Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Cuidados Intensivos e Paliativos / Made available in DSpace on 2013-03-04T20:46:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 310505.pdf: 690249 bytes, checksum: 2671d3e49c4edf50f868c96267bac241 (MD5) / Introdução: Infecção bacteriana é uma complicação frequente nos pacientes com cirrose hepática descompensada, proporcionando um impacto negativo durante o acompanhamento desses indivíduos. Objetivos: Avaliar a efetividade da proteína C reativa (PCR) e da procalcitonina (PCT) no diagnóstico de infecção e investigar a relação entre esses biomarcadores inflamatórios com a mortalidade após a admissão hospitalar. Método: Estudo prospectivo que incluiu pacientes com cirrose hepática descompensada que foram submetidos à investigação de infecção e realização de dosagens séricas de PCR e PCT na admissão hospitalar. Resultados: Um total de 64 pacientes e 81 internações hospitalares foram incluídas no estudo. A média de idade foi 54,31±11,87 anos com predomínio do sexo masculino (68,8%). Concentrações séricas da PCR e da PCT estavam significativamente mais elevadas nos pacientes infectados (PCR mediana: 81,55 vs. 6,78; p < 0,001 e PCT mediana: 2,50 vs. 0,19; p < 0,001). Áreas sob a curva ROC da PCR e da PCT para o diagnóstico de infecção foram, respectivamente 0,835 ± 0,052 e 0,86 ± 0,047. Pacientes que morreram até o 3º mês após a admissão hospitalar apresentaram medianas da PCR e da PCT mais elevadas do que os sobreviventes (PCR 7,04 vs. 41,05 p = 0,026 e PCT 0,16 vs. 0,94 p = 0,001). Conclusão: PCR e PCT foram confiáveis marcadores de infecção bacteriana nos pacientes com cirrose hepática descompensada. Valores mais elevados de medianas da PCR e PCT foram encontrados nos pacientes que morreram, embora não houve associação entre infecção na admissão hospitalar e mortalidade no acompanhamento de sete dias e três meses.

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-16. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:30Z : No. of bitstreams: 1 000849239.pdf: 306516 bytes, checksum: cab162ea96c4456d9e47531798b2c3eb (MD5) / Leishmaniasis is a major public health problem in the world. The protozoa of the genus Leishmania has worldwide distribution and epidemiology of the disease depends on the characteristics of the parasites. Leishmaniasis are divided into visceral leishmaniasis and cutaneous. The dog plays a key role in the transmission of L. infantum to humans and in the epidemiology of the disease. Due to the adaptation of Leishmania to new hosts or vectors is important to know the current etiologic agent in dogs. Molecular techniques have been used for the diagnosis of leishmaniosis. The PCR-RFLP detects and distinguishes the different species of the parasite. The objective of this study was to identify the Leishmania species found in 103 samples of peripheral blood of dogs naturally infected with this protozoan, the city of Bauru - SP. For the diagnosis of leishmaniosis was determined by parasitological examination, indirect ELISA and PCR was performed. The determination of Leishmania species the DNA amplified intergenic region ITS1 was digested with the restriction enzyme HaeIII. Positive samples for Leishmania ssp. showed an identical restriction profile of L. amazonensis in 77/103 samples, 17/103 were similar to L. infantum, and 09/103 were mixed profile. In conclusion, we identified L. amazonensis greater number of dogs than L.infantum in Bauru city, SP

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-20Bitstream added on 2014-06-13T18:29:20Z : No. of bitstreams: 1 silva_jr_me_botib.pdf: 572070 bytes, checksum: 91e0d84d7ce9e5bd73020942f3c5e9df (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Grande parte do genoma dos eucariotos é composta de múltiplas cópias de DNA, conhecidas como DNAs repetitivos, cuja função em relação à manutenção, estrutura e funcionamento do genoma ainda precisa ser melhor investigada. Os DNAs repetitivos classificados como elementos transponíveis vêm sendo considerados como um dos principais representantes do genoma de vertebrados e, de maneira particular, os peixes têm chamado atenção em relação à grande diversidade de classes destes elementos encontradas em seus genomas. Visando ampliar os dados acerca de elementos transponíveis em peixes, o presente trabalho teve como objetivos o isolamento e a caracterização de retrotransposons da família Rex em duas espécies de Characidae - Brycon amazonicus e B. orbignyanus - e realizar inferências acerca de sua organização e dinâmica evolutiva. Desta forma, amostras de DNA foram utilizadas em PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar