Les canaux ioniques sont des protéines membranaires permettant le transport ionique au travers des membranes biologiques. Du fait de leur omniprésence dans l'organisme, ils représentent une classe de cibles thérapeutiques encore actuellement peu exploitée du fait de limitations expérimentales dans leur étude. La mesure électrique de l'activité des canaux ioniques au sein de bicouches biomimétiques reconstituées in vitro permettrait de répondre à ces limitations. Cependant, il n'existe actuellement pas de système satisfaisant au cahier des charges complet pour de telles analyses : stabilité et pureté de la bicouche, faible niveau de bruit, insertion rapide des canaux ioniques, intégration dans un dispositif fluidique, possibilité de mener une caractérisation optique simultanée. L'objectif de ces travaux de thèse était d'évaluer dans quelle mesure l'utilisation d'un substrat SOI (Silicon On Insulator) comprenant des nanopores pourrait permettre de répondre à tous ces critères. Des nanopores de diamètre compris entre 10 nm et 160 nm ont été réalisés à partir d'un substrat SOI. Une cellule fluidique transparente est utilisée pour l'adressage fluidique. Cette cellule permet d'autre part la double caractérisation électrique et optique. Les propriétés électriques en milieu liquide du dispositif ont été étudiées et permettent de dégager des perspectives d'amélioration. La double caractérisation électrique et optique est démontrée au moyen d'expériences de capture de nanoparticules fluorescentes sur les nanopores. Enfin, des premiers résultats prometteurs d'obtention d'une bicouche lipidique suspendue sont présentés. / Ion channels are membrane proteins responsible for ion transport across biological membranes. Due to their ubiquity, they are promising drug targets but are not yet fully exploited as such due to experimental restrictions in their study. Electrical measurement of ion channels activity within in vitro artificial lipid bilayers would enable to overcome these restrictions. However, there is not yet a system satisfying all the requirements for ion channels studies: stability and purity of the lipid bilayer, low noise level, fast insertion of ion channels, fluidic integration, ability to perform simultaneous optical characterization. The aim of this phD was to assess in which extent the use of an SOI (Silicon On Insulator) substrate bearing nanopores could satisfy all these requirements. 10 nm to 160 nm diameter nanopores were fabricated in an SOI substrate and characterized. A transparent fluidic cell was used for fluidic addressing. This transparent cell allows combined electrical and optical characterization. Electrical properties of the device in aqueous environment were studied, allowing to bring out improvement prospects. The combined electrical and optical characterization was demonstrated with fluorescent nanoparticle trapping experiments on the nanopores. Finally, promising results about the formation of a free-standing lipid bilayer are presented.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l’Université de Montréal / Les canaux ioniques présents dans la membrane des cellules musculaires lisses vasculaires, et surtout des cellules retrouvées au niveau des artères de résistance, jouent des rôles prépondérants dans le contrôle du potentiel membranaire et de la contractilité vasculaire. Nos deux études ont porté sur l) les propriétés biophysiques et pharmacologiques des canaux potassiques (K+) et 2) les propriétés fonctionnelles des canaux perméables au chlore (Cl') dans la régulation de l'activité électromécanique des cellules artérielles. Dans la première partie de cette thèse, nous décrivons le mécanisme de l'interaction entre la 4-aminopyridine et un courant K+ sortant à rectification retardée (Kdr) dans des cellules d'artères coronaires de conductance de lapin. Parmi les multiples canaux K identifies au niveau des cellules musculaires lisses vasculaires, Kdr joue un rôle majeur dans le maintien du potentiel membranaire de repos entre -70 et -40 mV. La 4-aminopyridine (4- AP) est un inhibiteur relativement spécifique du canal Kdr et a été utilisée abondamment pour caractériser ses propriétés biophysiques et son rôle physiologique. Malgré son usage répandu, on ne connaît pas la nature de l'interaction entre la 4-AP et le canal Kdr concernant les canaux Kdr, nous estimons que le canal Kdr coronaire est possiblement un hétéro-multimère de plusieurs sous-unités fonctionnelles a et modulatrices P. Le but de notre deuxième étude a été d'évaluer le rôle des canaux Cl' dans la contraction vasculaire induite par la stimulation des récepteurs αi-adrénergiques, et de mesurer l'influence de changements de la pression transmurale sur cette réponse. Malgré l'importance des canaux calciques de type L (CaL) dans la contraction vasculaire, des études récentes suggèrent que deux canaux perméables au Cl' dépendants du Ca2+ intracellulaire (CICa) ou sensibles aux changements de volume (Clvol) sont impliqués, respectivement, dans la dépolarisation et contraction