Os neutrófilos representam a primeira linha de defesa do hospedeiro, atuando na contenção e eliminação de patógenos. Contudo, alterações na vida média, no excessivo recrutamento e ativação dos neutrófilos estão associados a danos teciduais e a doenças inflamatórias e autoimunes. A modulação das funções efetoras dos neutrófilos pode auxiliar no tratamento de tais patologias. Neste sentido, os produtos naturais constituem uma importante fonte de novas substâncias imunomoduladoras. Um estudo recente demonstrou que, a inibição do metabolismo oxidativo de neutrófilos pelo extrato etanólico bruto das folhas de Baccharis dracunculifolia (EEBBd) correlaciona-se com a proporção entre ácido cafeico (CaA) e outros compostos fenólicos contidos nesta amostra. Para dar prosseguimento à investigação do potencial imunomodulador do EEBBd e do CaA, os objetivos do presente estudo foram avaliar o efeito modulador desses produtos naturais: (i) em três funções efetoras de neutrófilos humanos - fagocitose, atividade microbicida e metabolismo oxidativo estimulado por agentes independentes de receptores (forbol-12-miristato-13-acetato; PMA) e dependentes apenas de receptores Fcgama (imunocomplexos não-opsonizados; IC) ou de receptores Fcgama associados a receptores do complemento (imunocomplexos opsonizados com complemento; IC-SHN); (ii) na atividade da mieloperoxidase (MPO); (iii) na expressão de receptores de membrana; (iv) e na captura (scavenger) de H2O2 e HOCl. O CaA foi mais efetivo do que o EEBBd em inibir a atividade da MPO e em capturar H2O2 e HOCl. A análise in silico revelou que o CaA bloqueia a entrada do sítio ativo da MPO através da interação com os resíduos Gln-91, His-95 e Arg-239; os dois últimos resíduos são essenciais para clivar o H2O2 e para estabilizar o sítio ativo, respectivamente. A eficiência dos agentes utilizados para estimular o metabolismo oxidativo, medido por quimioluminescência dependente de lucigenina e de luminol, ocorreu na seguinte ordem: PMA > IC-SHN > IC. Embora o PMA tenha sido o agente mais efetivo em estimular o metabolismo oxidativo, ambas as amostras (EEBBd e CaA) inibiram com maior intensidade esta função celular estimulada por PMA do que a mesma função estimulada por IC-SHN e IC. Além disso, ambas, EEBBd e CaA, não alteraram os níveis de expressão dos receptores TLR2, TLR4, CD16, CD32, e CD11b/CD18. Nas maiores concentrações avaliadas, EEBBd (50 ug/mL) e CaA (90 ug/mL) não foram citotóxicos para os neutrófilos. O EEBBd inibiu intensamente a capacidade fagocítica e reduziu discretamente a capacidade microbicida dos neutrófilos frente à Candida albicans. Portanto, o CaA contribui para ação inibitória do EEBBd no metabolismo oxidativo e na atividade da MPO, mas não na capacidade fagocítica e microbicida de neutrófilos. Por fim, o efeito imunomodulador do CaA e do EEBBd não é mediado por alterações na viabilidade celular ou na expressão de receptores de membrana em neutrófilos. O conjunto de resultados obtidos pode auxiliar na elucidação do mecanismo de ação destes produtos naturais sobre as funções efetoras de neutrófilos, bem como no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de doenças inflamatórias mediadas pela ativação exacerbada de neutrófilos. / Neutrophils represent the first line of host defense that acts in the containment and clearance of pathogens. However, changes in life span and excessive recruitment and activation of neutrophils are associated with tissue damage and inflammatory and autoimmune diseases. Modulation of the effector functions of neutrophils can help to treat these pathologies. In this sense, natural products constitute an important source of novel immunomodulating compounds. A recent study has demonstrated that the neutrophil oxidative metabolism inhibition by the crude ethanol extract of Baccharis dracunculifolia (EEBBd) leaves correlates with the ratio of caffeic acid (CaA) to other phenolic compounds that exist in it. To continue investigating the immunomodulating potential of EEBBd and CaA, the present study aimed to examine whether these natural products modulate: (i) three effector functions of human neutrophils phagocytosis, microbial killing, and oxidative metabolism elicited by a receptor-independent stimulus (phorbol-12-myristate-13-acetate; PMA) and by receptor-dependent stimuli that bind Fcgama receptors alone (non-opsonized immune complexes; IC) or in combination with complement receptors (complement-opsonized immune complexes; IC-SHN); (ii) myeloperoxidase (MPO) activity; (iii) expression of membrane receptors; (iv) H2O2 e HOCl scavenging. CaA was more effective than EEBBd in inhibiting MPO activity and scavenging H2O2 and HOCl. The in silico analysis revealed that CaA blocks the entrance of the active site of MPO through the interaction with Gln-91, His-95, and Arg-239; the two last residues are essential to cleave H2O2 and stabilize the active site, respectively. The agents used to stimulate the oxidative metabolism, as measured by the lucigenin- and luminol-dependent chemiluminescence assays, acted in the following ranking order of efficiency: PMA > IC-SHN > IC. Although PMA was the most efficient agent at stimulating the neutrophil oxidative metabolism, both samples (EEBBd and CaA) suppressed the PMA-induced oxidative metabolism more effectively than they suppressed the same cell function elicited by IC-SHN and IC. Both EEBBd and CaA did not alter the levels of TLR2, TLR4, CD16, CD32, and CD11b/CD18 receptors expression. At the highest concentrations tested, EEBBd (50 ug/mL) and CaA (90 ug/mL) were not toxic towards neutrophils. EEBBd strongly diminished the phagocytic capacity and slightly reduced the Candida albicans killing ability of neutrophils. In conclusion, CaA contributes to the EEBBd inhibitory action on the oxidative metabolism and MPO activity but not on the phagocytic capacity and microbial killing ability of neutrophils. Furthermore, the immunomodulating effect of CaA and EEBBd is not mediated by alterations in either cell viability or expression of membrane receptors in neutrophils. Together, the results can help to unravel the mechanism of action of these natural products on the effector functions of neutrophils, and to develop new drugs to treat inflammatory diseases mediated by neutrophil overactivation.