segmentos dos retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6 e os fragmentos obtidos foram clonados e sequenciados. Adicionalmente, estes segmentos de DNA foram utilizados como sondas em experimentos de hibridação in situ visando identificar a localização cromossômica destes retrotransposons. A identificação de elementos Rex em B. cephalus e B. orbignyanus demonstrou a presença destes retrotransposons não-LTR (Long Terminal Repetition) em um maior número de espécies de Characiformes e, especificamente, no grupo Characidae. Os segmentos analisados de Rex1 e Rex3 correspondem aos domínios codificantes 3-7 e 1, 2, 2A, A e B do gene da transcriptase reversa (RT), respectivamente. O fragmento de DNA relativo ao retroelemento Rex6 isolado codifica a porção C-terminal de uma endonuclease. Comparações entre sequências nucleotídicas de diferentes espécies de peixes... / A huge part of the eukaryote genome is constituted by multiple DNA copies, known as repetitive DNAs, which role regarding to the maintenance, structure, and function of the genome needs to be better understandable. The repetitive DNAs that are classified as transposable elements have been considered one of the main parts of the vertebrate genome and, particularly, fishes have gain attention due to the presence of many different classes of these elements in their genomes. In order to improve data on fish transposable elements, the present work intent to isolate and characterize retrotransposons of the Rex family in two Characidae species - Brycon amazonicus and B. orbignyanus - and infer on the organization and evolutionary dynamics of these elements. Therefore, DNA samples were used on PCR (Polymerase Chain Reaction) in order to amplify segments of the Rex1, Rex3, and Rex6 elements, and the obtained fragments were cloned and sequenced. Additionally, these DNA segments were used as probes throughout in situ hybridization procedures to identify the chromosome localization of these retrotransposons. The identification of Rex elements in B. cephalus e B. orbignyanus evidenced the presence of these non-LTR (Long Terminal Repetition) retrotransposons in a large number of Characiformes species and, specifically, in Characidae. The analyzed fragments of Rex1 and Rex3 correspond to the coding domains 3-7 and 1, 2, 2A, A and B of the reverse transcriptase (RT) gene, respectively. The DNA segment correlated to the Rex6 element codifies a C-terminal portion of an endonuclease. Nucleotide sequence comparisons among different fish species showed that these regions are highly conserved in diverse groups. Although the obtained data for B. amazonicus seemed to point to a higher similarity between Rex1 and Rex3 of... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-27Bitstream added on 2014-06-13T19:54:03Z : No. of bitstreams: 1 sousa_mc_me_jabo.pdf: 1262141 bytes, checksum: 754a27f31e87b5e771e534235e7eb0a7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A severidade dos sintomas provocados pelo Huanglongbing (HLB) ou Greening, a rápida progressão na incidência de plantas afetadas nos pomares e o fato de esta doença afetar indistintamente todas as variedades comerciais de citros, contribuíram para este estudo que visou conhecer o padrão de colonização da bactéria Candidatus Liberibacter americanus (Lam) e Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) em plantas cítricas. O PCR convencional é o teste atualmente utilizado na diagnose. Apesar de ser uma técnica reconhecidamente sensível, para o caso do HLB tem sido apenas confirmatório, ou seja, somente permite detecção da presença da bactéria em amostras de folhas sintomáticas. Surgiram aprimoramentos da técnica de PCR, como é o caso do Nested PCR e o PCR quantitativo (qPCR), demonstrado neste trabalho ser o método empregado mais sensível que o PCR convencional. Assim, através deste estudo pode-se concluir que Las e Lam se concentraram prioritariamente nas partes com sintomas de HLB das plantas de campo, naturalmente inoculadas e infectadas por liberibacter, se diferenciando na média do número estimado de cópias de liberibacter por grama de folha de plantas afetadas, sendo Las com 5,63 contra 5,01 em plantas afetadas por Lam (título bacteriano). A proporção de amostras positivas para Lam foram de 21 (19%) contra 12 (11,2%) amostras positivas para Las. A maior parte das amostras foi negativa para ambas as liberibacters (96 – Las e 90 – Lam). O pequeno acréscimo nos resultados positivos obtido pelo método de qPCR, aliado ao seu alto custo, não justifica a substituição do PCR convencional por este método na diagnose laboratorial do HLB, ficando restrito somente a pesquisa / The degree of severity of the symptoms developed by Huanglongbing (HLB) or Greening, the fast incidence of diseased plants at different orchards and the fact that this phytopathogen affects various commercial citrus varieties have contributed to the proposition of the present work, that aimed to know the colonization pattern developed by the bacteria Candidatus Liberibacter americanus (LAM) and Candidatus Liberibacter asiaticus (LAS) on citrus plants. The conventional PCR is the current used assay to detect HLB. Besides being a sensitive and specific technique it is currently seen and a molecular technique that confirms the already symptomatic leaves of diseased plants. Improvements of the PCR technique named the Nested PCR and the quantitative PCR is described in this work as the most sensitive to detect the phytopathogen prior to the development of the symptoms disease. So, based on the results obtained in this work it was possible to conclude that LAS and LAM concentrate showed a tendency to appear mostly on parts of the plants exhibiting symptoms and that are already infected by these bacteria, showing difference when mean number of copies of liberibacter per g of leaf of infected plants, with LAS value of 5.63 as compared to 5.01 for LAM on plants with LAM detectable symptoms (high bacterial titer). The ratio of LAM positive samples was 21 (19%) against 12 (11.2%) positive for LAS. The majority of the samples were detected as negative for both bacteria (96% for LAS and 90% for LAM). The small increase on the positive results obtained when qPCR was used and considering its present high analysis cost, this type of PCR is not seen as adequate to diagnose LAM or LAS

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-13Bitstream added on 2014-06-13T20:14:44Z : No. of bitstreams: 1 morales_amr_me_jabo.pdf: 2247542 bytes, checksum: 86246681e04ea55e109f11ef3ef48d68 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Este trabalho teve como objetivo analisar a expressão de genes de soja envolvidos na resistência ao nematóide de galhas, Meloidogyne javanica, utilizando a técnica de PCR em tempo real (RT-PCR). Foram avaliadas raízes de soja inoculadas e não inoculadas com o nematóide. Linhagens de soja resistentes (genótipo PI595099) e suscetíveis (cultivar BRS133) e indivíduos resultantes deste cruzamento foram inoculados com juvenis do nematóide. Raízes foram coletadas após um, três e seis dias de inoculação. O RNA total foi extraído e em seguida foi feita a síntese de cDNA, para ser utilizado nas reações de PCR em tempo real. As reações para quantificação do nível de expressão relativa foram preparadas em triplicatas, e um controle endógeno, o gene RNAr 18S também foi incluído. Os resultados mostraram que comparando os indivíduos resistentes com os suscetíveis, os resistentes apresentaram maior expressão dos genes, Chs, Xet, Hs1pro-1, Sth-2. / This work objective was to analyze the expression of soybean genes involved in the resistance to the root nematode, Meloidogyne javanica, using the Real Time PCR (RT-PCR) technique. Soybean roots inoculated and not inoculated with the nematode were evaluated. Resistant soybean lineages (genotype PI595099) and susceptible lineages (cultivate BRS133) and resulting individuals of this crossing were inoculated with juvenile of the nematode. Roots were collected after one, three and six days after inoculation. The Total RNA was extracted and, afterwards cDNA synthesis was made, to be used in the reactions of Real Time PCR. The reactions for quantification relative expression level were prepared in triplicate, and an endogenous control, gene rRNA 18S, was also included. The results showed that comparing the resistant individuals with the susceptible ones, resistants showed higher expression level of the genes, Chs, Xet, Hs1pro-1, Sth-2.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-05Bitstream added on 2014-06-13T19:43:38Z : No. of bitstreams: 1 troncarelli_mz_dr_botfmvz.pdf: 4588450 bytes, checksum: a779f6cb9a1e51d0648806d5715dc5d8 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Com o objetivo de normatizar a cadeia produtiva visando à melhoria da qualidade do leite no Brasil, o MAPA delineou a IN n° 51, em vigor desde julho de 2005. Em linha com estes parâmetros, objetivou-se, no presente estudo, padronizar o método de mPCR para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli em amostras de leite bovino obtidas de tanques de expansão, e avaliar esta técnica como possível recurso diagnóstico a ser empregado em programas de controle de qualidade do leite oferecido para consumo. Foram visitadas 20 propriedades leiteiras do Estado de São