Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-05-27T15:35:37Z No. of bitstreams: 1 2013_LeticiaStockVieira.pdf: 18600579 bytes, checksum: 14a54125f3b23d05237dce58119ad628 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-27T16:11:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LeticiaStockVieira.pdf: 18600579 bytes, checksum: 14a54125f3b23d05237dce58119ad628 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-27T16:11:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LeticiaStockVieira.pdf: 18600579 bytes, checksum: 14a54125f3b23d05237dce58119ad628 (MD5) / Canais iônicos (CIs) são proteínas transmembrânicas capazes de regular o fluxo de íons, para dentro e para fora das células, abrindo e fechando seus poros. Tal regulação se da em resposta a diferentes estímulos, como ligação de moléculas, diferenças de potencial eletrostático, estímulos mecânicos, etc. Além disso, em geral, CIs são altamente seletivos a um íon. Assim, em função do íon transportado pelo canal, estes podem ser denominados canais de Na+, K+, Ca++ ou Cl-. O funcionamento de CIs está relacionado a uma variedade de funções biológicas essenciais como: contração muscular, sinapses, geração e transmissão de impulsos nervosos, controle da pressão osmótica, secreção hormonal, percepção do ambiente e consciência, entre outros. Portanto, essas proteínas tem sido alvo de intensas investigações ao longo das ultimas décadas. Diversas estruturas cristalográficas de canais iônicos foram resolvidas nos últimos anos. Conjuntamente com avanços no poder computacional, tais estruturas possibilitam a investigação de CIs com alta resolução, via simulações de dinâmica molecular (DM). Em 2011 foi publicada a primeira estrutura cristalográfica de canal de Na+: um CI bacteriano denominado NavAb (Payandeh et al., 2011). Observa-se que o poro de CIs apresenta uma estrutura geral comum. Em contrapartida, a região responsável pela discriminação dos íons, o chamado filtro de seletividade (FS), naturalmente mostra diferenças consideráveis. Segundo pode ser observado na estrutura cristalográfica, o FS de canais de Na+ e relativamente curto e amplo, sendo portanto capaz de acomodar íons hidratados no seu interior. Além disso, e sugerido que íons dispõem de certa mobilidade no interior desse FS. Tal descrição difere significativamente do ambiente constrito e pouco hidratado observado no FS de canais de K+. Frente a isso, espera-se que os mecanismos de condução em canais de Na+ e K+ sejam diferentes. Neste trabalho, cálculos de energia livre (via metadinâmica) e simulações de DM com aplicação de potenciais eletrostáticos transmembrânicos foram empregados na investigação do mecanismo de condução de canais de Na+, através do CI NavAb. Conjuntamente, ambas metodologias mostram que os íons ligam-se essencialmente a três sítios no interior do FS, chamados HFS, CEN e IN. Mostrou-se também que o movimento de íons e água no interior do filtro e pouco restrito. Em decorrência disso, e permitida a ocupação concomitante de um único sitio do FS por mais de um íon, o que implica em um mecanismo fundamentalmente distinto daquele observado em canais de K+. Outro resultado interessante aponta para uma assimetria nos mecanismos de condução de Na+ em condições de hiperpolarização ou equilíbrio (ΔV≤0) e de despolarização (ΔV>0). O mecanismo de condução predominante a ΔV ≤ 0 envolve essencialmente a participação de dois Na+. Em contrapartida, a ΔV > 0, o mecanismo conta com três íons, sendo que a chegada do terceiro estimula a liberação de um dos íons anteriormente presentes no canal. Perspectivas desse estudo impactam algumas das questões mais desafiantes da biofísica molecular atual, tais como: identificar os fatores determinantes da seletividade iônica; compreender melhor a relação estrutura-função de canais iônicos eucariotos, particularmente canais de Na+ e Ca++; mecanismo de ação de anestésicos e aplicações nanobiotecnológicas. _______________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Ion channels (ICs) are transmembrane (TM) protein pores, capable of regulating the flow of ions in and out of the cells by opening and closing the hydrated pathway they form. This can be done in response to various stimuli, such as binding of ligands, voltage, mechanical stimuli, etc. Moreover, most ICs are highly selective. Hence, according to the ion they selectively transport, ICs can be denominated either Na+, K+, Ca++ or Cl- channels. ICs functioning is essential to a variety of biological functions, e.g.: muscular contraction, electric signaling in neurons, control of the osmotic pressure, hormone secretion, consciousness, etc. Therefore have been the subject of intense research over the last 50 years. Several IC crystal structures have been resolved over the last few years. Along with improvements in