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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Au niveau plasmatique, les différentes classes de lipides sont transportées par des complexes macromoléculaires communément appelés lipoprotéines. Ces dernières sont caractérisées par la présence d'une ou plusieurs protéines (ou apolipoprotéines) qui leur confèrent des propriétés déterminant leur structure, ainsi que leur métabolisme intravasculaire. Parmi ces apolipoprotéines, l'apo A-IV se distingue par son rôle et ses multiples fonctions. L'apo A-IV humaine est une glycoprotéine de 46-kd synthétisée exclusivement par l'intestin. Dans le plasma, cette apolipoprotéine est retrouvée sous forme libre ou associée aux lipoprotéines riches en triglycérides (les chylomicrons et les VLDL) et aux lipoprotéines de haute densité (HDL). Elle est étroitement impliquée dans le métabolisme des lipoprotéines en modulant les activités de la lipoprotéine lipase (LPL) et de la lécithine :cholestérol acyltransférase (LCAT), le flux du cholestérol périphérique, le transport inverse du cholestérol et le métabolisme intravasculaire des HDL. Grâce à ces mécanismes, l'apo A-IV réduit considérablement le risque de développer l'athérosclérose. Au niveau du système nerveux central, l'apo A-IV agirait en tant que signal de satiété et serait donc en mesure de réduire l'apport alimentaire. Par ailleurs, l'augmentation des taux de synthèse et de sécrétion de l'apo A-IV suit étroitement un repas riche en matières grasses, ce qui établit, de manière évidente, une relation entre le métabolisme lipidique et l'appétit. Dans le même ordre d'idées, de très récentes découvertes confèrent à l'apo A-IV un rôle de neurotransmetteur et de neuromodulateur capable d'inhiber la sécrétion de l'acide et de la vidange gastriques. En outre, l'apo A-IV peut être régulée par de nombreux facteurs tels que: diverses hormones (hormones thyroïdiennes, insuline, glucocorticoïdes, oestrogènes) stade du développement, plusieurs nutriments (matières grasses, protéines, glucides et nucléotides), ainsi que les fibrates. Le dernier type d'influence est de nature biliaire. Cependant, les composantes biliaires responsables n'ont pas encore été identifiées. Étant donné les nombreuses fonctions importantes de l'apo A-IV, on doit accorder une attention particulière à l'élucidation des mécanismes contrôlant la synthèse et la sécrétion de cette apolipoprotéine. Même si le processus d'absorption des matières grasses module l'apo A-IV intestinale, l'influence des différentes classes d'acides gras sur l'expression génique et la synthèse protéique demeure jusqu'à ce jour inconnue. Par conséquent, l'objectif de ce projet est d'évaluer les effets modulatoires des acides gras oléique (n-9), linoléique (n-6), linolénique (n-3) et docosahexaéndique (n-3) sur l'expression génique, la synthèse protéique et la concentration de l'apo A-IV, et ce, lors de deux périodes d'incubation, l'une de courte durée (30 minutes) et la deuxième, de longue durée (20 heures). Le modèle intestinal utilisé est représenté par les cellules Caco-2, puisque cette lignée cellulaire détient un nombre considérable de caractéristiques morphologiques et biochimiques des entérocytes et récapitule même une partie de leurs fonctions telles que l'absorption et le transport. De plus, dans notre laboratoire ce type de cellules s'est avéré à plusieurs reprises, un modèle approprié lorsqu'on a procédé à l'investigation de la sécrétion des apolipoprotéines. La détermination des niveaux d'ARNm est effectuée par « RT-PCR », combinée à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (5%) et à la quantification par Phosphorlmager. La synthèse de l'apo A-IV est mesurée par l'incorporation d'un précurseur radioactif (35[S]-méthionine) et sa concentration par chimiluminescence. Nos résultats révèlent qu'à 30 minutes, la synthèse de novo est abaissée, ce qui se traduit par une diminution des niveaux d'apo A-IV. Par contre, à plus long terme (20 heures), ces deux paramètres sont augmentés en présence d'acides gras. En outre, nos observations mettent en évidence l'augmentation des niveaux d'ARNm d'apo A-IV qui sont certainement responsables de sa biogénèse. Nos données démontrent donc que les acides gras sont en mesure de moduler l'apo A-IV au niveau transcriptionnel. De plus, les acides oléique et docosahéxaénoique semblent avoir un effet plus prononcé que les deux autres acides gras. Cependant, le degré d'insaturation et la longueur de la chaîne carbonée ne semblent exercer aucune influence. En concluant, les présentes données apportent un éclairage nouveau sur le rôle des acides gras monoinsaturés et polyinsaturés. Ces derniers induisent la synthèse de l'apo A-IV, un facteur préventif de l'athérosclérose et limitant la prise excessive d'aliments.

