Les métalloprotéines contenant des centres Fe-S jouent un rôle important dans la<br />nature car elles sont impliquées dans des fonctions physiologiques essentielles telles que la<br />photosynthèse, la respiration et la fixation de l'azote.<br />Dans cette thèse, une ferrédoxine impliquée dans la biogenèse des centres Fe-S, et une<br />dioxygenase bactérienne jouant un rôle crucial dans la biodegradation des hydrocarbures<br />aromatiques ont fait l'objet d‘analyses structurales par cristallographie aux rayons X. La<br />structure d'une ferrédoxine de la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatus, a été<br />résolue dans les états oxyde et réduit. De petits changements structuraux ont été observes lors de la réduction, notamment au voisinage du centre [2Fe-2S]. Ces changements sont compares a ceux décrits pour des ferrédoxines de structure similaire mais de fonction différente.<br />Une métalloprotéine plus complexe, appartenant a une grande famille de dioxygenases<br />bactériennes, a été étudiée pour son activité d'oxydation des hydrocarbures aromatiques<br />polycycliques (HAP). Cette enzyme a trois composantes, isolée d'une souche de<br />Sphingomonas dégradant les HAP comprend une oxydoréductase a NAD(P)H, une<br />ferrédoxine a centre [2Fe-2S], et composante oxygenase de six sous-unités assemblées en un hexamère de type α3β3. La composante oxygenase, appelée PhnI, contient une centre [2Fe-2S] de type Rieske et un ion ferreux par sous-unité α, qui ont été identifies par leur signature RPE. L'enzyme est douée d'une spécificité du substrat extrêmement large, puisqu'elle est capable d'hydroxyle toute une gamme de HAP fait de 2 a 5 cycles aromatiques, y compris des cancérogènes comme le benz[a]anthracene et le benzo[a]pyrene. Avec le naphtalène comme substrat, des mesures de cinétique ont montre que cette enzyme a un Km bas (0.92 WM) et une constante de spécificité de 2.0 WM-1. s-1. La proteine Phn1 a été cristallisée, et sa structure 3D a été résolue avec une résolution de 1.85 A. En dépit d'une modeste similitude de séquence avec des dioxygenases homologues, le repliement polypeptidique est très semblable.<br />Des différences ont toutefois été observées au niveau de la poche catalytique.<br />Les protéines sous forme cristallisée, notamment les protéines Fe-S, peuvent subir des<br />dommages dus au rayonnement X synchrotron, causant des artefacts lors de la détermination<br />de la structure. Pour essayer de palier cet inconvénient, des rayons X de très haute énergie (55 keV; 0.22 A), qui sont peu absorbes par les protéines, ont été utilises pour résoudre la<br />structure d'une proteine modèle, le lysozyme. Une structure a été établie pour la première fois<br />par cette approche, en utilisant les phases expérimentales obtenues par différentes méthodes.<br />Les applications potentielles en biologie structurale sont discutées.

L'oxyde supraconducteur YBa2Cu3O7Δ (Y123) qui possède une température critique de 92 K a éveillé à sa découverte un grand enthousiasme et est la source de nombreux travaux. Grâce à ses bonnes propriétés supraconductrices à la température de l'azote liquide (77 K) il semble être le plus prometteur pour les applications sous champ magnétique. Pour obtenir des densités de courant critique élevées, il est nécessaire de les densifier et d'induire une orientation cristallographique préférentielle.<br />Ce travail a consisté à élaborer des échantillons plus performants en terme de propriétés supraconductrices. Le procédé conventionnel de texturation induit des fissures et de la porosité dans les échantillons et nécessite l'ajout de dopants pour améliorer ses propriétés. Nous avons étudié un nouveau procédé « infiltration et croissance » ainsi que la mise en forme d'une géométrie originale « à parois minces ». Les caractérisations effectuées sur la microstructure, la texture et les propriétés supraconductrices sont rapportées.<br />L'optimisation du procédé a consisté à comprendre les mécanismes d'infiltration et de croissance, puis à rechercher la configuration et la composition donnant des échantillons les plus performants. Des densités de courants critiques de l'ordre de 68 kA/cm2 en champ propre ont été mesurées à 77 K. <br /> L'étude des échantillons perforés a montré que, grâces aux « trous » artificiels, les microstructures sont exempt de porosité, les échantillons se refroidissent plus rapidement et l'oxygénation est plus rapide et homogène comparé aux matériaux non perforés.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Sciences des matériaux : Lille 1 : 2004. / N° d'ordre (Lille 1) : 3482. Titre provenant de la page de titre du document numérisé. Bibliogr. à la suite de chaque chapitre.