computer processing power, such structures enable the investigation of ICs with atomic resolution, by means of molecular dynamics (MD) simulations. In 2011 the first crystal structure of a sodium channel (a bacterial channel named NavAb) was published (Payandeh et al., 2011). While ICs display a pore with overall conserved structure, significant differences can be seen in the so-called selectivity filter (SF): the pore region responsible for discriminating between different ionic species. As of its crystal structure, the Na+ channel SF is relatively short and wide, and thence can fit hydrated cations. Besides, ions and water molecules are expected to have a certain degree of mobility inside the SF. Such SF characteristics greatly differ from the narrow dehydrated environment described for the K+ channel SF. In this context, conduction mechanisms are also expected to be significantly different in these channels. Here, free energy calculations and MD simulations with an applied TM voltage were harnessed to investigate the conduction mechanisms of Na+ channels. Altogether, these methodologies indicate that Na+ ions can bind to three main sites within the SF, named HFS, CEN and IN. Because the movement of ions and water is less restricted, a side-by-side configuration of ions is permitted. This implies in a conduction mechanism fundamentally different from what is known for K+ channels. What is more, this study describes an asymmetry in the conduction mechanisms taking place under hyperpolarizing/neutral (ΔV≤0) and depolarizing (ΔV>0) conditions. Under ΔV≤0, conduction involves two Na+ ions bound to the filter. Contrastingly, under ΔV>0, 3 ions participate and the approach of the third ion triggers the conduction. Perspectives of this study can impart some of the most interesting questions in the molecular biophysics field, such as: identify the determinants of ion selectivity; better understand the structure-function interplay in eukaryotic ICs, specially Na+ and Ca++; the molecular mechanism of anesthetics action and nanobiotechnological applications.

Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L. / In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.

Este trabalho apresenta simulações físicas de correntes de densidade não-conservativas desenvolvendo-se num canal bidimensional de grande porte (5,00x0,40x1,00m) e declividade variável. A metodologia empregada foi desenvolvida em estudos anteriores (Manica, 2002 e Ávila, 2003) para ensaios em canal de pequeno porte e adaptada para o canal de maior porte, objetivando gerar subsídios para o estudo dos efeitos da escala de simulação sobre os padrões deposicionais de correntes de turbidez. As correntes foram formadas por uma mistura de água e carvão com massa específica em torno de 1023 kg/m3. A granulometria dos carvões utilizados ficou entre 0,062-0,297mm para o Carvão 207 e entre 0,062-0,177mm para o Carvão 205. Os experimentos foram divididos em três etapas. Na primeira etapa, foram simuladas correntes simples com o objetivo de realizar a transposição da metodologia de simulação física de correntes de turbidez do canal de pequeno porte para o canal de grande porte. Os dados obtidos foram comparados com os resultados pré-existentes do canal de pequeno porte provenientes dos estudos de Ávila (2003). Na segunda etapa foram simuladas correntes consecutivas, as quais foram compostas de um total de quatro fluxos por ensaio. Novamente, os dados obtidos foram comparados com os resultados pré-existentes dos estudos de Ávila (2003). Finalmente, na terceira etapa, foram simuladas correntes simples sobre canal com declividades de –0,5° e 2,0°. As correntes 00000geradas durante a segunda e a terceira etapas também tiveram seus parâmetros geométricos (alturas da cabeça e do corpo) e hidrodinâmicos (velocidades e acelerações da cabeça) comparados com dados pré-existentes de simulações com correntes conservativas (Fabian, 2002) Os resultados obtidos demonstraram que os depósitos gerados durante a primeira etapa foram os que mais se assemelharam aos dados pré-existentes de Ávila (2003) no que se refere às distribuições longitudinais e verticais. Também se observou que as correntes nãoconservativas não apresentaram variações significativas das alturas da cabeça e do corpo para as declividades ensaiadas. Tais observações acerca dos depósitos e da hidrodinâmica sugerem que, para que se garanta a eliminação de efeitos de escala, devem ser mantidas constantes: a massa específica do sedimento empregado na mistura, as condições de admissão da mesma e também o valor do número de Froude Densimétrico. Também há indícios de que variações nos parâmetros geométricos das correntes podem estar associadas com a massa específica do sedimento empregado para a simulação e com as condições de admissão da mistura.

