit präsentiere ich eine CRISPR-Cas9-basierte Technik, die einen zielgerichteten Austausch einzelner Nukleotide in einem ausgewählten Gen in vivo ermöglicht. Hierfür wird gezielt ein DNA-Doppelstrangbruch innerhalb des Gens induziert und anschließend wieder durch Aktivierung des Homologie-gesteuerten Reparaturmechanismus der Alge behoben, bei dem eine ausgewählte Punktmutation integriert wird.
Diese Technik habe ich anschließend verwendet, um die Funktion der Kanalrhodopsine ChR1 und ChR2 in vivo aufzuklären. Dazu habe ich die codierenden Gene jeweils im Chlamydomonas Wildtyp-Stamm ausgeschaltet und Punktmutationen im verbleibenden Kanalrhodopsin eingeführt. Die so erzeugten Kanalmutanten weisen Veränderungen in ihrer Photozykluskinetik und Ionenselektivität auf, die das lichtabhängige Verhalten der Alge beeinflussen sollten.
Die Ergebnisse zeigten zum einen, dass sowohl ChR1 als auch ChR2 Photorezeptoren sind, die die Phototaxis steuern, und zum anderen, dass eine Erhöhung der ChR2-Expression nach Deletion von ChR1 die phototaktische Aktivität der Algen wiederherstellt. Darüber hinaus wiesen die mutierten Chlamydomonas-Stämme mit veränderter Photozykluskinetik und reduzierter Kalzium-Permeabilität eine fast 100-fache Verringerung der Photosensitivität, eine verminderte photophobische Reaktion und schnellere Lichtadaptation auf. Zudem führte die Umkehr der Selektivität vom Channelrhodopsin von Kationen zu Anionen zum kompletten Verlust der Photoreaktion der Algen. Nicht zuletzt konnte diese Studie die Bedeutung der Proton-Leitfähigkeit der Kanalrhodopsine für das photoinduzierte Verhalten von Chlamydomonas aufzeigen. / The green alga Chlamydomonas reinhardtii is a model organism that played a key role in the development of optogenetics, after discovery of two photoreceptors called channelrhodopsins. Channelrhodopsins are light-gated ion channels that are responsible for photo-induced behavior of Chlamydomonas.
Untill now, their functionality in algal photoresponses such as phototaxis and photophobic reaction has not been extensively studied, primarily due to the challenges connected to genetic editing in the organism.
In this work, I presented a CRISPR-Cas9-based technique allowing a targeted exchange of single nucleotides in a gene of interest in vivo. It is based on targeted induction of DNA double-stranded breaks in the gene and on subsequent engagement of homologous recombination to repair the damage and integrate a selected point mutation.
To elucidate the function of channelrhodopsins ChR1 and ChR2 in vivo, I created channelrhodopsin single knockouts in the wild-type Chlamydomonas strain and integrated point mutations in the remaining channelrhodopsin gene. The selected mutations affected photocycle kinetics and ion selectivity. It was shown that, first, both ChR1 and ChR2 are photoreceptors that mediate phototaxis and second, the upregulation of ChR2 upon the deletion of ChR1 rescues phototactic activity of the algae. Further, the mutant Chlamydomonas strains with altered photocycle kinetics and lower calcium permeability exhibited nearly 100-fold reduction of photosensitivity, a diminished photophobic reaction and faster light adaptation rates. Moreover, the conversion of channelrhodopsin selectivity to anions aborted algal photoresponse. In addition, the study highlighted the importance of proton conductance in the photo-induced behavior of Chlamydomonas.