De la reconnaissance protéine-glucides. Une activité lectine avec une spécificité mannose/glucose a été détectée dans les graines de Platypodium elegans, une légumineuse de la sous-tribu Dalbergiae. Le gène de la lectine PELa a été cloné. Son produit est une protéine de 261 acides aminés appartenant à la famille des lectines de légumineuses et présentant des similarités avec l'agglutinine de Pterocarpus angolensis (PAL). La lectine recombinante a été exprimée dans E. coli et renaturée à partir des corps d'inclusion. L'analyse de la spécificité par Glycan Array montre une préférence très rare pour des N-glycanes de type complexe avec des branches disymmétriques. Une branche courte composée d'un résidu de mannose est préférée sur le bras 1-6 des N-glycanes, tandis que l'extension par les résidus GlcNAc et Gal et favorable sur le bras 1-3. Les affinités ont été mesurées par microcalorimétrie de titration en utilisant des heptasaccharides liés à une asparagine et obtenus par une méthode semi-enzymatique. Une très forte affinité de 5 uM a été obtenue pour deux ligands symétriques et disymmétriques. Les structures cristallographiques de PELa complexé avec le trimannose branché et l'heptasaccharide-Asn symétrique de type complexe ont été résolues respectivement à 2,1 et 1,65 Å de résolution. La lectine adopte l'organisation dimérique canonique des lectines de légumineuses. Le trimannose ponte les sites de liaison de deux dimères voisins, résultant en la formation de chaînes infinies dans le cristal. L'heptasaccharide-Asn se lie par le mannose du bras 1-6 dans le site principal de liaison et de nombreux contacts supplémentaires sont établis avec les autres résidus glucidiques. Le GlcNAc du bras 1-3 interagit avec la surface de la protéine dans une conformation contrainte qui peut expliquer la plus grande affinité que l'on observe sur les puces pour les oligosaccharides avec des bras 1-3 courts qui ne contiennent pas ce monosaccharide.

La voie endo-lysosomale dirige les récepteurs membranaires vers le processus de dégradation lysosomale. En bref, les récepteurs sont marqués par l'ubiquitine, envoyés vers les endosomes précoces puis, pris en charge pas le système ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) et intégrés dans des vésicules intraluminales. Ce système est composé des complexes ESCRT-0, I, II, II et VPS4. Certaines protéines ESCRT sont aussi recrutées lors de processus topologiquement similaires comme la cytokinèse ou le bourgeonnment viral de certains virus enveloppés. AMSH (Associated Molecule of the SH3 domain of STAM) est une ubiquitine-hydrolase associée au système ESCRT qui hydrolyse les chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63. Elle interagit directement avec ESCRT-0 via la sous-unité STAM et avec les membres CHMP1A, 1B et 3 d'ESCRT-III. Bien qu'AMSH pourait recruter ces protéines ESCRT ou être elle-même recrutée par celles-ci, le mécanisme d'activation de son activité d'hydrolase est encore méconnu. Afin de mieux comprendre les bases structurales de l'activation d'AMSH, j'ai essayé danalyser des formes recombinantes de cette protéine par cristallographie aux rayons X et par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ce qui m'a permis d'obtenir deux modèles à basse résolution. De plus, j'ai caractérisé par SPR (Surface Plasmon Resonance) les interactions entre AMSH et CHMP1A, 1B et 3 et déterminé les résidus clefs du dernier complexe. Cela a montré que les surfaces d'interaction employées par le domaine MIT d'AMSH ne sont pas les mêmes pour CHMP3 et CHMP1A/1B. J'ai aussi découvert que l'activité enzymatique d'AMSH seule est très faible ce qui impliquerait une auto-inhibition en solution. L'hydrolyse des chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63 pourrait alors être activée par une construction de STAM comprenant le domaine SH3 ainsi que les domaines liant l'ubiquitine VHS et/ou UIM.