Esta dissertação apresenta uma revisão sobre canais iônicos com respeito aos seus aspectos biofísicos e sobre alguns modelos matemáticos utilizados em sua análise. As abordagens dividem-se em duas classes: uma em que é possível realizar análises exatas e outra mais apropriada à análise numérica. Será revista a solução da equação de Poisson em coordenandas toroidais, que fornece uma expressão para o potencial elétrico na região do canal. Uma outra abordagem estudada utiliza os ensembles da mecânica estatística de equilíbrio para determinar a forma do potencial elétrico médio nessa mesma região. As descrições destinadas à análise numérica compreendem: uma formulação em que todos os elementos são considerados como meios contínuos; a Dinâmica Browniana e a Dinâmica Molecular. A dissertação é encerrada com a apresentação de alguns resultados experimentais sobre canais reais. Ao final, o leitor deverá ter um panorama sobre os estudos, teóricos e aplicados, no campo da condução passiva de íons através de membranas celulares. Esta dissertação não tem por finalidade esgotar os tópicos que abrangem esta área do conhecimento. / This dissertation presents a review about ion channels with respect to their biophysical aspects and some mathematical models employed in its analysis. Our approach is separated in two parts: one where it is possible to achieve exact results and another more suitable to numerical analysis. There will be reviewed a solution for Poisson’s equation in toroidal coordinates which gives an expression for electrical potential in the region of the channel. Also, There will be reviewed the mean force potential formulation derived from the ensembles of equilibrium statistical mechanics. The numerical analysis approach comprehends formulations where all elements are considered as a continuum media and via Brownian Dynamics and the Molecular Dynamics. This dissertation finishes with a discussion of some experimental results about real channels. At the end of this all, the reader should have an overview about the studies, both theoretical and applied, in the field of passive conduction of ions through cell membranes. However, this dissertation has no intention to be a comprehensive review of the subject.

A comparação entre cooperativas e empresas privadas, com ba se em pressupostos teõricos, tem feito crescer, nos últimos tempos a convicção de que as diferenças entre ambas são cada vez menores. Cresce o consenso de que as cooperativas, no afã de fazer frente -a-s empresas privadas, engajam-se em um processo de desenvolvimento muito prõximo a um comportamento capitalista que se contrapõe ã fi losofia do cooperativismo. Com a preocupação de levar a comparação entre cooperativas e empresas privadas para o ãmbito dos fatos concretos, elaborou-se o presente trabalho. Com base em levantamentos de campo, comparouse a atuação daqueles dois tipos de instituições no que se refere ao desempenho das funções de marketing envolvidas na distribuição da soja no Rio Grande do Sul. Foram pesquisadas 28 cooperativas e 20 empresas privadas, cuja seleção foi feita com base no volume de soja comercializada em 1981. As instituições participantes da amostra, em função do vo lume comercializado naquele ano, enquadram-se nos três extratos se guintes: pequenas, médias e grandes. Essas instituições movimenta ram em 1981, 4,5 milhões de toneladas de soja, o que representa 74% da safra gaúcha deste ano. Os resultados permitiram concluir que as cooperativas que participam do canal de distribuição da soja no Rio Grande do Sul, caracterizam-se pela prestação de serviços. Desempenham atividades intensas nas ãreas de armazenagem, beneficiamento, financiamento e fomento à produção da soja, mas não participam de forma efetiva na transformação do produto. A industrialização e- dominada pelas empresas privadas. Ficou evidente que as funções de marketino desempenhadas pe las cooperativas assumem um carãter de apoio aos produtores de so ja, enquanto que as empresas privadas, em geral, utilizam-se