Cryptococcus neoformans é uma levedura oportunista que pode se alojar no sistema nervoso central causando meningite, meningoencefalite e encefalite principalmente em indivíduos com algum comprometimento do sistema imune. É responsável por 4,5% das infecções oportunistas que acometem pacientes portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-positivos). Cryptococcus gattii é um patógeno primário responsável por uma alta incidência de criptococomas no pulmão e no cérebro e que apresenta uma alta morbidez neurológica e uma resposta retardada à terapia antifúngica. O diagnóstico da criptococose é, atualmente, baseado na detecção da levedura em amostras clínicas, no cultivo com posterior identificação bioquímica e na pesquisa de antígenos circulantes. A diferenciação entre as espécies C. neoformans e C. gattii, na maioria dos laboratórios, é realizada utilizando o meio de cultura ágar canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) e demora em torno de sete dias. Neste trabalho foi padronizada uma metodologia de PCR multiplex que pode vir a substituir as provas bioquímicas utilizadas atualmente para a identificação das espécies de Cryptococcus, reduzindo em 6 dias o tempo necessário para a identificação das espécies. A metodologia também se mostrou mais específica na identificação das espécies, concordando com os resultados das sorotipagens em todos os 132 isolados de Cryptococcus testados, enquanto o resultado obtido com o cultivo em ágar CGB foi discordante em 6 dos 132 isolados, sendo 5 falso-positivos e 1 falso negativo. Foi também realizado o primeiro estudo epidemiológico do perfil de pacientes com meningite criptocócica no estado do Rio Grande de Sul notificados no Laboratório Central de Saúde Pública IPB-LACEN/RS no período de 2000 a 2005. A maioria dos pacientes é do sexo masculino (77,12%), branco (83,5%), na faixa etária entre 30 a 39 anos (46,24%) e infectados pelo HIV (95%).

Introdução - A Infecção do Trato Urinário (ITU) é uma das doenças mais comuns, especialmente em mulheres jovens e sexualmente ativas, causada, na maioria das vezes, pela Escherichia coli. Este estudo objetiva analisar os fatores de risco associados com este tipo de infecção, além de estudar o perfil de resistência à genotipagem da E. coli. Pacientes e métodos - Foram avaliados 62 pacientes femininas, residentes em Santa Cruz do Sul, com idade variando entre 18 a 84 anos, com o diagnóstico ambulatorial de ITU não complicada. O diagnóstico foi estabelecido na presença de sintomas urinários e urocultura com a contagem superior a 105 UFC/mL. Os pacientes responderam a um questionário para obtenção de dados clínicos. A sensibilidade dos isolados de E. coli frente aos antimicrobianos foi determinada usando o método de difusão em disco em meio Mueller Hinton. A genotipagem foi realizada através da técnica de reação em cadeia da polimerase baseada na região consenso repetitivo intergênica. Resultados: O perfil de resistência bacteriana aos antibióticos testados foi de 22,6% para a sulfametoxazol-trimetoprim, 19,3% para a cefalexina, 8,1% para a norfloxacina, 4,8% para a gentamicina e 3,2% para a nitrofurantoína. A genotipagem revelou que 43,5% dos isolados clínicos de E. coli apresentavam relação clonal. A comparação dos dados clínicos dos pacientes que eram portadores de cepas formadoras de clones com os que não eram, revelou que não houve diferença entre os dois grupos em relação ao perfil de resistência, idade da primeira infecção urinária, atividade sexual, história de doença renal no passado, número de episódios de ITU, hospitalização, uso prévio de antibióticos nos últimos 2 meses e presença de animal de estimação em casa. A análise dos grupos classificados pelo resultado da genotipagem quanto ao perfil de resistência revelou que não há diferença estatisticamente significante nos níveis de resistência à cefalexina, à gentamicina, à nitrofurantoína, à norfloxacina e à sulfametoxazol-trimetoprim nos diferentes clones observados. Conclusão: O perfil de resistência da E. coli aos antibióticos testados mostrou altos níveis de resistência à SMT e à cefalexina. A genotipagem da E. coli identificou, em 43,5% dos isolados, a presença de uma relação clonal embora não tenha sido observado uma associação da relação clonal com perfil de resistência e variáveis clínicas.

