INTRODUÇÃO: A prevalência de asma tem crescido e a maioria dos pacientes com asma grave não obtém o controle total dos sintomas com as terapias disponíveis, fazendo-se necessária a busca por novas alternativas terapêuticas. Inibidores de proteinases têm sido estudados como tratamento de processos inflamatórios, dentre eles o Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) OBJETIVO: Avaliar se o inibidor de proteinase EcTI modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação, remodelamento e estresse oxidativo nas vias aéreas e septos alveolares em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Vinte e quatro camundongos Balb/c machos, entre seis e sete semanas de vida, pesando em media 25 g foram divididos em quatro grupos: C (controle), OVA (sensibilizados com ovalbumina, 50 ug intraperironeal (i.p) nos dias 0 e 14 e desafiados nos dias 22, 24, 26, 28); C+EC (controle tratados com EcTI (2 mg/kg/i.p) nos dias 22 a 28); OVA+EC (sensibilizados e desafiados com ovalbumina e também tratados com EcTI (2 mg/kg -i.p) nos dias 22 a 28). No dia 29, foram realizadas realizadas: (i) hiperresponsividade à metacolina e obtidas as respostas máximas de resistência e elastância do sistema respiratório; (ii) análise histopatológica do pulmão para quantificação de eosinófilos, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas (VA) e nos septos alveolares (SA); e (iii) imunohistoquímica para quantificação de células positivas para IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NF-kB e fração de volume de isoprostano nas VA e nos SA. Uma semana após o dia 29 foi realizada a técnica de anafilaxia cutanea passiva(PCA) para quantificar IgE e IgG1. A significância foi considerada quando p < 0,05. RESULTADOS: Houve aumento de todos os parâmetros avaliados no grupo OVA em relação ao grupo controle (p < 0,05). Houve atenuação da resposta máxima de Rrs e Ers no grupo OVA+EC comparado as grupo OVA (p < 0,05). O tratamento com EcTI nos animais sensibilizados atenuou o número de eosinófilos, células positivas para IL-4, IL-5, IL-13,IFN-y, iNOS, MMP-9, TIMP-1, NF-kB e TGF-beta e fração de volume de isoprostano, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas e nos séptos alveolares quando comparado ao grupo OVA (p < 0,05).Houve reaçao de PCA nos animais sensibilizados com ovalbumina. CONCLUSÃO: EcTI atenuou a hiperresponsividade brônquica, a inflamação, o remodelamento e o estresse oxidativo nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Embora sejam necessários mais estudos, esse inibidor pode ser considerado uma futura ferramenta farmacológica para o tratamento de asma / BACKGROUND: The number of cases of asthma has grown in recent decades. People who have severe asthma are likely to have more attacks and are at greater risk of a fatal attack, which propose to keep up global attention and keep approaching for advances in asthma care. Proteinase inhibitors of vegetable origin have been studied as a modulator of inflammatory responses and diseases. Among these inhibitors is Enterolobium contortisiliquum Trypsin Inhibitor (EcTI). AIMS: To evaluate the effects of EcTI in pulmonary mechanical, eosinophilic recruitment, inflammatory cytokines, remodeling of extracellular matrix and oxidative stressin an experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation. METHODS: Twenty-four young adult male pathogen-free mice BALB/c (6-7 weeks old, 25-30g) were divided into 4 groups: C (control), OVA (sensitized with ovalbumin, 50 ug intraperitoneal (i.p), on days 0 and 14 and challenged with ova 1%, on days 22, 24, 26, 28); C+EC (control treated with EcTI- 2 mg/kg/i.p. from days 22 to 28); OVA+EC (sensitized and challenged with ovalbumin and treated with EcTI (2 mg/kg/i.p) from days 22 to 28). At day 29, we performed: (i) Bronchial hyperresponsiveness to methacholine and obtained the maximum response of resistance (Rrs) and elastance (Ers) of the respiratory system; (ii) lung histopathological analysis by morphometry to quantify eosinophils, collagen and elastic fibers volume fraction in airways; and (iii) immunohistochemistry to quantify IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-, iNOS, NF-kB positive cells and isoprostane volume fraction in airways. One week after the day 29 we performed PCA technique to quantify IgE and IgG1 antibodies. Significance was considered at p < 0.05. RESULTS: The EcTI treatment in the ovalbumin-sensitized animals attenuated the maximal response of resistance and elastance of respiratory system after methacholine, the number of eosinophils, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, NF-kB and iNOS-positive cells, isoprostane, elastic, collagen volume fraction, MMP-9, TIMP-1 and TGF-beta-positive cells compared to OVA group (p < 0.05). PCA was positive in sensitized animals. CONCLUSION: EcTI attenuates bronchial hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress activation in this experimental asthma mice model. Although more studies are needed this inhibitor may be considered a future pharmacological tool for the treatment of asthma

A epidemia causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) é a mais importante das ultimas décadas. A despeito dos avanços no conhecimento da patogenia do vírus e da resposta imune à infecção, até o momento não existe uma vacina eficaz contra a aquisição do HIV. Diversas linhas de evidência indicam que anticorpos neutralizantes ou ligadores, linfócitos T CD4+ e T CD8+ desempenham um papel importante na imunidade contra o HIV. Os anticorpos que são capazes de neutralizar o HIV são direcionados principalmente à glicoproteína do envelope do vírus (env), mas os candidatos vacinais baseados na proteína de envelope gp120 monomérica testados até hoje falharam em induzir proteção nos ensaios de eficácia. Avanços no entendimento da estrutura e função da glicoproteína env tem facilitado o desenvolvimento de uma nova geração de imunógenos baseada em trímeros mais estáveis e solúveis da glicoproteína gp140. Em uma formulação vacinal além da escolha do antígeno, os adjuvantes desempenham um papel fundamental. Os adjuvantes são conhecidos por aumentar a imunogenicidade das vacinas, e nos últimos anos vários compostos, incluindo agonistas de receptores do tipo Toll (TLR) e NOD (NLR) têm demonstrado eficácia em ensaios clínicos. Em estudos prévios, nosso grupo demonstrou que a imunização de camundongos com uma vacina de DNA codificando 18 epítopos para linfócitos T CD4+ do HIV-1 (HIVBr18), foi capaz de induzir resposta específica e ampla de linfócitos T CD4+ e T CD8+. Devido ao importante papel do efeito auxiliar de linfócitos T CD4+ na resposta humoral nas imunizações assistidas por diversos adjuvantes, o objetivo central do trabalho foi verificar se a imunização inicial com a vacina de DNA HIVBr18 seria capaz de aumentar a magnitude/qualidade