Le virus Epstein-Barr (EBV) est un gamma herpèsvirus humain infectant plus de 95 % de la population mondiale. Lorsque la primo-infection a lieu pendant l'adolescence ou à l'âge adulte, elle peut induire la mononucléose infectieuse (MNI), cette maladie est le plus souvent bénigne. EBV est aussi associé à un certain nombre de cancers de type lymphome (lymphomes de Burkitt et d'Hodgkin) et de type carcinome (carcinomes gastriques et indifférenciés du rhinopharynx). L'importance des protéines de latence du virus dans l'apparition des tumeurs a été très étudiée. Des études récentes montrent que les protéines lytiques d'EBV sont aussi très importantes pour l'apparition et le développement des tumeurs. Le complexe Hélicase-Primase (H-P) du virus herpès simplex 1 (HSV-1, alpha herpèsvirus) est la cible de nouveaux antiviraux. Les activités ATPase, hélicase et primase du complexe d'HSV-1 ont été largement étudiées, mais aucune information structurale du complexe H-P n'est disponible actuellement pour un membre des herpèsvirus humains. Nous avons entrepris l'étude du complexe H-P d'EBV (BBLF4 : hélicase, BSLF1 : primase et BBLF2/3 : sous-unité accessoire) afin de caractériser sa structure et les activités qu'il porte. Nous avons pu établir les conditions d'expression et de purification du complexe et débuter des études structurales et enzymatiques préliminaires. Nous avons pu observer une activité ATPase basale du complexe indépendante de la présence d'un substrat ADN simple brin. Nous observons deux formes solubles du complexe lors des purifications, une présentant probablement une stœchiométrie proche de 1/1/1 et une seconde forme ayant surement un excès de la protéine Hélicase (BBLF4). Ces premiers résultats apportent des informations nouvelles pour le complexe H-P d'EBV et doivent être poursuivis afin de les confirmer et de pouvoir les comparer avec ceux déjà connus pour le complexe H-P d'HSV-1.

Le bourgeonnement est l'étape finale du cycle viral du virus VIH. Les particules virales vont devoir modifier la topologie de la membrane plasmique afin de promouvoir leur libération dans le milieu extracellulaire ; cette étape est réalisée par le recrutement de protéines ESCRT (en particulier CHMP4 et CHMP2) au point de bourgeonnement. A ce jour, les détails moléculaires de ce recrutement sont méconnus. Lethal Giant Discs (LgD) a été décrite dans la littérature comme un régulateur du traffic endosomal, et une interaction avec CHMP4B a été proposée pour l'orthologue humain CC2D1A. Un point majeur de ce travail aura été de caractériser l'interaction CC2D1A.CHMP4B, mais également de mieux comprendre l'organisation de la protéine. En particulier j'ai résolu la structure d'un fragment de LgD à 2.4 Å, comprenant une région hélicale et un domaine C2 en c-terminal. En outre, nous montrons que CC2D1A inhibe la capacité de CHMP4B à polymériser in vitro. A partir d'une structure cristallographique de CHMP4B et de données biochimiques, nous montrons que le site d'interaction de CC2D1A sur CHMP4B est impliqué dans la polymérisation de CHMP4B, et important pour la fonction de la protéine dans le contexte du bourgeonnement du HIV. Un projet parallèle m'a également conduit à définir un protocole de purification de la protéine CHMP2B recombinante sous forme monomérique, cet isoforme ayant été récemment impliqué dans la formation de structures tubulaires à la membrane plasmique et dans des activités de scission membranaire. En particulier, j'ai pû caractériser la protéine en présence de liposomes et préciser de nouveaux partenaires cellulaires.

