Les neurones thalamiques de relai ont un rôle exclusif dans la transformation et de transfert de presque toute l'information sensorielle dans le cortex. L'intégration synaptique et la réponse électrophysiologique des neurones thalamiques de relai sont déterminées non seulement par l’état du réseau impliqué, mais ils sont également contrôlés par leurs propriétés intrinsèques tels les divers canaux ioniques voltage-dépendants ainsi que l’arborisation dendritique élaboré. Par conséquent, investiguer sur le profil complexe de morphologie dendritique et sur les propriétés dendritiques actives révèle des renseignements importants sur la fonction d'entrée-sortie de neurones thalamiques de relai. Dans cette étude, nous avons reconstruit huit neurones thalamocorticaux (TC) du noyau VPL de chat adulte. En se basant sur ces données morphologiques complètes, nous avons développé plusieurs modèles multicompartimentaux afin de trouver un rôle potentiellement important des arbres dendritiques des neurones de TC dans l'intégration synaptique et l’intégration neuronale. L'analyse des caractéristiques morphologiques des neurones TC accordent des valeurs précises à des paramètres géométriques semblables ou différents de ceux publiés antérieurement. En outre, cette analyse fait ressortir de tous nouveaux renseignements concernant le patron de connectivité entre les sections dendritiques telles que l'index de l'asymétrie et la longueur de parcours moyen (c'est-à-dire, les paramètres topologiques). Nous avons confirmé l’étendue des valeurs rapportée antérieurement pour plusieurs paramètres géométriques tels que la zone somatique (2956.24±918.89 m2), la longueur dendritique totale (168017.49±4364.64 m) et le nombre de sous-arbres (8.3±1.5) pour huit neurones TC. Cependant, contrairement aux données rapportées antérieurement, le patron de ramification dendritique (avec des cas de bifurcation 98 %) ne suit pas la règle de puissance de Rall 3/2 pour le ratio géométrique (GR), et la valeur moyenne de GR pour un signal de propagation est 2,5 fois plus grande que pour un signal rétropropagé. Nous avons également démontré une variabilité significative dans l'index de symétrie entre les sous-arbres de neurones TC, mais la longueur du parcours moyen n'a pas montré une grande variation à travers les ramifications dendritiques des différents neurones. Nous avons examiné la conséquence d’une distribution non-uniforme des canaux T le long de l'arbre dendritique sur la réponse électrophysiologique émergeante, soit le potentiel Ca 2+ à seuil bas (low-threshold calcium spike, LTS) des neurones TC. En appliquant l'hypothèse du «coût minimal métabolique», nous avons constaté que le neurone modélisé nécessite un nombre minimal de canaux-T pour générer un LTS, lorsque les canaux-T sont situés dans les dendrites proximales. Dans la prochaine étude, notre modèle informatique a illustré l'étendue d'une rétropropagation du potentiel d'action et de l'efficacité de la propagation vers des PPSEs générés aux branches dendritiques distales. Nous avons démontré que la propagation dendritique des signaux électriques est fortement contrôlée par les paramètres morphologiques comme illustré par les différents paliers de polarisation obtenus par un neurone à équidistance de soma pendant la propagation et la rétropropagation des signaux électriques. Nos résultats ont révélé que les propriétés géométriques (c.-à-d. diamètre, GR) ont un impact plus fort sur la propagation du signal électrique que les propriétés topologiques. Nous concluons que (1) la diversité dans les propriétés morphologiques entre les sous-arbres d'un seul neurone TC donne une capacité spécifique pour l'intégration synaptique et l’intégration neuronale des différents dendrites, (2) le paramètre géométrique d'un arbre dendritique fournissent une influence plus élevée sur le contrôle de l'efficacité synaptique et l'étendue du potentiel d'action rétropropagé que les propriétés topologiques, (3) neurones TC suivent le principe d’optimisation pour la distribution de la conductance voltage-dépendant sur les arbres dendritiques. / Thalamic relay neurons have an exclusive role in processing and transferring nearly all sensory information into the cortex. The synaptic integration and the electrophysiological response of thalamic relay neurons are determined not only by a state of the involved network, but they are also controlled by their intrinsic properties; such as diverse voltage-dependent ionic channels as well as by elaborated dendritic arborization. Therefore, investigating the complex pattern of dendritic morphology and dendritic active properties reveals important information on the input-output function of thalamic relay neurons. In this study, we reconstructed eight thalamocortical (TC) neurons from the VPL nucleus of adult cats. Based on these complete morphological data, we developed several multi-compartment models in order to find a potentially important role for dendritic trees of TC neurons in the synaptic integration and neuronal computation. The analysis of morphological features of TC neurons yield precise values of geometrical parameters either similar or different from those previously reported. In addition, this analysis extracted new information regarding the pattern of connectivity between dendritic sections such as asymmetry index and mean path length (i.e., topological parameters). We confirmed the same range of previously reported value for several geometric parameters such as the somatic area (2956.24±918.89 m2), the total dendritic length (168017.49±4364.64 m) and the number of subtrees (8.3±1.5) for eight TC neurons. However, contrary to previously reported data, the dendritic branching pattern (with 98% bifurcation cases) does not follow Rall’s 3/2 power rule for the geometrical ratio (GR), and the average GR value for a forward propagation signal was 2.5 times bigger than for a backward propagating signal. We also demonstrated a significant variability in the symmetry index between subtrees of TC neurons, but the mean path length did not show a large variation through the dendritic arborizations of different neurons. We examined the consequence of non-uniform distribution of T-channels along the dendritic tree on the prominent electrophysiological response, the low-threshold Ca2+ spike (LTS) of TC neurons. By applying the hypothesis of “minimizing metabolic cost”, we found that the modeled neuron needed a minimum number of T-channels to generate low-threshold Ca2+ spike (LTS), when T-channels were located in proximal dendrites. In the next study, our computational model illustrated the extent of an action potential back propagation and the efficacy of forward propagation of EPSPs arriving at the distal dendritic branches. We demonstrated that dendritic propagation of electrical signals is strongly controlled by morphological parameters as shown by different levels of polarization achieved by a neuron at equidistance from the soma during back and forward propagation of electrical signals. Our results revealed that geometrical properties (i.e. diameter, GR) have a stronger impact on the electrical signal propagation than topological properties. We conclude that (1) diversity in the morphological properties between subtrees of a single TC neuron lead to a specific ability for synaptic integration and neuronal computation of different dendrites, (2) geometrical parameter of a dendritic tree provide higher influence on the control of synaptic efficacy and the extent of the back propagating action potential than topological properties, (3) TC neurons follow the optimized principle for distribution of voltage-dependent conductance on dendritic trees.