de resposta imune humoral e celular induzida pelo trímero de gp140 na presença de diferentes adjuvantes. Para tal, camundongos BALB/c foram imunizados inicialmente com a vacina HIVBr18 ou com o vetor vazio e posteriormente com a proteína gp140 na presença dos adjuvantes: completo de Freund (ACF), poly IC, CpG ODN 1826, Monofosforil lipídeo A (MPL), Muramildipeptídeo (MDP), Imiquimod (R837), e Resiquimod (R848). Observamos que a imunização inicial com HIVBr18 foi capaz de fornecer um auxílio cognato para a proliferação específica de linfócitos T CD4+ e T CD8+ e também para a produção da citocina IFNy. A análise da xx resposta humoral mostrou que a imunização inicial com a vacina HIVBr18, foi capaz de influenciar a produção das subclasses de imunoglobulinas, independente do adjuvante testado. No presente trabalho, também analisamos a influência dos adjuvantes na imunogenicidade da gp140. Os animais que receberam os adjuvantes MPL, poly IC e CpG ODN 1826 apresentaram títulos de anticorpos estatisticamente superiores quando comparados aos animais que receberam os adjuvantes Alum, MDP, R837 e R848. Observamos que os animais imunizados com a gp140 na presença dos diferentes adjuvantes desenvolveram células B do centro germinativo e células TCD4+ auxiliar foliculares. Estes resultados nos permitem concluir que a imunização inicial com HIVBr18 é capaz de alterar a qualidade da resposta humoral e celular gp140- específica. Assim, essa formulação poderia ser utilizada para auxiliar e/ou direcionar a resposta imune induzida por outros imunógenos como por exemplo o trímero de gp140. Podemos concluir também que diferentes formulações de adjuvantes que se encontram em ensaios clínicos como poly IC, CpG ODN e MPL podem ser capazes de induzir um resposta imune humoral e celular tão ou mais potente que aquela induzida pelo ACF / The epidemic caused by the human immunodeficiency virus (HIV) is the most important in the last decades. Despite advances in the knowledge about virus pathogenesis and immune response to infection, until now there is not an effective vaccine against HIV acquisition. Several evidences indicate that neutralizing or binding antibodies, CD4+ and CD8+ T lymphocytes play an important role in immunity against HIV. The antibodies that are able to neutralize HIV are primarily directed against the virus envelope glycoprotein (env), but the vaccine candidates based on monomeric gp120 envelope protein tested so far failed to induce protection in efficacy trials. Advances in understanding the structure and function of the env glycoprotein have facilitated the development of a new generation of immunogens based on trimers, a more stable and soluble form of gp140 glycoprotein. In a vaccine formulation, in addition to the antigen, adjuvants play a pivotal role. Adjuvants are known to increase the immunogenicity of vaccines and, in the last years, several compounds, including agonists of Toll-like receptors (TLR) and NOD (NLR), have presented efficacy in clinical trials. In previous work, our group demonstrated that immunization of mice with a DNA vaccine (HIVBr18) encoding 18 CD4+ T cells epitopes from HIV-1 was able to induce a broad CD4+ T and CD8+ T cells specific response.. Given the important role of CD4+ T cells in the humoral response after adjuvant-assisted immunization, the aim of the study was to verify whether an initial immunization with the DNA vaccine HIVBr18 could increase the magnitude/quality of humoral and cellular immune response induced by gp140 trimer in the presence of different adjuvants. Therefore, BALB/c mice were initially immunized with the vaccine HIVBr18 or empty vector and then with gp140 in the presence of the following adjuvants: Freund\'s complete (CFA), poly IC, CpG ODN 1826, monophosphoryl lipid A (MPL), Muramyl dipeptide (MDP), Imiquimod (R837), and Resiquimod (R848). We observed that initial immunization with HIVBr18 was able to provide cognate help for specific CD4+ and CD8+ T cells proliferation and also for IFN-y production. Analysis of humoral response showed that initial immunization with the HIVBr18 vaccine was able to alter the production of immunoglobulin subclasses independent of the adjuvant tested. This work also analyzed the influence of adjuvants on the immunogenicity of gp140. Mice that received the adjuvant MPL, poly IC and CpG ODN 1826 presented higher antibody titers when compared to animals that received Alum, MDP, R837 and R848. We observed that mice immunized with gp140 in the presence of all adjuvants tested developed germinal center B cells and follicular helper T cells (TFH). We conclude that initial immunization with HIVBr18 is able to alter the quality of specific humoral and cellular immune responses.. Therefore, this formulation could be used in combination with other immunogens, such as gp140, to help/redirect the immune response. We also conclude that the adjuvants that are in clinical trials such as poly IC, MPL and CpG ODN 1826 may be able to induce stronger humoral and cellular response than CFA

INTRODUÇÃO: A prevalência de asma tem crescido e a maioria dos pacientes com asma grave não obtém o controle total dos sintomas com as terapias disponíveis, fazendo-se necessária a busca por novas alternativas terapêuticas. Inibidores de proteinases têm sido estudados como tratamento de processos inflamatórios, dentre eles o Enterolobium contortisiliquum Tripsin Inhibitor (EcTI) OBJETIVO: Avaliar se o inibidor de proteinase EcTI modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação, remodelamento e estresse oxidativo nas vias aéreas e septos alveolares em um modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Vinte e quatro camundongos Balb/c machos, entre seis e sete semanas de vida, pesando em media 25 g foram divididos em quatro grupos: C (controle), OVA (sensibilizados com ovalbumina, 50 ug intraperironeal (i.p) nos dias 0 e 14 e desafiados nos dias 22, 24, 26, 28); C+EC (controle tratados com EcTI (2 mg/kg/i.p) nos dias 22 a 28); OVA+EC (sensibilizados e desafiados com ovalbumina e também tratados com EcTI (2 mg/kg -i.p) nos dias 22 a 28). No dia 29, foram realizadas realizadas: (i) hiperresponsividade à metacolina e obtidas as respostas máximas de resistência e elastância do sistema respiratório; (ii) análise histopatológica do pulmão para quantificação de eosinófilos, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas (VA) e nos septos alveolares (SA); e (iii) imunohistoquímica para quantificação de células positivas para IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NF-kB e fração de volume de isoprostano nas VA e nos SA. Uma semana após o dia 29 foi realizada a técnica de anafilaxia cutanea passiva(PCA) para quantificar IgE e IgG1. A significância foi considerada quando p < 0,05. RESULTADOS: Houve aumento de todos os parâmetros avaliados no grupo