Mémoire (M.Sc.)--Université du Québec à Chicoutimi, 1978. / Document électronique également accessible en format PDF. CaQCU

L'objectif principal de ce projet de thèse était d'obtenir de nouvelles données structurales sur les transporteurs ADP/ATP mitochondriaux et de développer des outils pour les approches de micro- et nano-cristallographie appliquées à la biologie structurale des protéines membranaires.Le rôle principal du transporteur ADP/ATP (AAC) est d'importer et d'exporter respectivement de l’ADP3- et l’ATP4- à travers la membrane mitochondriale interne, entre l'espace intermembranaire et la matrice. AAC est le transporteur mitochondrial le mieux caractérisé de toute cette famille de protéines. De nombreuses études ont été menées pour caractériser sa fonction et sa structure. Toutefois, les données structurales n’étant disponibles que pour une conformation de la protéine, de nombreuses questions fondamentales notamment sur les différents états conformationnels adoptés par la protéine au cours du processus de transport restent encore posées. Dans cette thèse, nous avons étudié les 4 isoformes humaines d’AAC. Elles sont impliquées dans diverses maladies génétiques, mais jouent également un rôle dans la cancérogenèse. Cette thèse décrit ainsi en détail la caractérisation structurale et fonctionnelle de ces protéines et leur comparaison. C’est est une étape essentielle pour définir leurs propriétés, et constitue un point de départ précieux dans le développement de nouvelles thérapies.Le domaine de la biologie structurale ne cesse de connaître de nouveaux développements, comme c’est le cas par exemple avec l’avènement de la cristallographie sérielle. Il y a donc un besoin constant de nouvelles approches notamment pour la préparation des échantillons, leur montage sur les lignes de lumière et les collectes de données afin de continuer à améliorer la qualité des données collectées au synchrotron. Ainsi, notre objectif était d'utiliser différents échantillons de protéines membranaires pour développer de nouvelles techniques de cristallisation et de montage d’échantillons sur les lignes de lumière afin de préserver au mieux la qualité des échantillons tout en permettant des collectes de données plus rapides, plus efficaces et plus simples. / The main objective of this PhD project was to gain new structural data on the mitochondrial ADP/ATP carriers and develop tools for micro- and nano-crystallography approaches applied to membrane protein structural biology.The main role of the ADP/ATP carrier (AAC) is to import and export ADP3- and ATP4- respectively between the intermembrane space and the matrix through the inner mitochondrial membrane. AAC is the best characterized among all mitochondrial carriers. Much has been done to investigate its function and structure. However, since structural data are only available for one conformation of the protein some fundamental questions about the different conformational states adopted during the transport process still need to be answered.In this thesis we considered 4 human AAC homologs as a main target. They are involved in different genetic diseases but play also a role in cancerogenesis. This thesis describes and compares in detail the functional and structural characterization of the human AAC isoforms. It was an essential step to give insight into their native properties and is a precious starting point for the drug development field.Since the structural biology field is rapidly developing especially in serial crystallography techniques, there are more and more new applications for samples preparation, mounting and measurements in order to improve the quality of the data collected at the synchrotrons. Hence, our second objective was to use different membrane protein samples to develop new crystal-friendly crystallization set up combined with different sample environment on the beamline toward faster, more efficient and simpler data collection.

Virtuellement tous les habitats terrestres sont dominés par les angiospermes, ou plantes à fleurs. Leur capacité à coloniser de nouveaux habitats et supplanter une autre espèce est due à l'avènement d'une nouvelle structure reproductrice – la fleur. La fleur uni les organes mâles et femelles dans une structure compacte et contient la graine. Les plantes à fleurs ne sont pas seulement le type dominant des plantes terrestres, mais sont également la principale source de nourriture et l'habitat de tous les animaux, y compris les humains. En termes d'évolution, les fleurs sont considérées comme un développement récent. Elles ont fait l'objet de spéculations depuis l'époque de Charles Darwin qui à nommé l’évolution dominante et la diversification des plantes à fleurs comme «un abominable mystère» en raison de l'absence d'une transition en douceur de la non-floraison vers la floraison des plantes dans le registre fossile. Avec le séquençage de plusieurs génomes de gymnospermes (semences de plantes non-florales), d’angiospermes basals et de plantes à fleurs supérieures, certaines familles de gènes jouant un rôle central dans le développement et l'évolution de la fleur ont été identifiées. Notre recherche se concentre sur une de ces familles de régulateurs de niveau supérieur appelée « famille de facteur de transcription MADS » (TF). Cette famille de TF permet d'orchestrer le développement des fleurs. Nous nous sommes intéressés à la compréhension des mécanismes moléculaires de la famille des MADS et à la façon dont ces protéines sont capables de contrôler les fonctions de reproduction complexes.Ce projet intègre différentes techniques biophysiques comme la cristallographie aux rayons X, la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) et la microscopie à force atomique (AFM) afin d’étudier les interactions protéine-protéine et protéine-ADN des FT MADS. Aucune