Causada por protozoários do gênero Leishmania, a leishmaniose é uma doença infecciosa que afeta milhões de pessoas em todos os continentes. São grandes os desafios no tratamento da leishmaniose porque os fármacos atualmente disponíveis apresentam alta toxicidade, efeitos colaterais, alto custo e resistência parasitária. Sendo assim, faz-se necessário o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da doença de maneira mais eficiente. A investigação de novas alternativas terapêuticas, novos alvos bioquímicos, em particular a arginase em de Leishmania (L) amazonensis, é considerada um alvo interessante na busca de novos compostos leishmanicidas. A via bioquímica em que está envolvida a arginase é fundamental para a manutenção do ciclo de vida do parasito, sendo responsável pela hidrólise de L-arginina em L-ornitina em mamíferos. Muitos compostos oriundos de produtos naturais tem sido relatados como inibidores da arginase de L. (L.) amazonensis e a presença de grupos hidroxila em suas estruturas mostraram ser importantes na atividade inibidora da enzima. O objetivo desse trabaho estudar a interação bioquímica entre a enzima arginase de L. (L.) amazonensis, extratos vegetais, flavonoides e derivados do ácido cafeico. O extrato acetônico de folhas de Qualea grandiflora apresentou maior capacidade inibitória da arginase (IC50 = 1,7 ± 01 µg/mL) dentre os extratos analisados. Dentre os flavonoides, o composto mais potente foi a taxifolina (IC50 = 1,7 ± 0,2 µM). O verbascosídeo foi o derivado do ácido cafeico com maior potencial de inibição da arginase (IC50 = 0,5 ± 0,2 µM). As estruturas desses compostos podem servir como referência no desenvolvimento de novas drogas para o controle da leishmaniose, que tenham como alvo a arginase. / Caused by protozoa of the genus Leishmania, leishmaniosis is an infectious disease that affects millions of people on all continents. The currently available drugs are highly toxic, expensive, have side effects and parasitic resistance and for these reasons there is a need of developing new drugs to more effective treatment of the disease. The research of new therapeutic alternatives, new biochemical targets, in particular the arginase of Leishmania (Leishmania) amazonensis is considered an interesting target in the search for new compounds leishmanicidal. The biochemistry of arginase pathway is essential for the survival of the parasite, is also responsible for hydrolysis of L- arginine to L- ornithine in mammals. Many compounds from natural products has been reported as inhibitors of arginase L. (L.) amazonensis, and the presence of hydroxyl groups in their structures shown to be important for inhibitory activity of the enzyme. This work studies the biochemical interaction between the arginase enzyme, plant extracts, flavonoids and derivatives of caffeic acid. The acetone extract of Qualea grandiflora leaves showed higher inhibitory capacity of arginase (IC50 = 1.7 ± 01 µg/mL) from the analyzed extracts. Among the flavonoids, the most potent compound was taxifolin (IC50 = 1.7 ± 0.2 µM). The verbascosideo was the derivative of caffeic acid with greater potential for arginase inhibition (IC50 = 0.5 ± 0.2 µM) The structures of these compounds can serve as a reference in developing new drugs for the control of leishmaniosis, which target arginase.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Medicinal plants were and are very important for healing various diseases. However, improper use of plants for therapeutic purposes can cause a number of side effects. There are in the literature various reports about plants induced-toxicity and, in some cases patients have hepatic disorders. The knowledge about toxicity of vegetable materials is insipient because there are few scientific studies related to pharmacokinetics and pharmacodynamics. Plants containing pyrrolizidine alkaloids show hepatotoxic effects well documented. Scutia buxifolia Reiss is a Rhamnaceae. This plant occurred in Uruguay, Argentina and Brazil. It is used for hypertension treatment. Extracts and fractions obtained from S. buxfolia have antimicrobial and antioxidants effects. Nevertheless, S. buxifolia toxic effects are unknown. The present study was aimed to evaluate the acute and sub-chronic toxicity of S. buxifolia