Les canaux ioniques dépendants du voltage sont responsables de l'initiation et de la propagation des potentiels d'action dans les cellules excitables. De nombreuses maladies héréditaires (channelopathies) sont associées à un contrôle défectueux du voltage par ces canaux (arythmies, épilepsie, etc.). L’établissement de la relation structure-fonction exacte de ces canaux est donc crucial pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques spécifiques. Dans ce contexte, le canal procaryote dépendant du voltage et sélectif au potassium KvAP a servi de modèle d’étude afin d’approfondir i) le processus du couplage électromécanique, ii) l’influence des lipides sur l’activité voltage-dépendante et iii) l’inactivation de type closed-state. Afin de pallier à l’absence de données structurales dynamiques du côté cytosolique ainsi que de structure cristalline dans l’état fermé, nous avons mesuré le mouvement du linker S4-S5 durant le gating par spectroscopie de fluorescence (LRET). Pour ce faire, nous avons utilisé une technique novatrice du contrôle de l’état conformationnel du canal en utilisant les lipides (phospholipides et non phospholipides) au lieu du voltage. Un modèle dans l’état fermé a ainsi été produit et a démontré qu’un mouvement latéral modeste de 4 Å du linker S4-S5 est suffisant pour mener à la fermeture du pore de conduction. Les interactions lipides - canaux jouent un rôle déterminant dans la régulation de la fonction des canaux ioniques mais ne sont pas encore bien caractérisées. Nous avons donc également étudié l’influence de différents lipides sur l’activation voltage - dépendante de KvAP et mis en évidence deux sites distincts d’interactions menant à des effets différents : au niveau du senseur de voltage, menant au déplacement de la courbe conductance-voltage, et du côté intracellulaire, influençant le degré de la pente de cette même courbe. Nous avons également démontré que l’échange de lipides autour de KvAP est extrêmement limité et affiche une dépendance à l’état conformationnel du canal, ne se produisant que dans l’état ouvert. KvAP possède une inactivation lente particulière, accessible depuis l'état ouvert. Nous avons étudié les effets de la composition lipidique et de la température sur l'entrée dans l'état inactivé et le temps de récupération. Nous avons également utilisé la spectroscopie de fluorescence (quenching) en voltage imposé afin d'élucider les bases moléculaires de l’inactivation de type closed-state. Nous avons identifié une position à la base de l’hélice S4 qui semble impliquée à la fois dans le mécanisme responsable de ce type d'inactivation et dans la récupération particulièrement lente qui est typique du canal KvAP. / Voltage-gated ion channels are responsible for the initiation and propagation of action potentials in excitable cells. Several hereditary diseases (channelopathies) are associated with a defective voltage control by these channels, leading to arrhythmias, epilepsy, etc. Hence, establishing the exact structure/function relation for ion channels is crucial for the development of new specific therapeutic agents. Here, the bacterial voltage-gated potassium channel KvAP served as a model to study i) electromechanical coupling, ii) influence of lipids on the voltage dependent activity and iii) closed-state inactivation. To overcome the lack of structural information on the cytosolic side and of crystal structure in the closed state, we determined the S4-S5 linker movement during gating using fluorescence spectroscopy (LRET). We were able to control the conformational state of the channels by using lipids (phospholipids and non phospholipids) instead of voltage clamp. Based on these experimental constraints, a model in the closed state was produced, showing that a small 4Å radial displacement of the S4-S5 linker is sufficient to close the conduction pore. Interactions between lipids and membrane proteins play an important role in the regulation of ion channels activity but are not well characterized. We studied the influence of different lipids on KvAP voltage-dependent activation and showed two distinct effects related to different interactions sites: one bound to the voltage sensor, leading to a shift of the conductance-voltage curve, and another at the intracellular side near the pore region, affecting the steepness of this curve. We also showed that the exchange of lipids is very limited around KvAP and seems to be state dependent, occuring only when the channels are kept in the open state. KvAP has a slow inactivation atypical, accessible from the open state. We studied the effects of lipid composition and temperature on entry into inactivation and recovery. We also used voltage-clamp fluorometry in bilayers to investigate closed-state inactivation molecular basis. We identified a position at the bottom of the S4 helix that seems involved in the mechanism for slow inactivation and the extremely slow recovery from inactivation typically displayed by KvAP.