delas como instrumentos de barganha para aumentar, ou pelo menos manter, a participação na aquisição do produto. Na categoria de prestadoras de serviços e com a predisposi çio de atender preponderantemente às demandas dos fornecedores, as cooperativas propiciam aos usuãrios de seus serviços maior flexibi lidade em termos de quando e a quem vender o produto. Desta forma, os resultados deste trabalho se contrapõem às supostas semelhanças entre o comportamento de cooperativas e empre sas privadas, muito embora o esclarecimento definitivo acerca das reais diferenças entre ambas deva ser confirmado através de novas pesquisas, enfocando novos aspectos de seus comportamentos. / Lately, in comparing cooperatives and private businesses based on theoretical assumptions, there has been a growing conviction that differences between them are diminishing. There is an increasing consensus that cooperatives which strive to compete with private business use a development process very similar to capitalist behaviour, which is the opposite of the philosophy of cooperati vi sm. The purpose of this study was to achieve a concrete comparison between cooperatives and private companies. Based on field surveys, the behaviour of these two types of institution was compared as to the performance of marketing functions involved in soy-bean distribution in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. Twenty-eight cooperatives and twenty private companies studied, were chosen by the amount of soy-bean sold in 1981. The institutions participating in the sample, as function of the volu me of turnover for that year, are classified according to the three following extracts: small, medium-sized and large. In 1981, these institutions had a turnover of 4,5 million tons of soy-bean, equivalent to 74% of the Rio Grande do Sul production for that year. It was concluded, from the results that the main characteristic of cooperatives participating in the soy-bean distribution channel for Rio Grande do Sul is service. They are very active in providing storage, processing, financing and incentives to soy pro duction, but do not participate effectively in product transformation. Industrial processing is carried out mainly by private companies. It became obvious that the marketing functions of the coope ratives are to supoort soy-bean producers, whereas private busines ses generally use them as bargaining instruments to increase, orat least maintain, participation in product purchase. As service companies nrepared to satisfy mainly the demands of the suppliers, cooperatives provi de the users of their services with greater flexibility in terms of when and to whom the product is to be sold. Thus, the results of this study show the contrary of the previously assumed differences between the behaviour of cooperatives and private companies, although a defini te explanation of real differences between them must be confirmed by new studies focusing other aspects of their behaviour.

O monossialotetra-hexosilgangliosídeo (GM1) é um glicoesfingolipídio presente nas membranas celulares que exerce propriedades antioxidantes e neuroprotetoras. Os mecanismos neuroquímicos envolvidos na neuroproteção induzida pelo GM1 não são completamente conhecidos. Recentemente, foi demonstrado que o GM1 aumenta a quantidade da enzima catalase no SNC por causar vasodilatação, e sugeriu-se que a vasodilatação possa ser responsável pelas suas propriedades neuroprotetoras. Contudo, o mecanismo pelo qual o GM1 causa vasodilatação não foi determinado. Dado o papel central do óxido nítrico (NO), bem como de canais de potássio no controle do tonus do músculo liso, o objetivo deste trabalho foi determinar a participação do NO e de canais de K+ na vasodilatação induzida pelo GM1. Primeiramente, avaliamos o efeito da administração de L-NAME (metil éster de NGnitro- L-arginina, 60 mg/kg, i.p.), um inibidor da enzima óxido nítrico sintase (NOS), na vasodilatação cerebral induzida pelo GM1 (50 mg/kg, i.p.) em ratos Wistar machos