Les interactions intermoléculaires au sein des êtres vivants sont complexes et permettent de véhiculer l’information nécessaire à la survie de l’organisme à un moment donné. Il arrive même que certains intervenants soient impliqués à différents stades d’un même processus. Parmi les très nombreux processus biologiques présents au sein des cellules, la biogénèse des centres fer-soufre apparaît être très complexe. Cette complexité est probablement reliée à la toxicité cellulaire du fer libre et du soufre libre. Ainsi les différentes étapes de la création des centres fer-soufre doivent être étroitement régulées. Des études récentes montrent que les protéines BolA et les glutarédoxines de classe II sont impliquées dans l’homéostasie du fer en intervenant seules ou de manière concertée. Cependant, la fonction réelle de ces protéines notamment aux différents stades de la biogénèse des centres fer-soufre reste encore que très peu connue. Afin de mieux comprendre la capacité des protéines BolA et glutarédoxines à jouer leur fonction biologique, nous avons étudié à travers ce travail de thèse la capacité des protéines BolA et glutarédoxines d’Arabidopsis thaliana, à former des homodimères et des hétérodimères. Pour ce faire, la cristallographie des rayons X, la résonance magnétique nucléaire et d’autres méthodes spectroscopiques ont été utilisées pour caractériser structuralement les différents états oligomériques de ces deux protéines / Intermolecular interactions in living cells are complex and help convey the information indispensable to the survival of the organism at a given time. It even happens that various stakeholders are involved at different stages of the same process. Among many biological processes present within living cells, the biogenesis of iron-sulfur clusters appears to be very complex. This complexity is probably related to cellular toxicity of both free iron and free sulfur. Thus the different stages of iron-sulfur clusters biosynthesis must be tightly regulated. Recent studies highlight that BolA proteins and class II glutaredoxins are involved in iron homeostasis probably by acting alone or in a concerted manner. However, the current function of these proteins in the various steps of the iron-sulfur clusters biogenesis is yet unidentified. To better understand how BolA proteins and glutaredoxins fulfill their biological function, we studied throughout this PhD work the ability of Arabidopsis thaliana proteins to form homodimers and heterodimers. To do this, X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance and other spectroscopic methods were used to structurally characterize the different oligomeric states of these two proteins

La drosophile se défend contre les infections microbiennes par un ensemble de réponses immunitaires très efficaces comme la synthèse de peptides antimicrobiens. L’expression de ces peptides antimicrobiens est contrôlée par deux voies indépendantes : la voie Toll et la voie IMD. La voie IMD est activée par PGRP-LC, une protéine de la famille PGRP (Peptidoglycan Recognition Protein). PGRP-LF est un régulateur négatif spécifique de la voie IMD. Il a été proposé que cette protéinepourrait agir spécifiquement au niveau du récepteur PGRP-LC, en séquestrant le ligand peptidoglycane (PGN) et en empêchant son accès à PGRP-LC. Mon travail de thèse a été de résoudre la structure des deux domaines PGRP de PGRP-LF, LFz et LFw, dans le but de caractériser le mécanisme de régulation par cette protéine.J’ai exprimé le domaine LFz dans des cellules S2 et le domaine LFw dans des bactéries. J’ai résolu la structure cristallographique de LFz à la résolution de 1.72Å et celle de LFw à la résolution de 1.94Å. Les structures de LFz et LFw montrent qu’elles ne possèdent pas la crevasse de liaison classique des PGRP, et ne peuvent pas interagir avec le PGN. J’ai confirmé ces résultats structuraux par des étudesbiochimiques de liaison des ces domaines à du PGN insoluble. L’aspect de régulation par PGRP-LF, par une séquestration du PGN, n’est donc valide. J’ai cloné et exprimé dans des cellules S2 les protéines PGRP-LCx et PGRP-LCa (partenaire du complexe activateur de la voie IMD) dans le but d’étudier leur interaction avec PGRP-LF. J’ai mis en évidence, par des analyses de résonnance plasmonique de surface, une interaction entre PGRP-LF et PGRP-LCx en absence et en présence duPGN. Ces données nous permettent de proposer un modèle dans lequel PGRP-LF assure la régulation négative de la voie IMD par