aqueous extract (SBSB). The flavonoids, condensed tannins, and flavonoids were measured in SBSB. The antioxidant scavenger capacity of SBSB was determined by DPPH assay. Antioxidant power of SBSB was comparable with the antioxidant ascorbic acid. The single dose of SBSB at concentrations 100, 200, 400 mg/ kg body weight administered to Wistar rats did not cause mortality and, behavioral changes. Then, we speculate that the lethal dose of SBSB is greater than 400 mg / kg body weight. In the sub-chronic assay, thirty-two animals are divides in 4 groups: the control group which receive distilled water by gavage and, the experimental groups which received the same doses used in the acute toxicity assay. The animals received water or SBSB once a day, during 30 days. The serum alanine aminotransferase (ALT) and asparate aminotransferase (AST) activities and, serum albumin levels were measured on 15º and 30º day of treatment. The malondialdehyde (MDA) and non-protein thiol groups (NPSH) contents and, the antioxidant activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) were quantified in the liver. Treatment with SBSB did not elevate the activity of AST and ALT, and did not alter the level of serum albumin in the doses of 100 and 400 mg / kg body weight. In animals treated with 200 mg / kg an increased activity of the enzyme AST was observed. This fact can occurred due, probably, to hemolysis. Treatment with SBSB preserves antioxidant defenses and does not increase the lipid peroxidation in liver tissue. These findings along with histopathological analysis show that the SBSB is safe. / As plantas medicinais foram e são de suma importância para a cura de diversas doenças. No entanto, o uso indiscriminado de plantas para fins terapêuticos pode provocar uma série de efeitos colaterais. Existem na literatura, vários relatos de intoxicação por plantas mundialmente usadas e em alguns casos, pacientes apresentaram falência hepática. O conhecimento dos efeitos tóxicos de matérias vegetais ainda é bastante insipiente, pois, há poucos trabalhos científicos sobre farmacocinética e farmacodinâmica. Plantas que contêm alcalóides pirrolizidínicos apresentam efeitos tóxicos para o fígado e já foram bem documentadas. Scutia buxifolia é uma Rhamnaceae que ocorre no Uruguai, Argentina e Brasil. Esta planta é popularmente usada no tratamento da hipertensão. Extratos e frações das folhas e cascas de S. buxifolia já tiveram suas atividades antimicrobianas e antioxidantes investigadas. Porém, os efeitos tóxicos do extrato de S. buxifolia são pouco conhecidos. O presente estudo teve como objetivo principal avaliar a toxicidade aguda e sub-crônica do extrato aquoso de S. buxifolia (SBSB). Neste extrato quantificou-se o conteúdo total de compostos fenólicos, taninos condensados, e flavonóides. A atividade antioxidante do SBSB determinada pelo método do DPPH é comparável á do ácido ascórbico. A dose única do SBSB nas concentrações de 100, 200 e 400 mg / kg de peso corporal administrada a ratos da raça Wistar, não causou mortalidade nos grupos e nem alterações comportamentais. Então, especula-se que a dose letal do SBSB seja maior que 400 mg/ kg de peso corporal. No ensaio sub-crônico, trinta e dois animais foram divididos em quatro grupos: o controle que recebeu água e, os experimentais que receberam o extrato nas mesmas doses que as utilizadas no ensaio da toxicidade aguda. Os animais receberam água ou extrato uma vez ao dia via gavagem, durante 30 dias. A atividade sérica das enzimas alanina aminotransferase (ALT) e asparato aminotransferase (AST) e o nível de albumina foram mensurados no 15º de 30º dia de tratamento. O conteúdo de malondialdeído (MDA), de tióis não-protéicos e atividade antioxidante das enzimas catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) foram quantificadas no fígado dos animais. O tratamento com o SBSB não eleva a atividade da AST e da ALT e, não alterara o nível sérico de albumina nas doses de 100 e 400 mg/ kg de peso corporal. Os animais tratados com a dose de 200 mg/kg tiveram um aumento na atividade da enzima AST. O tratamento com SBSB preserva as defesas antioxidantes e não aumenta a peroxidação lipídica no tecido hepático. Esses achados juntamente com análise histopalógica mostram que o SBSB é seguro.