OVA em relação ao grupo controle (p < 0,05). Houve atenuação da resposta máxima de Rrs e Ers no grupo OVA+EC comparado as grupo OVA (p < 0,05). O tratamento com EcTI nos animais sensibilizados atenuou o número de eosinófilos, células positivas para IL-4, IL-5, IL-13,IFN-y, iNOS, MMP-9, TIMP-1, NF-kB e TGF-beta e fração de volume de isoprostano, fibras colágenas e elásticas nas vias aéreas e nos séptos alveolares quando comparado ao grupo OVA (p < 0,05).Houve reaçao de PCA nos animais sensibilizados com ovalbumina. CONCLUSÃO: EcTI atenuou a hiperresponsividade brônquica, a inflamação, o remodelamento e o estresse oxidativo nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Embora sejam necessários mais estudos, esse inibidor pode ser considerado uma futura ferramenta farmacológica para o tratamento de asma / BACKGROUND: The number of cases of asthma has grown in recent decades. People who have severe asthma are likely to have more attacks and are at greater risk of a fatal attack, which propose to keep up global attention and keep approaching for advances in asthma care. Proteinase inhibitors of vegetable origin have been studied as a modulator of inflammatory responses and diseases. Among these inhibitors is Enterolobium contortisiliquum Trypsin Inhibitor (EcTI). AIMS: To evaluate the effects of EcTI in pulmonary mechanical, eosinophilic recruitment, inflammatory cytokines, remodeling of extracellular matrix and oxidative stressin an experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation. METHODS: Twenty-four young adult male pathogen-free mice BALB/c (6-7 weeks old, 25-30g) were divided into 4 groups: C (control), OVA (sensitized with ovalbumin, 50 ug intraperitoneal (i.p), on days 0 and 14 and challenged with ova 1%, on days 22, 24, 26, 28); C+EC (control treated with EcTI- 2 mg/kg/i.p. from days 22 to 28); OVA+EC (sensitized and challenged with ovalbumin and treated with EcTI (2 mg/kg/i.p) from days 22 to 28). At day 29, we performed: (i) Bronchial hyperresponsiveness to methacholine and obtained the maximum response of resistance (Rrs) and elastance (Ers) of the respiratory system; (ii) lung histopathological analysis by morphometry to quantify eosinophils, collagen and elastic fibers volume fraction in airways; and (iii) immunohistochemistry to quantify IFN-y, IL-4, IL-5, IL-13, MMP-9, TIMP-1, TGF-, iNOS, NF-kB positive cells and isoprostane volume fraction in airways. One week after the day 29 we performed PCA technique to quantify IgE and IgG1 antibodies. Significance was considered at p < 0.05. RESULTS: The EcTI treatment in the ovalbumin-sensitized animals attenuated the maximal response of resistance and elastance of respiratory system after methacholine, the number of eosinophils, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, NF-kB and iNOS-positive cells, isoprostane, elastic, collagen volume fraction, MMP-9, TIMP-1 and TGF-beta-positive cells compared to OVA group (p < 0.05). PCA was positive in sensitized animals. CONCLUSION: EcTI attenuates bronchial hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress activation in this experimental asthma mice model. Although more studies are needed this inhibitor may be considered a future pharmacological tool for the treatment of asthma

Dados recentes do nosso laboratório demonstram que somente a co-transdução, não a tradução individual, com vetores adenovirais portadores de Interferon-beta (IFN?) (citocina imuno modulatória) e p19Arf (parceira funcional da proteína supressora de tumor p53) resulta na morte celular massiva do melanoma murino B16F10. A capacidade desse tratamento combinado de induzir uma resposta imune antitumoral ainda não foi avaliada. Dessa maneira, o objetivo do presente trabalho foi investigar se células B16F0 tratadas por essa combinação são capazes de induzir uma resposta imune antitumoral em um modelo de vacinação profilático de melanoma. Para isso, essas células foram co-transduzidas com os vetores AdPGp19 e AdPGIFN? e 48 horas depois, inoculadas como agente vacinal no flanco esquerdo (sítio da vacina) de camundongos C57BL/6 imunocompetentes. Sete dias após a última vacinação, esses animais foram desafiados com células B16F10 naïve no flanco direito (sítio do desafio). A progressão tumoral do desafio foi significativamente reduzida, mesmo quando o desafio tumoral foi feito 73 dias após da vacinação. Porém, como os animais imunizados desenvolveram tumores no sítio da vacina, condições para o uso dessas células tratadas foram avaliadas, revelando que: o número de células e de aplicações usadas durante a vacinação tem influência no aparecimento desse tumores, e que apenas com o tratamento combinado os camundongos permanecem livres de tumor. A influência do sistema imune para este resultado foi revelada após protocolo de imunussupressão. Em seguida, o papel da p19Arf e do IFN? na proteção antitumoral da combinação foi estudado. In vitro, os efeitos antitumorais da combinação parecem ser mais influentes da reposição de p19Arf do que da expressão de IFN?, mas já in vivo, na presença do sistema imune, foram mais dependentes do IFN?. Com a combinação estes efeitos mostraram-se mais pronunciados, induzindo uma proteção antitumoral e maior sobrevida aos animais vacinados. Estes resultados indicam que a combinação p19Arf e IFN? pode ser aplicada como um agente imunoterápico e sugerem que a associação entre morte celular e imuno estimulação pode beneficiar o tratamento contra o câncer / Previously, we have shown in a mouse melanoma model of in situ gene therapy that co-transduction, but not individual application, with adenovirus vectors expressing the Interferon-beta (IFN?) (immune modulatory cytokine) and p19Arf (functional partner of the p53 tumor suppressor) transgenes results in massive cell death and reduced tumor progression. However, the capability of this combined treatment to stimulate an antitumor immune response has not been evaluated. Therefore, the aim of this work was to investigate, trough a prophylactic vaccine model, if B16F10 cells treated by the p19Arf and IFN? combination could induce such immune response. To do so, these cells were co-transduced by the AdPGp19 e AdPGIFN? adenoviral vectors and 48 hours after, inoculated as a vaccine agent in the left flank (vaccine site) of immune competent C57BL/6 mice. Seven days after the last vaccine, a tumor challenge was done with naïve B16F10 cells in the right flank (challenge site). Tumor progression was markedly reduced, even when challenge was done 73 days after the vaccination. However, since these animals developed tumors where the vaccine was applied, more appropriate conditions for the use of these treated cells were pursued, thus revealing that: the number of cells and inoculations can dictate tumor development, and also, that only with the combined treatment was tumor formation abolished. The influence of the immune system for this result was revelead by performing an immune supression protocol. Next, the roles of p19Arf and of IFN? were studied. In vitro, the antitumor effects were stronger upon the introduction of p19Arf than IFN?, but in vivo, in the presence of the immune system, the effects were more IFN? dependent. In fact, these effects were more pronouced with the combined treatment, inducing protection against tumor formation and progression and increasing survival in the vaccinated animals. Taken together, these results demonstrate the application of cells treated by the p19Arf e IFN? combination as an effective vaccine agent and also indicates that the association between cell death and immune stimulation may benefit the treatment of cancer