compétition avec PGRP-LCa pour la liaison au récepteur PGRP-LCx. / The fruit fly defends itself against microbial infections by a set of highly effective immune responses that involve the synthesis of antimicrobial peptides. The expression of these antimicrobial peptides is controlled by two independent pathways: the Toll pathway and the IMD pathway. The IMD pathwayis activated by PGRP-LC, a protein of the PGRP family (Peptidoglycan Recognition Protein). PGRPLF is a specific negative regulator of the IMD pathway. It has been proposed that this protein specifically acts at the receptor PGRP-LC, by sequestering peptidoglycan (PGN) and preventing its access to PGRP-LC. My thesis work aims to solve the structure of the two PGRP domains of PGRPLF, LFz and LFw, in order to characterize the mechanism of regulation by this protein. I have expressed the LFz domain in S2 cells and the LFw domain in bacteria. I have solved the crystalstructure of LFz at 1.72 Å resolution and that of LFw at 1.94Å resolution. Structures of LFz and LFw show they do not possess the classical binding cleft found in others PGRP, and cannot interact with the PGN. I have confirmed these structural results with biochemical studies of binding of these domains with insoluble PGN. The model of regulation by PGRP-LF, by a sequestration of PGN, is no longer valid. I have cloned and expressed in S2 cells PGRP-LCx and PGRP-LCa proteins (partners of theactivating complex of the IMD pathway) in order to elucidate whether there is direct interaction between PGRP LF and one of two isoforms of PGRP-LC. I have demonstrated, through Surface Plasmon Resonance analysis, an interaction between PGRP-LF and PGRP-LCx. Actually, PGRP-LF regulates negatively the IMD pathway by competing with PGRP-LCa to bind to the PGRP-LCx receptor.

Le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) et le virus Nipah (NiV) appartiennent respectivement aux familles des Rhabdoviridae et des Paramyxoviridae. VSV est un modèle du virus de la rage tandis que NiV est un virus émergeant, appartenant à la sous-famille des Paramyxovirinae, pour lequel les données moléculaires et structurales sont limitées. Ces sont des virus enveloppés dont le génome code pour cinq à neuf protéines. Le complexe de réplication de ces virus est constitué de trois protéines : la phosphoprotéine (P), la nucléoprotéine (N) et la polymérase virale (L). La N encapside le génome viral et l'ensemble N-ARN sert de matrice pour la transcription et la réplication. La P joue deux rôles : elle sert de cofacteur pour la polymérase et forme le complexe N0-P qui maintient la N sous une forme soluble, compétente pour l'encapsidation des génomes néo-synthétisés. Un premier objectif de mon travail de thèse consistait à étudier la structure et la dynamique des protéines P de VSV et de NiV. Ce sont des protéines modulaires qui contiennent des domaines structurés, séparés par des régions flexibles. A mon arrivée au laboratoire un travail important avait été déjà réalisé sur la P de VSV et j'ai participé à l'achèvement de cette étude. Je me suis ensuite intéressé à la protéine P de NiV. J'ai cristallisé et résolu par diffraction des rayons X les structures du domaine C-terminal et du domaine central (codes PDB : 4F9X et 4GJW). La combinaison de ces modèles cristallographiques avec des données de SAXS sur la P entière et des données de résonance magnétique nucléaire (RMN, collaboration IBS) va permettre d'obtenir un modèle atomique de la P entière sous la forme d'un ensemble de conformères. Un deuxième objectif était d'étudier les complexes N0-P. J'ai activement participé au développement de la méthode de reconstitution et à la caractérisation structurale du complexe N0-P de VSV, entre un mutant de la N (NΔ21) et un peptide N-terminal de la P (code PDB : 3PMK). J'ai ensuite reconstitué, cristallisé et résolu la structure de complexe N0-P de NiV entre la N (tronquée de son domaine C-terminal) et la partie N-terminale de la P. Ces structures montrent par quel mécanismes moléculaires la P maintien la N sous forme monomérique, en empêchant sa polymérisation et son interaction avec l'ARN. Les résultats présentés ici ont permis de générer de nouvelles hypothèses pour expliquer les mécanismes d'encapsidation et d'initiation de la synthèse d'ARN chez ces virus. Le complexe N0-P étant essentiel pour la réplication du virus, l'information structurale obtenue au cours de ce travail devrait permettre d'envisager l'utilisation de ce complexe comme