engendrées par certains agonistes vasoconstricteurs ou lors d'une élévation de la pression transmurale ("réponse myogénique"), propriété à laquelle on attribue un rôle important dans les mécanismes d'autorégulation dans plusieurs lits vasculaires. En condition isobarique, nous avons évalué le rôle des canaux Cl' dans les réponses αi-adrénergique (stimulée par la phényléphrine - PE) et myogénique des artérioles (70 -100 pm diamètre interne) mésentériques de lapin. Nos observations nous ont permis de tirer les conclusions suivantes. i) La PE cause une vasoconstriction liée à l'activation des canaux CICaet CaL. ii) L'acide niflumique (NfA) ou le 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid (DIDS) ne modifie pas la contraction induite par l'activation des canaux CaL. iii) La dilatation induite par l'inhibition de dca par la NfA est dépendante de la pression pour des concentrations faibles et modérées (0.5 à 1 µM) de l'agoniste PE. iv) L'étirement de la paroi causée par une hausse de la pression transmurale active possiblement un courant sensible au DIDS qui "masque" en partie la vasoconstriction induite par la PE attribuée à l'activité des canaux CICa. v) La dépolarisation induite par la PE est renversée complètement par la NfA. vi) Le courant sensible au DIDS contribue à la réponse myogénique. Ces travaux mettent donc en évidence l'importance physiologique des canaux Cl' dans la dépolarisation et la contraction de la microcirculation mésentérique associées à la stimulation par le système nerveux autonome sympathique dans des conditions normales de pression transmurale.

Thèse en cotutelle avec Université de Nantes - Pays de La Loire - France (2005-2010) / Les maladies cardio-vasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. L’hypertrophie cardiaque est un processus de remodelage provoqué par une surcharge de travail du muscle cardiaque afin de mieux répondre à la demande de l’organisme. Bien que bénéfique à court terme, une hypertrophie trop accentuée conduira à long terme, à une insuffisance cardiaque. L’hypertrophie est associée à un remodelage électrique qui conduit généralement à un allongement du potentiel d’action, une des causes des arythmies ventriculaires et de la mort subite. Généralement, le mécanisme causal est la fibrillation ventriculaire, un trouble du rythme irréversible dont les mécanismes sont complexes et méconnus. Si les conséquences fonctionnelles in vitro des mutations génétiques ou du remodelage ionique sont relativement simples à étudier ou à prévoir, leur rôle dans les mécanismes des troubles du rythme in vivo sont plus difficiles à appréhender. Parmi les nombreux modèles animaux développés pour la recherche sur les troubles du rythme, la souris est de plus en plus utilisée en raison de notre capacité à muter, invalider ou sur-exprimer les gènes d'intérêt chez ces animaux. L'objectif de mon travail de thèse était de mieux comprendre le rôle des canaux ioniques en physiopathologie cardiaque, en particulier dans la survenue des troubles du rythme in vivo. Ces travaux ont permis d'améliorer notre connaissance du rôle des anomalies génétiques impliquant des canaux ioniques et du remodelage ionique dans la physiopathologie des troubles du rythme et pourrait ainsi ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement anti-remodelage cardiaque et la prévention de la mort subite. / Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world each year. If no action is taken to improve cardiovascular health and current trends continue, WHO estimates that 25% more healthy life years will be lost to cardiovascular disease globally by 2020. Cardiac hypertrophy is the consequence of an excessive workload of the heart muscle leading to cardiac remodeling process. As the workload increases, the ventricular walls grow thicker, lose elasticity and eventually may fail to pump with as much force as a healthy heart. Furthermore, hypertrophied myocardium is not physiologically normal and may confer a predisposition to potentially fatal arrhythmias. Generally, the causal mechanism is ventricular fibrillation, a cardiac rhythm disorder which is irreversible but the pathophysiological mechanisms are complex and poorly understood. The functional consequences of mutations or ionic remodeling are relatively simple to study in vitro, but their role in the pathophysiology of arrhythmias in vivo is more difficult to grasp. Among the different animal models developed in cardiac arrhythmias research, the mouse is increasingly used because of our ability to mutate, knock-out or over-express genes of interest. The objective of my thesis was to study the role of ion channels in physiology as well as cardiac pathophysiology, particularly in the involvement of the occurrence of cardiac arrhythmias in vivo. This thesis will improve our understanding of the role of genetic abnormalities involving ionic remodeling in the pathogenesis of the heart and may also open new therapeutic perspectives in the treatment of cardiac remodeling as well as sudden cardiac death.