Mancha marrom ou Helmintosporiose é uma das principais doenças do trigo, causada pelo fitopatógeno Bipolaris sorokiniana, sendo responsável por grandes perdas econômicas no cultivo do trigo no mundo inteiro. Este fungo apresenta uma grande diversidade morfológica, fisiológica e genética. Com objetivo de caracterizar a diversidade molecular de amostras monospóricas de B. sorokiniana isolados de sementes do Brasil e outros países, foram utilizados 60 isolados monospóricos tendo o DNA genômico desses isolados sido submetidos à amplificação por PCR. Foram utilizados 12 oligonucleotídeos iniciadores universais construídos a partir de sequências repetidas do genoma do arroz (URP). Os perfis gerados foram analisados pelo método de médias aritméticas não ponderadas (UPGMA). O método PCR – URP permitiu obter informações importantes sobre o perfil genético das culturas monospóricas mostrando distinções entre os três conídios isolados oriundos da mesma cepa polispórica. Os oligonucleotídeos URP-30F, URP-6R, URP-17R e URP-38Famplificaram com um elevado índice de isolados. Em contra partida, os oligonucleotideos URP-13R, URP- 25F e URP-32F apresentaram um perfil de amplificação menor entre os isolados do fitopatógeno. O número total de fragmentos gerados com cada um dos oligonucleotídeos variou entre 41 e 77 fragmentos. Os oligonucleotídeos URP-17R, URP-30F, URP-32F e URP-6R apresentaram maior índice de fragmentos polimórficos. Os isolados apresentaram uma grande diversidade intra-especifíca entre os oligonucleotideos iniciadores URP e entre os conídios monospóricos. A análise forneceu informações relevantes sobre a variabilidade genética e a relação entre os isolados de B. sorokiniana. / Leaf spot disease or helmintosporiosis is one of the most important diseases of wheat cultures caused by the phytopathogem Bipolaris sorokiniana. It is responsible for great economic loss of wheat cultivation worldwide. This fungus presents a great morphologic, physiologic and genetic diversity. The aim of this study was to characterize the molecular diversity of B. sorokiniana monosporic isolates isolated from seeds from Brazil and other countries. For this purpose 60 monosporic isolates were used. The genomic DNA of this isolates were submitted to PCR amplification using 12 universal primers built from repeated sequences of rice genome (URP). The analysis of the amplification profile were calculated by Unweighted Pair Group Arithmetic Mean (UPMGA) Method. The PCR-URP method provided important information about the genetic profile to the monosporic culture, showing distinctions between the three spore isolates of the same polysporic strain. The primers URP-30F, URP-6R, URP-17R and URP-38F were able to amplify a higher percentage of the isolates been the more efficient in the study of this phytopathogen. However, the primers URP-13R and URP-32F have shown a lower amplification profile between the B. sorokiniana isolates. The number of fragments that resulted from the amplification of each primer had varied between 41 and 77 fragments. The primers URP-17R, URP-30F, URP-32F and URP-6R generated a higher number of polymorphic fragments with the isolates. The analysis provided relevant information about the variability and genetic relationship between B. sorokiniana isolates.