cible pour le développement de composés antiviraux. / Abstract Vesicular stomatitis virus (VSV) and Nipah virus (NiV) belong to the Rhabdoviridae and Paramyxoviridae families, respectively. VSV serves as model system for rabies virus while NiV is an emerging pathogen of the Paramyxovirinae subfamily, for which molecular and structural data are scarce. Both viruses are enveloped and their genomes encode five to nine proteins. Three proteins form their replication complex: the phosphoprotein (P), the nucleoprotein (N) and the viral polymerase (L). N encapsidates the viral genome and this N-RNA complex serves as template for transcription and replication. P has two functions: it serves as a polymerase cofactor and forms an N0-P complex, which keeps the N protein in a soluble and monomeric state, competent for the encapsidation of the newly synthesized genomes. The first goal during the PhD work was to study the structure and dynamics of the VSV and NiV P proteins. These proteins are modular, containing structured domains separated by flexible regions. Before my arrival, a large amount of work was already done on the VSV P protein in the lab and I was involved in the final stages of this work. Then this I studied the NiV P protein, crystallizing and solving the structures of its Central and C-terminal domains by X-ray crystallography (PDB codes: 4F9X and 4GJW). Combining these structures with small angle X-ray scattering (SAXS) and nuclear magnetic resonance (NMR, collaboration with IBS group) data obtained for the entire protein will allow the construction of an atomic model of the phosphoprotein in the form of a conformational ensemble. The second goal was to study the N0-P complex. I actively participated in the development of the method which permitted the reconstruction of the VSV N0-P complex, using a truncation mutant of the N protein (NΔ21) and an N-terminal peptide from P, and to its structural determination (PDB code: 3PMK). Then I reconstructed, crystallized and solved the structure of the NiV N0-P complex using a C-terminally truncated N protein and the N-terminal region of the P protein. Both structures yielded insights into the molecular mechanisms used by the phosphoproteins in order to maintain the corresponding nucleoproteins in their monomeric state, thus inhibiting their polymerization and interaction with RNA. The results presented here also offered new hypothesis about mechanisms of encapsidation and of RNA synthesis initiation. Given that the N0-P complex is an essential component of the replication complex, the structural information gained from this work allow us to consider this complex as a potential antiviral target.

Il est reconnu, depuis des années, que la flore intestinale par son équilibre complexe et dynamique joue un rôle essentiel dans la santé humaine. Une des stratégies les plus prometteuses pour la maintenir ou l’améliorer consiste à moduler le microbiome par l’utilisation de bactéries probiotiques ou de sucres prébiotiques. C’est dans ce contexte que s’inscrivent les études structurales et fonctionnelles d’α glucosidases bactériennes développées dans cette thèse. Ces enzymes hydrolysant les liaisons α-(1,4) glucosidiques sont classées, selon la base de données CAZy, dans les familles de glycoside hydrolases (GH) 4, 13, 31, 63, 97 et 122. Ces travaux de thèse, centrés sur trois α-glucosidases issues de Lactobacillus bulgaricus (11842aglu, GH31), Lactococcus lactis (1403aglu, GH13) et Shewanella sp. ANA-3 (SHWaglu, GH97), exposent la mise au point de leurs protocoles de surexpression et de purification. Ils présentent également des études bioinformatiques de 11842aglu et de 1403aglu, ainsi qu’une caractérisation enzymatique préliminaire de cette dernière. Une analyse structurale et fonctionnelle approfondie de SHWaglu a aussi été réalisée. La résolution, par cristallographie aux rayons X, des structures de SHWaglu seule, en complexe avec différents ligands et de mutants, a participé à enrichir les connaissances, jusqu’à présent peu étendues, sur les enzymes de la famille GH97. Ainsi, un motif structural conservé au sein de cette famille a notamment été mis en évidence. Par ailleurs, ces informations structurales combinées aux études enzymatiques ont permis de révéler des déterminants moléculaires de l’activité de cette α-glucosidase et, par conséquent, d’établir les relations structure-fonction-activité de cette enzyme. Ainsi, l’ensemble des données obtenues, couplé à des études d’ingénierie