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Yes / The synthesis of nanoparticles of conjugates of caffeic acid-modified chitosan with ruthenium arene complexes is described. The chemical structure and physical properties of the nanoparticles were characterised by electronic absorption spectroscopy (UV-vis), Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR), 1H NMR spectroscopy, dynamic light scattering (DLS), transmission electron microscopy (TEM), X-ray powder diffraction (XRD), and circular dichroism (CD) analysis. The multi-spectral results revealed that caffeic acid is covalently bound to chitosan and chelates to {Ru(p-cymene)Cl}+. The DLS studies indicated that the Ru–caffeic acid modified chitosan nanoparticles are well-defined and of nanometre size. Such well-defined nanocomposites of chitosan and metal complexes might find a range of applications, for example in drug delivery. / We thank the National Natural Science Foundation of China (Project No. 21571154), the Jiangsu Overseas Research & Training Program for University Prominent Young & Middle-aged Teachers and Presidents, Leverhulme Trust (Early Career Fellowship No. ECF-2013-414 to NPEB), the ERC (Grant No. 247450 to PJS), EPSRC (EP/F034210/1 to PJS) and Science City (AWM/ERDF) for support, and EU COST Action CM1105 for stimulating discussions.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Phenolic compouds and their derivatives constitute a leading family of natural compounds. Caffeic acid (CA) and caffeic acid phenethyl ester (CAPE) are the important members of phenolic compound, sharing several biological applications; antioxidant, neuroprotective, anti-inflammatory, antiproliferative, antibacterial, antiviral, antiatherosclerotic and anticancer properties. In spite of these, literature reportes some of its pro-oxidants activity depending on cellular environment. These pathophysiolocal properties increased the interest to evaluate the effect of CA and CAPE on the enzyme evolved in the purines salvage and the acetylcholine hydrolyzing enzyme the acetylcholineterase (AChE); in both PNS and CNS, since the essential constituent of our dietary items. Previously, our research group has reported that phenolic compound altered the activities of these enzymes. The AChE rapidly hydrolyzes the acetylcholine in neuronal and non neuronal tissues, mediating several neurodegenerative diseases. Beside the ACh, ATP (as co-neurotramittors) and adenosine are important signaling molecules, communicating cells in both PNS and CNS. In the extracellular signalling pathways; the adenine nucleotides, their derivative and the coupling of these molecules with specific receptor have a crucial role in nervous, vascular and immune systems. Once released, these molecules are hydrolyzed by a cascade of enzymes including ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase; E.C. 3.6.1.5, CD39), 5 -nucleotidase (E.C 3.1.3.5, CD73), ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase (E-NPP), modulating crucially the signaling pathways in the normal functioning of nervous, vascular and immune systems. Next, adenosine deaminase (ADA) and xanthin oxidase (XO) degrade the adenosine and xanthine respectively which further control the functioning mechanisms in cellular events. Found in the neuronal and non neuronal (in both PNS and CNS) the AChE, NTPDase, 5'-nucleotidase, E-NPP, and ADA regulate several events including neurotransmission, inflammation, and thrombogenic process. We hypothesized to evaluate first the in vitro effects of CA on AChE activity in peripheral and central cholinergic system of rats. The results showed that CA significantly modulated the cholinergic system in vitro. By modulating the cholinergic system in vitro, apparently CA (e.g. phenolic structure) has proper role in neurotransmission. Therefore we hypothesizes to evaluate the in vivo effects of CA on AChE, NTPDase, E-NPP, 5'-nucleotidase, platelets aggregation and (ADA) in different tissues/cell from rats. The animals were treated during 30 days and killed after behavioral test. The results showed that caffeic acid increased significantly the AChE activity in hippocampus, hyphothalmus, pon and lymphocytes while that in cortex, cerebellum and striatum the AChE was inhibited. CA improves step-down latencies in the inhibitory avoidance. Investigating the in vivo effects of CA in purinergic system, caffecid acid increased the ATP and AMP hydrolysis in synaptosomes. However, in the synaptosomes no alterations were observed in the ADA activity in the groups evaluated in this study. CA increased the ATP and AMP hydrolysis, while the ADP hydrolysis was decreased in platelets. In the present findings caffeic acid decreased the platelets aggregation induced by ADP agonist. Treatment with CA also increased the NTPDase and ADA activities in lymphocytes of rats. Considering the dual function of caffeic acid in vitro and in vivo, the present study was extended to CAPE followed by acute treatment model (ip) in order to elucidate the effect of another phenolic structure on the same parameters. In this line the animals were treated (ip) with CAPE and killed