O papel dualístico exercido por Enterococcus na natureza estimula a pesquisa dos fatores que determinam sua virulência. O objetivo desse estudo foi investigar a distribuição de genes envolvidos com fatores de virulência entre isolados de Enterococcus e sua correlação com a capacidade de formação de biofilme e confirmar a identificação de E. casseliflavus e E. gallinarum por PCRRFLP. Foram analisados 66 isolados clínicos e 70 alimentares quanto a presença dos genes gelE, esp, agg, ace e cylA por PCR e atividade de gelatinase e citolisina. Isolados clínicos apresentaram maior incidência de fatores de virulência quando comparados com alimentares, exceto para os genes gelE e ace. Em ambas amostragens houve a ocorrência de isolados positivos para os genes gelE e cylA, porém sem atividade enzimática, indicando a presença de genes silenciosos. A maioria dos isolados apresentou capacidade de formação de biofilme, entretanto não houve uma correlação entre os genes analisados e o fenótipo de formação de biofilme, porém é possível que o gene ace e gelE atuem como potencializadores na formação de biofilmes em Enterococcus. Para testar a técnica de PCR-RFLP, 32 e 20 isolados de E. gallinarum e E. casseliflavus, respectivamente, identifcados bioquimicamente foram avaliados. O fragmento de 661 bp correspondente a uma região conservada do 16S rDNA foi clivado com HinfI e 47% E. gallinarum e 25% E. casseliflavus apresentaram fragmentos de 589bp e 72bp, padrão esperado para o PCR-RFLP. Assim sendo, a PCR-RFLP mostrou ser uma ferramenta molecular útil na confirmação das espécies E. casseliflavus e E. gallinarum. / The dualistic role played by enterococci in the nature, encourages the study of virulence factors. The aim of this study was to investigate the distribution of genes involved in virulence among Enterococcus isolates and to correlate with biofilm formation ability and to confirm the identification of Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus isolated from clinical and food samples by PCR-RFLP. Sixty six clinical and 70 food isolates were analyzed for the presence of gelE, esp, agg, ace and cylA genes by PCR and the gelatinase and cytolysin activities. Clinical isolates showed a higher incidence of virulence factors when compared to food isolates, except for gelE and ace genes. In both samples was observed the occurrence of isolates positive for gelE and cylA genes, but with no enzymatic activities, indicating the presence of silent genes. Most isolates showed ability to form biofilm, although there was no correlation between the presence of the genes and the phenotype of biofilm formation, but it is possible that ace and gelE genes perform as enhancers in biofilm formation in Enterococcus. To test the PCR-RFLP tecnhique, 32 and 20 strains identified by conventional biochemical exams as E. casseliflavus E. gallinarum, respectively, were were submitted to PCR amplification and digested with HinfI.. The DNA fragment of 661 bp corresponding to a conserved region of 16S rDNA was cleaved with HinfI and 47% and 25% of E. gallinarum and E. casseliflavus showed DNA fragments of 589 bp and 72 bp, expected for PCR-RFLP. Thus, PCR-RFLP proved to be a useful molecular tool for confirmation the E. casseliflavus and E. gallinarum species.

Orientador: Fernando Antônio de Ávila / Banca: Karina Paes Bürger / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Luciano Menezes Ferreira / Banca: Adilson César Abreu Bernardi / Resumo: Assim como nos bovinos, a búfala pode ter mastite, sendo o Staphylococcus aureus o principal causador desta enfermidade. No entanto, é possível que sua prevalência possa estar superestimada. Este estudo objetivou comparar métodos fenotípico e genotípico na identificação de S. aureus em amostras de leite bubalino e ambiente de ordenha bem como propor uma nova PCR quantitativa em tempo real para identificação do mesmo. Para isso, de um total de 408 amostras obtidas de leite de búfalo, ambiente de ordenha e mãos de ordenhadores, 32 cepas presuntivas de S. aureus foram identificadas com base em seu crescimento fenotípico característico em ágar Baird Parker, reações positivas de Gram e catalase, capacidade de coagular plasma de coelho, e resultado positivo no ensaio de PCR Sa442 específico para a espécies. No entanto, testes adicionais revelaram que destas 32 estirpes, apenas 10 isolados apresentaram resultado positivo na aglutinação em látex, incluindo um S. chromogenes e um S. agentis. A análise de MALDI-TOF MS revelou que oito das 32 cepas eram S. aureus, 19 S. chromogenes, três S. agnetis e uma S. xylosus. Todas as oito cepas identificadas como S. aureus pela análise de MALDI-TOF e confirmadas pelo sequenciamento do 16S rRNA foram positivas na PCR do gene cydB específico para S. aureus. Além disso, foi encontrada uma cepa positiva para o gene sea, nove para o gene cna, uma para o gene sei, duas para o gene sem, uma para o gene seg, seis para