protéique, contribue à ouvrir de nouvelles perspectives industrielles, notamment en suggérant d’optimiser ou de conférer des activités enzymatiques modifiées dans certaines cibles de choix afin de leur faire synthétiser des sucres de type prébiotiques / It is now generally accepted that the gut flora with its complex and dynamic nature plays a vital role in human health. One of the most promising strategies for maintaining or improving health is to modulate the microbiome by the use of probiotics and prebiotics as food supplements. The structure/function/activity relationship studies of bacterial α-glucosidases described in this thesis have been performed within this context. These α-(1,4)-glucosidic bond hydrolyzing enzymes are classified, according to the CAZy database, into glycoside hydrolases families (GH) 4, 13, 31, 63, 97 and 122. This thesis work, has focused on three α-glucosidases from Lactobacillus bulgaricus (11842aglu, GH31), Lactococcus lactis (1403aglu, GH13) and Shewanella sp. ANA-3 (SHWaglu, GH97), and the development of their overexpression and purification protocols. It also presents a bioinformatics studies of 11842aglu and 1403aglu, as well as preliminary enzymatic characterization of the latter. As for SHWaglu, detailed structural and functional studies have been carried out. The crystal structures of SHWaglu in its native state, in complex with different ligands as well as site directed mutants have contributed to increase our knowledge on enzymes from the GH97 family which to date remains relatively limited. Notably, a conserved structural motif in this family has been identified. Overall, the structural- and enzymatic studies and analyses have revealed molecular-and structural determinants governing the activity and broad substrate specificity of this α-glucosidase which is adapted to cold temperatures. Apart from the insight gained from a fundamental research point of view, data described within this work, coupled with protein engineering studies may contribute to open up new industrial perspectives, in particular by suggesting optimized or altered enzyme activities in some attractive enzyme targets with the aim of synthesizing prebiotic compounds

Dans le domaine du photovoltaïque, le composé Cu2ZnSnS4 (CZTS) serait une solution alternative aux composés classiques en couches minces qui sont à base d'éléments chers ou toxiques. Mise à part un gap de 1.5 eV et un coefficient d'absorption de 10-4 cm-1, il est constitué d'éléments bénins et abondants, ce qui réduira le coût de revient de la cellule finale. Il connaît un intérêt particulier et bien qu'il ait atteint un rendement de 12.6%, il demeure méconnu quant à l'effet de ses propriétés intrinsèques sur ses performances photovoltaïques. En raison de la volatilité du soufre, des déviations à la stoechiométrie peuvent être enregistrées rendant la synthèse d'un monophasé très difficile. Les phases secondaires sont difficilement inévitables, elles constituent une barrière à la formation de la phase CZTS, ce qui rend difficile la fixation du gap et augmente le taux de recombinaison des porteurs de charges. Dans le cadre de cette thèse, une série de composés CZTS a été synthétisée par réaction à l'état solide et liquide avec des excès en soufre pour compenser les pertes liées à la décomposition chimique et l'évolution de la composition dans le diagramme de phase Cu-Zn-Sn-S. L'effet du souffre sur la cristallinité, la pureté et l'ordre dans la maille a été mis en évidence. Le domaine monophasé a été déterminé et il a été montré qu'il est possible d'obtenir des composés de grande pureté. La morphologie par microscopie optique a révélé des polycristaux granulaires avec rejet des phases secondaires dans les joints de grains. Le composé Cu2ZnGeS4 (CZGS) pourrait trouver des applications dans le photovoltaïque et l'optoélectronique. L'ajout de l'étain pourrait sensiblement améliorer la cinétique réactionnelle et la cristallinité d'où l'intérêt d'étudier le composé Cu2ZnGexSn(1-x)S4 ( x=0 à 1). L'analyse cristallographique par DRX a montré une transition structurale d'une kesterite pour CZTS vers une orthorhombique pour CZGS. Le composé Cu2Zn(Ge,Sn)S4 est une solution solide avec gap de miscibilité entre 0 et 20% de germanium / In the photovoltaic field, Cu2ZnSnS4 (CZTS) compound is an alternative solution to substitute solar thin film based on toxically and expensive conventional materials. The gap of this material is around 1.5eV and absorption