No / Piperacillin, a potent ß-lactam antibiotic, is effective in a large variety of Gram+ and Gram¿ bacterial infections but its administration is limited to the parenteral route as it is not absorbed when given orally. In an attempt to overcome this problem, we have synthesized a novel series of charged liposaccharide complexes of piperacillin comprising a sugar moiety derived from d-glucose conjugated to a lipoamino acid residue with varying side-chain length (cationic entity) and the piperacillin anion. A complete multiple reaction monitoring LC¿MS/MS method was developed to detect and characterize the synthesized complexes. The same method was then successfully applied to assess the in vitro apparent permeability values of the charged liposaccharide complexes in Caco-2 monolayers. / BBSRC

This study investigates the efficacy of a newly developed humanized serum-free media (SFM) that replaces Fetal Bovine Serum (FBS), in culturing of common in vitro models (Caco-2 and 3D Primary Human Hepatocytes (PHH)). The research’s focus aligns with the 3R principles (replacement, reduction, refinement) and may potentially lead to enhancing the human relevance of the in vitro models and ultimately contribute to more accurate and successful drug development in the future. This study is divided into two subprojects, Caco-2 and 3D PHH, respectively. For Caco-2, we evaluated cell morphology, proliferation and monolayer formation by assessing the permeability of marker compounds. For PHH, we investigated spheroid formation and viability using an ATP measurement assay, lipid concentration using an Adipored Assay and CYP activity of the 3D PHH. Finally, global proteomics analysis was performed for both Caco-2 cells and 3D PHH grown in SFM and in conventional medium (CM). Our findings show that Caco-2 cells could proliferate well enough in the SFMCaco-2 without any change in their cell morphology, whereas their monolayer tightness was found to be similar in SFMCaco-2 as compared to CMCaco-2. Furthermore, from the proteomics analysis there was no major difference detected between cells in SFMCaco-2 and in CMCaco-2, however several of the relevant drug transporters of this model were found in higher levels in Caco-2 cultured in SFMCaco-2. For 3D PHH, our findings indicate that spheroids could be perfectly formed in both SFM3D PHH and in CM3D PHH, having relatable viability and lipid concentration, especially after two week of culturing period. Finally, the proteomics analysis revealed no significant difference between the proteome of the spheroids when cultured in SFM3D PHH or in CM3D PHH. In conclusion, these results suggest that the SFM provides a viable and sometimes superior alternative to CM for both Caco-2 and 3D PHH, promoting the 3R principles and potentially offering a more human-relevant model for in vitro studies.

[ES] La dieta es la principal vía de exposición a mercurio (Hg) para la mayoría de la población. Las principales formas de Hg en los alimentos son el metilmercurio (MeHg) y el Hg inorgánico divalente [Hg(II)]. Aunque el intestino es la principal puerta de entrada del tóxico en la circulación sistémica, los estudios sobre su toxicidad a nivel intestinal son escasos. El objetivo de la presente tesis ha sido evaluar la toxicidad y los mecanismos de acción del Hg(II) y el MeHg a nivel intestinal. Adicionalmente, se ha ensayado la eficacia de cepas de bacterias ácido- lácticas (BAL) como estrategia de reducción de esta toxicidad. Para los estudios in vitro se ha desarrollado un modelo celular en el que se han combinado enterocitos, células mucosecretoras y macrófagos en un sistema bicameral. Las células se han expuesto a Hg(II) y MeHg (0.1-1 mg/L) durante 10 días. Los datos han evidenciado que ambas especies generan un aumento de la respuesta inflamatoria, incrementando la liberación de la citoquina IL-8 e IL-1β, y una respuesta pro-oxidante, con un aumento de las especies reactivas de oxígeno/nitrógeno (ROS/RNS) y una sobreexpresión de proteínas de estrés (HSP70, HSP90 y MT2A). Esta respuesta ha sido más notable en macrófagos, indicando que posiblemente sean las células inmunitarias las que gobiernen la respuesta al tóxico. La situación de estrés va acompañada de una alteración de la expresión de la proteína de las uniones estrechas ZO-1 y una modificación de la morfología de la monocapa. Además, la exposición genera un aumento de la secreción de mucus y una sobreexpresión de su principal mucina, principalmente a MeHg. Los mecanismos de esta hipersecreción podrían estar relacionados con la ruta IL4/IL13/STAT6. Todos estos efectos sobre la monocapa epitelial conllevan un aumento de la