o gene seh, 15 para o gene eno 11 p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Like cattle, buffalo may have mastitis, with Staphylococcus aureus being its main cause. However, it is possible that its prevalence may be overestimated. This study aimed to compare phenotypic and genotypic methods for S. aureus identification in samples of buffalo milk and milking environment as well as to propose a new quantitative real time PCR for its identification. For this, a total of 408 samples obtained from buffalo milk, milking environment and milkers hand, 32 presumed S. aureus strains were identified based on their characteristic phenotypic growth in Baird Parker agar, positive reactions of Gram and catalase, ability to coagulate rabbit plasma, and positive result in the species-specific Sa442 PCR assay. However, additional tests revealed that of these 32 strains, only 10 isolates tested positive for latex agglutination, including a S. chromogenes and a S. agentis. Analysis of MALDI-TOF MS revealed that eight of the 32 strains were S. aureus, 19 were S. chromogenes, three were S. agnetis and one was S. xylosus. All eight strains identified as S. aureus by MALDI-TOF analysis and confirmed by 16S rRNA sequencing were positive in S. aureus specific cydB gene PCR. In addition, a positive strain was found for the sea gene, nine for the cna gene, one for the sei gene, two for the sem, one for the seg gene, six for the seh gene, 15 for the eno 11 gene for the gene ebps two for the fib gene and 14 for the fnbA gene. Of the isolates, only one showed resistance to clindam... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Ureases (uréia amino-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas níquel-dependentes, que catalisam a hidrólise da uréia à amônia e dióxido de carbono. Elas são produzidas por fungos, bactérias e plantas, mas não por animais. A soja produz duas isoenzimas, a urease ubíqua, que é codificada pelo gene Eu4, presente em pequenas quantidades em todos os tecidos da planta, e a urease embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, que é sintetizada apenas no embrião em desenvolvimento. A urease ubíqua é responsável pela biodisponibilização de nitrogênio para planta, enquanto o papel da embrião-específica permanece desconhecido. Estudos prévios, sugerem que esta urease possa estar envolvida na defesa da planta.Como a urease ubíqua é encontrada em pequenas quantidades em todos tecidos da planta, tornando difícil sua obtenção, pouco é conhecido sobre esta enzima. No presente trabalho, estabeleceu-se um sistema de expressão e purificação parcial da urease ubíqua recombinante, expressa como uma proteína fusionada a uma cauda de glutationa-S-transferase (GST). O gene da urease foi amplificado por PCR e ligado em plasmídeo pGEX-4T-2 e expresso em Escherichia coli BL21 (DE3). A urease recombinante foi parcialmente purificada em resina de afinidade Glutationa Sepharose 4B, obtendo-se um rendimento de aproximadamente 2 mg/L de cultura. A proteína recombinante foi analisada para atividade enzimática e imunorreatividade para anticorpos contra urease de Canavalia ensiformis.O sucessodeste método de expressão da urease ubíqua da soja, permitirá a produção de quantidades suficientes desta proteína para estudos posteriores de caracterização. / Urease (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) is a nickel-dependent metalloenzyme, that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Ureases are produced by many organisms, including plants, fungi and bacteria. Soybean produces two isoenzymes, the ubiquitous urease, which is encoded by Eu4 gene and is present in small amounts in all plant tissues, and the embryo-specific urease, which is encoded by the Eu1 gene, and is synthesized only in the developing embryo. The ubiquitous urease is responsible for recycling metabolically derived urea while the role of the embryo-specific urease remains unkown. Previous studies had suggested that the embryo-specific urease could be involved in plant defense. Since the ubiquitous urease is found in low amounts in plant tissues making difficult to purify the enzyme, little is known about this protein.In the present work, a system for the expression and partial purification of soluble soybean ubiquitous urease was established expressing a protein fusioned with glutathione S- transferase (GST). The urease gene amplified by PCR was inserted into a pGEX-4T-2 GST fusion vector and then expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant urease was partially purified by a Glutathione Sepharose 4B affinity chromatography, yielding about 2 mg protein/L of culture broth. The recombinant protein was tested for enzymatic activity and imunoreactivity against anti Canavalia ensiformis antibodies. Successful expression of ubiquitous urease in E. coli provides a way to produce this protein in amounts enough for posterior studies and characterization.