La base phosphazène ButP4 associée au thiophénol ou au bis (2-mercaptoéthyl) éther a été utilisée avec succès pour amorcer quantitativement la polymérisation anionique par ouverture de cycle des monomères cyclopropane-1,1-dicarboxylates de dialkyle. Pour des températures comprises entre 30 et 60°C dans le THF ou entre 30 et 100°C dans le toluéne, le mécanisme observé est celui d'une polymérisation anionique vivante qui conduit à des polymères présentant des indices de polymolécularité faibles et dont les Mn expérimentaux (mesurés par SEC et RMN 1H) sont en accord avec les valeurs théoriques. D'autres systèmes déamorçage comme le carbazole ou des composés possédant un proton acide associés à ButP4 conduisent également à des polymères bien définis. Une étude cinétique montre que l'ordre interne en monomère est égal à 1 sur l'ensemble de la gamme de conversion. Le système déamorçage thiophénol / ButP4 dans le THF présente une réactivité bien supérieure à celle du thiophénolate de sodium dans le DMSO qui est le système classique d'amorçage pour ce type de polymérisation. Différents agents de terminaison, comme l'acide chlorhydrique, le bromure d'allyle ou le bromure de propargyle, ont été utilisés pour terminer les réactions et ont conduit à l'obtention de polyméres hétérotéléchéliques. D'autres dérivés de cyclopropanes présentant des substituants variés ont également été examinés. Ces résultats ouvrent de très intéressantes perspectives dans la préparation d'architectures complexes comme des copolyméres à blocs, greffés ou en étoile. Les premières expériences de copolymérisation ont d'ailleurs été couronnées de succès. Afin d'obtenir de nouveaux canaux ioniques artificiels, différents monomères cyclopropane-1,1- dicarboxylates porteurs d'éthers-couronne ont été synthétisés. La polymérisation anionique par ouverture de cycle de ceux-ci a été étudiée en utilisant soit le thiophénolate de sodium soit le système thiophénol / ButP4 comme amorceur. Ces travaux ont également permis l'obtention d'un nouveau type de poly(éther-ester) qui s'est révélé intéressant comme perméabilisant membranaire. Les interactions des oligo(éther-ester)s avec des membranes modèles planes, des vésicules unilamellaires et des cellules ont été étudiées en collaboration avec des physiciens et des biologistes. Des résultats prometteurs en termes de transport d'ions ont été obtenus et sont présentés dans ce mémoire / The tetrameric phosphazene base ButP4 in association with thiophenol or bis(2-mercaptoethyl) ether has been successfully used in order to initiate the anionic ring-opening polymerization of di-n-alkyl cyclopropane-1,1-dicarboxylates. Well-defined monofunctional or difunctional polymers with a very narrow molecular weight distribution were obtained through a living process at temperatures between 30 and 60°C in THF or between 30 and 100°C in toluene. An excellent agreement is observed between theoretical and experimental Mn values (measured by SEC and by NMR). Other initiating systems such as carbazole or compounds with an acidic proton in association with ButP4 lead also to welldefined polymers. A kinetic study shows a first order with respect to the monomer concentration over the entire conversion range. The initiating system thiophenol / ButP4 in THF shows a much higher reactivity compared to the alkali metal thiophenolate which is the classical one. The living ends were reacted with different terminating agents such as hydrochloric acid, allyl and propargyl bromide thus leading to telechelic polymers. Other cyclopropane derivatives with various substituents have been also examined. These results open very exciting perspectives for the preparation of new architectures such as block and graft copolymers, star polymers. The first copolymer attempts were very successful. With the aim of designing new ion channel biomimics, cyclopropane-1,1-dicarboxylate monomers with crown-ethers substituents were synthesized. The anionic ring-opening polymerization of these monomers has been investigated using either sodium thiophenolate or thiophenol activated by ButP4. Moreover a new alternating poly(ether-ester) was obtained which is an interesting membrane permeabilizer. Its interaction with unilamellar vesicles, planar phospholipidic membranes and cells was studied in collaboration with biophysicists and biologists. Very promising results have been obtained

L'utilisation de champs électriques pulsés (PEF) dans les secteurs de la médecine et de la biotechnologie est devenue de plus en plus courante au cours des dernières décennies. La recherche a montré qu'en ajustant la durée du PEF, nous pouvons prédire quels effets seront observés. Alors que les PEF dans la gamme micro - milliseconde ont été utilisés pour perméabiliser la membrane cellulaire et améliorer l'absorption de médicament ou de protéine, le PEF nanoseconde (nsPEF) a démontré des effets uniques sur les organites intracellulaires. Les deux PEF et nsPEF ont démontré un potentiel thérapeutique pour une variété de pathologies humaines, y compris le traitement du cancer. Utilisant l'imagerie des cellules vivantes, cette thèse a étudié in vitro les effets de champs pulsés d'une durée de 10 ns à 10 ms sur des lignées cancéreuses (U87 glioblastome multiforme) et non cancéreuses (neurones hippocampes de souris (HT22) et cellules ovariennes du hamster chinois (CHO)). Des résultats publiés antérieurement ont démontré que les cellules cancéreuses sont plus sensibles aux champs électriques que les cellules saines. Nos résultats sont en accord avec ces résultats, dans la mesure où les cellules U87 ont subi une dépolarisation significativement plus importante de leur potentiel transmembranaire après une seule impulsion électrique à toutes les durées. Dans un ensemble d'expériences parallèles, malgré des seuils de champ électrique similaires pour la perméabilisation membranaire, les cellules U87 ont démontré une absorption significativement améliorée de YO-PRO par rapport aux autres lignées cellulaires. Bien que les cellules U87 aient subi le plus grand changement dans la dépolarisation membranaire et la perméabilisation membranaire, elles ont également montré la constante de rescellement de la membrane la plus rapide, qui était environ 30 secondes plus rapide que les autres lignées cellulaires. Pour élucider certains des mécanismes sous-jacents par lesquels les cellules U87 répondent aux champs électriques, une série d'expériences a examiné le rôle des canaux ioniques transmembranaires. Plusieurs études récentes ont rapporté que les PEF peuvent agir directement sur les canaux ioniques voltage-dépendants. En utilisant divers modulateurs de canaux ioniques pharmacologiques spécifiques et à action large, nous avons démontré que nous pouvions presque entièrement inhiber la dépolarisation membranaire induite par le champ électrique dans les cellules U87 en bloquant certains canaux cationiques. Ces résultats étaient assez spécifiques, tels que le canal de potassium de grande conductance (BK), les canaux calciques de type L et T, et le canal cationique non spécifique, TRPM8, étaient capables d'inhiber la dépolarisation tandis que le blocage d'autres canaux ioniques ne produisait aucun changement significatif. . Les travaux de cette thèse ont montré que la lignée cellulaire maligne U87 présentait une plus grande sensibilité aux champs électriques allant de 10 ns à 10 ms par rapport aux lignées cellulaires non cancéreuses étudiées. Des améliorations potentielles aux protocoles de traitement actuels ont été proposées sur la base des résultats présentés ici. / The use of pulsed electric fields (PEF) in medical and biotechnology sectors has become increasingly prevalent over the last few decades. Research has shown that by adjusting the duration of the PEF we can predict what effects will be observed. Whereas PEF in the micro-to-millisecond range have been used to permeabilize the cell membrane and enhance drug or protein uptake, nanosecond PEF (nsPEF) have demonstrated unique effects on intracellular organelles. Both PEF and nsPEF have demonstrated therapeutic potential for a variety of human pathologies, including the treatment of cancer. Using live-cell imaging, this thesis investigated, in vitro, the effects of pulsed fields ranging in duration from 10 ns to 10 ms on cancerous (U87 glioblastoma multiforme) and non-cancerous cell lines (mouse hippocampal neurons (HT22) and Chinese hamster ovary (CHO) cells). Previously published results have demonstrated that cancerous cells have a greater sensitivity to applied electric fields than healthy cells do. Our results are in agreement with these findings, insofar as the U87 cells underwent a significantly greater depolarization of their transmembrane potential following a single electric pulse at all durations. In a parallel set of experiments, despite having similar electric field thresholds for membrane permeabilization, the U87 cells demonstrated significantly enhanced YO-PRO uptake compared to the other cells lines. Although U87 cells underwent the greatest change in both membrane depolarization and membrane permeabilization, they also showed the fastest membrane resealing constant, which was approximately 30 seconds faster than other cell lines. To elucidate some of the underlying mechanisms by which U87 cells respond to electric fields, a series of experiments looked at the role of transmembrane ion channels. Several recent studies have reported that PEFs can act directly on voltage-gated ion channels. Using a variety of specific and broad acting pharmacological ion channel modulators, we demonstrated that we could almost entirely inhibit the electric field-induced membrane depolarization in U87 cells by blocking certain cationic channels. These results were quite specific, such that the big conductance potassium (BK) channel, L- and T-type calcium channels, and the non-specific cationic channel, TRPM8, were able to inhibit depolarization while blocking other ion channels produced no significant change. The work in this thesis showed that the malignant U87 cell line showed a greater sensitivity to electric fields from ranging from 10 ns – 10 ms when compared to the non-cancerous cell lines that were investigated. Potential improvements to current treatment protocols have been proposed based on the findings presented herein.