after 40 minutes. In platelets, the results showed that the effect of CAPE increased the NTPDase, E-NPP, 5 -nucleotidase activities, while ADA activities did not change significantly. In synaptosomes CAPE significantly inhibited the NTPDase, and 5 -nucleotidase activity. CAPE induced no significant changes in ADA in synaptosomes but reduced XO in whole brain. Finaly we investigated the activity of AChE in cortex, cerebellum, striatum, hippocampus, hyphotalamus, pon, lymphocytes and muscules of rats treated with CAPE. The results showed that CAPE significantly decreased the AChE activity in cortex cerebellum and striatum. CAPE significantly increased the AChE activity in hippocampus hypothalamus, pons, muscle and lymphocytes. In cholinergic system our results clearly demonstrating that both compound with dual functions.These findings demonstrated that the AChE activities and the cascade of ecto-enzymes was alter in different tissues after treatment with CA and CAPE in rats, suggesting that these compound should be considered a potentially therapeutic agent in immune, vascular and neurological disorders related with the cholinergic purinergic system. / Os compostos fenólicos e seus derivados constituem uma importante família de compostos naturais. O ácido cafeico (AC) e o éster fenetil do ácido cafeico (CAPE) são membros importantes dessa família e compartilham algumas aplicações biológicas, tais como: antioxidante, neuroprotetor, antiinflamatório, antiproliferativo, antibacteriano, antiviral, antiaterosclerótico e anticancerígeno. Entretanto, a literatura relata algumas atividades pró-oxidantes, dependendo do ambiente celular. Devido a estas propriedades patofisiológicas, aumentou o interesse com o objetivo de avaliar o efeito de CA e CAPE sob as atividades das enzimas purinérgicas e da acetilcolinesterase (AChE), tanto no Sistema Nervoso Periférico (SNP) como no Sistema Nervoso Central (SNC). Previamente, nosso grupo de pesquisa relatou que o composto fenólico tem a capacidade de alterar as atividades dessas enzimas. A AChE rapidamente hidrolisa a acetilcolina (ACh) em tecidos neuronais e não neuronais, mediando algumas doenças neurodegenerativas. Ao lado da ACh, o ATP (como coneurotransmissor) e adenosina são importantes moléculas sinalizadoras, comunicando as células em ambos os SNP e do SNC. Nas vias de sinalização extracelulares, os nucleotídeos de adenina e seus derivados podem ser acoplados a receptores específicos e desse modo ter um papel crucial no sistema nervoso, sistema vascular e imune. Uma vez liberadas, estas moléculas são hidrolisadas por uma cascata de enzimas incluindo a ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (NTPDase; EC 3.6.1.5, CD39), 5'- nucleotidase (EC 3.1.3.5, CD73), ectonucleotideo pirofosfatase/fosfodiesterase (E-NPP), modulando definitivamente as vias de sinalização do funcionamento normal do sistema nervoso, sistema vascular e imune. Além disso, a adenosina deaminase (ADA) e a xantina oxidase (XO) degradam a adenosina e a xantina, respectivamente, as quais controlam o funcionamento de mecanismos em eventos celulares. As enzimas encontradas em tecidos neuronais e não neuronais como a AChE, a NTPDase, a 5'-nucleotidase, a E-NPP e a ADA regulam eventos celulares incluindo a neurotransmissão, inflamação e processos trombogênicos. Com essas informações, nós introduzimos a hipótese de avaliar primeiramente os efeitos in vitro de CA na atividade da AChE periférica e no sistema central colinérgico de ratos. Os resultados demonstraram que o CA modula significativamente o sistema colinérgico no estudo in vitro. Essa modulação demonstra aparentemente que o CA (estrutura fenólica) possui propriedades de ação que altera a neurotransmissão. Portanto, a hipótese de se avaliar os efeitos in vivo de CA na atividade da AChE, NTPDase, E-NPP, 5'-nucleotidase, ADA e da agregação de plaquetas em diferentes tecidos de ratos tornou-se evidente. Para esse estudo, os animais foram tratados durante 30 dias e sacrificados após o teste comportamental. Os resultados do experimento demonstraram que o CA aumentou significativamente a atividade da AChE em hipocampo, hipotálamo, ponte e nos linfócitos, enquanto que no córtex cerebral, cerebelo e estriado a AChE foi inibida. No teste comportamental o CA teve evolução de melhora na latência de passos da esquiva inibitória. A investigação dos efeitos in vivo do CA no sistema purinérgico demonstrou aumento na hidrólise de ATP e AMP em sinaptossomas. Entretanto, não foram observadas alterações significativas na atividade da ADA em sinaptossomas dos grupos avaliados neste estudo. Em plaquetas, o CA aumentou significativamente a hidrólise de ATP e AMP, enquanto que a hidrólise de ADP foi diminuída nesse tecido. No presente estudo o CA reduziu significativamente a agregação de plaquetas induzida pelo agonista ADP. Além disso, o tratamento com CA aumentou significativamente as atividades da NTPDase e da ADA em linfócitos de ratos. Considerando a dupla função de CA, in vitro e in vivo, o presente estudo foi estendido para CAPE seguindo o modelo de tratamento agudo pela via intraperitoneal (ip) com o objetivo de elucidar