Paulo, com sistema de ordenha mecânica e tanque de expansão próprio, nas quais foram colhidas amostras de leite para a realização da mPCR, cultivo microbiológico, CCS e CBT. S. aureus, S. agalactiae e E. coli foram isolados, em 30%; 10% e 40% das amostras de leite dos tanques de expansão, respectivamente, e detectados pela mPCR em 0; 10% e 35%, respectivamente. A mPCR apresentou acurácia de 78,3%; sensibilidade de 37,5% e especificidade de 93,2% e limiar de detecção de 100 picogramas. A CCS apresentou mediana de 395.000 células/mL, e 55% das amostras avaliadas resultou em valores de CBT satisfatórios para mesófilos. O índice de mastite subclínica nos rebanhos avaliados pelo CMT foi de 28,3%. Conclui-se que a mPCR para a detecção de S. aureus, S. agalactiae e E. coli foi padronizada com êxito no presente estudo, e pode ser indicada como método complementar aos utilizados na rotina diagnóstica de mastite bovina e qualidade do leite / Brazilian Ministry of Agriculture and Supply, objecting the improvement of milk quality in Brazil, published the Normative Instruction n. 51, a technical group of rules for milk business that has been attended since July 2005. In line with these parameters, the aim of the present study was to standardize the mPCR test for S. aureus, S. agalactiae and E. coli detection in bovine milk samples obtained from bulk tanks, in order to evaluate this method as a possible tool to be used in milk quality control programs. Twenty milk farms with milking machine system and individual bulk tank, of different regions of Sao Paulo state were sampled. Bulk milk samples were collected for mPCR, microbiological culture, Somatic Cell Count and Total Bacterial Count. S. aureus, S. agalactiae e E. coli were isolated in 30%; 10% and 40% samples, respectively, and detected by mPCR in 0; 10% and 35% samples, respectively. mPCR presented 78,3% accuracy; 37,5% sensitivity and 93,2% specitivity and detection lower of 100pg for each pathogen. CCCs presented medium of 395.000 cells/mL and 55% of evaluated samples resulted in TBC satisfactory values for mesophilus. Subclinical mastitis index in evaluated cattle, by CMT, was 28,3%. In conclusion, mPCR for S. aureus, S. agalactiae and E. coli detection was successfully standardized in the present study and can be indicated as a complementary diagnosis to the routine methods for bovine mastitis and milk quality’s monitoring

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-06Bitstream added on 2014-06-13T19:43:39Z : No. of bitstreams: 1 faccioli_py_dr_botfmvz.pdf: 1990690 bytes, checksum: 7e2419e37a55f0133432db74f5707b3e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O leite é de extrema importância na alimentação humana. A exigência quanto à sua qualidade tem aumentado, inclusive com relação à transmissão de patógenos. Staphylococcus aureus é um dos principais agentes da mastite bovina e tem grande importância em saúde pública por produzir enterotoxinas. Os objetivos do trabalho foram avaliar o perfil dos produtores da região considerando-se a atual legislação e a qualidade do leite produzido com ênfase na presença de Staphylococcus enterotoxigênicos, utilizando a PCR na detecção de S. aureus e dos genes codificadores das enterotoxinas sea, seb, sec e sed diretamente do leite de tanque em comparação ao exame microbiológico tradicional, e realizando a detecção das respectivas enterotoxinas pelo método de aglutinação passiva reversa em látex (RPLA) diretamente do leite, comparando com os resultados genotípicos. Utilizaram-se 104 amostras de leite de tanque, estudadas a fresco e após incubação por 5 horas, uma alíquota a 7°C e outra a 25°C concomitantemente. A PCR foi altamente sensível, detectando S. aureus em 99% das amostras, mas com moderada concordância com o microbiológico nas amostras positivas. As amostras de Staphylococcus enterotoxigênicos apresentaram predomínio do gene sec (58,65%), seguido pelo gene sea (43,27%), seb (23,27%) e sed (1,28). Quanto às enterotoxinas, houve a sua detecção em 9% das amostras em quantidades que variaram de 1 a 5 ng/μL. Verifica-se a importância do estudo do potencial do leite como fonte de S. aureus enterotoxigênico e de suas enterotoxinas, fornecendo risco para a saúde pública caso o leite não seja refrigerado adequadamente / Milk has extreme importance to human feed. The demand for quality milk has increased, including pathogens transmission. Staphylococcus aureus is one of the main agents of mastitis and has importance in public health for producing enterotoxins. The study aims were to evaluate the region producer’s profile, considering the present legislation and the quality of milk produced