Nas últimas décadas, tem sido relatado o aumento de casos de infecções fúngicas invasivas por agentes oportunistas, tais como Aspergillus spp., Fusarium spp. e fungos da ordem Mucorales, em pacientes hospitalizados, particularmente os imunocomprometidos. Como os sintomas são frequentemente inespecíficos, esses patógenos não são identificados inicialmente como agentes causais. Além disso, muitas vezes o diagnóstico só é estabelecido em estágios tardios da infecção, pois as metodologias diagnósticas de rotina, como cultura e microscopia, apresentam limitações caracterizadas, sobretudo, por baixa sensibilidade e especificidade. Os métodos moleculares, incluindo as amplificações de material genômico por PCR, em tecidos a fresco e parafinados, têm sido mais aplicados para a melhoria na detecção e identificação desses patógenos. A técnica de PCR em tempo real apresenta a vantagem de fornecer resultados com rapidez e elevada sensibilidade, além de minimizar os riscos de contaminação ambiental das amostras. Para aprimorar o conhecimento sobre a eficácia desta técnica na detecção e identificação dos patógenos, neste estudo foram utilizados camundongos da linhagem BALB/c para o desenvolvimento de modelos de infecção invasiva por Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus e Fusarium solani. Após inoculação dos fungos por via intravenosa, os órgãos (pulmão, fígado, rins, cérebro e coração) foram retirados para realização dos exames de cultura, histopatologia, PCR semi-nested e PCR em tempo real. As culturas foram realizadas em ágar Sabouraud dextrose e incubadas por 3 a 5 dias à temperatura ambiente. Para as análises histopatológicas, uma parte dos órgãos foi emblocada em parafina e cortes foram submetidos às colorações por hematoxilina-eosina e Gomori-Grocott. Para as análises moleculares, foram realizadas clonagens dos amplicons obtidos com os mesmos primers gênero-específicos (Aspergillus spp. e Fusarium spp.) e ordem-específicos (mucoráceos) empregados nas reações de PCR. Os clones foram empregados na técnica de PCR em tempo real para avaliação da sensibilidade analítica dos ensaios e como controles positivos. Os tecidos a fresco e parafinados foram submetidos a extrações de DNA, e as amostras foram avaliadas por PCR do tipo semi-nested, e por PCR em tempo real, empregando-se os primers gênero e ordem-específicos. Após 48-72 horas, observou-se crescimento fúngico nas culturas, porém a identificação macroscópica foi possível somente após 96 horas. Nos exames histopatológicos foram observadas presença de estruturas fúngicas e alterações na morfologia tecidual, confirmando a disseminação da infecção nos três modelos experimentais. Os dois métodos de PCR (convencional e tempo real) empregando os primers para Aspergillus e mucoráceos demonstraram 100% de especificidade. Além disso, os primers para mucoráceos amplificaram amostras de DNA dos gêneros Rhizopus, Mucor e Lichtheimia, confirmando serem ordem-específicos. Por outro lado, os testes moleculares com emprego de diversos primers de Fusarium apresentaram reatividade cruzada, principalmente com amostras de DNA de Aspergillus e Rhizopus. O limiar de detecção (LD) das PCR semi-nested para Aspergillus e Rhizopus foi de 50 fentogramas de DNA, enquanto na PCR em tempo real o LD foi de 20 fentogramas de DNA e 2x102 plasmídios/ul. Os dois métodos moleculares detectaram DNA de Aspergillus e Rhizopus, em 100% das amostras de tecido a fresco e parafinado, corroborando com os resultados de cultura e histopatologia. Os resultados do estudo demonstraram que a PCR em tempo real foi capaz de detectar e diferenciar Aspergillus e Rhizopus nos tecidos a fresco e parafinados, com 100% de especificidade e maior sensibilidade analítica quando comparada à PCR semi-nested. Entretanto, os resultados obtidos com diversos primers de Fusarium utilizados nos ensaios de PCR foram inconsistentes em relação à especificidade das amplificações. A PCR em tempo real constituiu um método rápido para diagnosticar, com acurácia, aspergilose e mucormicose em tecidos, podendo ser implementada como alternativa na rotina diagnóstica de laboratórios de patologia ou microbiologia. Por outro lado, a técnica apresentou baixa especificidade com os primers de Fusarium selecionados neste estudo. Outras sequências gênicas deste fungo deverão ser avaliadas na técnica molecular para se atingir resultados precisos / Increase of invasive fungal infections by opportunistic agents, such as Aspergillus sp., Fusarium sp. and fungi from the order Mucorales, in immunocompromised patients has been reported in the last decades. As the symptoms are often non-specific, diagnosis are only established in late stages of infection. Routine diagnostic methodologies, such as culture and direct microscopy, have limitations due to their low sensitivity and specificity. Molecular methods, including amplifications of nucleic acids by PCR in fresh and paraffined tissues, have been more frequently applied to improve the detection and identification of these pathogens. The real-time PCR (qPCR) technique has the advantage of providing fast results with high sensitivity, as well as minimizing the risks of environmental contamination of the samples. This study aimed to evaluate the effectiveness of this technique for detection and discrimination of the fungal pathogens in tissues taken from BALB/c mice intravenously inoculated with Aspergillus fumigatus, Rhizopus arrhizus and Fusarium solani. The organs (lung, liver, kidneys, brain and heart) were removed from animals and analysed by culture, histopathology, semi-nested PCR and qPCR. Recombinant plasmid clones containing small sequences of Aspergillus, Fusarium and mucoraceous were used to draw qPCR standard curves and to evaluate the analytical sensitivity of the assays. The fresh and paraffined tissues were submitted to DNA extractions, and samples were evaluated by semi-nested PCR and qPCR with genus-specific primers for Aspergillus and Fusarium, and order-specific primers for mucoraceous. Cultures were positive for all