o efeito de uma segunda estrutura fenólica sobre os mesmos parâmetros. Nesta linha de pesquisa, os animais foram tratados ip com CAPE e eutanasiados após 40 minutos. Em plaquetas, os resultados demonstraram que o CAPE aumentou significativamente a atividade da NTPDase, E-NPP e 5'-nucleotidase, enquanto que a atividade da ADA não foi alterada significativamente. Em sinaptossomas, o CAPE inibiu significativamente a atividade da NTPDase e da 5'-nucleotidase. O CAPE não induziu alterações significativas na atividade da ADA em sinaptossomas, mas reduziu significativamente a atividade da XO em todo o cérebro. Finalmente, nós investigamos a atividade da AChE no córtex cerebral, cerebelo, estriado, hipocampo, hipotálamo, ponte, linfócitos e músculos de ratos tratados com CAPE. Os resultados demonstraram que CAPE diminuiu significativamente a atividade da AChE em córtex cerebral, cerebelo e estriado. O CAPE aumentou significativamente a atividade da AChE em hipotálamo, hipocampo, ponte, músculo e linfócitos. No sistema colinérgico, nossos resultados demonstram claramente que ambos os compostos possuem dupla função. Estes resultados demonstram que as atividades da AChE e da cascata das ecto-enzimas foram alteradas em diferentes tecidos após o tratamento com CA ou CAPE em ratos, sugerindo que estes compostos devem ser considerados agentes com potencial terapêutico em doenças imunes, vasculares e neurológicas relacionadas com o sistema colinérgico e purinérgico.

A cana-de-açúcar é uma monocotiledônea poliplóide, alógama que possui baixa taxa reprodutiva devido a dificuldade de florescimento. Devido estas características genéticas e fisiológicas os programas de melhoramento são longos e laboriosos. Alternativamente, modernas aplicações da biotecnologia visam contribuir com o desenvolvimento de novos cultivares. Neste trabalho estudou-se a metodologia de cultura de tecidos a partir de discos de folhas imaturas para o estabelecimento da cultura de calos embriogênicos e regeneração de plantas a partir dos calos embriogênicos e diretamente, a partir de folhas imaturas. O objetivo principal foi contribuir para o desenvolvimento de métodos eficientes para produção de plantas transgênicas a partir de calos e folhas imaturas, considerando-se a crescente necessidade de produção de novos cultivares com características agronômicas específicas. Diversas concentrações de 2,4-D e cinetina em meio MS foram testadas para o estabelecimento de calos altamente embriogênicos e para a indução da desdiferenciação celular nos discos foliares antecedendo a regeneração de plantas. Meios de cultura sem reguladores de crescimento (MS) e com a adição de BAP e ANA foram testados para a regeneração de plantas a partir de discos foliares. Calos embriogênicos com 12 a 20 semanas de cultivo produziram em média 3 a 5 plantas, em meio de regeneração MS. Folhas imaturas apresentaram elevado potencial de regeneração de plantas quando se utilizou 2,4-D em concentrações de 5 e 8 mg/L nos períodos de 5 e 8 dias no escuro. Houve indução a formação de embriões somáticos que resultaram em média 12 a 16 plantas por explante no período total de 7 a 10 semanas. Além disso, foi testado o pré-tratamento dos discos foliares em meio MS3K, contendo 2,4-D (3mg/L) e cinetina (0,1 mg/L), antes da transferência do discos para meio de regeneração MS. Os discos submetidos a este pré-tratamento durante 14, 21 e 28 dias apresentaram aumento significativo na eficiência de regeneração de plantas, variando em média de 41 a 50 plantas por disco foliar nas variedades RB835089 e RB855156. A redução no tempo para obtenção de plantas aliado ao aumento na média de plantas obtidas é a base para aumentar a eficiência de transformação genética de plantas. Experimentos de cotransformação dos genes neo e comt(AS), foram realizados por biolística. Em plantas regeneradas a partir de folhas imaturas da variedade RB835486, as análises de PCR confirmaram a incorporação do gene marcador neo em 57 e 90% das plantas em meio seletivo com geneticina (30 mg/L), sendo que a maior eficiência de regeneração de transgênicos (90%) foi obtida no pré-tratamento com o meio MS3K. Das plantas transgênicas para o gene neo, 7 e 38% também foram confirmadas para a incorporação do gene comt(AS). Nas plantas regeneradas a partir de calos embriogênicos em meio seletivo, as análises de PCR detectaram somente a incorporação do gene neo, o que ocorreu em 52% das plantas analisadas. Os resultados obtidos mostram que a cultura de discos de folhas imaturas para o processo de transformação genética por biolística é uma metodologia viável, rápida e menos onerosa, quando comparada com a cultura de calos embriogênicos. / Sugarcane is a polyploidy monocot and allogamous species that has low reproductive rate due to the difficulty of flowering. Because of these genetic and physiological characteristics breeding program takes long time and demand hard labor. Alternatively, modern biotechnology approaches contribute to the development of new cultivars. In this work we studied the methodology of plant tissue culture from immature leaf discs to establish callus culture and plant regeneration from