permeabilidad y una reducción de la capacidad de regeneración. En los ensayos in vivo se han expuesto ratones BALB/c a Hg(II) y MeHg (1- 10 mg/L) durante 4 meses a través del agua de bebida. Los datos obtenidos han confirmado lo observado in vitro. La exposición a ambas especies (especialmente a 5 y 10 mg/L) induce un proceso inflamatorio en el colon, con un aumento de las citoquinas TNF-α e IL1-β y la presencia de infiltrados de neutrófilos. Paralelamente, la exposición genera estrés oxidativo con un incremento de las ROS/RNS y los peróxidos lipídicos. Se ha confirmado in vivo la participación en esta respuesta de algunas rutas apuntadas in vitro, en concreto p38 MAPK y JNK. Además, también se evidencian alteraciones en la expresión de proteínas de las uniones estrechas y de la mucina MUC2 en el colon, acompañada de una hiperplasia de las células mucosecretoras, especialmente en los tratamientos con MeHg. En estos animales se observa, además, un aumento de la expresión de IL13 e IL4, lo que apunta a la participación de la ruta IL4/IL13/STAT6, tal y como indicaban los ensayos in vitro. Además, estos ensayos in vivo muestran un efecto de ambas especies sobre el metabolismo de la microbiota intestinal con una reducción de los contenidos luminales de los ácidos grasos de cadena corta (SCFA), aunque los cambios detectados en la composición de la microbiota son mínimos. Finalmente, los animales tratados presentan un aumento de la permeabilidad. Todos los datos obtenidos in vitro e in vivo ponen de manifiesto que una exposición continuada a Hg(II) y MeHg genera una disrupción de la barrera intestinal. Los ensayos in vitro realizados para determinar la eficacia de las cepas de BAL de origen murino LE1 y LE2 como estrategia de protección se han realizado coexponiendo el modelo celular a Hg(II) o MeHg (1 mg/L) junto con las cepas durante 7 días. Los datos obtenidos han mostrado un efecto protector de ambas cepas, con una reducción de la respuesta inflamatoria, el estrés y los efectos sobre las uniones estrechas y la producción de mucus. Asimismo, la presencia de ambas bacterias restaura parcialmente la permeabilidad y la capacidad de regeneración de las monocapas. Teniendo en cuenta que en este estudio las BAL están inactivadas térmicamente, esta protección se asocia principalmente a su capacidad de quelación del Hg, aunque no hay que descartar que algún componente estructural de la pared bacteriana pueda ejercer otro tipo de efecto beneficioso. Los ensayos in vivo para confirmar el efecto protector de las BAL se han realizado en ratones BALB/c expuestos durante 2 meses a MeHg (5 mg/L) a través del agua de bebida. Las bacterias, en este caso viables, se han administrado por sonda gástrica diariamente. Los datos obtenidos muestran que, aunque las dos cepas reducen por igual los contenidos colónicos de MeHg, la reducción de los efectos tóxicos es mucho más notable con la cepa LE1. Se observan reducciones de los contenidos de mediadores de inflamación y estrés en el colon, hay una recuperación de la expresión de proteínas constituyentes de las uniones estrechas y del mucus. Se reestablecen los niveles luminales de los metabolitos de la microbiota y se restaura parcialmente la permeabilidad intestinal. Los resultados muestran que, además del proceso de quelación, la cepa LE1 activa la ruta de señalización Nrf2/Keap1/ARE y la producción de la citoquina anti-inflamatoria IL10. Los datos obtenidos in vitro e in vivo, apuntan a que la cepa LE1 podría ser una buena alternativa para reducir la toxicidad intestinal del Hg; reducción que puede tener también repercusiones beneficiosas a nivel sistémico. / [CA] La dieta és la principal via d'exposició a mercuri (Hg) per a la majoria de la població. Les principals formes de Hg en els aliments són el metilmercuri (MeHg) i el Hg inorgànic divalent [Hg(II)]. Encara que l'intestí és la principal porta d'entrada del tòxic a la circulació sistèmica, els estudis sobre la seua toxicitat a nivell intestinal són escassos. L'objectiu de la present tesi ha sigut avaluar la toxicitat i els mecanismes d'acció del Hg(II) i el MeHg a nivell intestinal. Addicionalment, s'ha assajat l'eficàcia de soques de bacteris àcid-làctics (BAL) com a estratègia de reducció d'aquesta toxicitat. Per als estudis in vitro s'ha desenvolupat un model cel·lular en el qual s'han combinat enteròcits, cèl·lules mucosecretores i macròfags en un sistema bicameral. Les cèl·lules s'han exposat des de l'inici a Hg(II) i MeHg (0.1-1 mg/L) durant 10 dies. Les dades han evidenciat que totes dues espècies generen un augment de la resposta inflamatòria, incrementant l'alliberament de la citocina IL- 8 i IL-1β, i