Infecções por Chlamydia trachomatis estão entre as mais freqüentes doenças sexualmente transmissíveis (DST) em todo o mundo, apresentando grande importância epidemiológica. A identificação deste patógeno pode ser difícil e um método de detecção baseado na amplificação de ácidos nucleicos é altamente desejável, por sua acurácia e rapidez. O presente estudo avaliou a acurácia, sensibilidade e especificidade de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) in “house” em amostras de urina de homens com e sem sintomas de DST comparados a um teste comercial, o COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Suiça). Foram utilizados primers específicos para amplificar um segmento do plasmídio críptico de C. trachomatis gerando um fragmento de 201 pb, cuja seqüência foi confirmada por clivagem enzimática e seqüenciamento automático. A especificidade analítica dos primers foi confirmada frente ao DNA de diferentes microrganismos patogênicos e não patogênicos da microbiota urogenital masculina. A detecção limite do DNA clamidial pela PCR in house após hibridização (Southern blot), foi de 1 pg. O COBAS Amplicor CT/NG foi considerado o teste de referência por ser automatizado e conter um programa de controle interno da reação para identificar inibição da DNA polimerase. Entre as 37 amostras testadas positivas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 33 foram confirmadas positivas pela PCR in house. Foram detectados inibidores da reação nas 4 amostras que apresentaram resultados falso-negativos, utilizando-se a técnica de contaminação da reação com o DNA clamidial (spiked) e um controle interno da reação com primers que amplificam a β-globina do DNA humano. Após congelamento e descongelamento para eliminar prováveis substâncias inibidoras lábeis, as 4 amostras foram re-testadas, resultando na positividade de mais 2 amostras, completando 35 amostras positivas pela PCR in house. Entre as 74 amostras testadas negativas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 72 foram confirmadas negativas pela PCR in house. Das 2 amostras prováveis falso-positivas, apenas 1 permaneceu positiva, após re-teste. Dos 111 pacientes analisados, 108 apresentaram resultados idênticos nos dois testes, o equivalente a uma acurácia = 97,3%, sensibilidade = 94,6% e especificidade = 98,6%. A alta sensibilidade e especificidade apresentada pela PCR in house, demonstra a possibilidade de triar e diagnosticar C. trachomatis em urina de homens, importante reservatório da infecção clamidial para as mulheres. / Chlamydia trachomatis infections are among the most commum sexually transmitted diseases and of great epidemiological importance world-wide. Identification of this pathogen can be difficult, and it is highly desirable to have a rapid and accurate nucleic acid amplification based detection method. The present study was designe to evaluate the accuracy, sensitivity and specificity of a in house plasmid-based polymerase chain reaction (PCR) and hybridization on first void urine specimens from symptomatic and asymptomatic men, compared with a commercial test the PCR COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Switzerland), for detection of C. trachomatis (CT). Specific primers for the cryptic plasmid of C. trachomatis were designed to amplify a 201 bp fragment confirmed by enzymatic cleavage and automatic sequencing. The analytic specificity was determined by submitting to the intended protocol, the DNA of normal and pathogenic urogenital microbiota, the specific primers anneling was confirmed. The detection limit of the PCR and the Southern blot hibridization, was mesured in 1 pg of chlamydial DNA. The COBAS Amplicor CT/NG was considered the reference test, it contains a internal control (IC) programme to identify DNA polymerase inhibition. Among 37 positive specimens tested by COBAS Amplicor, 33 were confirmed positive by in house PCR and inhibitors of PCR were demonstrated in the 4 possibly false-negative samples performing DNA chlamydial spiking experiments and using a positive internal control of human β-globin DNA. The specimens were freezedthowed and re-tested to remove labile inhibitors, but 2 samples remained negative. Among 74 negative specimens by COBAS Amplicor, 72 were confirmed negative by in house PCR. The 2 problaby false-positive samples were re-tested and just one remained positive. The final results of the two tests were identical for 108 of the 111 pacients, accuracy = 97,3% ; sensitivity = 94,6% and specificity = 98,6%. This study shows that the in house plasmid-based PCR is fasible for detection of Chlamydia trachomatis in male urine specimens. This test presented high accuracy, sensitivity and specificity, offering great potencial for the screening of men, an important reservoir of infection chlamydial for women.