Les maladies cardio-vasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. L’hypertrophie cardiaque est un processus de remodelage provoqué par une surcharge de travail du muscle cardiaque afin de mieux répondre à la demande de l’organisme. Bien que bénéfique à court terme, une hypertrophie trop accentuée conduira à long terme, à une insuffisance cardiaque. L’hypertrophie est associée à un remodelage électrique qui conduit généralement à un allongement du potentiel d’action, une des causes des arythmies ventriculaires et de la mort subite. Généralement, le mécanisme causal est la fibrillation ventriculaire, un trouble du rythme irréversible dont les mécanismes sont complexes et méconnus. Si les conséquences fonctionnelles in vitro des mutations génétiques ou du remodelage ionique sont relativement simples à étudier ou à prévoir, leur rôle dans les mécanismes des troubles du rythme in vivo sont plus difficiles à appréhender. Parmi les nombreux modèles animaux développés pour la recherche sur les troubles du rythme, la souris est de plus en plus utilisée en raison de notre capacité à muter, invalider ou sur-exprimer les gènes d'intérêt chez ces animaux. L'objectif de mon travail de thèse était de mieux comprendre le rôle des canaux ioniques en physiopathologie cardiaque, en particulier dans la survenue des troubles du rythme in vivo. Ces travaux ont permis d'améliorer notre connaissance du rôle des anomalies génétiques impliquant des canaux ioniques et du remodelage ionique dans la physiopathologie des troubles du rythme et pourrait ainsi ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement anti-remodelage cardiaque et la prévention de la mort subite. / Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world each year. If no action is taken to improve cardiovascular health and current trends continue, WHO estimates that 25% more healthy life years will be lost to cardiovascular disease globally by 2020. Cardiac hypertrophy is the consequence of an excessive workload of the heart muscle leading to cardiac remodeling process. As the workload increases, the ventricular walls grow thicker, lose elasticity and eventually may fail to pump with as much force as a healthy heart. Furthermore, hypertrophied myocardium is not physiologically normal and may confer a predisposition to potentially fatal arrhythmias. Generally, the causal mechanism is ventricular fibrillation, a cardiac rhythm disorder which is irreversible but the pathophysiological mechanisms are complex and poorly understood. The functional consequences of mutations or ionic remodeling are relatively simple to study in vitro, but their role in the pathophysiology of arrhythmias in vivo is more difficult to grasp. Among the different animal models developed in cardiac arrhythmias research, the mouse is increasingly used because of our ability to mutate, knock-out or over-express genes of interest. The objective of my thesis was to study the role of ion channels in physiology as well as cardiac pathophysiology, particularly in the involvement of the occurrence of cardiac arrhythmias in vivo. This thesis will improve our understanding of the role of genetic abnormalities involving ionic remodeling in the pathogenesis of the heart and may also open new therapeutic perspectives in the treatment of cardiac remodeling as well as sudden cardiac death. / Thèse en cotutelle avec Université de Nantes - Pays de La Loire - France (2005-2010)

Introduction : La dysfonction primaire du greffon (DPG) post-transplantation pulmonaire est la principale cause de décès en phase péri-opératoire. Sa physiopathologie n’est pas encore totalement élucidée mais les lésions d’Ischémie/Reperfusion (I/R) pourraient constituer un facteur important de son développement. L’I/R et la DPG sont caractérisées par des dommages de l’endothélium vasculaire et de l’épithélium alvéolaire, un œdème pulmonaire et une réaction inflammatoire exacerbée. La résorption de l’œdème dépend du rétablissement de l’intégrité fonctionnelle alvéolaire, dont la capacité à réabsorber les ions Na+ (via les canaux ENaC), et secondairement le liquide par les cellules alvéolaires. Nous avons émis l’hypothèse que la dysfonction épithéliale alvéolaire, causée par l’I/R, présente dans les greffons donneurs (GD), jouerait un rôle clef dans le développement de la DPG chez les receveurs. Notre but était d’identifier de biomarqueurs, associés à la dysfonction épithéliale des GD et au développement de DPG chez les receveurs. Méthodes : L’impact d’un protocole mimant une I/R a d’abord été évalué sur des cultures primaires de cellules alvéolaires de rats. Puis, nous avons étudié l’impact de l’I/R in vivo grâce à des modèles de stress inflammatoire par infusion de LPS ou transplantation unilatérale chez le porc. Finalement, des biopsies de tissus de GD ont été recueillies durant les transplantations pulmonaires. Après détermination du grade de DPG chez les receveurs, nous avons étudié les facteurs et les altérations alvéolaires associés. Résultats : Une baisse d’expression des protéines de jonctions serrées (ZO-1), des canaux