una resposta pro-oxidant, amb un augment de les espècies reactives d'oxigen/nitrogen (ROS/RNS) i una sobreexpressió de proteïnes d’estrès (HSP70, HSP90 i MT2A). Aquesta resposta ha sigut més notable en macròfags, indicant que possiblement són les cèl·lules immunitàries les que governen la resposta al tòxic. La situació d’estrès va acompanyada d'una alteració de l'expressió de la proteïna de les unions estretes ZO-1 i una modificació de la morfologia de la monocapa. A més, l'exposició, principalment a MeHg, genera un augment de la secreció de mucus i una sobreexpressió de la seua principal mucina. Els mecanismes d'aquesta hipersecreció podrien estar relacionats amb la ruta IL4/IL13/STAT6. Tots aquests efectes sobre la monocapa epitelial comporten un augment de la permeabilitat i una reducció de la capacitat de regeneració. En els assajos in vivo s'han exposat ratolins BALB/c a Hg(II) i MeHg (1-10 mg/L) durant 4 mesos a través de l'aigua de beguda. Les dades obtingudes han confirmat l'observat in vitro. L'exposició a totes dues espècies (especialment a 5 i 10 mg/L) indueix un procés inflamatori en el còlon, amb un augment de les citocines TNF-α i IL1-β i la presència d'infiltrats de neutròfils. Paral·lelament, l'exposició genera estrès oxidatiu amb un increment de les ROS/RNS i els peròxids lipídics. S'ha confirmat in vivo la participació en aquesta resposta d'algunes rutes apuntades in vitro, en concret p38 MAPK i JNK. A més, també s'evidencien alteracions en l'expressió de proteïnes de les unions i de la mucina MUC2 en el còlon, acompanyada d'una hiperplàsia de les cèl·lules mucosecretores, especialment en els tractaments amb MeHg. En aquests animals hi ha, a més, un augment de l'expressió d'IL13 i IL4, la qual cosa apunta a la participació de la ruta IL4/IL13/STAT6, tal com indicaven els assajos in vitro. A més, aquests assajos in vivo mostren un efecte de les espècies de Hg sobre el metabolisme de la microbiota intestinal, amb una reducció dels continguts luminals dels àcids grassos de cadena curta (SCFA), encara que els canvis en la composició de microbiota intestinal son minims. Finalment, els animals tractats presenten un augment de la permeabilitat. Totes les dades obtingudes in vitro i in vivo posen de manifest que una exposició continuada a Hg(II) i MeHg genera una disrupció de la barrera intestinal. Els assajos in vitro realitzats per a determinar l'eficàcia de les soques de BAL d'origen murí LE1 i LE2 com a estratègia de protecció s'han realitzat coexposant el model cel·lular combinat a Hg(II) o MeHg (1 mg/L) juntament amb les soques durant 7 dies. Les dades obtingudes han mostrat un efecte protector de totes dues soques, amb una reducció de la resposta inflamatòria, l'estrès i els efectes sobre les unions estretes i la producció de mucus. Així mateix, la presència dels bacteris restaura parcialment la permeabilitat i la capacitat de regeneració de les monocapes. Tenint en compte que en aquest estudi les BAL estan inactivades tèrmicament, aquesta protecció s'associa principalment a la seua capacitat de quelació del Hg, encara que no cal descartar que algun component estructural de la paret bacteriana puga exercir un altre tipus d'efecte beneficiós. Els assajos in vivo per a confirmar l'efecte protector de les BAL s'han realitzat en ratolins BALB/c exposats durant 2 mesos a MeHg (5 mg/L) a través de l'aigua de beguda. Els bacteris, en aquest cas viables, s'han administrat per sonda gàstrica diàriament. Les dades obtingudes en aquest assaig mostren que, encara que els dues soques redueixen per igual els continguts colònics de MeHg, la reducció dels efectes tòxics és molt més notable amb la soca LE1. S'observen reduccions dels continguts dels mediadors d'inflamació i estrès en el còlon, hi ha una recuperació de l'expressió de proteïnes constituents de les unions estretes i el mucus. Es restableixen els nivells luminals dels metabòlits de la microbiota i es restaura parcialment la permeabilitat intestinal. Els resultats mostren que a més del procés de quelació, la soca LE1 activa la ruta de senyalització Nrf2/Keap1/ARE i la producció de la citocina anti-inflamatòria IL10. Les dades obtingudes in vitro i in vivo apunten al fet que la soca LE1 podria ser una bona alternativa per a reduir la toxicitat intestinal del Hg; reducció que pot tindre també repercussions beneficioses a nivell sistèmic. / [EN] A cell model for in vitro studies in which enterocytes, mucosecretory cells and macrophages have been combined in a bicameral system has been developed. Cells have been exposed to Hg for 10 days. The data have shown that both species induce an inflammatory response and a pro-oxidant