fresh tissue samples. Presence of typical fungal structures and alterations in tissue morphology were observed in the histopathological examinations, confirming the dissemination of infection in the three experimental models. Both PCR assays employing Aspergillus and mucoraceous primers demonstrated 100% specificity. On the other hand, molecular tests using at least six different Fusarium primers showed cross reactivity, mainly with Aspergillus and Rhizopus DNA samples. The limit of detection (LD) of the semi-nested PCR for Aspergillus and Rhizopus was 50 femtograms of DNA, while for the qPCR it was 20 femtograms of DNA, and 2x102 plasmids/?l. Both molecular methods detected Aspergillus and Rhizopus DNA in 100% of fresh and paraffined tissue samples, corroborating the results with cultures and histopathology. The results of the study demonstrated that qPCR assay was able to detect and differentiate Aspergillus and Rhizopus in fresh and paraffined tissues, with 100% of specificity and higher analytical sensitivity when compared to semi-nested PCR assay. However, the results obtained with several Fusarium primers in the PCR assays were inconsistent regarding specificity of the amplifications. Real-time PCR assay is a fast and accurate method to diagnose aspergillosis and mucormycosis in tissues, and could be implemented as an alternative tool for diagnostic routine in pathology or microbiology laboratories. On the other hand, the technique showed low specificity with the Fusarium primers selected in this study. Other gene sequences should be evaluated by PCR assays techniques to achieve accurate results

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-22. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:13Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12887.pdf: 1856396 bytes, checksum: 42de9f60d780e16634f25ebf960a3c24 (MD5) / Lesões no sistema nervoso central (SNC) levam a permeabilidade da barreira hematoencefálica, o que permite a entrada de células do sistema imune e a ativação das células da glia, principalmente microglia e astrócitos. Esse processo desencadeia a secreção de mediadores inflamatórios por essas células. As citocinas são as principais moléculas da resposta neuroinflamatória e são críticas para a regulação desta resposta, exercendo uma variedade de ações no SNC. Células tronco mesenquimais (CTMs), que possuem potencial proliferativo e são capazes de originar linhagens celulares distintas e especializadas, também secretam essas moléculas, caracterizando um poder imunomodulador. As CTMs, particularmente as derivadas da medula óssea, promovem o reparo tecidual pela secreção de fatores que aumentam a regeneração do tecido, estimulando proliferação, migração e diferenciação de progenitores endógenos encontrados na maioria dos tecidos, diminuindo a resposta imune e inflamatória e a apoptose. A habilidade de essas células alterarem o microambiente através de sua influência trófica pode contribuir mais significativamente para o reparo do tecido que a transdiferenciação. Nossa hipótese é que as citocinas secretadas pelas CTMs poderiam participar da atração de células tronco neurais endógenas para um local de lesão no SNC, criando um microambiente favorável para essas células. Tendo isso em vista, esta tese teve como objetivo estudar os efeitos dos fatores secretados pelas CTMs sobre células tronco neurais (CTNs) in vitro, e analisar a expressão de citocinas por CTMs in vivo em um modelo de lesão traumática no SNC. Primeiramente, avaliamos os efeitos dos fatores secretados pelas CTMs sobre apoptose, proliferação e diferenciação de CTNs adultas derivadas da zona subventricular e cultivadas como neuroesferas. Para isso, cultivamos as neuroesferas em meio condicionado por CTMs derivadas de medula óssea. Além disso, foram realizadas lesões no córtex motor primário dos animais, seguidas da injeção de CTMs no local da lesão. Nossos resultados indicam que os fatores secretados pelas CTMs não induzem nem previnem a apoptose das CTNs, aumentam a proliferação dessas células e induzem maior expressão do gene GFAP in vitro, o que indicaria uma tendência a diferenciação em astrócitos. Nos experimentos in vivo, nossos resultados mostram que a injeção das CTMs em um modelo de lesão aguda no SNC diminui a expressão de citocinas pró-inflamatórias no tecido lesado, indicando que os fatores solúveis secretados por CTMs podem modular a inflamação no local lesado, o que pode ser interessante para a criação de um microambiente favorável para CTNs endógenas e conseqüentemente para o reparo do tecido lesado. / Central nervous system (CNS) injury breakes the impermeability of the blood brain barrier, this allows the invasion of immune cells and activation of glial cells, mainly microglia and astrocytes. This process triggers the secretion of inflammatory mediators by these cells. Cytokines are the main molecules in neuroinflammatory response and are critical for its regulation, exerting a variety of actions in the CNS. Furthermore, mesenchymal stem cells (MSC) which have proliferative potential and are able to originate different and specialized cell lineages, also secrete these molecules, characterizing its immunomodulatory function. MSC, particularly those derived from bone marrow, promote tissue repair by secreting factors that enhance tissue regeneration stimulating proliferation, migration and differentiation of endogenous stem-like progenitors found in most tissues, decreasing inflammatory and immune reactions and apoptosis. The ability of such cells to alter tissue microenvironment through its trophic influence may contribute more significantly than their capacity for transdifferentiation in effecting tissue repair.Our hypothesis is that MSC secreted cytokines could take part in the attraction of endogenous neural stem cells (NSC) to an injury site in the CNS, providing a favorable microenvironment for these cells. Our aim was to study the effects of factors secreted by MSC on NSC in vitro and to analyse the MSC cytokines expression in vivo in a model of CNS traumatic injury. We first evaluated the effects of MSC secreted factors on apoptosis, proliferation and differentiation of adult NSC derived from the subventricular zone and cultured as neurospheres. Neurospheres were cultured in MSC conditioned medium (MSC-CM), which was obtained from bone marrow-derived MSC cultures. Besides a traumatic injury was performed at the primary motor cortex of mice and MSCs were injected at the injury site. Our results show that MSC secreted factors do not induce or prevent NSC apoptosis, increase NSC proliferation and induce bigger expression of GFAP gene in vitro, this could indicate a tendency of differentiation to astrocytes. In vivo experiments show that MSC injection at an acute model of injury diminishes pro-inflamatory cytokines in the injured tissue, suggesting that MSC secreted factors may modulate the inflammation at the injury site, which may be interest to the development favorable microenvironment for endogenous NSC and consequently repair of the injured tissue. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A epidemia causada pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) é a mais importante das ultimas décadas. A despeito dos avanços no conhecimento da patogenia do vírus e da resposta imune à infecção, até o momento não existe uma vacina eficaz contra a aquisição do HIV. Diversas linhas de evidência indicam que anticorpos neutralizantes ou ligadores, linfócitos T CD4+ e T CD8+ desempenham um papel importante na imunidade contra o HIV. Os anticorpos que são capazes de neutralizar o HIV são direcionados principalmente à glicoproteína do envelope do vírus (env), mas os candidatos vacinais baseados na proteína de envelope gp120 monomérica testados até hoje falharam em induzir proteção nos ensaios de eficácia. Avanços no entendimento da estrutura e função da glicoproteína env tem facilitado o desenvolvimento de uma nova geração de imunógenos baseada em trímeros mais estáveis e solúveis da glicoproteína gp140. Em uma formulação vacinal além da escolha do antígeno, os adjuvantes desempenham um papel fundamental. Os adjuvantes são conhecidos por aumentar a imunogenicidade das vacinas, e nos últimos anos vários compostos, incluindo agonistas de receptores do tipo Toll (TLR) e NOD (NLR) têm demonstrado eficácia em ensaios clínicos. Em estudos prévios, nosso grupo demonstrou que a imunização de camundongos com uma vacina de DNA codificando 18 epítopos para linfócitos T CD4+ do HIV-1 (HIVBr18), foi capaz de induzir resposta específica e ampla de linfócitos T CD4+ e T CD8+. Devido ao importante papel do efeito auxiliar de linfócitos T CD4+ na resposta humoral nas imunizações assistidas por diversos adjuvantes, o objetivo central do trabalho foi verificar se a imunização inicial com a vacina de DNA HIVBr18 seria capaz de aumentar a magnitude/qualidade de resposta imune humoral e celular induzida pelo trímero de gp140 na presença de diferentes adjuvantes. Para tal, camundongos BALB/c foram imunizados inicialmente com a vacina HIVBr18 ou com o vetor vazio e posteriormente com a proteína gp140 na presença dos adjuvantes: completo de Freund (ACF), poly IC, CpG ODN 1826, Monofosforil lipídeo A (MPL), Muramildipeptídeo (MDP), Imiquimod (R837), e Resiquimod (R848). Observamos que a imunização inicial com HIVBr18 foi capaz de fornecer um auxílio cognato para a proliferação específica de linfócitos T CD4+ e T CD8+ e também para a produção da citocina IFNy. A análise da xx resposta humoral mostrou que a imunização inicial com a vacina HIVBr18, foi capaz de influenciar a produção das subclasses de imunoglobulinas, independente do adjuvante testado. No presente trabalho, também analisamos a influência dos adjuvantes na imunogenicidade da gp140. Os animais que receberam os adjuvantes MPL, poly IC e CpG ODN 1826 apresentaram títulos de anticorpos estatisticamente superiores quando comparados aos animais que receberam os adjuvantes Alum, MDP, R837 e R848. Observamos que os animais imunizados com a gp140 na presença dos diferentes adjuvantes desenvolveram células B do centro germinativo e células TCD4+ auxiliar foliculares. Estes resultados nos permitem concluir que a imunização inicial com HIVBr18 é capaz de alterar a qualidade da resposta humoral e celular gp140- específica. Assim, essa formulação poderia ser utilizada para auxiliar e/ou direcionar a resposta imune induzida por outros imunógenos como por exemplo o trímero de gp140. Podemos concluir também que diferentes formulações de adjuvantes que se encontram em ensaios clínicos como poly IC, CpG ODN e MPL podem ser capazes de induzir um resposta imune humoral e celular tão ou mais potente que aquela induzida pelo ACF / The epidemic caused by the human immunodeficiency virus (HIV) is the most important in the last decades. Despite advances in the knowledge about virus pathogenesis and immune response to infection, until now there is not an effective vaccine against HIV acquisition. Several evidences indicate that neutralizing or binding antibodies, CD4+ and CD8+ T lymphocytes play an important role in immunity against HIV. The antibodies that are able to neutralize HIV are primarily directed against the virus envelope glycoprotein (env), but the vaccine candidates based on monomeric gp120 envelope protein tested so far failed to induce protection in efficacy trials. Advances in understanding the structure and function of the env glycoprotein have facilitated the development of a new generation of immunogens based on trimers, a more stable and soluble form of gp140 glycoprotein. In a vaccine formulation, in addition to the antigen, adjuvants play a pivotal role. Adjuvants are known to increase the immunogenicity of vaccines and, in the last years, several compounds, including agonists of Toll-like receptors (TLR) and NOD (NLR), have presented efficacy in clinical trials. In previous work, our group demonstrated that immunization of mice with a DNA vaccine (HIVBr18) encoding 18 CD4+ T cells epitopes from HIV-1 was able to induce a broad CD4+ T and CD8+ T cells specific response.. Given the important role of CD4+ T cells in the humoral response after adjuvant-assisted immunization, the aim of the study was to verify whether an initial immunization with the DNA vaccine HIVBr18 could increase the magnitude/quality of humoral and cellular immune response induced by gp140 trimer in the presence of different adjuvants. Therefore, BALB/c mice were initially immunized with the vaccine HIVBr18 or empty vector and then with gp140 in the presence of the following adjuvants: Freund\'s complete (CFA), poly IC, CpG ODN 1826, monophosphoryl lipid A (MPL), Muramyl dipeptide (MDP), Imiquimod (R837), and Resiquimod (R848). We observed that initial immunization with HIVBr18 was able to provide cognate help for specific CD4+ and CD8+ T cells proliferation and also for IFN-y production. Analysis of humoral response showed that initial immunization with the HIVBr18 vaccine was able to alter the production of immunoglobulin subclasses independent of the adjuvant tested. This work also analyzed the influence of adjuvants on the immunogenicity of gp140. Mice that received the adjuvant MPL, poly IC and CpG ODN 1826 presented higher antibody titers when compared to animals that received Alum, MDP, R837 and R848. We observed that mice immunized with gp140 in the presence of all adjuvants tested developed germinal center B cells and follicular helper T cells (TFH). We conclude that initial immunization with HIVBr18 is able to alter the quality of specific humoral and cellular immune responses.. Therefore, this formulation could be used in combination with other immunogens, such as gp140, to help/redirect the immune response. We also conclude that the adjuvants that are in clinical trials such as poly IC, MPL and CpG ODN 1826 may be able to induce stronger humoral and cellular response than CFA