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CRISPR/Cas9 und Zinkfinger-Nukleasen für die gezielte Genstilllegung in Chlamydomonas reinhardtiiGreiner, Andre 11 March 2015 (has links)
Die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ist ein vielseitiger Modellorganismus sowohl in der Grundlagenforschung als auch für biotechnologische Anwendung. Für die genetische Veränderung wurden verschiedene Methoden entwickelt, jedoch ist die gezielte Modifikation kerncodierter Gene immernoch sehr schwierig. In dieser Arbeit wird eine Strategie vorgestellt, die es ermöglicht, kerncodierte Gene in Chlamydomonas gezielt mit sequenzspezifischen Zinkfinger-Nukleasen zu verändern. Das COP3-Gen, welches den lichtaktivierbaren Ionenkanal Kanalrhodopsin-1 codiert, diente hierbei als Zielsequenz der für die Deletion hergestellten Zinkfinger-Nukleasen. Um eine Charakterisierung der ZFNs zu ermöglichen, wurde ein Modelstamm generiert, der ein inaktiviertes Markergen enthält. Die Inaktiverung erfolgte hierbei durch Insertion der COP3-ZFN Zielsequenz. Die Transformation dieses Modellstamms mit ZFN codierender Plasmid-DNA und einem Reparatur-Template ermöglichte die Wiederherstellung der Markeraktivität und eine Selektion Antibiotika-resistenter Kolonien. Wenn in diesen Experimenten zusätzlich ein COP3 veränderndes Template benutzt wurde, enthielt 1% der analysierten Klone ein mutiertes COP3-Gen. Der Chlamydomonas Augenfleck ist ein lichtsensitives Organell mit entscheidender Funktion für die phototaktische Orientierung der Alge. Eine Deletionsmutante des Blaulicht-Photorezeptors Phototropin zeigte in Experimenten eine veränderte Regulation der lichtabhängigen Augenfleckgröße. Durch Komplementierung der Phototropin-Dysfunktion konnte der lichtabhängige Regulationsprozess wiederhergestellt werden. Die Expression der Phototropin-Kinasedomäne führte zu einer lichtunabhängigen Reduktion der Augenfleckfläche. Interessanterweise führte auch die Expression der N-terminalen LOV-Domänen zu einer geänderten Regulation des Augenflecks und der Phototaxis. Dies deutet, zusätzlich zur Lichtregulation der Kinasedomäne, auf eine zelluläre Signalfunktion der LOV-Domänen hin. / The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is a versatile model for fundamental and biotechnological research. A wide toolset for genetic manipulation has been developed for this alga, but specific modification of nuclear genes is still not routinely possible. Here we present a nuclear gene targeting strategy for Chlamydomonas that is based on the application of zinc-finger nucleases (ZFNs). Initially, we designed a set of ZFNs for targeting the COP3 gene that encodes the light-activated ion channel channelrhodopsin-1. To evaluate the designed ZFNs, we constructed a model strain by inserting a non-functional selection marker interspaced with a short COP3 target sequence into the nuclear genome. Upon co-transformation of this recipient strain with the engineered ZFNs and a DNA repair template, we were able to restore marker activity and select antibiotic resistant clones with active nucleases. In cases where cells were co-transformed with a modified COP3 template, 1% of these clones contained a modified COP3 locus as well. The eyespot of Chlamydomonas is a light-sensitive organelle important for phototactic orientation of the alga. Here we found that eyespot size is downregulated in light. In a strain in which the blue light photoreceptor phototropin was deleted, the light regulation of the eyespot size was affected. We restored this dysfunction in different phototropin complementation experiments. Complementation with the phototropin kinase fragment reduced the eyespot size, independent of light. Interestingly, overexpression of the N-terminal LOV-domains alone also affected eyespot size and phototaxis, suggesting that aside from activation of the kinase domain, they fulfill an independent signaling function in the cell. We propose that phototropin is a light regulator of phototaxis that desensitizes the eyespot when blue light intensities increase.
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Exploration du rôle des différents domaines C2 de l'otoferline et des isoformes des canaux calciques CaV1.3 dans la transmission synaptique des cellules ciliées auditives / Exploring the role of the various C2 domains of otoferlin and isoforms of calcium channels CaV1.3 in synaptic transmission of auditory hair cellsTertrais, Margot 19 December 2018 (has links)