response, with an increase in reactive oxygen/nitrogen species and an overexpression of stress proteins. The situation of stress is accompanied by alterations in the expression of the tight junction protein ZO-1 and changes in the morphology of the intestinal monolayer. In addition, exposure, especially to MeHg, generates an increase in mucus secretion and an overexpression of its main mucin. The mechanisms of this hypersecretion could be related to the IL4/IL13/STAT6 pathway. All these effects on the epithelial monolayer lead to and increased permeability and a reduced regeneration capacity. In vivo assays have been performed in BALB/c mice exposed to Hg (1-10 mg/L) for 4 months through drinking water. The data obtained have confirmed the previous results observed in vitro. Exposure to both species induces an inflammatory process in the colon and generates oxidative stress with an increase in ROS/RNS and lipid peroxides. The participation in this response of some signaling pathways targeted in vitro has been confirmed in vivo. In addition, alterations in the expression of tight junction proteins and the mucin MUC2 in the colon are also evidenced, accompanied by a hyperplasia of the mucosecretory cells, especially in MeHg treatments. In these animals, there is also an increase in the expression of IL-13 and IL-4 cytokines, which points to the participation of the IL4/IL13/STAT6 pathway. In addition, these in vivo assays show an effect of both species on the metabolism of the intestinal microbiota, with a reduction in the luminal contents of short-chain fatty acids, although changes in the intestinal microbiota composition are minimal. Finally, the treated animals showed an increase in permeability. The in vitro studies carried out to determine the efficacy of the BAL strains of murine origin LE1 and LE2 as a strategy of protection have been performed by co-exposing the combined cell model to Hg (1 mg/L) together with the strains for 7 days. The data obtained have shown a protective effect of both strains, with a reduction in the inflammatory response, oxidative stress and the effects on tight junctions and mucus production. In the same way, the presence of both bacteria partially restores the permeability and the regenerative capacity of the monolayers. Bearing in mind that in this study the LABs are heat-inactivated, this protection is mainly associated with their ability to bind Hg, although it cannot be ruled out that some structural components of the bacterial wall may exert another type of beneficial effect. In vivo assays carry out to confirm the protective effect of LAB have been performed in BALB/c mice exposed for 2 months to MeHg (5 mg/L) through drinking water. The strains of LAB have been administered daily by gavage. Data show that, the reduction of the toxic effects is much more pronounced when LE1 strain is administrated. Reductions in the contents of inflammatory and stress mediators in the colon are observed, together with a recovery in the expression of proteins of the tight junctions and the mucus layer. The luminal levels of microbiota metabolites are restored, and intestinal permeability is partially reestablished. The results show that in addition to the chelation process, LE1 strain activates the Nrf2/Keap1/ARE signaling pathway and the production of the anti-inflammatory cytokine IL10. The data obtained in vitro and in vivo suggest that LE1 strain could be a good strategy to reduce Hg intestinal toxicity; reduction that can also have beneficial repercussions at a systemic level. / Rodríguez Viso, P. (2023). Estrategias para mitigar la toxicidad asociada a la exposición crónica al mercurio a través de la dieta [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/192865

Le β-carotène (Bc) est un caroténoïde connu pour son activité pro vitaminique A. La consommation de fruits et légumes riches en Bc est donc particulièrement encouragée, principalement dans les pays en développement. Cependant, au cours d'un repas, la biodisponibilité du Bc est influencée par la présence des macro et microconstituants des aliments. L'objectif général de ce travail a été d'étudier les interactions alimentaires pouvant survenir au cours des différentes étapes du processus d'absorption du Bc. La bioaccessibilité du Bc, évaluée à l'aide d'un modèle de digestion in vitro, a révélé que la quantité de Bc micellarisé des aliments de base (patate douce orange (PDO) et banane plantain) des pays du Sud se retrouve augmentée dans certaines préparations tratitionnelles. De plus, dans une simple association de deux aliments, nos résultats ont montré que la naringine de jus d'agrumes diminuait la