ioniques ENaC et CFTR ainsi qu’une réduction de la résistance transépithéliale et de la capacité de réparation suite aux lésions ont été observées suite au protocole mimant l’I/R dans le modèle de cultures primaires de cellules alvéolaires. Un traitement avec un activateur du canal K+ KvLQT1 (R L3) a permis d’améliorer la vitesse de réparation, l’intégrité de la barrière épithéliale et l’expression d’ENaC et CFTR. Dans nos modèles animaux, nous avons observé une réponse pro-inflammatoire et une altération des protéines ZO-1, ENaC et CFTR. Nos données préliminaires indiquent aussi une infiltration inflammatoire et une baisse d’ENaC, CFTR et ZO-1, déjà présentes dans les GD ayant subits une I prolongée, chez les receveurs ayant ensuite développés une DPG. Conclusion : Nos résultats soutiennent notre hypothèse du développement d’une dysfonction épithéliale alvéolaire, caractérisée par une altération de biomarqueurs de fonctionnalité et d’intégrité (ENaC, CFTR et ZO-1), en lien avec l’I/R et la DPG. / Background: Primary graft dysfunction (PGD) after lung transplantation is the first cause of death in the perioperative phase. The PGD pathophysiology is not fully elucidated, but Ischemia/Reperfusion (I/R) injury might be an important factor. I/R and PGD both feature endothelial/ epithelial damage, lung edema and inflammation. Edema resorption then depends on the restoration of the alveolar functional integrity, especially the ability of alveolar epithelial cells to reabsorb Na+ (through ENaC channels) and fluid. We hypothesized that alveolar epithelial dysfunction (related to I/R), observed within donor grafts, then plays a key role in the development of PGD in lung recipients. Our goal was to identify novel biomarkers, associated with epithelial dysfunction within donor’s grafts, and then PGD development in recipients. Methods: The impact of a protocol mimicking hypothermic ischemia and reperfusion was first tested on primary rat alveolar epithelial cell cultures. Then, the impact of I/R was studied in vivo using models of inflammatory stress induced by LPS infusion or after unilateral transplantation in pigs. Finally, lung biopsies from donor grafts were collected during lung transplantations. After defining PGD scores within the recipients, associated factors and alveolar alterations were finally analyzed. Results: In primary cell cultures, the protocol mimicking hypothermic I/R induced a decrease in tight junction proteins (ZO-1), transepithelial resistance, wound repair capacity as well as ENaC and CFTR channel expression. Treatment with a KvLQT1 K+ channel activator (R-L3) accelerated the repair rates and enhanced barrier integrity (ZO-1 staining) as well as ENaC and CFTR protein expressions. In the porcine models, an exacerbated inflammatory response was observed along with alveolar damage, lung edema and decreased ZO-1, ENaC and CFTR expressions. Our preliminary data using human samples collected during lung transplantations also indicate an inflammatory response and reduced ENaC, CFTR and ZO-1 expressions, already observed within lung grafts, submitted to longer cold ischemia duration, among lung recipients then developing a PGD. Conclusion: Altogether these data support our hypothesis of an alveolar epithelial dysfunction, featuring an alteration of functionality and barrier integrity biomarkers (ENaC, CFTR and ZO-1), associated with I/R and DPG.

Ce travail de thèse concerne l'étude théorique des mécanismes d'interaction de nanostructures à base de carbone avec les membranes cellulaires, constituant l'essentiel des cellules vivantes. Ce sujet très complexe compte tenu de la pluridisciplinarité de la thématique a été essentiellement réalisé à l'aide de simulations numériques. Nous avons volontairement partagé ce travail en deux parties distinctes. Nous avons d'abord étudié le fonctionnement des canaux ioniques à l'aide de la dynamique moléculaire et des études ab-initio. Ces canaux sont d'une part des protéines membranaires essentielles pour la fonction cellulaire, et d'autre part, elles constituent aussi des cibles thérapeutiques fréquentes dans la recherche des nouveaux médicaments. Dans une seconde partie, nous avons étudié le comportement d'espèces carbonées nus et fonctionnalisés tels que les fullerènes (C60) et les nanotubes (CNT) en présence de la membrane cellulaire en analysant finement le mécanisme d'ingestion (ang. uptake) de ces vecteurs de médicaments potentiels par les membranes biologiques. Ces études en dynamique moléculaire sur des temps très longs (sub-1 μs) et sur des systèmes très vastes étaient aussi le challenge du point de vue informatique. Pour palier la problématique dans le temps limitée d'une thèse le développement des calculs parallèles de haute performance CPU/GPU a du être mis en place. Les résultats obtenus tentent de mettre en évidence le rôle toxique que peuvent présentées certaines nanostructures vis-à-vis des protéines membranaires précédemment étudiées. Ce travail de thèse ouvre naturellement la voie à l'étude des nanovecteurs biocompatibles pour la délivrance des médicaments.