adultos. Verificamos que o L-NAME preveniu o aumento do diâmetro dos vasos cerebrais induzido pelo GM1. Tendo em vista a participação do NO no efeito vasodilatador do GM1, determinamos o conteúdo de nitritos e nitratos (NOx), bem como de hemoglobina (Hb) no hipocampo e no córtex cerebral, 15, 30 e 60 min após a administração de GM1. Observamos um aumento no conteúdo de Hb e uma redução dos níveis de NOx após 60 min. Dado que nitritos e nitratos podem ser removidos in vivo pelo sangue por ligação com a Hb, um possível efeito do GM1 sobre o conteúdo de NOx poderia ser mascarado. No intuito de contornar essa situação, determinamos os níveis de NOx em fatias de córtex cerebral incubadas com GM1 (0, 10, 30 e 100 µM). Verificamos que o GM1 (100 µM) aumentou os níveis de NOx em 30 min e, reduziu o conteúdo em 60 min, sem alterar o conteúdo de Hb. Ainda, mostramos que o L-NAME (100 µM) reverte o aumento de NOx induzida pela incubação com GM1 (100 µM, por 30 minutos) em fatias de córtex cerebral, sem alterar o conteúdo de Hb. Tendo em vista a participação do NO no efeito vasodilatador do GM1, e conhecendo a capacidade de ligação da Hb com o NO, determinamos a via de relaxamento muscular mediada pelo NO em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos. Verificamos que o GM1 causou relaxamento vascular através de uma curva cumulativa de concentrações (10 nM a 3 mM), e também determinamos que a participação do endotélio é fundamental para este efeito. O efeito vasorelaxante do GM1 além de ser dependente da presença do endotélio vascular, é completamente bloqueado pela presença de L-NAME (1 µM), da mesma forma que os resultados encontrados nos experimentos com vasos cerebrais. Considerando que o NO formado no endotélio ativa a guanilato ciclase (GCs), também testamos o efeito do inibidor desta enzima (ODQ-1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one) no efeito vasorelaxante do GM1. Neste caso, o efeito do GM1 foi bloqueado parcialmente pelo ODQ (10 µM). Além da participação da GCs, avaliamos o papel dos canais de K+ no efeito vasorelaxante do GM1. Verificamos que o tetraetilamônio (1 mM), um bloqueador não seletivo, assim como a glibenclamida (10 µM), bloqueador dos canais de K+ sensíveis ao ATP bloquearam parcialmente o efeito do GM1. Por outro lado, a apamina (50 nM), um bloqueador de canais de K+ dependentes voltagem e Ca²+ (KCa) de baixa condutância não alterou o efeito do GM1, enquanto que a caribdotoxina (50 nM), um bloqueador de KCa de alta condutância deslocou a curva de relaxamento para a direita. Em resumo, neste trabalho mostramos a participação do NO e dos canais de K+ na vasodilatação induzida pelo GM1. Embora mais estudos sejam necessários para estabelecer o mecanismo vasodilatador do GM1, sugerimos que uma terapia adjunta com GM1 ou com drogas correlatas é válida em condições clínicas onde o aumento do fluxo sanguíneo é associado a um melhor prognóstico, como doenças vasculares obstrutivas e doenças neurodegenerativas. / Monosialotetra-hexosylganglioside (GM1) is a glycosphingolipid present in most cell membranes which displays antioxidant and neuroprotective properties. Additionally, it has been recently demonstrated that GM1 increases catalase content in the CNS due to vasodilation, and it has been suggested that vasodilation may be responsible, at least in part, for the neuroprotective properties of GM1. However, the mechanisms underlying GM1-induced vasodilation have not been determined. Given the pivotal role of nitric oxide and potassium channels in the control of vascular tonus, we decided to investigate whether these mediators are involved in the vasodilation induced by GM1. Initially, we investigated the effect of L-NAME (NG-nitro-L-arginine methyl ester, 60 mg/kg, i.p.), an inhibitor of nitric oxide sinthase (NOS), on the cerebral vasodilation induced by GM1 (50 mg/kg, i.p.) in male wistar rats. L-NAME fully prevented the increase in outer diameter of pial vessels induced by GM1. In addition, we investigated the content of stable NO end