those calli and from immature leaves, directly. The main objective was to contribute to the development of efficient methods to produce transgenic plants from callus and immature leaves, due to the growing need to produce new cultivars with specific agronomics traits. MS medium with different concentrations of 2,4-D and kinetin were tested to obtain highly embryogenic calli and to induce cellular dedifferentiation in the immature leaf discs prior to plant regeneration. Culture media without growth regulators (MS) and with the addition of BAP and NAA were tested for plant regeneration from leaf discs. Callus culture with 12 to 20 weeks resulted on average 3 to 5 plants on regeneration medium designed as MS. Immature leaves showed a high potential for plant regeneration when 2,4-D at concentrations of 5 and 8 mg/L in periods of 5 and 8 days in the dark. There were inducing of somatic embryos that resulted in average 12 to 16 plants per explant in the total period of 7 to 10 weeks. In addition, we tested the pre-treatment of leaf discs in MS3K medium which contain 2,4-D (3 mg/L) and kinetin (0.1 mg/L) before transfering to plant regeneration MS medium . The discs submitted to this pretreatment for 14, 21 and 28 days showed significant increase in the efficiency of plant regeneration, with on average of 41 to 50 plants per leaf disc in varieties RB835089 and RB855156. The reduction of time to obtain plants coupled with the increase of plants obtained is the basis for increasing the efficiency of plant genetic transformation. Co-transformation with genes neo and comt(AS), were performed by biolistics. Plants regenerated from immature leaves of the variety RB835486, PCR analysis confirmed the incorporation of the neo selection marker gene in 57 and 90% of the plants on selective medium with geneticin (30 mg/L), the higher efficiency of transgenic plants (90%) was obtained on pre-treatment in MS3K medium. Transgenic plants for the neo gene, 7 and 38% were also confirmed for the incorporation of comt (AS). PCR analysis of candidates transgenic plants from callus growing on selective medium, revelled only the insertion of the neo gene, which occurred in 52% of the analyzed plants. The results of this work showed that the approach of using immature leaf discs to obtain plant genetic transformation by biolistics methodology is a viable, cheaper and faster than using embryogenic callus.

A cana-de-açúcar é uma monocotiledônea poliplóide, alógama que possui baixa taxa reprodutiva devido a dificuldade de florescimento. Devido estas características genéticas e fisiológicas os programas de melhoramento são longos e laboriosos. Alternativamente, modernas aplicações da biotecnologia visam contribuir com o desenvolvimento de novos cultivares. Neste trabalho estudou-se a metodologia de cultura de tecidos a partir de discos de folhas imaturas para o estabelecimento da cultura de calos embriogênicos e regeneração de plantas a partir dos calos embriogênicos e diretamente, a partir de folhas imaturas. O objetivo principal foi contribuir para o desenvolvimento de métodos eficientes para produção de plantas transgênicas a partir de calos e folhas imaturas, considerando-se a crescente necessidade de produção de novos cultivares com características agronômicas específicas. Diversas concentrações de 2,4-D e cinetina em meio MS foram testadas para o estabelecimento de calos altamente embriogênicos e para a indução da desdiferenciação celular nos discos foliares antecedendo a regeneração de plantas. Meios de cultura sem reguladores de crescimento (MS) e com a adição de BAP e ANA foram testados para a regeneração de plantas a partir de discos foliares. Calos embriogênicos com 12 a 20 semanas de cultivo produziram em média 3 a 5 plantas, em meio de regeneração MS. Folhas imaturas apresentaram elevado potencial de regeneração de plantas quando se utilizou 2,4-D em concentrações de 5 e 8 mg/L nos períodos de 5 e 8 dias no escuro. Houve indução a formação de embriões somáticos que resultaram em média 12 a 16 plantas por explante no período total de 7 a 10 semanas. Além disso, foi testado o pré-tratamento dos discos foliares em meio MS3K, contendo 2,4-D (3mg/L) e cinetina (0,1 mg/L), antes da transferência do discos para meio de regeneração MS. Os discos submetidos a este pré-tratamento durante 14, 21 e 28 dias apresentaram aumento significativo na eficiência de regeneração de plantas, variando em média de 41 a 50 plantas por disco foliar nas variedades RB835089 e RB855156. A redução no tempo para obtenção de plantas aliado ao aumento na média de plantas obtidas é a base para aumentar a eficiência de transformação genética de plantas. Experimentos de cotransformação dos genes neo e comt(AS), foram realizados por biolística. Em plantas regeneradas a partir de folhas imaturas da variedade RB835486, as análises de PCR confirmaram a incorporação do gene marcador neo em 57 e 90% das plantas em meio seletivo com geneticina (30 mg/L), sendo que a maior eficiência de regeneração de transgênicos (90%) foi obtida no pré-tratamento com o meio MS3K. Das plantas transgênicas para o gene neo, 7 e 38% também foram confirmadas