La production hétérologue des protéines membranaires reste difficile, peut-être parce que l’insertion dans la membrane de la cellule hôte constitue une étape limitante de la production. Afin de tourner cette difficulté, deux modes de synthèse ont été envisagés: la synthèse de protéines dans un système a-cellulaire, en l’absence de membrane mais en présence de détergent, ou l’adressage forcé de la protéine vers les corps d’inclusion dans le cas d’une expression plus classique en bactérie entière. La réalisation des deux stratégies repose sur l’utilisation de protéines de fusion possédant une séquence d’entraînement en amont du gène d’intérêt, soit qu’elles améliorent la traduction du transcrit en limitant le repliement spatial de ce dernier, soit qu’elles favorisent la production de la protéine d’intérêt en corps d’inclusion. La porine OmpX et le peptide T7 ont été choisis en cas d’expression dans les systèmes bactériens. La protéine SUMO est utilisée pour la production dans un lysat eucaryote. Les différentes approches ont été testées sur la production de la pannexine1 humaine (Px1).Si les séquences d’entraînement OmpX et le peptide T7 sont correctement produites in vitro, aucune des deux, en revanche, ne favorise la production de la Px1. Seul l’entraîneur SUMO est efficace. En effet, nous avons observé que cette protéine augmente la production de la Px1 dans un lysat eucaryote de germe de blé. Par ailleurs OmpX, connue pour être largement produite in vivo dans les corps d’inclusion, n’entraîne pas la localisation de la Px1 dans ces structures. Contre toute attente, l’étiquette T7 dirige la Px1 dans les corps d’inclusion. L’étude électrophysiologique de la Px1 a donc été effectuée à partir de la protéine produite in vivo (T7his-Px1) après renaturation, ou produite sous forme soluble in vitro (his6-Px1) dans le lysat eucaryote. Dans le cas de la protéine T7his-Px1 renaturée, une activité canal qui rappelle celle qui est observée après expression dans l’ovocyte de Xénope, a été détectée en patch-clamp, mais dans trois cas seulement. Dans le cas de la protéine his6-Px1, aucune activité canal n’est clairement détectée. Dans une deuxième partie de ce travail on examine le rôle de la boucle périplasmique dans la sensibilité à la pression du MscL, un canal mécanosensible bactérien devenu un système modèle dans l’étude de la mécanosensibilité. Presque toutes les études fonctionnelles sur ce canal ont été réalisées sur le canal de E.coli, alors que la structure a été obtenue à partir de l’homologue de M. tuberculosis. Une étude fonctionnelle a montré que le MscL de M. tuberculosis est difficile à ouvrir : son ouverture requiert l’application d’une pression double de celle qui est nécessaire chez E.coli. Les deux homologues diffèrent principalement par la longueur de leur unique boucle périplasmique. De manière à examiner le rôle de la boucle, on a comparé l’activité du canal MscL de E.coli, celle du canal de M. tuberculosis et celle d’une protéine chimère constituée de la protéine de M. tuberculosis dans laquelle la boucle a été changée pour celle de la protéine de E.coli. De manière inattendue, nous avons constaté que les canaux de E.coli et de M. tuberculosis ont la même sensibilité à la pression. La protéine chimère n’avait pas d’activité canal. Si ce travail ne permet pas de conclure quant au rôle de la boucle, il montre sans ambigüité que contrairement à ce qui a été rapporté les canaux MscL de E.coli et de M. tuberculosis ne diffèrent pas sensiblement sur le plan fonctionnel / The production of heterologous membrane protein is notoriously difficult; this might be due to the fact that insertion of the protein in the membrane host is a limiting step. To by-pass this difficulty, two modes of synthesis were tested: 1) production in a cell-free system devoid of biological membrane but supplemented with detergent or liposomes, 2) production in bacteria, with targeting of the membrane protein to inclusion bodies. Both strategies were tested for the production of the human pannexin 1 channel (Px1). The gene coding the protein was fused with an “enhancer” sequence resulting in the addition of a peptide or short protein at the N terminus of the protein of interest. This enhancer sequence which is well produced in vitro or in vivo is supposed to facilitate the translation of the protein of interest. Three enhancer sequences were chosen: 1) the small porin OmpX of E. coli, which, in addition, should target the protein to inclusion bodies when the protein is expressed in bacteria 2) a peptide of phage T7 for expression in E.coli lysate or E.coli cells 3) the small protein SUMO for production in a wheat germ cell-free system. In a bacterial cell-free system, neither OmpX nor T7 promoted Px1 production. Px1 is only produced when the SUMO enhancer sequence is used in the wheat germ system. In bacteria, OmpX, known to form inclusions bodies did not promote the targeting of the fusion protein to inclusion bodies. Unexpectedly, the peptide T7 was able to do it.Px1 obtained from inclusion bodies (T7his-Px1) was renatured and reconstituted in liposomes. Similarly his6-Px1 produced in wheat germ system was reconstituted in liposomes. Both preparations were used for electrophysiological studies (patch-clamp and planar bilayers). With the refolded T7his-Px1, channel activity reminiscent of that observed with Px1 expressed in Xenope oocyte (Bao et al., 2004) could be detected, but only in three cases. In the case of his6-Px1, no clear channel activity could be observed. The second part of this work deals with the involvement of the periplasmic loop of the bacterial mechanosensitive channel MscL in its sensitivity to pressure. Mscl has become a model system for the investigation of mechanosensisity. Nearly all functional studies have been performed on MscL from E.coli while the structure of the protein has been obtained from the Mycobacterium tuberculosis homologue. In one functional study it was shown that MscL from M. tuberculosis is extremely difficult to open, gating at twice the pressure needed for E.coli MscL The periplasmic loop is the most variable sequence between the two homologues, being longer in E.coli than in M. tuberculosis. In order to assess the role of the periplamic loop in the sensitivity to pressure, we compared the activity of the E.coli and M. tuberculosis MscL and of a chimeric protein made of the M. tuberculosis protein in which the periplasmic loop has been exchanged for that of the E. coli channel. Unexpectedly, M. tuberculosis and E .coli MscL were observed to gate at a similar applied pressure. The chimeric protein had no functional activity. In conclusion, this study does not allow any conclusion as to the role of the loop in the sensitivity to pressure, but it shows clearly that, in contrast to the results of a previous study, there is no functional difference between E. coli and M. tuberculosis MscL.