coefficient 10-4 cm-1, in addition this material is composed of abundant and harmless elements which will strongly decrease the price of the final cell. This material present a particular interest and in spite of the efficiency which reached 12.6%, till now this material is not well known especially the effect of its intrinsic properties on its photovoltaic performances. Because of the sulfur volatility, it is difficult to prepare single phase compound. Also, it is difficult to surmount the formation of secondary phases which are a barrier to CZTS complete reaction allowing difficulties to fix the gap and increase the recombination of carrier. In the frame of this PhD thesis, a serial of CZTS compounds has been synthetized from solid and liquid state using an excess of sulfur to compensate its volatility and the composition change in the Cu-Zn-Sn-S equilibrium diagram. We have determined the monophased field and we have shown that it is possible to obtain a compound with high purity. By optical microscopy we have observed a granular morphology composed of polycrystalline grains and the secondary phases were rejected in the grains boundary. The Cu2ZnGeS4 (CZGS) compound can be used for photovoltaic and optoelectronic applications. The addition of tin can be a good way to improve the kinetic reaction and the crystallinity of this materials, So, it is interesting to study Cu2ZnGexSn(1-x)S4 ( x=0 to 1) compound . By X ray diffraction we have shown a structure transition from Kesterite (CZTS) to orthorhombic (CZGS). The Cu2Zn(Ge,Sn)S4 compound is a solid solution with a gap miscibility between 0 and 20% of germanium

Ce mémoire porte sur la synthèse et la caractérisation de composés hexaferrites dans le système Ca-Fe-O. Ce travail a permis d’isoler quatre composés sous forme polycristalline ayant pour composition (Ca4Fe5O13)1-x(Fe9O12)1+x (x= 0,334 ; 0,301 et 0,128) et (Ca4Fe5O13)(Fe4O4). Leur structure cristalline a été déterminée à partir de données de diffraction électronique acquises en mode tomographie par précession des électrons et validée à l’aide de l’imagerie haute résolution (HREM et HAADF). Les différents modèles structuraux ont également été confirmés par diffraction des rayons X et des neutrons sur poudre. L’analyse fine des défauts d’intercroissance en imagerie HAADF a révélée des écarts significatifs de composition par rapport à la composition idéale (Ca4Fe5O13)(Fe9O12) à l’origine des trois polymorphes observés. En complément des études menées sur des cristaux de taille micrométrique dans les années 80, l’obtention d’échantillons polycristallins a rendu possible l’étude des propriétés physiques de ces composés. Malgré la complexité de ces structures et la présence de défauts étendus, la spectrométrie Mössbauer a mis en exergue un degré d’oxydation unique pour les atomes de fer (+3) et de confirmer les nombreuses transitions magnétiques initialement détectées par les mesures d’aimantation, ainsi que leur évolution en fonction de l’écart à la stœchiométrie x. Les composés ont également été caractérisés par des mesures de résistivité électrique et de coefficient Seebeck. / This thesis reports on the synthesis and the characterization of hexaferrite compounds in the Ca-Fe-O system. This work has allowed to isolate four polycrystalline compounds presenting the chemical formula (Ca4Fe5O13)1-x(Fe9O12)1+x (x= 0.334; 0.301 and 0.128) and (Ca4Fe5O13)(Fe4O4). Their crystalline structure has been determined using the precession electron diffraction tomography and has been validated through high resolution imaging microscopy (HREM/HAADF). X-ray diffraction and neutron diffraction studies on polycrystalline samples have confirmed the different structural models. Fine analysis of intergrowth defects in HAADF imaging revealed significant deviations in composition with respect to the ideal composition (Ca4Fe5O13)(Fe9O12) at the origin of the three observed polymorphs. In addition to the studies on micron-sized crystals in the 80s, obtaining polycrystralline samples allowed the measurement of their physical properties. Despite the complexity of these structures and the presence of extensive defects, the Mössbauer spectroscopy has highlighted a unique oxidation degree of iron (+3) and confirmed as well the various magnetic transitions initially detected by magnetization measurements, as well as their evolution versus the x deviation value. Electrical resistivity and Seebeck coefficient measurements were performed on the samples.