Os avanços científicos das últimas décadas permitiram que a compreensão do câncer evoluísse de uma visão simplista, na qual o principal motor seria uma atividade celular hiperploriferativa, para uma visão mais complexa onde o estado fisiológico geral permite a gênese e progressão tumoral. Essa evolução permite o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas e traz novas esperanças para o tratamento de muitos tipos de cânceres ainda extremamente deletérios. Dentro desse novo panorama, terapias que estimulem a imunidade antitumoral têm se mostrado extremamente promissoras. Nesse trabalho, procuramos investigar os efeitos antitumorais desencadeados pela combinação da indução de morte celular e imunoestimulação. Para tanto, visamos à recuperação da via de p53 (pela transferência gênica do próprio p53 ou p19) associada à transferência gênica de IFNbeta. A transferência gênica foi mediada por vetores adenovirais do sorotipo 5. Nossas observações, em um modelo murino de carcinoma pulmonar, permitem concluir que esta linhagem é sensível a morte induzida pela transferência gênica de p19 e não p53. Porém, a transferência gênica intratumoral de IFNbeta se mostrou chave no controle do crescimento do tumor primário. Destacamos, entretanto, que a associação de IFNbeta com p19 produziu efeitos imunoprotetores superiores à transferência de IFNbeta ou p19 sozinhos. Tal efeito parece ser dependente da indução de fatores quimiotáxicos e conseqüente recrutamento de neutrófilos para o sítio tumoral. O efeito da transferência gênica combinada de ambos os genes IFNbeta e p19 se mostrou ainda mais promissor quando associado à cisplatina, induzindo uma notável redução no crescimento tumoral / Scientific advances from the last decades enabled the evolution of our knowledge of cancer from a simplistic vision, in which the main motor was an excessive cell proliferation, to a more complex one, where the general physiologic state enables tumorigenesis and tumor progression. This evolution enabled the development of new therapies and brings new hopes for the treatment of several types of cancers. In this context, therapies that induce an antitumor immunity are very promising. In this work, we are investigating the antitumor effects triggered by the combination of cell death induction and immunostimulation. To this end, we aimed to restore p53 pathway (by p53 or p19 gene transfer) associated with immunostimulation by IFNbeta gene transfer. The gene transfer was mediated by Adenovectors Serotype 5. Our observations in a murine model of lung cancer showed that this cell line is sensitive to cell death induced by p19 gene transfer, but not p53. Nevertheless, intratumoral gene transfer of IFNbeta, was crucial in controlling tumor growth. Moreover, p19 and IFNbeta association induced higher immunoprotecting effects than p19 or IFNbeta alone. This effect seems to be depending on the induction of chemotactic factors, and the recruitment of neutrophils to the tumor site. The effect of combined gene transfer of p19 and IFNbeta was even more promising when associated with Cisplatine, inducing a remarkable reduction in tumor growth

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:19:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_GustavoFerreira_D.pdf: 65115196 bytes, checksum: 18f51cababf3e248cceb806b8faef631 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Atualmente, muito se sabe sobre o acometimento muscular na DMD, mas poucos estudos estão voltados para os efeitos no Sistema Nervoso Central (SNC), mais especificamente no microambiente do motoneurônio medular. Sabe-se que durante a evolução da doença, o terminal axonal, na junção neuromuscular, entra em um ciclo de denervação (retração) e reinervação (brotamento). A possibilidade de modulação do MHC I se apresenta como uma nova estratégia de influenciar positivamente o processo de plasticidade sináptica após lesões do Sistema Nervoso Periférico (SNP) e SNC. Tal modulação pode ser realizada através da utilização ou desenvolvimento de drogas específicas. O fator estimulador de colônias glanulocitárias (G-CSF) é uma glicoproteína que foi descrita há mais de vinte anos, possui aprovação do ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e é comumente utilizada para tratar neutropenia, ou para transplantes de medula óssea. O GCSF possui um efeito neuroprotetor aparentemente multimodal, incluindo-se a atividade anti-apoptóptica em neurônios, regeneração da vascularização, efeito antiinflamatório e estimulação de neurogênese endógena, sendo capaz de atuar efetivamente no processo de regeneração do sistema nervoso. No presente trabalho, foram utilizados camundongos MDX. Os camundongos foram distribuídos em 4 grupos (axotomia + G-CSF; Axotomia; Controle + G-CSF e Controle), com n=10. Incluiu-se para imunoistoquímica o grupo placebo, onde os animais receberam uma dose diária de 200?m, via subcutânea, de glicose a 25%. Nossos resultados indicam que redução de sinapses nos motoneurônios alfamedulares e aumento da astrogliose circunjacente aos neurônios alfa-medulares, seja decorrente da desconexão parcial entre o orgão alvo e o corpo neuronal durante o período de ciclos de degeneração/regeneração muscular que ocorrem a partir das primeiras semanas de vida nos camundongos MDX. Estes ciclos podem repercutir retrogradamente nos corpos celulares dos motoneurônios alfa-medulares, provocando uma série de alterações denominadas cromatólise. A axotomia do nervo isquiático resulta num aumento significativo da expressão de MHC I nas duas linhagens estudadas. Contudo, nos animais MDX, este aumento é menor, comparativamente à linhagem C57BL/10. Quando tratados com G-CSF a expressão de MCH I ficou maior em relação aos grupos não tratados e, isso pode indicar um papel ativo da droga no potencial regenerativo após a lesão. Também podemos sugerir que, apesar dos animais MDX apresentarem uma menor função motora em relação aos animais controle, os resultados indicam que o tratamento com G-CSF é capaz de reduzir os efeitos inflamatórios e atuar positivamente no processo de regeneração nervosa periférica após esmagamento do nervo isquiático / Abstract: Currently, much is known about the muscular involvement in DMD, but few studies have focused on the effects on the central nervous system (CNS), specifically in the microenvironment of spinal motor neurons. It is known that during the course of the disease, the axon terminal at the neuromuscular junction, enters a cycle of denervation (retraction) and reinnervation (sprouting). The possibility of modulation of MHC I presents