Les canaux sodiques dépendants du voltage, ou canaux Nav, jouent un rôle capital dans l'excitabilité neuronale, dans la genèse et dans la propagation des potentiels d'action. Le canal Nav1.9 se distingue par une expression restreinte aux nocicepteurs et par des propriétés électrophysiologiques uniques qui, si elles excluent sa contribution à la phase dépolarisante du potentiel d'action, lui confèreraient un rôle dans la modulation de l'excitabilité des nocicepteurs. Ce travail de thèse vise à caractériser son implication dans la physiopathologie de la douleur par une approche comportementale, moléculaire et fonctionnelle. La première partie de ce travail consiste à étudier la contribution du canal Nav1.9 à la douleur inflammatoire. Nous avons donc réalisé différents tests comportementaux chez des souris knock-out (KO) et des rats traités par antisens (knock-down) modèles de douleur inflammatoire (aigu, subaigu, chronique). L'expression du canal ainsi que ses propriétés électrophysiologiques sont ensuite analysées chez ces mêmes modèles animaux. Notre premier constat est que le canal Nav1.9 n'est pas impliqué dans la réponse à une stimulation mécanique ou thermique chaude nociceptive chez des animaux sains. En revanche, l'hypersensibilité douloureuse thermique et mécanique induite par une inflammation subaiguë (carragénine intraplantaire) ou chronique (monoarthrite) est significativement réduite chez la souris KO Nav1.9. Un résultat similaire est obtenu par traitement antisens chez le rat, sur le modèle d'inflammation subaiguë. Chez la souris, suite à l'induction d'une inflammation subaiguë, une légère diminution suivie d'une forte augmentation de l'expression protéique du canal Nav1.9 est observée dans les ganglions rachidiens innervant la patte enflammée. Une augmentation de la quantité de canaux est également observée au niveau des troncs nerveux cutanés innervant cette même zone. Les canaux néosynthétisés ne contribuent pas au courant sodique enregistré en patch clamp dans les corps cellulaires des neurones des ganglions rachidiens, mais nos données suggèrent qu'ils sont exportés en direction des terminaisons nerveuses, où ils pourraient devenir fonctionnels et augmenter l'excitabilité cellulaire. La deuxième partie de ce travail de thèse consiste à caractériser l'implication de canal Nav1.9 dans la perception du froid et dans l'hypersensibilité au froid induite par l'oxaliplatine. Nous avons en effet observé de manière inattendue que les souris KO Nav1.9 présentent des seuils de douleur au froid (<10°C) plus élevés que les souris sauvages. Ce phénomène est confirmé par plusieurs tests comportementaux chez les souris KO et chez des rats traités par antisens anti-Nav1.9. L'oxaliplatine, prescrit dans le traitement des cancers colorectaux, est connu pour induire une hypersensibilité au froid invalidante chez la majorité des patients. Nous avons donc décidé d'étudier la contribution du canal Nav1.9 à ce symptôme. Suite à une injection unique d'oxaliplatine, une forte hypersensibilité au froid apparait chez les souris dès 20°C. Nous montrons que le KO Nav1.9 permet de supprimer l'hypersensibilité au froid aux températures normalement non douloureuses (20 et 15°C, allodynie), et de réduire l'hypersensibilité aux températures douloureuses (10 et 5°C, hyperalgie). Le même effet est observé chez le rat après traitement antisens. En conclusion, ce travail permet de mettre en évidence l'intérêt du canal Nav1.9 en tant que cible pharmacologique potentielle pour le traitement de douleurs inflammatoires et de l'hypersensibilité au froid induite par l'oxaliplatine. Il est de plus intéressant de constater que les seuils de réponse à des stimuli nociceptifs ne sont pas perturbés chez les souris KO Nav1.9 saines, à l'exception de la douleur provoquée par des températures froides extrêmes. Le blocage du canal Nav1.9 aurait donc des propriétés anti-hyperalgiques plutôt qu'antalgique, ce qui est conceptuellement intéressant.