La méiose est un processus de ségrégation des chromosomes essentiel pour la gamétogenèse chez tous les organismes qui présentent une reproduction sexuée. Ce mécanisme nécessite des connections entre chromosomes homologues et des structures intermédiaires d’ADN appelées Jonction de Holliday. Ces jonctions sont résolues principalement par complexe MutLγ (Mlh1-Mlh3). Des mutations sur les gènes impliqués en méiose s’accompagnent chez l’homme de problèmes allant de la stérilité à des réarrangements chromosomiques comme la trisomie. Mlh1-Mlh3 joue aussi un rôle dans la voie de réparation des mésappariements de l’ADN (MisMatch Repair - MMR). Notre laboratoire a révélé la première structure cristalline de la région C-terminale du complexe MutLα (Mlh1-Pms1) qui est l’endonucléase majeure de la voie MMR. Mon projet de thèse s’insère dans le cadre de l’étude des différentes fonctions des MutL eucaryotes et plus particulièrement sur le mécanisme moléculaire de MutLγ (Mlh1-Mlh3). Au cours de ma thèse, nous avons déterminé la structure cristalline du domaine C-terminale du complexe Mlh1-Mlh3 qui contient le site d’endonucléase et caractérisé 3 états du site actif. Nous avons montré le rôle de Mlh1 dans le site endonucléase. Nous avons caractérisé la spécificité de ce domaine pour les Jonctions de Holliday et proposé un modèle du site de fixation de l’ADN sur le complexe entier. Ce modèle a permis de proposer un nouveau mutant de séparation de fonction de Mlh1-Mlh3, appelé KERE, qui a été analysé par gel retard et génétique. / Meiosis is key process in sexual reproduction, where chromosomes are segregated. During this process, a parental diploid cell divides into haploid gametes. This mechanism requires connections between homologous chromosomes and intermediate DNA structures called Holliday Junctions. These junctions are mainly resolved by MutLγ (Mlh1-Mlh3) complex. Mutations of genes involved in meiosis are associated with human diseases including sterility and chromosomal rearrangements such as trisomy. Mlh1-Mlh3 plays also a role in DNA mismatch repair (MMR). Our laboratory has characterized the first crystal structure of the C-terminal region of the MutLα complex (Mlh1-Pms1) which is the major endonuclease in MMR. My thesis aims at understanding the molecular mechanism of MutLγ (Mlh1-Mlh3) mainly involved in meiosis and to compare it with Mlh1-Pms1 mainly involved in MMR.We determined the crystal structure of the C-terminal domain of the MutLγ complex which contains the endonuclease site. We characterized the structure of three different states of the active site. We showed how Mlh1 is an integral part of the Mlh3 endonuclease site. We characterized the specificity of this domain for Holliday Junctions and proposed a model of the full-length complex and its DNA binding sites. Finally, we design new separation of function allele of Mlh1-Mlh3, called KERE, which was analyzed by EMSA and genetic experiments.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La détermination des structures tertiaires des protéines par rayons X a pour but de nous apporter des connaissances détaillées sur leur repliement et de comprendre la relation entre leur structure et leur fonction. Nous allons montrer par la présente étude comment la cristallographie jumelée à la mutagenèse dirigée peut être utilisée dans la détermination et la compréhension du mécanisme enzymatique de l'aldolase du muscle de lapin. Les différentes mutations générées visent des acides aminés qui sont, dans la plupart des cas, situés dans le site actif et qui sont impliqués dans la catalyse enzymatique. Certains mutants de l'aldolase du muscle sont analysés par des méthodes cristallographiques, cinétiques, enzymatiques et d'échanges isotopiques. L'enzymologie nous a permis de déterminer les paramètres cinétiques de ces mutants, afin d'établir leur rôle dans la réaction enzymatique. L'étude structurale permet d'avoir une vision directe des types d'interactions au sein d'une enzyme. L'interprétation des données structurales associée aux données cinétiques permet d'analyser avec pertinence la fonction des résidus impliqués dans le mécanisme catalytique de l'aldolase du muscle de lapin. Dans le but de connaître l'implication de certains résidus dans le mécanisme catalytique, nous nous sommes focalisés sur l'étude structurale de plusieurs mutants. Les principaux intérêts de ce travail consistent à connaître si la perte d'activité est directement liée à la mutation ou à un changement global de la structure engendrée par celle-ci, à déterminer la structure mutante formant un complexe avec le substrat ou le produit de la réaction catalytique ainsi qu'a connaître le lien entre l'affinité pour le substrat et un acide aminé bien spécifique. La réponse à toutes ces questions nous a amenés à la résolution des structures cristallographiques de certains mutants. La cristallographie qui donne une vision directe des interactions entre les acides aminés est un puissant outil qui nous renseigne sur la nature et le mode d'action des résidus. Les résultats structuraux nous ont permis de tirer plusieurs conclusions sur la relation structure/fonction de cette enzyme et de déterminer la nature et le rôle des résidus impliqués dans la catalyse, ainsi que ceux impliqués dans sa conformation. Ces méthodes nous ont également permis de proposer un nouveau modèle du mécanisme enzymatique. Nous discuterons aussi des problèmes liés à la cristallisation des protéines et les méthodes récentes appliquées pour les contourner.