products, namely, nitrites and nitrates (NOx), as well as the content of the hemoglobin (Hb) in the hipocampus and cerebral cortex 15, 30 and 60 min after GM1 administration. Interestingly, GM1 increased Hb content and decreased NOx content 60 min after administration. Since it has been demonstrated that NO end products like NOx can be removed from brain in vivo by blood flow, a possible effect of GM1 on NOx levels could be masked. Therefore, we decided to investigated the effect of GM1 (0, 10, 30 e 100 µM) on NOx content in slices of cerebral cortex. The incubation of slices with GM1 (100 µM) for 30 min significantly increased NOx levels. In addition, we observed decreased NOx levels after 60 min of incubation, without changes in Hb content. In order to obtain pharmacological evidence for the role of nitric oxide synthase (NOS) in GM1-induced increase of NOx content in situ, cortical slices were incubated with L-NAME (100 µM) in the presence or absence of GM1 (100 µM) for 30 minutes, and the NOx content was measured. L-NAME blunted GM1-induced increase of NOx content. Since it has been demonstrated that GM1 induces pial vessel vasodilation and increases NOx content in cerebral cortex, which are fully prevented by the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME, we further investigated whether GM1 relaxes larger vessels, as well as the mechanisms by which GM1 causes vasorelaxation. We found that GM1 (10, 30, 100, 300 µM, 1 and 3 mM) induced vascular relaxation of the rat mesenteric artery, as determined by isometric tension studies in arterial rings contracted with 1 µM phenylephrine. The vasorelaxation induced by GM1 was abolished by endothelium removal, by incubation with LNAME (1 µM) and partially inhibited by the blockade of potassium channels by 1 mM tetraethylammonium, 10 μM glibenclamide, by the soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one (10 µM), and by 50 nM charybdotoxin, a blocker of large and intermediate conductance calcium-activated potassium channels. Moreover, GM1- induced relaxation was not affected by apamin (50 nM), a small conductance calcium-activated potassium channel blocker. Althogether, these results indicate that nitric oxide and potassium channels participate in the vasodilation induced by GM1. Although more studies are necessary to definitely establish the mechanisms underlying the GM1-induced vasodilation, we suggest that vasodilation may underlie some of the biological effects of exogenous GM1 ganglioside and that adjunct therapy with GM1 may be of value in clinical conditions in which increased blood flow is associated to a better prognosis, such as obstructive vascular and neurodegenerative diseases. We found that GM1 (10, 30, 100, 300 µM, 1 and 3 mM) induced vascular relaxation of the rat mesenteric artery, as determined by isometric tension studies in arterial rings contracted with 1 µM phenylephrine. The vasorelaxation induced by GM1 was abolished by endothelium removal, by incubation with LNAME (1 µM) and partially inhibited by the blockade of potassium channels by 1 mM tetraethylammonium, 10 μM glibenclamide, by the soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4]oxadiazolo[4,3-alpha]quinoxalin-1-one (10 µM), and by 50 nM charybdotoxin, a blocker of large and intermediate conductance calcium-activated potassium channels. Moreover, GM1- induced relaxation was not affected by apamin (50 nM), a small conductance calcium-activated potassium channel blocker. Althogether, these results indicate that nitric oxide and potassium channels participate in the vasodilation induced by GM1. Although more studies are necessary to definitely establish the mechanisms underlying the GM1-induced vasodilation, we suggest that vasodilation may underlie some of the biological effects of exogenous GM1 ganglioside and that adjunct therapy with GM1 may be of value in clinical conditions in which increased blood flow is associated to a better prognosis, such as obstructive vascular and neurodegenerative diseases.