with emphasis in enterotoxigenic Staphylococcus presence, using PCR in detection of S. aureus and enterotoxins encoding genes sea, seb, sec and sed directly from bulk tank milk in comparison with traditional microbiological test, and carring out the detection of respective enterotoxins by reverse passive latex agglutination method (RPLA) directly from milk comparing with genotypic results. A total of 104 samples of bulk tank milk were used, studied fresh and after 5-hour storage, one bracket at 7°C the another at 25°C concurrently. PCR was highly sensitive, detecting S. aureus in 99% of samples, but with moderate concordance with microbiological test in positive samples. The samples of enterotoxigenic Staphylococcus presented predomination of sec (58.65%), followed by sea (43.27%), seb (23.27%) and sed (1.28%) genes. As the enterotoxins, its detection occurred in 9% of samples in quantities that ranged from 1 to 5 ng/μL. The importance of the study of milk potential as enterotoxigenic S. aureus and enterotoxins source is verified, providing risk to public health if milk is not refrigerated properly

Orientadora : Profa. Dra. Vanete Thomaz Soccol / Coorientador : Prof. Dr. Marcelo Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 22/10/2010 / Inclui referências : f.76-84 / Área de concentração: Saúde humana e animal / Resumo: O crescente aumento das culturas de sementes transgênicas e do comercio de produtos que contenham derivados dos mesmos foi constatado ao longo dos anos. Este fator levou a consolidação das indústrias de produtoras de sementes geneticamente modificadas no mundo. Atualmente, observa-se uma manifestação de interesses antagônicos envolvendo a comercialização destes produtos em relação aos produtos sem traços de transgenia. A dicotomia entre o risco avaliado e a percepção dos riscos dos transgênicos define o seu nível de aceitação entre as diferentes sociedades globais. Uma planta geneticamente modificada (PGM) é um organismo vivo que possui suas características genéticas alteradas de maneira não natural, ou seja, cuja composição gênica foi alterada por meio de processo de engenharia genética. Este é conhecido como um evento de transformação e tem sido amplamente aplicado às commodities agrícolas. Assim, a soja Roundup Ready ™ (RR™), evento GTS 40-3-2, tornou-se a cultura predominante de sementes transgênicas no mundo. Esta variedade foi desenvolvida para conferir à soja tolerância ao herbicida a base do princípio ativo glifosato, da marca comercial Roundup Ready™, desenvolvido e patenteado pela Monsanto Company. Questões relativas à detecção e a rastreabilidade dos OGMs auferiram um grande interesse mundial, devido à difusão global crescente e por suas implicações sócio-econômicas e na saúde da população. Além disso, com a utilização excessiva de transgênicos na produção de alimentos, foram estabelecidos regulamentos de rotulagem, produção, comercialização e destinação em diversos países para proteger os direitos dos consumidores e produtores. Além da busca pela regulamentação, as questões de interesse do consumidor resultaram no desenvolvimento de diferentes métodos para detectar e?ou quantificar alimentos derivados de culturas geneticamente modificadas e de suas matérias-primas. O presente trabalho pretendeu estabelecer uma metodologia que poderia ser aplicada como padrão qualitativo às sementes e grãos de soja comercializados no Brasil, em acordo com a normatização do País e com as comunidades estrangeiras. Foram utilizados dois métodos de extração para identificar as melhores qualidades de DNA extraídos de grãos e sementes de soja. O método de Brometo de Hexadecil Trimetil Amônio (CTAB) demonstrou os melhores resultados na extração do DNA genômico das amostras. A técnica de PCR padronizada para verificação de pureza varietal foi capaz de detectar a presença de quantidades conhecidas de soja RR™ em misturas intencionais de sementes OGMs em quantidades conhecidas de sementes convencionais. A sensibilidade da metodologia mostra que o método é confiável e facilmente reprodutível desde que os padrões pré-estabelecidos sejam seguidos. Baseado neste estudo, o método poderá ser ajustado para a identificação de OGMs em outras matérias-primas alimentícias e, também, para alimentos processados. Palavras-chave: Soja Roundup Ready™. Reação de Polimerização em Cadeia. Certificação e Detecção de Sementes e Grãos Geneticamente Modificados. / Abstract: The strong increase in genetic modified seed production verified over the years led to a consolidation of the transgenic seed industries worldwide. Currently, expressive antagonic issues have risen regarding the trade of these products