Introdução: A psoríase é uma doença inflamatória sistêmica crônica que afeta predominantemente a pele e as articulações. Sua etiologia é multifatorial e ainda não completamente entendida. A suscetibilidade genética à psoríase é um fator causal importante, e vários genes e polimorfismos têm sido associados à sua ocorrência. Poucos estudos avaliaram a influência dos polimorfismos C677T e A1298C do gene metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) na suscetibilidade à psoríase em diferentes populações (asiáticos e caucasides), e os resultados foram contraditórios. Material e métodos: Foram estudados 339 indivíduos caucasoides; desses, 142 eram pacientes com diagnóstico clínico de psoríase e 197 controles. Os grupos foram comparados quanto à freqüência dos polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR através de reação em cadeia da polimerase. Resultados: Para o polimorfismo C677T do gene MTHFR, a prevalência do genótipo mutante foi de 16,0% nos casos e 9,1% nos controles (p=0,103). Quando comparados os genótipos CC versus CT+TT, não houve diferença entre os grupos (p=0,605). A prevalência do genótipo CC para o polimorfismo A1298C foi de 2,8% nos casos e 4,1% nos controles (p=0,824). Quando comparados os genótipos AA versus AC + CC também não houve diferença significativa (p=0,943). A análise combinada dos genótipos foi similar entre os grupos. Conclusão: Nossos resultados não indicam qualquer associação entre os polimorfismos C677T e A1298C do gene MTHFR e suscetibilidade à psoríase nem demonstraram ação sinérgica da presença de ambos na redução de atividade da enzima MTHFR.

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No. of bitstreams: 1 marcelle_f_m_silva_ioc_bcm_mest_2009.pdf: 2789273 bytes, checksum: 9eec02b2cff5e8b7d0e13273295ee5ea (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Nas décadas de 80 e início de 90 os rotavírus A (RV-A) de genótipo G5, comum em suínos, equinos e bovinos eram detectados com frequência em amostras fecais de crianças brasileiras. Após 1996, deixou de circular em caráter endêmico, tornando-se apenas esporadicamente detectado, enquanto o genótipo G9 começou a ser detectado com frequência. Esta situação leva a crer que houve a substituição do genótipo G5 pelo G9. Tendo em vista a escassez de dados moleculares a respeito de amostras de genótipo G5 de RV-A, no presente estudo foi realizada a análise filogenética para os genes que codificam para as proteínas VP1, VP2, VP3, VP4, e VP7 de vinte e oito amostras de RV-A humano de genótipo G5P[8], coletadas em diferentes estados brasileiros entre 1986 e 2005. A análise filogenética do gene que codifica para a proteína VP7 demonstrou que as mesmas agrupam juntamente com amostras humanas brasileiras de genótipo G5 (IAL28, Br 1054 e Br H8), no entanto a análise do gene que codifica para a proteína VP4 demonstrou que circularam três linhagens do genótipo P[8] (P[8]-1, P[8]-2, e P[8]-3) no Brasil entre 1986 e 2005 em associação com G5. As análises filogenéticas para os genes que codificam para VP1, VP2, e VP3 demonstraram que os mesmos pertencem ao genogrupo Wa-Like, comum a humanos, o que sugere que estas amostras possam ter se originado de uma amostra de RV-A humano. As análises filogenéticas dos genes de VP1, VP2 e Vp3 revelaram que todas as amostras foram classificadas dentro dos genótipos R1, M1 e C1, respectivamente Os resultados do presente estudo enfatizam a importância do monitoramento contínuo e a caracterização molecular das amostras de RV-A circulantes, principalmente para prever a possível emergência e/ou re-emergência de genótipos após a introdução de uma vacina contra RV-A nos diferentes continentes do mundo e para se melhor entender a dinâmica e o padrão de evolução dos RV-A de genótipo G5. / The group A rotavirus (RV-A) genotype G5, which is common in pigs but also detected in horses and cattle was frequently detected in stool samples collected in the 1980s and the early 1990s in Brazil. After 1996, the G5 has disappeared as an endemic/epidemic strain, becoming only sporadically detected. On the other hand the RV-A G9 has showed a