étude n’a, à ce jour, porté sur les mécanismes moléculaires des FT MADS en utilisant cette approche structurale intégrée.Un obstacle important dans l'étude des FT MADS a été l’expression des protéines recombinantes et leur purification. Dans ce projet, les protocoles de purification de plusieurs recombinants FT MADS entières ont été établis, permettant la caractérisation structurale et biochimique des protéines dans leurs intégralités. La structure aux rayons X du domaine d'oligomérisation de la protéine de la famille MADS, SEPALLATA3 (SEP3) est présenté et utilisé comme modèle pour comprendre les motifs d'oligomérisation de la famille élargie et les bases moléculaires des interactions protéine-protéine. Des solutions de structures9provenant d'études SAXS de AGAMOUS (AG) et de la phase végétative courte (SVP) sont présentées et complétés par la caractérisation biochimique de leur état d'oligomérisation.Afin d'étudier les interactions protéine-ADN, des procédés complémentaires ont été utilisés. Une propriété importante des FT MADS est leur capacité à modifier la structure de l'ADN grâce à la formation de boucles d'ADN. De manière hypothétique, les FT MADS oligomérisent et fixent l'ADN sur deux sites différents, bouclant potentiellement l'ADN. En utilisant l'AFM, la première preuve directe de la formation de boucle d'ADN par SEP3 est obtenue. Les caractéristiques de liaison d'ADN de SVP ont été étudiées par analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA), par thermophorèseà échelle microscopique (MST) et par AFM. Contrairement au cas de SEP3, l’EMSA et l’AFM ont montrés que SVP est un dimère et présente différents modes de liaison à l'ADN.Ces données fournissent une base atomique et structurale de la fonction des FT MADS. Sur la base de ce travail, nous commençons à comprendre l’oligomérisation et certaines spécificités déterminantes de liaison à l'ADN. Ces études montrent comment les FT MADS s’oligomérisent. / Virtually all terrestrial habitats are dominated by angiosperms, or flowering plants. Their success in colonizing new habitats and supplanting other species is due to the advent of a complex reproductive structure – the flower. The flower unites the male and female organs into one compact structure and encloses the seed. Flowering plants are not only the dominant type of land plants, but also are the primary source of food and habitat for all animals, including humans. In evolutionary terms, flowers are considered a recent development and have been a subject of speculation from the time of Charles Darwin who termed the dominant rise and diversification of flowering plants as “an abominable mystery”* due to the lack of a smooth transition from non-flowering to flowering plants in the fossil record. With the sequencing of multiple genomes from gymnosperms (non-flowering seed plants), basal angiosperms and higher flowering plants, certain gene families have been identified which play a central role in the development and evolution of the flower. My research focuses on one such family of high-level regulators, the MADS transcription factor (TF) family. This TF family helps to orchestrate flower development among other functions. As such, there is great interest in understanding the molecular mechanisms of the MADS family and how these proteins are able to control complex reproductive pathways.This project integrates different biophysical techniques including x-ray crystallography, small angle x-ray scattering (SAXS) and atomic force microscopy (AFM) to investigate protein-protein and protein-DNA interactions of MADS TFs. No studies to date have investigated the molecular mechanisms of MADS TFs using this integrated structural approach.One important hurdle in the study of the MADS TFs has been recombinant protein expression and purification. In this project, recombinant purification protocols for several full length MADS TFs were established, allowing the structural and biochemical characterisation of the proteins. The crystal structure of the oligomerisation domain of the MADS family protein SEPALLATA3 (SEP3) is presented and used as a template for understanding the oligomerisation patterns of the larger family and the molecular basis for protein-protein interactions. Investigation of solution structures, derived from SAXS studies, of AGAMOUS (AG) and SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) along with biochemical characterisation of their oligomerisation states are also presented.In order to study protein-DNA interactions, complementary methods were used. An important putative property of the MADS TFs is their ability to change the structure of DNA through the formation of DNA loops. MADS TFs are hypothesized to oligomerise and bind DNA at two different sites, potentiating looping of DNA. Using AFM, the first direct evidence of DNA looping by SEP3 is described. The DNA binding characteristics of SVP were studied using electrophoretic mobility shift assay (EMSA), microscale thermophoresis (MST) and AFM. Unlike SEP3, SVP is dimeric and thus exhibits different DNA-binding patterns.The data presented here provide an atomic and structural basis for MADS TF function. Based on this work, we now are beginning to understand some of the oligomerisation and DNA-binding specificity determinants. These studies demonstrate how the MADS TFs oligomerise and the results show that we can disrupt oligomerisation and potentially DNA-binding very specifically through the introduction of point mutations. Future work will investigate the in vivo consequences of altered oligomerisation and how this affects different developmental programs in plant reproduction and floral organ morphogenesis.*Letter from Charles Darwin to Joseph Dalton Hooker, written 22 July 1879 (Source: Cambridge University Library DAR 95: 485 – 488) (Friedman, 2009b).