in relation to the products without any transgenic trace. The dichotomy between the evaluated risk and the perceived risk of transgenic use has defined their level of acceptability among the different global societies. A Genetically Modified Plant (PMO) is a living organism whose genetic composition has been altered by means of genetics technology. This process is referred to as the transformation event and has been widely applied to agricultural commodities. Thus, the Roundup Ready™ (RR™), soy event GTS 40-3-2, developed by Monsanto Company has become the most prevalent transgenic crop in the world. This variety was developed to confer inplant tolerance to gliphosate-based agricultural herbicide Roundup Ready™. With the widespread use of GMOs in food production, labeling regulations have been established in some countries to protect the right of consumers and producers. Further than regulatory demand, consumer concern issues have resulted in the development of several methods to detect and quantify foods derived from genetically engineered crops and their raw materials. Polymerase Chain Reaction has proved to be the method of choice to detect the presence or absence of the introduced genes of GMOs at the DNA level. In this study, it was utilized two methods of DNA extraction for identifying the best quality of DNA of the samples. The Cetyl Trimethylammonium Bromide (CTAB) has showed to be the best method for the DNA extraction of the samples. The present paper aimed to verify if the PCR technique can detect RR™ soybean seeds among conventional seeds. The results showed that this method could be applied with high sensibility in order to certificate conventional soybean seeds. Keys words: Roundup Ready™ soybean. Polymerase Chain Reaction. Certification. Certification and Detection of Genetically Modified Seeds and Grains.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2002-09Bitstream added on 2014-06-13T19:24:08Z : No. of bitstreams: 1 vechiato_mh_dr_botfca.pdf: 1951086 bytes, checksum: 3601f634d2920c34d704cb5312055b13 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho teve como objetivos a) desenvolver um método eficiente, rápido e de fácil aplicação na detecção e na identificação de Diaporthe phaseolorum var. meridionalis (Dphm), em sementes de soja utilizando-se a técnica de reação de polimerase em cadeia (PCR); b) comparar PCR com os métodos rotineiros de patologia de sementes. Os resultados sugerem que pode haver uma identificação equivocada, quando se utiliza este parâmetro na diferenciação do agente causal do cancro da haste da soja, com outras espécies de Diaporthe presentes em sementes; b) pela coloração das colônias nos meios de cultura BDA e Czapeck, os isolados de Dphm e Dph foram agrupados em 9 classes. Em meio Czapeck, todas as colônias identificadas como Dphm, foram agrupadas nas classes 8 e 9, apresentando um padrão micelial lanoso (tipo feltro), exceto o isolado 46; c) pelo crescimento micelial não foi possível distinguir Dphm de Dph. Comparando-se os métodos do papel de filtro modificado com 2,4D, plaqueamento em BDA e sementes em papel de filtro com 2,4D, associado a PCR, para detecção e identificação de Dphm, visando distinguí-lo de outras espécies presentes nas sementes, conclui-se que o método mais confiável foi o de incubação das sementes em papel de filtro com 2,4D associado a PCR. Em relação ao melhor método de extração de DNA, em sementes colonizadas por Dph., foi o da lavagem das sementes com STE e purificação do DNA com a resina de sílica gel da Wizard (Promega). / The objective of this research was to develop, an easy, quick and efficient method for detection and identification of Diaporthe phaseolorum var. meridionalis (Dphm), in soybean seeds, using the polimerase chain reaction (PCR) technique and methods routinely used in seed pathology. The results suggest that there can be a mistake when using this parameter to distinguish the causal agent of the stem canker from other species of Diaporthe; b)color of the colonies in PDA and Czapeck medium, Dphm and the of Diaporthe spp. (Dph) isolates were grouped in 9 classes. In Czapeck medium, all isolates identified as Dphm, were grouped in classes 8 and 9, showing wooled micelial pattern (like felt), except isolate 46; c) basead on the micelial growth it was not possible to distinguish Dphm from Dph. For detection and identification of Dphm of other Dph species in the seeds, the most reliable method was the modified blotter test with 2,4D associated with PCR. In Dph colonized seeds, the best method of DNA extraction was seed washing with STE and DNA purification using Wizard (Promega) silica gel resin.