L'objectif de cette thèse était de développer et de caractériser un modèle de cellules souches cardiaques humaines dans un contexte de thérapie cellulaire. Après avoir sélectionné et caractérisé une population de cellules souches d'origine mésenchymateuse, isolée à partir d'auricules humaines, exprimant le marqueur W8B2 (CSCs W8B2+), nous nous sommes focalisés (par les techniques de RT-qPCR à haut rendement, d'immuno-marquage, de western-blot et de fluorescence calcique) sur ; 1. la caractérisation génique des canaux ioniques et des acteurs de la signalisation calcique et 2. l'étude de leur différenciation in vitro en parallèle à l'activité calcique intracellulaire. Les résultats montrent que CSCs W8B2+ tendent à se différencier en cellules pacemaker. Certains gènes spécifiques nodaux, comme Tbx3, HCN, ICaT,L, Kv, NCX, s'expriment durant la différenciation. L'enregistrement de l'activité calcique (via une sonde optogénétique) montre la présence d'oscillations calciques qui évoluent en fréquence et en intensité pendant la différenciation. Les stocks-IP3 sensibles et l'échangeur NCX joueraient un rôle fondamental.Nous avons ensuite étudié l'importance du canal BKCa et des récepteurs sphingosine 1-phosphate (S1P) dans la régulation des propriétés fondamentales des CSCs W8B2+. L'inhibition du BKCa diminue la prolifération cellulaire en accumulant les cellules à la phase G0/G1, réprime l'auto-renouvellement mais n'affecte pas la migration. Quant à la S1P elle freine la prolifération et l'auto-renouvellement via une voie différente de celles des récepteurs S1P1,2,3.Ce travail fait ressortir des cibles moléculaires fondamentales dans un contexte de thérapie cellulaire cardiaque. / The aim of this thesis was to develop and characterize a model of human heart stem cells in a context of cell therapy.A population of mesenchymal stem cells, expressing the W8B2 marker (CSCs W8B2+), was first isolated from human auricles and characterized using high-throughput RT-qPCR techniques, immuno-labeling, western-blot and calcium fluorescence imaging. These experiments were focused on 1. the gene expression of ion channels and calcium signaling proteins; and 2. the study of CSCs W8B2+ in vitro differentiation and associated intracellular calcium activity changes.The results show that CSCs W8B2+ tend to differentiate into pacemaker cells. Some nodal specific genes such as Tbx3, HCN, ICaT, L, Kv, NCX, are expressed during differentiation. The recording of calcium activity (via an optogenetic probe) shows the presence of calcium oscillations that change in frequency and intensity during differentiation. IP3 sensitive calcium stocks and the NCX exchanger would play a fundamental role in these variations.Then we studied the importance of the BKCa channel and the sphingosine 1-phosphate (S1P) receptors in the regulation of the fundamental properties of the W8B2+ CSCs. Inhibition of BKCa reduces cell proliferation by accumulating cells in the G0 / G1 phase, suppresses cell self-renewal but does not affect migration properties. Concerning S1P, it decreases proliferation and self-renewal without stimulate S1P1,2,3 receptors.This work highlights fundamental potential molecular targets in a context of cardiac cell therapy.

L'infarctus du myocarde constitue la première cause de mortalité cardiovasculaire. Dans ce contexte, depuis plus de 40 ans et les premières études sur les populations du Groenland, il est connu qu'une consommation de poisson riche en acide gras polyinsaturés de type omégas 3 (AGPI n-3) a des effets cardioprotecteurs. De très nombreuses études cliniques, animales et cellulaires ont ensuite confirmé ces résultats cardioprotecteurs des AGPI n-3 qui semblent passer par une prévention des arythmies cardiaques post infarctus.Cependant, du fait de leurs nombreuses doubles liaisons carbone-carbone, les principaux AGPI n-3 que sont l'acide eicosapentaénoïque et l'acide docosahexaénoïque sont très sensibles à l'oxygénation à l'air et peuvent subir une peroxydation non enzymatique spontanée sous condition de stress oxydant qui accompagne notamment l'ischémie/reperfusion lors d'un infarctus du myocarde.Dans ce travail de thèse, nous posons la question de savoir quelle forme d'AGPI a des effets cardioprotecteur : la forme réduite ou oxydée. En effet, les effets des AGPI n-3 sur la fonction cardiaque sont très controversés, notamment due au manque d'information sur les mécanismes impliqués. Particulièrement, on ne sait pas quel lipide est actif : les AGPI n-3 ou un des leurs métabolites oxygénés.Durant l'ischémie reperfusion puis dans les mois qui suivent l'infarctus du myocarde, le stress oxydant est élevé et de nombreux métabolites non enzymatiques dérivés des AGPI n-3 comme les NeuroProstanes sont alors produits à tel point qu'ils sont reconnus comme biomarqueurs du stress oxydant. Ainsi, dans ce travail de recherche, nous spéculons que les NeuroProstanes ne sont pas seulement des biomarqueurs du stress oxydant mais auraient un rôle biologiquement actif qui expliqueraient les effets cardioprotecteurs connus de leurs précurseurs ; les AGPI n-3.Le but de cette thèse est dans un premier temps d'investiguer l'influence de la peroxydation lipidique du DHA sur ses propriétés antiarythmiques in cellulo sur des cellules ventriculaires cardiaques isolées puis in vivo sur des souris ayant subit un infarctus du myocarde par ligature de l'artère coronaire gauche. De la même manière, nous avons évalué les propriétés antiarythmiques des métabolites non enzymatique des AGPI n-3 et notamment le 4(RS)-4F4t-NeuroProstane. Dans un second temps et de manière plus précoce, nous avons observé si une infusion préventive de 4(RS)-4F4t-NeuroP chez le rat, 20 minutes avant un épisode d'ischémie reperfusion peut protéger le myocarde des dommages ischémiques (morts cellulaires), des arythmies et des altérations morpho-fonctionnelles.L'ensemble de ce travail de thèse a ainsi permis de mettre en évidence que un des médiateurs lipidiques des AGPI n-3 ; le 4(RS)-4-F4t-NeuroP peut exercer des effets biologiquement actifs qui passent par une prévention des arythmies dans les mois qui suivent l'infarctus du myocarde ; effets passant par une prévention des modifications post-translationnelles du RyR2 et in fine d'une régulation de l'homéostasie calcique. De manière plus précoce durant l'ischémie reperfusion, nos résultats montrent que le 4(RS)-4-F4t-NeuroP réduit les arythmies ventriculaires, la taille de la zone infarcie et la dysfonction cardiaque, effets cardioprotecteurs