O preparo químico-mecânico tem sido essencial no sucesso do tratamento endodôntico. No entanto, atualmente não existe instrumento ou técnica com capacidade de proporcionar a limpeza e a desinfecção dos sistemas de canais em sua totalidade. O objetivo desse estudo foi avaliar a limpeza, tempo, transporte e centralização de preparos de canais radiculares curvos utilizando os sistemas de rotação contínua ProTaper®, de rotação alternada WaveOne® e uma sugestão de técnica híbrida de preparo. Foram selecionadas raízes mesiais de primeiros molares inferiores humanos permanentes extraídos. Após a definição dos ângulos de curvatura e raio, os canais (n=60) foram divididos em três grupos experimentais, conforme sistemas de preparo (ProTaper, WaveOne, WaveOne Técnica Híbrida). O diâmetro apical final foi padronizado em #25. As quantidades de debris e smear layer remanescentes foram analisadas em microscopia eletrônica de varredura, através de escores, e avaliadas estatisticamente por meio do teste de Kruskal–Wallis. Fraturas ou deformações nos instrumentos foram registradas. O tempo de preparo foi cronometrado e analisado através de ANOVA e Tukey. Tomografia computadorizada de feixe cônico pré e pós-operatória foram feitas para mensuração do transporte e centralização dos canais e os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente através de ANOVA. Em relação à capacidade de limpeza, os três grupos apresentaram semelhante capacidade em remover debris e formar smear layer, sem diferenças estatísticas (P>0,05) em todas as porções dos canais. O preparo com apenas um instrumento foi significativamente mais rápido do que com sequências de instrumentos (P<0,05). Durante a instrumentação, não ocorreram fraturas, apenas três instrumentos deformaram. Não foram encontradas diferenças no transporte e centralização dos canais entre os sistemas. Sob as condições deste estudo, todos os instrumentos apresentaram uma capacidade de limpeza similar, sendo o instrumento único semelhante aos demais sistemas de sequências de instrumentos, contudo, reduzindo o tempo de preparo de forma significativa. Nenhum instrumento forneceu um debridamento completo. Todos os grupos mostraram-se similares em relação à capacidade de manter a curvatura original do canal. / The chemo-mechanical preparation is essential for successful endodontic treatment. However, currently no instrument can predictably clean the entire root canal system. The aim of this investigation was to assess the cleanliness, preparation time and shaping ability of curved root canals in extracted human molar teeth using rotary full-sequence ProTaper, single-file system WaveOne and a protocol using both systems. Sixty canals had the degree and the radius of curvature determined and were divided into three groups according with preparation systems. Canals were prepared until #25 apical sizes and the shaping ability and the cleaning efficacy were evaluated. The amounts of debris and smear layer were quantified on the basis of a numerical evaluation scale by scanning electron microscope and were analyzed statistically using the Kruskal–Wallis test. Instrument failures were recorded. Preparation time was analyzed statistically using ANOVA and Tukey. Teeth were scanned pre- and post-operatively using computed tomography to measure shaping changes and the obtained results were statistically analyzed using ANOVA. For debris removal and smear layer remaining, the results for three groups were similar and not significantly different for the all parts of the canals (P> 0.05). Instrumentation with WaveOne was significantly faster than with other instruments (P< 0.05). During preparation, no file fractured, three suffered deformations. No difference in the transportation and centering ratio was found between the systems. Under the conditions of this study, all instruments maintained the original canal curvature well and were safe to use. A single-file system presented as good cleanliness capacity as others, reducing the preparation time significantly, although none could provide a complete debridement.

Resumo não disponível.