para a incorporação do gene comt(AS). Nas plantas regeneradas a partir de calos embriogênicos em meio seletivo, as análises de PCR detectaram somente a incorporação do gene neo, o que ocorreu em 52% das plantas analisadas. Os resultados obtidos mostram que a cultura de discos de folhas imaturas para o processo de transformação genética por biolística é uma metodologia viável, rápida e menos onerosa, quando comparada com a cultura de calos embriogênicos. / Sugarcane is a polyploidy monocot and allogamous species that has low reproductive rate due to the difficulty of flowering. Because of these genetic and physiological characteristics breeding program takes long time and demand hard labor. Alternatively, modern biotechnology approaches contribute to the development of new cultivars. In this work we studied the methodology of plant tissue culture from immature leaf discs to establish callus culture and plant regeneration from those calli and from immature leaves, directly. The main objective was to contribute to the development of efficient methods to produce transgenic plants from callus and immature leaves, due to the growing need to produce new cultivars with specific agronomics traits. MS medium with different concentrations of 2,4-D and kinetin were tested to obtain highly embryogenic calli and to induce cellular dedifferentiation in the immature leaf discs prior to plant regeneration. Culture media without growth regulators (MS) and with the addition of BAP and NAA were tested for plant regeneration from leaf discs. Callus culture with 12 to 20 weeks resulted on average 3 to 5 plants on regeneration medium designed as MS. Immature leaves showed a high potential for plant regeneration when 2,4-D at concentrations of 5 and 8 mg/L in periods of 5 and 8 days in the dark. There were inducing of somatic embryos that resulted in average 12 to 16 plants per explant in the total period of 7 to 10 weeks. In addition, we tested the pre-treatment of leaf discs in MS3K medium which contain 2,4-D (3 mg/L) and kinetin (0.1 mg/L) before transfering to plant regeneration MS medium . The discs submitted to this pretreatment for 14, 21 and 28 days showed significant increase in the efficiency of plant regeneration, with on average of 41 to 50 plants per leaf disc in varieties RB835089 and RB855156. The reduction of time to obtain plants coupled with the increase of plants obtained is the basis for increasing the efficiency of plant genetic transformation. Co-transformation with genes neo and comt(AS), were performed by biolistics. Plants regenerated from immature leaves of the variety RB835486, PCR analysis confirmed the incorporation of the neo selection marker gene in 57 and 90% of the plants on selective medium with geneticin (30 mg/L), the higher efficiency of transgenic plants (90%) was obtained on pre-treatment in MS3K medium. Transgenic plants for the neo gene, 7 and 38% were also confirmed for the incorporation of comt (AS). PCR analysis of candidates transgenic plants from callus growing on selective medium, revelled only the insertion of the neo gene, which occurred in 52% of the analyzed plants. The results of this work showed that the approach of using immature leaf discs to obtain plant genetic transformation by biolistics methodology is a viable, cheaper and faster than using embryogenic callus.

Coffee contains many antioxidants including purpurogallin, which is a hydrophobic phenolic antioxidant that is difficult to measure with reported methods. A method combining solid-phase extraction and liquid chromatography–mass spectrometry was developed to detect and quantify purpurogallin in brewed beverages, including coffee. For beverage preparation, water extraction was adopted for improved correlation with moka pot brewing. Purpurogallin was detected in all commercial coffee samples, and its content in ground coffees ranged from 455-630 ng/g dry weight. Purpurogallin was only detected in two English breakfast tea samples (335-360 ng/g dry weight) and was not detected in any cocoa sample. Antioxidant activity, total phenolic content, and phenolic profile of coffees with different degrees of roasting were determined and analyzed. The developed methodology was then further improved, and coffees with different roasting degrees were analyzed for their antioxidant activity, total phenolic content, and phenolic profile. The antioxidant activity ranged from 63.9-92.0 mg Trolox equivalents per gram of coffee (dry weight), and the total phenolic content ranged from 36.0-57.7 mg gallic acid equivalents per gram of coffee (dry weight). However, the total phenolic content was not correlated with the roasting degree (p > 0.05). When the roasting degree increases, chlorogenic acid decreases drastically, but shikimic acid, caffeic acid, gallic acid, pyrogallol, and purpurogallin increase correspondingly. The results suggest that purpurogallin is a common antioxidant in roasted coffees, and an increase in roasting degree will not only lead to dramatic breakdown of chlorogenic acid, but also promote significant formation of other phenolic compounds that can provide antioxidant activity.