qui passent par des mécanismes mitochondriaux.Le travail de cette thèse démontre pour la première fois que le DHA n'exerce pas d'effets cardioprotecteurs mais que ce serait les produits issus de son oxydation non enzymatique tel le 4(RS)-4-F4t-NeuroP pouvant ainsi expliquer l'ensemble des effets connus des AGPI n-3. Cette découverte ouvre de nouvelles perspectives sur les produits oxydés non enzymatiques des AGPI n-3 comme des potentiels médiateurs dans les maladies comme durant l'infarctus du myocarde ou le stress oxydant qui est généré joue un rôle prépondérant dans les altérations physiopathologiques qui en découlent. / Since 40 years, ω3 poly-unsaturated fatty acids (n-3 PUFA) are known to have cardioprotective properties in ischemic disease such as cardiac infarction following ischemia/reperfusion period. Many studies in isolated cells or in animals confirmed these effects and it has been suggested that n-3 PUFA have direct effects on targeted proteins such as ionic channels. However, due to the abundance of double carbone bounds, the main n-3 PUFA; eicosapentaenoic acid (C20: 5 n-3, EPA) and docosahexaenoic acid (C22: 6 n-3, DHA) are very sensitive to free radical oxidation and can undergo non-enzymatic spontaneous peroxidation under oxidative stress conditions as it occurs in ischemia/reperfusion. In the present work, we addressed the question of the form of DHA having cardioprotective properties: reduced or oxidized. Indeed, the effects of n-3 PUFA on cardiac function are controversial, notably due to the lack of information on the mechanisms involved. Particularly, it is not well understood which is the active lipid: the PUFA or one of its oxygenated metabolites. In the context of oxidative stress, during ischemia/reperfusion and in month following cardiac infarction, a lot of oxygenated metabolites of PUFA like Neuroprostane; 4(RS)-4F4t-NeuroP are produced and used as biomarkers of oxidative stress. This metabolite is associated to a lower atherosclerosis risk suggesting a beneficial role in cardiovascular diseases. In this context we speculate that Neuroprostane are not just a markers of stress conditions but have biological activities.The aim of this thesis was in first time to investigate the influence of DHA peroxidation on its potentially anti-arrhythmic properties in isolated ventricular cardiomyocytes and in vivo in post-myocardial infarcted (PMI) mice. In same way, we investigated in cellulo and in vivo anti-arrhythmic properties of oxygenated metabolites of n-3 PUFA such as 4(RS)-4F4t-NeuroP. In second time we investigated if the pericardial delivery 20 minutes before occlusion of 4F4t-NeuroP protects in prevention the myocardium from ischemic damages and arrhythmias during and following an I/R episode in rats.In this study, we challenged the paradigm that spontaneously formed oxygenated metabolites of lipids are undesirable as they are unconditionally toxic. This study reveals that the lipid mediator 4(RS)-4-F4t-NeuroP derived from non-enzymatic peroxidation of DHA, can counteract such deleterious effects through cardiac anti-arrhythmic properties in month following cardiac infarction by preventing deleterious post-translational modification of RyR2 and thus regulating calcium homeostasis. More early, during ischemia/reperfusion, our results show that pericardial delivery of 4(RS)-4-F4t-NeuroP reduced ischemia-induced ventricular arrhythmias, infarct sizes, and cardiac dysfonction ; cardioprotective effects involving mitchondria mecanisms.This thesis demonstrate for the first time that DHA per se has no anti-arrhythmic effects and 4(RS)-4-F4t-NeuroP as a mediator of the cardioprotection characteristics of DHA. This discovery opens new perspectives for products of non-enzymatic oxidized n-3 PUFA as potent mediators in oxidative stress diseases like during a cardiac infarction, where oxidative stress generated play fundamental role in pathophysiological alterations.

L'insuffisance cardiaque (IC) est un processus progressif et inexorable menant au remodelage pathologique du cœur et à la destruction du parenchyme cardiaque. Indépendamment de l'étiologie, on observe une diminution d'environ 30% du nombre de cardiomyocytes ventriculaires au stade terminal de la maladie. Reposant sur les données précliniques convergentes dans les modèles d'IC, le concept novateur de thérapie cellulaire a suscité beaucoup d’espoir en cardiologie. Bien que leur rôle dans l'homéostasie cardiaque soit controversé, les progéniteurs cardiaques endogènes (eCPCs) qui perdurent au sein du myocarde adulte possèderaient les caractéristiques optimales en vue de la régénération myocardique. Nos données électrophysiologiques montrent que le courant potassique dépendant du Ca2+ de conductance intermédiaire (IKCa3.1) est dominant et qu'il contribue à la détermination du potentiel membranaire (Vmem). L'hyperpolarisation engendrée par l'activation du canal KCa3.1 (SK4; KCNN4) maintient le gradient électrique et favorise l'entrée capacitive de Ca2+ (ECC). D'un point de vue fonctionnel, la potentialisation de la signalisation calcique intracellulaire induite par KCa3.1 semble cruciale pour la prolifération des eCPCs c-Kit+. Puisque le statut clinique est connu pour avoir des conséquences néfastes sur la fonctionnalité des cellules souches, nous avons comparé la densité du courant IKCa3.1 dans des eCPCs c-Kit+ provenant de cœurs sains et insuffisants. En accord avec les données électrophysiologiques, nos résultats démontrent que l'insuffisance cardiaque congestive (CHF) diminue significativement l'expression de KCa3.1 ainsi que des protéines régulatrices du cycle cellulaire. Les cellules souches dérivées d'explants cardiaques (EDCs) représentent un autre produit cellulaire prometteur pour la thérapie cellulaire en cardiologie. Les EDCs se composent de sous-populations complémentaires dont la proportion varie en fonction du statut clinique. Alors que la population CD90- constitue la fraction active en termes d'efficacité thérapeutique, il a été démontré qu'une proportion élevée de cellules CD90+ réduit le potentiel régénératif des EDCs. Afin de faire la lumière sur les déterminants ioniques de la thérapie cellulaire cardiaque, les propriétés électrophysiologiques des populations CD90+ et CD90- ont été comparées. Considérant l'importance de KCa3.1 pour la fonction des eCPCs c-Kit+, la présence de canaux potassiques Ca2+-dépendants (KCa) dans les EDCs a été investiguée. Nous avons identifié 2 types de canaux KCa dans les EDCs humaines. Le