Les interactions protéine-protéine jouent un rôle primordial dans de nombreux processus biologiques. L’importance de ces interactions a suscité le développement de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent ces complexes protéiques. Nous nous proposons d’inhiber ces interactions en élaborant une stratégie de reconnaissance de surfaces de protéines par des molécules synthétiques de taille intermédiaire, les foldamères d’oligoquinoline. Ces composés se replient en des structures hélicoïdales stables dont chaque élément constitutif peut être fonctionnalisé pour permettre des propriétés de reconnaissance de surface de protéine.Afin de valider ce concept, l’interaction entre l’anhydrase carbonique humaine de type II (HCAII) et son inhibiteur N-benzyl-4-sulphamoylbenzamide (SBB) a été sélectionnée comme système modèle. Plusieurs étapes de synthèse ont permis de concevoir de nouveaux foldamères capables de former un complexe avec l’enzyme par l’intermédiaire de l’inhibiteur SBB et d’un espaceur approprié. Chaque complexe protéine-foldamère a été co-cristallisé et l’affinité des interactions a été caractérisée par dichroïsme circulaire induit et par résonance plasmonique de surface. Ce concept a ensuite été appliqué à une interaction protéine-protéine d’intérêt thérapeutique, le complexe IL-4/IL-4R, dans le cadre du programme européenFOLDAPPI (FP7-PEOPLE-IAPP-2008). / Protein-protein interactions play key roles in many biological processes as well as in many diseases. The importance of these interactions has led to the development of new therapeutic approaches that target protein interfaces. We have developed a protein surface recognition strategy to inhibit protein-protein interactions by using intermediate size organicmolecules called oligoquino line foldamers, that result in very stable and well defined helical structures. These helical backbones are used as templates within each building block can be modulated to allow protein surface recognition.In order to validate this concept, the well-characterized interaction between the enzyme human carbonic anhydrase II (HCAII) and its N-benzyl-4-sulphamoylbenzamide (SBB) inhibitor was selected as a model system. Multi-steps synthesis allowed functionalization of new foldamers able to bind to the enzyme through the SBB inhibitor attached by a spacer.Each foldamer–protein complex was cocrystallized and the affinity of the interactions was assayed using both induced circular dichroïsm and surface plasmon resonance. The concept of using a foldamer against protein-protein interaction was then applied to a protein complex of therapeutic interest, IL-4/IL-4R, within the European FOLDAPPI program (FP7-PEOPLEIAPP- 2008).