itself as a new strategy to positively influence the process of synaptic plasticity after injury Peripheral Nervous System (PNS) and CNS. Such modulation may be accomplished through the use or development of special drugs. The granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) is a glycoprotein which was first described more than twenty years, has approval from ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) and is commonly used to treat neutropenia, or bone marrow transplants. The G-CSF has a multimodal neuroprotective effect l, including the anti-apoptotic activity in neurons, regeneration of vascularization, anti-inflammatory effect and stimulation of endogenous neurogenesis, being able to act effectively in the process of regeneration of the nervous system. In this study, we used MDX mice. The mice were divided into 4 groups (axotomy + G-CSF; axotomy, Control + G-CSF and Control), with n = 10. Included immunohistochemistry to the placebo group, where the animals received a daily dose of 200?m, subcutaneously, glucose 25%. Our results indicate that reduction of synapses in the alpha motoneurosn and increased astrogliosis , either due to partial disconnection between the target organ and the neuronal body during the cycles of degeneration /regeneration muscle that occur from first weeks of life in MDX mice. These cycles can pass retrogradely in alpha motoneurons cell bodies, causing a series of changes called chromatolysis. The sciatic nerve axotomy results in a significant increase of MHC I expression in both strains studied. However, in MDX strain, this increase is smaller, compared to C57BL/10. After treatment with G-CSF the expression of MCH I got bigger compared to untreated groups, and this may indicate an active role in the regenerative potential of the drug after injury. Also we suggest that while the animals present MDX a smaller motor function compared to control animals, the results indicate that treatment with G-CSF is capable of reducing the inflammatory effects and act positively on peripheral nerve regeneration process after nerve crush sciatic. Also our results indicate that treatment with G-CSF is able to reduce the inflammatory effects and act positively on peripheral nerve regeneration process after nerve crush sciatic / Doutorado / Anatomia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Hipóxia é definida como a baixa teor de oxigênio. Nos tumores a principal causa da hipóxia é a isquemia, que ocorre em função do rápido crescimento da massa tumoral e diminuição ou obstrução dos vasos sanguíneos que irrigam o interior dos tumores. Como a hipóxia é uma das causas do aumento da resistência à radioterapia de radiação e algumas formas de quimioterapia, a identificação de tumores com regiões de hipóxia é de elevada relevância e a utilização de radiofármacos tem sido muito promissora, por ser um método não invasivo e que podem mapear diferentes alterações fisiológicas associadas à hipóxia. Neste trabalho sintetizamos o ligante [[99mTc](O)2HL91], com rendimento final de síntese de 82,6% e preparamos o respectivo complexo de tecnécio, com eficiência de marcação maior que 97 %; também foi preparado o radiofármaco (18F)FAZA, com eficiência de marcação de 17,9% e pureza radioquímica, após purificação, maior que 86 %. Estudos de captação em células de melanoma murino B16F10, apresentaram taxa de captação de 0,73%, em condições de normóxia e de 8,5 % em condições de hipóxia para o [[99mTc](O)2HL91] , sobe as mesmas condições, de 0,73% e 0,98%, para o (18F)FAZA, respectivamente. Estudos de biodistribuição ex vivo mostraram taxa de captação em tumores da ordem de 4,3% para o [[99mTc](O)2HL91] e de 0,56% para o (18F)FAZA, a relação tumor/sangue foi de 2,6% e 2,5%, respectivamente. Para ambos os rins são a principal via de excreção. Análise, por autorradiografia, de cortes dos tumores mostraram claramente a concentração do [[99mTc](O)2HL91] em regiões de hipóxia/necrose. Imagem da distribuição dos radiofármacos em camundongos C57/Bl6, com tumores de células B16F10, utilizando sistema hibrido PET/SPECT/CT dedicado a pequenos animais, mostraram que a concentração do [[99mTc](O)2HL91] permitiu visualizar captação difusa em regiões do tumor, o mesmo foi observado para o (18F)FAZA, mas em uma taxa menor. Em conclusão, os resultados obtidos apresentam as possibilidades de preparação e utilização de dois radiofármacos, o [[99mTc](O)2HL91] e o (18F)FAZA, como agentes marcadores para hipóxia, utilizando as técnicas de SPECT e PET para imagem. Todavia, novos estudos deverão ser realizados para determinação da especificidade desses radiofármacos em diferentes linhagens tumorais / Hypoxia is a deficiency of oxygen in the cell. In tumors the primary cause of hypoxia is ischemia, which occurs due to the rapid growth of the tumor mass and reduction or blockage of the blood vessels decreasing nutrients and oxygen supply in more internal regions of the tumors. Once hypoxia is one cause of the increased resistance to radiation therapy and some forms of chemotherapy, their identification in tumors is highly relevant and use of radiopharmaceuticals has been very promising, because it is a noninvasive and can map different physiological changes associated with hypoxia. In this work, we synthesized the ligand [[99mTc](O)2HL91] given a final synthesis yield of 82.6% and prepared their technetium complex with the labeling efficiency greater than 97%, the (18F)FAZA radiopharmaceutical was also prepared with labeling yield of 17.9% and marking radiochemical purity higher of 86 %, after purification. Uptake studies in murine B16F10 melanoma cells showed uptake rate of 0.73% in normoxic conditions and 8.5% in hypoxic conditions, for [[99mTc](O)2HL91], and, under same conditions, 0.73% and 0.98%, for (18F)FAZA. Ex vivo biodistribution study showed uptake rate in tumors of approximately 4.3% for [[99mTc](O)2HL91] and 0.56% for (18F)FAZA, the tumor/blood ratio was 2.6% and 2.5% respectively. For both products the main route 16 of excretion was by the kidneys. Analysis by autoradiography of tumors sections clearly showed the concentration of [[99mTc](O)2HL91] in hypoxia/necrosis regions. The distribution of radiopharmaceuticals in C57/Bl6 mice implanted with tumor B16F10 cells, using dedicated small animals hybrid system PET/SPECT/C, permitted to observe the uptake of the [[99mTc](O)2HL91] in diffuses points in the tumor regions, the same was observed for the (18F)FAZA, but with lower intensity. In conclusion, the results obtained show possibilities for preparation and use of both radiopharmaceuticals, the [[99mTc](O)2HL91] and (18F)FAZA as agents for hypoxia marker, using the SPECT and PET image techniques. However, further studies should be conducted to determine the specificity of these radiopharmaceuticals in different tumor cell lines