bioaccessibilité du Bc de la PDO car ce flavanone se micellarise et entre en compétition avec le Bc. L'effet de flavanones sur l'absorption intestinale du Bc a ensuite été étudié à l'aide d'un modèle cellulaire de type Caco-2. L'ensemble des glycosides de flavanones testés, mais principalement l'hespéridine (Hes), ont augmenté l'absorption du Bc. L'expérimentation in vivo chez la gerbille n'a quant à elle pas montré d'effet de l'Hes sur la bioefficacité du Bc de la PDO. Par contre, nos données suggèrent que l'Hes, dans le cas d'un régime carencé en caroténoïdes et vitamine A, pourrait stimuler l'activité de la β,β-carotène mono-oxygénase par un mécanisme impliquant le facteur de transcription PPARγ. / Β-carotene (Bc) is a carotenoid mainly known for its provitaminic A activity. Therefore, the consumption of fruits and vegetables rich in Bc are promoted, especially in developing countries. However, during a meal, the Bc bioavailability was modulated by other macro or micronutrients from food. The main objective of this study was to evaluate food interaction occurring during the different steps of Bc absorption. The Bc bioaccessibility, evaluated through an in vitro digestion, showed that the micellarization of Bc staple foods from South countries (orange fleshed sweet potato (OFSP) and plantain) increases in some traditional food preparations. Moreover, we observed that the Bc bioaccessibility from OFSP decreases in the presence of Citrus juice because of the naringin which competes for incorporation into mixed micelles. Effects of flavanones were then assessed on intestinal Bc uptake using Caco-2 cells. Among flavanone glycosides tested, mainly hesperidin (Hes), increased Bc uptake. In vivo experimentation with gerbil did not shown any effect of Hes on the bioefficacity of Bc from OFSP. By contrast, our data suggest that under a low Bc or vitamin A free diet, Hes might enhance BCMO1 activity through its action as agonist of PPARγ.

L'extraction par CO2 supercritique démontre les avantages d'un procédé de chimie verte en comparant ce procédé à la méthode d'extraction par solvant organiques et en tenant compte du degré de toxicité et de pollution du solvant. L'extraction par solvants organiques met en évidence l'influence du solvant d'extraction alors que l'extraction par CO2-SC met en évidence l'influence de différents paramètres dont la pression, la température, le temps de contact entre la matrice végétale et le CO2-SC, le diamètre moyen des particules et l'ajout d'un co-solvant. L'analyse chromatographique a permis d'identifier et de quantifier les flavonolignanes (silychristine, silydianine, silybine, taxifoline) dans les extraits de graines obtenus par solvants organiques et par CO2-SC avec co-solvant. A 220 bar, les concentrations en silydianine (38,87 mg/g) et en silybine (45,91mg/g) sont les plus élevés et à 40°C les concentrations en silychristine (31,97mg/g), en silydianine (38,87 mg/g) et en silybine (45,91mg/g) sont les plus importantes. Les extraits huileux obtenus à 220 bar et à 40°C des graines de Silybum marianum sont riches en acides gras : acide linoléique (65,22%), acide oléique (27,01%), acide palmitique (12,12%). L'activité antioxydante a été évaluée par deux tests : test DPPH et test ABTS. Ces deux tests sont complémentaires et ont permis de conclure que l'extrait ayant un effet antioxydant le plus important est l'extrait obtenu par CO2-SC à 220 bar et à 40°C. L'activité biologique de cet extrait est mise en évidence par rapport à une lignée cellulaire cancéreuse du colon Caco-2. La silychristine, la silydianine et la silybine ainsi que l'extrait obtenu par CO2-SC avec co-solvant (éthanol) à 220 bar et à 40°C ont été testés vis à vis de cette lignée cancéreuse. Ces expérimentations in vitro reflètent une activité cytotoxique quantifiable et une mortalité cellulaire des Caco-2 des flavonolignanes allant jusqu'à 71% / The supercritical CO2 extraction demonstrates the benefits of green chemistry process comparing with the method of organic solvents extraction and depending to toxicity and pollution solvent degree. Organic solvents extraction shows the solvent extraction influence, so that the SC-CO2 extraction highlights different parameters including pressure, temperature, contact time between the plant matrix and CO2 SC, the average particle diameter and the addition of a cosolvent. Chromatographic analysis identified and quantified four flavonolignans (silychristin, silydianin, silybin, taxifolin) in seed extracts obtained by organic solvents and SC-CO2 with cosolvent. At 220 bar, silydianin (38.87 mg / g) and silybin (45.91 mg / g) have highest concentrations and at 