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:24:11Z : No. of bitstreams: 1 000836316.pdf: 1042031 bytes, checksum: 4a8a8f1f380a58dcfe20921854b03eae (MD5) / Leishmaniose visceral é uma doença grave que tem no cão seu principal reservatório doméstico. Algumas lacunas no conhecimento dificultam ainda mais o controle da doença. Com relação ao reservatório canino, a possibilidade de se estabelecer indicadores de infectividade ao vetor, como a carga parasitária, poderia resultar em melhor caracterização de seu papel como fonte de infecção na cadeia epidemiológica. Foram realizados xenodiagnósticos em cães acometidos de leishmaniose visceral, com subsequente avaliação da carga parasitária no hospedeiro e no vetor, utilizando-se flebotomíneos da área urbana de Araçatuba,SP. Após cinco dias do repasto, as fêmeas foram dissecadas e submetidas à avaliação parasitológica por meio da demonstração direta do parasito (DDP) e da contagem em câmara de Neubauer (NC). Fragmento de DNA de cinetoplasto (kDNA) de Leishmania spp. foi amplificado por meio da PCR convencional e em tempo real (qPCR), para quantificação da carga parasitária. Os cães foram avaliados para a presença de sinais clínicos e amostras de sangue, swab conjuntival e de pele foram colhidas e processadas por PCR e qPCR. Os resultados dos métodos diagnósticos utilizados foram correlacionados em modelo de regressão linear e a positividade de felbotomíneos foi corrigida pela positividade natural. Tanto a PCR convencional quanto a qPCR mostraram-se adequadas para a avaliação da infectividade canina. Houve correlação entre a carga de parasitos presentes na pele e no swab conjuntival do cão bem como com a cargas de parasitos dos flebotomíneos. Alguns sinais clínicos dos cães, pela análise de componentes principais (PCA), estiveram relacionados com a maior taxa de infecção dos vetores. / Visceral leishmaniasis is a severe disease that has the dog as its main domestic reservoir. Gaps in the knowledge difficult even more the control of this disease. Regarding the canine reservoir, the possibility of establishing infectivity indicators, like the dogs parasite load, could result in better characterization of its role as source of infection in the transmission chain. Xenodiagnosis in dogs with visceral leishmaniasis were performed with subsequent parasite load evaluation of the host and the vectors, using sandflies captured in the urban area of Araçatuba,SP. After five days, the female sand flies were dissected, subjected to parasitological evaluation by the direct demonstration of the parasite (DDP) and by counting in a Neubauer chamber (NC). A kinetoplast DNA fragment of Leishmania spp. was amplified by conventional PCR and by qPCR to check the presence and quantification of Leishmania kDNA. Dogs were assessed for clinical signs and blood, skin and conjunctival swab samples were taken and tested for parasite load. The diagnostic methods tested (NC, PCR and qPCR) were correlated by linear regression and positivity results were corrected by the natural infection rate. Conventional PCR and qPCR proved to be appropriate for evaluating canine infectivity. There was a correlation between the parasite load present in the dog' skin and the conjunctive swab, as well as with the sandflies parasite loads. Principal component analysis revealed that some of the clinical signs shown by the dogs were related to a highest sandfly infection rate.