Les amylosaccharases sont des α-transglucosylases catalysant naturellement la synthèse exclusive d’α-1,4-glucanes à partir du saccharose. Ces enzymes produisent également des composés secondaires et, en particulier, des isomères du saccharose tels que le turanose et le tréhalulose.L’objectif de cette thèse a consisté à utiliser un panel de techniques biophysiques et biochimiques afin d’étudier les amylosaccharases de Deinococcus geothermalis (ASDg) et Neisseria polysaccharea (ASNp) afin de comprendre les relations unissant la structure, la flexibilité et la fonction de ces enzymes.La première étude rapporte la caractérisation structurale et biophysique de l’amylosaccharase la plus thermostable connue à ce jour, l’amylosaccharase de Deinococcus geothermalis. La structure tridimensionnelle révèle une organisation dimérique en solution, jamais rapportée pour une amylosaccharase. Grâce à l’analyse de l’interface dimérique et à des travaux d’analyse de séquences, une séquence signature de dimérisation a été identifiée. En rigidifiant la structure de l’ASDg, la structure quaternaire contribue à l’augmentation de la stabilité thermique de la protéine. La spécificité de production des isomères du saccharose par les amylosaccharases a été étudiée. Les résultats décrivent, pour la première fois, les structures de l’ASDg et de l’ASNp en complexe avec le turanose. Dans l’ASNp, les résidus clefs forcent le résidu fructosyle à adopter une conformation linéaire positionnant idéalement le O3’ pour sa glucosylation expliquant la formation préférentielle de turanose par l’enzyme. Ces résidus sont absents ou placés différemment dans l’ASDg. En conséquence, l’ASDg lie principalement les formes furanoses du fructose avec un faible réseau d’interactions. La topologie du sous-site +1 permet donc différents modes de liaison du fructose en accord avec la capacité de l’ASDg à produire une plus grande quantité de tréhalulose par rapport à l’ASNp.Dans la seconde étude, des techniques de mutagenèse à saturation et combinatoire ciblées sur les acides aminés voisins du site actif ont été utilisées pour modifier la spécificité d'accepteur de l’ASNp. Le criblage de trois bibliothèques semi-rationnelles représentant un total de 20 000 variants a permis d’isoler trois doubles mutants montrant une amélioration spectaculaire de spécificité à la fois vis-à-vis du saccharose, le substrat donneur et de l’accepteur α-allyl-N-acetyl-2-désoxy-α-D-glucopyranoside par rapport au type sauvage de l’ASNp. De tels niveaux d'amélioration d'activité n'ont jamais été signalés auparavant pour cette classe d’enzymes actives sur les sucres. L’analyse par cristallographie des rayons X de la structure des meilleures enzymes mutantes suivie par des simulations de dynamique moléculaire ont montré une rigidité locale du sous-site -1 couplée à une flexibilité des boucles impliquées dans la topologie du site actif. Ces faits pourraient être à l’origine des performances catalytiques accrues de ces enzymes mutantes. L'étude démontre l'importance, lors de la conception des bibliothèques de variants, de tenir compte de la conformation locale des résidus catalytiques ainsi que de la dynamique des protéines au cours du processus catalytique / Amylosucrases are sucrose-utilizing α-transglucosylases that naturally catalyze the synthesis of α-glucans, exclusively linked through α-1,4 linkages. Side-products and in particular sucrose isomers such as turanose and trehalulose are also produced by these enzymes.The objective of this thesis concerned the application of biophysical and biochemical techniques to study amylosucrases from Deinococcus geothermalis (DgAS) and Neisseria polysaccharea (NpAS) in order to investigate relationships between structure, flexibility and function of these enzymes.In the first study, we report the first structural and biophysical characterization of the most thermostable amylosucrase identified so far, the amylosucrase from Deinoccocus geothermalis. The 3D-structure revealed a homodimeric quaternary organization, never reported before for other amylosucrases. A sequence signature of dimerization was identified from the analysis of the dimer interface and sequence alignments. By rigidifying DgAS structure, the quaternary organization is likely to participate in the enhanced thermal stability of the protein. Amylosucrase specificity with respect to sucrose isomer formation (turanose or trehalulose) was also investigated. We report the first structures of the DgAS and NpAS in complex with turanose. In NpAS, key residues were found to force the fructosyl moiety to bind in an open state with the O3' ideally positioned to explain the preferential formation of turanose by NpAS. Such residues are either not present or not similarly placed in DgAS. As a consequence, DgAS binds the furanose tautomers of fructose through a weak network of interactions to enable turanose formation. Such topology at subsite +1 is likely favoring other possible fructose binding modes in agreement with the higher amount of trehalulose formed by DgAS.In the second study, iterative saturation mutagenesis and combinatorial active site saturation focused on vicinal amino acids were used to alter the acceptor specificity of NpAS and sort out improved variants. From the screening of three semi-rational sub-libraries accounting in total for 20,000 variants, we report here the isolation of three double-mutants displaying a spectacular specificity enhancement towards both sucrose, the donor substrate, and the α-ally-N-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranoside acceptor compared to wild-type N. polysaccharea amylosucrase. Such levels of activity improvement have never been reported before for this class of carbohydrate-active enzymes. X-ray structural analysis of the best performing enzymes followed by Molecular Dynamics simulations showed both local rigidity of the -1 subsite and flexibility of loops involved in active site topology which both account for the enhanced catalytic performances of the mutants. The study well illustrates the importance when designing enzyme libraries of taking into account the local conformation of catalytic residues as well as protein dynamics during the catalytic process