40°C silychristin (31.97 mg / g), silydianin (38.87 mg / g) and silybin (45.91 mg / g) have the most important concentrations. The oily extracts obtained at 220 bar and 40°C of Silybum marianum seeds are rich in fatty acids: linoleic acid (65.22%), oleic acid (27.01%), palmitic acid (12.12%). The antioxidant activity measured by two tests: DPPH and ABTS test. These two tests are complementary and confirm that the extract with the higher antioxidant effect is the extract obtained by SC-CO2 at 220 bar and 40°C. The biological activity of this extract is demonstrated with respect to a colon cancer cell line Caco-2. Silychristin, silydianin and silybin and the extract obtained by CO2-SC with co-solvent (ethanol) at 220 bar and 40°C were tested with respect to this line cancer. These experiments in vitro cytotoxic activity reflect estimable and cell death of Caco-2 flavonolignans of up to 71%

L’[alpha]-casozépine, décapeptide issu de l’hydrolysat trypsique de la caséine [alpha]s1, possède in vitro une affinité pour le site benzodiazépine des récepteurs GABAA centraux (Lecouvey et al., 1997 ; Miclo et al., 2001). Des résultats attestent du potentiel anxiolytique de ce décapeptide seul ou au sein de son hydrolysat, in vivo, en administration intrapéritonéale et per os chez le rat Wistar (Guesdon et al., 2006 ; Miclo et al., 2001 ; Violle et al., 2007) et chez l’Homme en administration orale (Kim et al., 2007 ; Messaoudi et al., 2005). Pour déterminer la sensibilité de l’[alpha]-casozépine à différentes attaques protéolytiques, des cinétiques d’hydrolyses gastriques, pancréatiques et intestinales, ont été réalisées in vitro avec les enzymes et systèmes enzymatiques suivants ; pepsine, trypsine, [alpha]-chymotrypsine, CorolasePP®, vésicules membranaires de bordure en brosse d’entérocytes de rats et épithélium entérocytaire reconstitué par les cellules de la lignée Caco-2. Pour chacune des conditions d’hydrolyses étudiées, l’ensemble des fragments peptidiques libérés ont été séparés par chromatographie liquide haute performance en phase inversée et caractérisés par spectrométrie de masse. Ces analyses mettent en évidence la résistance partielle de l’[alpha]-casozépine à certaines enzymes et systèmes enzymatiques. L’hydrolyse pepsique de l’[alpha]-casozépine libère notamment deux fragments : 91YLGYLEQ97 et 91YLGYL95, nommés F97 et F95 qui s’avèrent être plus résistants que [alpha]-casozépine à certaines enzymes employées. Ainsi pour permettre une meilleure compréhension de la relation entre la structure de l’[alpha]-casozépine et la fonction benzodiazépine mimétique obtenu in vivo, ces peptides tronqués dans leur partie carboxy-terminale ont été testés in vivo chez le rat Wistar en injection intrapéritonéale. Ils s’avèrent être également détenteurs d’activité anxiolytique. Cependant aucun transfert de l’[alpha]-casozépine et des fragments F97 et F95 n’a pu être observé au travers de l’épithélium entérocytaire reconstitué par le modèle cellulaire de la lignée Caco-2 et ce malgré les différentes conditions de cultures et d’analyses testées / [alpha]-Casozepine, a tryptic decapeptide from bovine [alpha]s1-casein, have in vitro an affinity for the benzodiazepine site of the central receptor GABAA (Lecouvey et al., 1997; Miclo et al., 2001). Some results display the anxiolytic potential of this peptide alone or within its hydrolysat, in vivo, in intra peritoneal administration and per os in Wistar rats (Guesdon et al., 2006; Miclo et al., 2001; Violle et al., 2007) and in human in oral administration (Kim et al., 2007; Messaoudi et al., 2005). To determine the sensitivity of [alpha]-casozepine in various proteolytic attacks, kinetics of gastric, pancreatic and intestinal hydrolyses, were realized in vitro with enzymes and following enzymatic systems; pepsin, trypsin, [alpha]-chymotrypsin, CorolasePPTm, brush border membranar vesicles rats enterocytes and enterocytes epithelium reconstituted by the Caco-2 cell line. For each of the conditions of studied hydrolysis, all the peptides fragments released were separated by liquid chromatography high-performance in inverted phase and characterized by mass spectrometry. These analyses underline the partial resistance of [alpha]-casozepine in some enzymes and enzymatic systems. [alpha]-Casozepine pepsic hydrolysis release in particular two peptide fragments: 91YLGYLEQ97 and 91YLGYL95, named F97 and F95 who turn out to be more resistant than [alpha]-casozepine in some used enzymes. So to allow a better understanding of the relation between structure of [alpha]-casozepine and the benzodiazepine mimetic function obtained in vivo, these peptides truncated in their carboxy-terminal party were tested in vivo with Wistar rat in intra peritoneal injection. They turn out to be also holders of anxiolytic activity. However no transfer of [alpha]-casozepine and fragments F97 and F95 was observed through the enterocyte epithelium reconstituted by the cellular model Caco-2 and this in spite of the various conditions of cultures and tested analyses