L'encodage du signal acoustique en impulsions nerveuses se réalise au niveau des synapses à ruban des cellules ciliées internes (CCI) de la cochlée. Une dépolarisation déclenche l'exocytose des vésicules synaptiques suite à l'activation des canaux calciques CaV1.3 et à l'action d'un senseur calcique particulier, l'otoferline, une grande protéine se composant d'un domaine transmembranaire en C-terminal et de six domaines C2 (A-F) pouvant lier le Ca2+ et les phospholipides. Afin de caractériser le rôle de ces différents domaines C2, nous avons utilisé des vecteurs viraux (AAV) permettant l'expression de formes raccourcies de l'otoferline (mini-Otof) in vivo dans les CCI de souris dépourvues d'otoferline (Otof -/-). Nous montrons que les mini-Otof contenant les domaines C2-EF, C2-DEF ou C2-ACEF sont suffisantes pour restaurer l'exocytose rapide des CCI Otof -/-, sans toutefois restaurer l'audition car le recrutement des vésicules synaptiques reste altéré. Nous révélons pour la première fois la présence d'une endocytose ultra-rapide (t < 20 ms) dynamine- et otoferline-dépendante, une fonction certainement essentielle à l'homéostasie membranaire des CCI. L'expression des mini-Otof C2-EF et C2-DEF a également permis de restaurer partiellement la composante rapide de l'inactivation du courant calcique des CCI, celle-ci étant absente chez les souris Otof -/-. Cette inactivation rapide est réalisée par les isoformes courtes Cav1.3S qui ont leur partie C-terminale régulatrice tronquée, contrairement aux isoformes longues Cav1.3L dépourvues d'inactivation. Afin de différencier les rôles spécifiques de ces isoformes dans le cycle des vésicules synaptiques, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9, nous permettant d'éditer spécifiquement la partie C-terminale régulatrice des canaux Cav1.3L. Nos résultats montrent que les souris CRISPR-Cav1.3L présentent une surdité sévère expliquée au niveau des CCI par un défaut de recrutement vésiculaire aux zones actives, alors que les Cav1.3S inaltérés contrôlent la fusion rapide des vésicules synaptiques. / The precise encoding of acoustic signals into nerve impulses is achieved at the ribbon synapses of inner hair cells (IHC) of the cochlea. Exocytosis of synaptic vesicles by IHC is triggered by voltage-activation of Cav1.3 calcium channels and the action of a specific calcium sensor, otoferlin, a large protein with a single C-terminal transmembrane domain and six C2 (A-F) domains which binds Ca2+ and interacts with phospholipids. In order to characterize the function of the various otoferlin C2 domains, we used viral vectors (AAV) allowing the expression of shortened forms of otoferlin (mini-Otof), in vivo, in IHC from mice lacking otoferlin (Otof -/-). We show that mini-Otof containing C2-EF, C2-DEF or C2-ACEF domains are sufficient to restore fast synaptic vesicle exocytosis in Otof -/- IHC, but without restoring hearing because vesicular replenishment remains impaired. For the first time, we also uncover an ultra-fast endocytosis (t < 20 ms) dynamin- and otoferlin-dependant, a function that is certainly essential for a fast regulation of IHC membrane homeostasis. Furthermore, the expression of the mini-Otof C2-EF and C2-DEF also partially restored the fast component of the Ca2+ current inactivation in Otof -/- IHC. This rapid inactivation is carried out by Cav1.3S short isoforms which have a truncated C-terminal regulatory domain, unlike Cav1.3L long isoforms which display no inactivation. To characterize the specific role of these Cav1.3 isoforms, we used CRISPR-Cas9 technology, allowing a specific removal of the C-terminal regulatory part of the Cav1.3L channels in IHC. Our results show that CRSIPR- Cav1.3L mice display severe deafness explained at the IHC level by a defect in vesicular replenishment of the active zones, while Cav1.3S are sufficient to ensure fast and transient exocytosis of docked synaptic vesicles.
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Transfert de gènes dans les cellules souches pluripotentes induites : application à la thérapie génique de l'hyperoxalurie primitive de type 1 / Gene transfer in induced pluripotent stem cells for gene therapy of primary hyperoxaluria type 1Estève, Julie 03 December 2018 (has links)
L’hyperoxalurie primitive de type 1 (ou HP1) est une maladie héréditaire du métabolisme liée à un déficit en enzyme hépatocytaire AGT (alanine:glyoxylate aminotransférase), codée par le gène AGXT. Ce déficit entraîne, chez les patients atteints d’HP1, une excrétion hépatique accrue d’oxalate ; celui-ci est ensuite éliminé dans les urines où il se complexe avec le calcium pour former des néphrolithiases oxalo-calciques massives, pouvant conduire à une insuffisance rénale chronique. Le seul traitement curatif disponible pour cette pathologie est la greffe allogénique combinée hépatorénale, actuellement limitée par la disponibilité des donneurs de greffons, une morbi-mortalité significative et la nécessité d’un traitement immunosuppresseur au long cours. L’objectif du projet de recherche est de développer une thérapie génique de l’HP1 par greffe de cellules hépatiques autologues génétiquement corrigées. La faible disponibilité et la difficulté d’amplification in vitro des hépatocytes adultes nous a conduit à explorer la piste des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs) pour produire des cellules hépatiques humaines utilisables en médecine régénérative. Nous avons dérivé et caractérisé des lignées de cellules iPSCs à partir de fibroblastes de patients atteints d’HP1, après expression transitoire des facteurs de reprogrammation par des vecteurs Sendai. Nous avons développé deux stratégies de thérapie génique additive par insertion d’un minigène codant une séquence optimisée de l’ADNc AGXT au moyen (1) d’un vecteur lentiviral à expression hépato-spécifique et (2) d’un processus de recombinaison homologue au locus AAVS1 facilité par le système de clivage ciblé de l’ADN « CRISPR/Cas9 ». Enfin, nous avons mis en évidence l’expression de la cassette thérapeutique après différenciation hépatocytaire des iPSCs génétiquement corrigées. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives de médecine régénérative pour l’HP1 par transplantation de cellules hépatocytaires autologues génétiquement corrigées dérivées d’iPSCs de patients. / Primary hyperoxaluria type 1 (or PH1) is an inherited metabolic disorder related to the deficiency of the hepatic AGT enzyme (alanine:glyoxylate aminotransferase), which is encoded by the AGXT gene. In PH1 patients, this deficiency leads to oxalate overexcretion by liver, followed by urine filtration and complexation with calcium to form massive calcium-oxalate nephrolithiasis potentially leading to chronic renal failure. The only available curative treatment is combined hepatorenal allogeneic engraftment, which is currently limited by the availability of transplant donors, significant morbidity and mortality, and the need for long-term immunosuppressive treatment. The aim of our research project is to develop gene therapy for PH1, consisting in engraftment of genetically corrected autologous liver cells. Considering that adult hepatocytes are hardly available and expandable in vitro, we chose to explore the use of induced pluripotent stem cells (iPSCs) to produce human liver cells for application in regenerative medicine. We derived and characterized iPSC lines from PH1 patient fibroblasts after transient expression of reprogramming factors delivered by Sendai virus vectors. We developed two additive gene therapy strategies by inserting a minigene encoding an optimized AGXT cDNA sequence using (1) a lentiviral vector designed for liver-specific expression and (2) homologous recombination process at the AAVS1 locus favoured by the targeted DNA cutting system “CRISPR/Cas9”. Finally, we highlighted therapeutic cassette expression after hepatic differentiation of genetically corrected iPSCs. These results pave the way for regenerative medicine for PH1 by transplantation of genetically modified autologous hepatocyte-like cells derived from patient-specific iPSCs.
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Régulation de l’excitabilité musculaire par le canal potassique EGL-23 et la voie de signalisation LIN-12/Notch chez le nématode C. elegans / Regulation of muscle excitability by the potassium channel EGL-23 and the LIN-12/Notch pathway in the nematode Caenorhabditis elegansEl Mouridi, Sonia 18 October 2018 (has links)
Les canaux potassiques à deux domaines pore (K2P) sont des régulateurs principaux de l’excitabilité cellulaire car ils jouent un rôle central dans l’établissement et le maintien du potentiel de repos des cellules animales. Malgré leur rôle fondamental, peu d’informations sont connues sur les processus cellulaires qui contrôlent la fonction des canaux K2P in vivo. En particulier, nous ne connaissons que quelques facteurs qui contrôlent directement le nombre, l’activité et la localisation des K2P à la surface des cellules.Durant ma thèse, j’ai utilisé des stratégies d’ingénierie du génome que j’ai associé à des approches génétiques afin de caractériser le canal potassique EGL-23. Pour cela, j’ai réalisé un crible suppresseur du phénotype de défaut de ponte du mutant egl-23(n601) et un crible visuel sur le rapporteur fluorescent traductionnel egl-23::TagRFP-T. Grâce au reséquençagecomplet du génome, j’ai pu cloner 4 gènes impliqués dans la régulation du canal EGL-23. / Two-pore domain potassium channels (K2P) are major regulators of cell excitability, playing a central role in the establishment and maintenance of the resting potential of animal cells. Despite their fundamental role, little is known about the cellular processes that control K2P channels function in vivo. In particular, we know only few factors that directly control thenumber, activity, and localization of K2P on the cell surface.During my thesis, I used state-of-the art genome engineering technologies combined with genetic approaches to characterize the C. elegans potassium channel EGL-23. For this, I realized a phenotypic suppressor screen of the egg-laying defective mutant egl-23(n601) and a visual screen on an egl-23 translational fluorescent reporter. Using whole genome sequencing, I was able to clone for new genes involved in EGL-23 regulation
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