broad geographic distribution. Recently, the G5 was reported in children with severe diarrhea in Argentina, Brazil, Cameroon, Paraguay, People’s Republic of China, and Vietnam. It suggests that the G5, although uncommon overall in humans, is found worldwide. Twenty-eight G5P[8] human RV-A strains isolated from a 19-year long sample collection (from 1986 to 2005), representing four different Brazilian states, was analyzed, and the genetic variability for VP1, VP2, VP3, VP4 and VP7 genes was determined. The nucleotide sequencing and phylogenetic analyses were performed. Based on VP7 gene phylogenetic analysis, all the analyzed sequences were clustered with other Brazilian G5 strains. The VP4 genes analyzes showed that three P[8] genetic lineages (P[8]-1, P[8]-2 and P[8]-3) circulated in Brazil between 1986 and 2005 in association with genotype G5. The analyzed partial sequences of VP1, VP2 and VP3 showed high identity with RV-A Wa-like strains, which suggests that they might have originated from a human RV-A strain. The phylogenetic analysis revealed that all Brazilian strains were classified as genotype R1, M1 and C1 for VP1, VP2 and VP3 genes, respectively. Our results show that the inner RV-A genotype G5 proteins have been adapted in humans for at least 20 years, emphasizing the importance of continuous virological surveillance of circulating RV-A to detect new variants and possible antigenic changes with potential effect on vaccine effectiveness and contribute to a better understanding of the dynamics and pattern of RV-A G5 evolution.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-07-16T01:38:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 213690.pdf: 2374034 bytes, checksum: 27fc864377794570554f05971b87a912 (MD5) / Com o grande crescimento da malacocultura em Santa Catarina, tornou-se necessário verificar e assegurar a qualidade sanitária destes moluscos, como também da água onde os mesmos são cultivados. Devido à característica de alimentação filtrante, moluscos bivalves podem bioacumular vírus e outros patógenos presentes em águas contaminadas por efluentes. O vírus da Hepatite A (HAV) tem sido detectado em surtos relacionados ao consumo de água ou alimentos contaminados, em especial de moluscos bivalves. Os métodos moleculares como a reação em cadeia da polimerase, a hibridização molecular e o sequenciamento são hoje os métodos mais recomendados para avaliação da presença de vírus entéricos com genoma RNA em amostras ambientais. O objetivo deste trabalho foi padronizar métodos para a detecção do vírus da Hepatite A a partir de tecidos de ostras. Para isso foram avaliados três protocolos de recuperação das partículas virais a partir de tecido digestivo dissecado das ostras e dois métodos de extração e purificação do RNA viral. Os protocolos selecionados combinam a dissecação do trato gastrointestinal das ostras, a extração orgânica antes da precipitação das partículas virais com PEG, a extração de RNA com Trizol LS® com a RT-PCR seguida pela hibridização molecular utilizando uma sonda marcada com digoxigenina. A sensibilidade do método foi determinada pela inoculação do trato gastrointestinal de ostras com diluições crescentes de HAV (0,001 a 105FFU/mL), seja por inoculação direta ou por semeadura viral em aquários. A RT-PCR foi capaz de detectar 0,1FFU/ml, e a hibridização, até 0,001FFU/ml. O protocolo estabelecido foi utilizado para analisar a possível contaminação por HAV de amostras de ostras, coletadas em três fazendas de cultivo de Florianópolis. Por RT-PCR, os índices de contaminação foram 10,5%, 21,1% e 0% para os sítios 1, 2 e 3, respectivamente. Quando a hibridização molecular foi utilizada, a sensibilidade de detecção viral foi aprimorada, e passou para: 47,4%, 79,0% e 31,8%, respectivamente. Conforme demonstrado, a hibridização molecular mostrou-se 100 vezes mais sensível que a RT-PCR na detecção do HAV no trato gastrointestinal de ostras. Os dados aqui apresentados poderão ser úteis no estabelecimento de um programa de segurança alimentar, visando a comercialização de ostras com qualidade sanitária assegurada para o consumo.