Neste trabalho, esclarecemos tópicos da patogenicidade de EIEC que sustentam a sua menor virulência quando comparada à S. flexneri, e mostramos a importância das células dendríticas (CD) nesse processo. Estudou-se o comportamento de EIEC e S. flexneri quando em contato com células Caco-2, avaliando-se uma cinética de expressão dos genes envolvidos na invasão e disseminação bacteriana. Em geral, todos os genes foram menos expressos em EIEC, fato corroborado pelo fenótipo de disseminação bacteriana, onde EIEC foi menos eficiente do que Shigella. Também foi avaliada a modulação da resposta inflamatória de células dendríticas intestinais murinas pela produção de citocinas, expressão de moléculas co-estimulatórias e apresentação de antígenos, após desafio das células com as bactérias. Os resultados sugerem que EIEC induz a uma resposta protetora ao hospedeiro, enquanto que Shigella estaria \"driblando\" o sistema imune, além de provavelmente super-estimular o sistema imune adaptativo, fato que poderia levar a um agravamento da doença. As ações integradas das células Caco-2, células dendríticas e estímulos bacterianos foram estudadas em co-cultura celular. Observou-se que EIEC e suas proteínas secretadas induzem a migração das CDs ao compartimento apical da co-cultura; nada foi observado quando o desafio se deu com Shigella. Também foram avaliadas as concentrações de citocinas inflamatórias no microambiente infeccioso formado. A citocina TNF-α, bem como CCL20 e MCP-1 foram mais proeminentes após estímulo com EIEC, fato que poderia explicar parcialmente a migração das CDs ao lado apical da co-cultura após estímulo com EIEC e suas proteínas secretadas. Nossas evidências experimentais indicam que a doença desencadeada por EIEC é mais restrita a um determinado local da infecção, ou seja, não é capaz de se disseminar a ponto de estender a lesão tecidual de forma mais drástica, como Shigella. Esse fenômeno pode estar associado à menor expressão de seus dos fatores de virulência e à resposta imune inata induzida no sítio de infecção, o que levaria, fatalmente, à resolução da doença. / In this study, we clarify topics of pathogenicity from EIEC that support its lower level of virulence when it is compared to S. flexneri, and we have shown the importance of dendritic cells (DC) in this process. We studied the conduct of EIEC and S. flexneri when they were in contact with Caco-2 cells and we analyzed the kinetics of the genes expression that was involved in the spread and invasion of the bacteria. In general, all genes were expressed less in EIEC, as demonstrated by the phenotype of the bacterial spread, where EIEC was less efficient than Shigella. We also analyzed the modulation of the inflammatory response by the murine intestinal dendritic cells by the production of cytokine, expression of co-stimulators molecules and antigens presentation, after the interaction of the cells with the bacteria. The results showed that EIEC induces a response that protects the host while Shigella manipulate the host intestinal innate and adaptive immune system and it probably over-stimulates the adaptive immune system which could let the disease worse. The integrated actions of Caco-2 cells, dendritic cells and bacterial stimulus, were studied in a co-culture cell. We observed that EIEC and its secreted proteins induce the migration of the DCs to the apical compartment of the co-culture; nothing was observed related to Shigella. We also evaluated the concentrations of the inflammatory cytokines at the infective micro environment that was formed. The cytokine TNF-α, as CCL20 and MCP-1 were more prominent after been stimulated with EIEC, a fact that could partially explain the migration of DCs to the apical side of the co-culture after the stimulus with EIEC and its secreted proteins. Our experimental evidence shows that the disease triggered by the EIEC is more restricted at a definite infection place, which means that it is not capable of disseminating beyond a certain point to extend the tissue\'s injury and let it worsen, as Shigella do. This phenomenon can be associated with the lower level of expression of its virulence factors and to the immune response induced in the infection site, what could finally lead to the eradication of the disease.