No presente estudo, foi investigado o mecanismo pelo qual, o isoproterenol hiperpolariza o potencial de membrana (PM) da célula de Sertoli em túbulos seminíferos de ratos, com quinze dias de idade (imaturos). Foram analisadas a modificação do potencial de membrana e a resistência, utilizando-se a técnica de registro intracelular. O isoproterenol (2x10-6M) induziu uma hiperpolarização imediata e significativa na membrana da célula de Sertoli. O antagonista β2-adrenérgico butoxamina (1x10-6M) anulou a ação do isoproterenol. O antagonista β1-adrenérgico metoprolol (1x10-6M) teve efeito de reduzir a ação do isoproterenol, porém sem ser significativo. A inibição dos canais K+ATP, com a sulfoniluréia glibenclamida, suprimiu a ação do isoproterenol. A testosterona, a qual atua despolarizando o potencial de membrana, através do fechamento de canais K+ATP, via PLC-PIP2, impediu a hiperpolarização produzida pelo agonista β-adrenérgico. Os policátions como: espermina e LaCl3 (cloreto de lantâno) reverteram o efeito hiperpolarizante do isoproterenol, despolarizando o potencial de membrana, provavelmente através de interações iônicas que neutralizam a ação do agonista β-adrenérgico nos canais K+ATP. O agonista da adenilato ciclase, forscolina (1x10-7M), rapidamente hiperpolariza o potencial de membrana da célula de Sertoli, mimetizando o efeito do isoproterenol; db-AMPc também hiperpolariza o potencial de membrana destas células. Estes efeitos indicam que o isoproterenol age nos canais K+ATP, provavelmente, envolvendo a cascata: receptor β-adrenérgico/Gs/AC/AMPc/PKA. Estes resultados sugerem que a hiperpolarização induzida por isoproterenol é mediada pela abertura de canais K+ATP, em células de Sertoli. Esta hiperpolarização β-adrenérgica, provavelmente, tem uma papel fisiológico, na modulação do potencial de membrana, opondo-se à despolarização produzida pela testosterona, através do fechamento dos canais K+ATP.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3132_1.pdf: 3125724 bytes, checksum: 3bf874d76ef407eac106e41b1d8b6065 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Canais iônicos são proteínas integrais, formadoras de poros na membrana plasmática das células e são de extrema importância para as funções intra e extracelulares. Os poros ajudam no transporte rápido e seletivo dos íons, nutrientes e metabolitos pela membrana plasmática, portanto estão diretamente relacionados a diferentes funções no organismo como, transmissão sináptica, contração muscular, secreção hormonal, regulação do volume celular, proliferação celular e diferenciação. Podemos classificar os canais iônicos de acordo com seu principal estímulo para ativação: temos os canais ativados por ligantes intracelulares, canais ativados por ligantes extracelulares, canais de potássio e cloreto ativados por cálcio, canais sensíveis a ácidos e canais dependentes de voltagem (Na+, K+, Ca+ e Cl-). Os canais iônicos têm sido extensamente estudados, e novas informações vêm sendo acumuladas nos últimos anos, mostrando a importância da participação destes canais em processos relacionados à homeostase, como também sua contribuição na proliferação e diferenciação celular. Nesse trabalho procuramos identificar os níveis de RNAm em quatro tipos de canais iônicos, canal de potássio de alta condutância ativado por cálcio (MaxiK), canal aniônico dependente de voltagem (pl-VDAC), Canal de cloreto ativado por cálcio (CLCA1) e Canal de potássio dependente de voltagem (hEAG1) nas células-tronco mesenquimais de cordão umbilical, a partir da geléia de Wharton (hwCTMs), nas diferentes fases do ciclo (G0/G1, S e G2/M) e diferenciação celular (adipo- e osteogênica), visando contribuir no processo de terapia celular. O RNA total de hwCTMs foi extraído utilizando RNeasy mini kit (QIAGEN). O RNA transcrito em cDNA com superScript reverse (Invitrogen). PCR em Tempo Real foi realizada no ABI prisma 7500 (Applied Biosystems) usando supermix UDG (Invitrogen). Em acordo com os dados publicados, o estímulo osteogênico originou características osteoblásticas das células comprovadas por coloração histoquímica (alizarin red S) onde se observou o aparecimento células alongadas com presença de granulações escuras (cristais de hidroxiapatita) na matriz extracelular. A comprovação da diferenciação adipogênica foi feita por coloração histoquímica com oil red O, mostrando células com morfologia mais arredondada e presença de vacúolos de gordura. Estabelecemos que entre os quatro canais estudados, dois, CLCA1 e hEAG1, não se expressaram, enquanto a expressão dos MaxiK e pl-VDAC foi consideravelmente alto atingindo ~10% do valor de housekeeping gene Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Encontramos que a expressão dos MaxiK e pl-VDAC aumentaram durante a progressão do ciclo celular (G0/G1, S e G2/M) nas hwCTMs. Detectamos que a diferenciação muda a expressão dos canais MaxiK e pl-VDAC de maneira oposta: o canal MaxiK aumenta enquanto que o pl-VDAC diminui. Os dados ampliam o conhecimento sobre os tipos dos canais iônicos e o nível da expressão nas hwCTMs aumentando a compreensão da biologia de células-tronco mesenquimais