canal KCa1.1 (BKCa; KCNMA1) est exprimé de façon homogène alors que KCa3.1 est présent exclusivement dans les cellules CD90-. D'un point de vue fonctionnel, l'activité du canal KCa3.1 détermine le Vmem et supporte la prolifération des EDCs. Puisque ce canal est présent uniquement dans la population cardiogénique, l'expression de KCa3.1 pourrait être un facteur déterminant de la capacité régénérative des EDCs. Nous avons investigué cette hypothèse et confirmé que la transplantation de cellules génétiquement modifiées pour exprimer le canal KCa3.1 augmente la régénération cardiaque dans un modèle murin d'IC d'origine ischémique. Pour la première fois, nous avons fait la démonstration que la modulation des propriétés ioniques de cellules souches peut améliorer leur efficacité thérapeutique. / Heart failure (HF) is a progressive disease characterized by extensive pathological remodelling of the heart and myocardial damage. Regardless of the etiology, a decrease of about 30% in the number of ventricular cardiomyocytes is observed at the terminal stage of HF. Based on converging preclinical data in HF models, the innovative concept of cell therapy has generated a great deal of enthusiasm in cardiology. Although the role of cardiac stem cells in cardiac homeostasis is highly controversial, the multipotent progenitors that persist within the adult myocardium possess the ideal characteristics for cardiac regeneration, especially because of their cardiogenic committment. Plasma membrane ion channels are involved in the fundamental processes of virtually all cells that make up the human body, including stem cells. A wide range of functional ion channels was identified in ex vivo proliferated endogenous cardiac progenitor cells (eCPCs), but their function remains poorly understood. We have completed the very first characterization of the ionic profile of freshly-isolated c-Kit+ eCPCs. We found that the intermediate conductance Ca2+-activated potassium current (IKCa3.1) is the predominant conductance and contributes to the determination of membrane potential (Vmem). The hyperpolarization generated by the activation of the KCa3.1 channel (SK4; KCNN4) maintains the electrical gradient and promotes store-operated Ca2+-entry (SOCE) that activates progenitor cell proliferation. Experimental congestive heart failure (CHF) significantly decreased the expression of KCa3.1 as well as cell cycle regulatory proteins. Taken together, these findings suggest that alterations in KCa3.1 may have pathophysiological and therapeutic significance in regenerative medicine In addition to c-Kit+ eCPCs, cardiac explants-derived cells (EDCs) represent another promising cell product for myocardial repair. EDCs are obtained as a heterogeneous mixture composed of complementary subpopulations. Interestingly, it was found that a high proportion of CD90+ cells reduce the functional benefits of EDCs therapy. Consistent with this observation, it has recently been shown that the CD90- population constitutes the active fraction in terms of therapeutic efficacy. In order to gain insight into the ionic determinants of EDCs function, the electrophysiological properties of the CD90+ and CD90- populations were studied. Considering the importance of KCa3.1 in c-Kit+ CPCs, we evaluated the presence of KCa channels in human EDCs. We have identified 2 types of KCa channels in ex vivo expanded EDCs. While KCa1.1 (BKCa; KCNMA1) channel was homogeneously expressed in both subpopulations, KCa3.1 was found exclusively in the CD90- cell fraction. Similar to our previous observations in freshly isolated c-Kit+ eCPCs, KCa3.1 was responsible for the determination of Vmem under resting conditions and during SOCE. Importantly, we demonstrated that transplantation of genetically-modified EDCs to over-express KCNN4 potentiates cardiac regeneration in a murine model of ischemic cardiomyopathy. This study provides the first evidence in the literature that modulating the activity of a single plasma membrane ion channel can truly improves the therapeutic efficacy of progenitor cells.

Les canaux ioniques sont des complexes macromoléculaires clés exprimés dans tous les types de cellules et sont impliqués dans divers processus physiologiques, y compris la génération et la propagation de potentiels d'action. Des canaux défectueux conduisent à des maladies graves, notamment l'épilepsie, des arythmies et des syndromes douloureux, ce qui en fait une cible potentielle intéressante pour le développement de médicaments. Pour améliorer notre compréhension de ces assemblages biologiques et éventuellement trouver des traitements spécifiques pour les canalopathies, il est crucial d'étudier la structure et la fonction des canaux ioniques. L'objectif principal de cette thèse a été d'étudier ce type de détails structurels et fonctionnels pour trois canaux ioniques associés aux domaines des capteurs de douleur et des canaux potassiques voltage-dépendants en utilisant des techniques de fluorescence et d'électrophysiologie. Dans le premier projet, nous avons étudié la stœchiométrie des canaux hétéromères Kv2.1 / 6.4 (chapitre trois). La technique du décompte de sous-unités isolées (single subunit counting :ssc) permet de compter les sous-unités marquées par fluorescence d’un complexe isolé en déterminant le nombre d'événements de photoblanchiment, qui apparaissent en sauts irréversibles vers le bas sur les traces de fluorescence. Pour désigner la stœchiométrie la plus probable, nous avons utilisé des calculs de probabilités pondérées et avons constaté que les canaux Kv2.1 / 6.4 s'expriment dans un arrangement 2 : 2. Plus précisément, les études fonctionnelles des canaux concatémériques montrent que les sous-unités Kv6.4 et 2.1 doivent être disposées de manière alternée. Le deuxième projet était également basé sur des expériences de SSC et visait à déterminer l'état oligomérique du nouveau canal ionique TACAN (chapitre quatre). Nous avons trouvé une portion significative de canaux intracellulaires, ce qui a provoqué une fluorescence de fond dans les expériences de SSC traditionnelles réalisées avec les cellules mammifères. Pour améliorer le rapport du signal sur bruit de fond, nous avons effectué des expériences de SSC sur des canaux purifiés qui ont été immobilisés sur des lamelles de verre fonctionnalisées Ni-NTA. En utilisant la méthode de calcul décrite dans le premier projet, nous avons trouvé différents états oligomériques et proposons que les canaux TACAN natifs s'assemblent en tétramères qui sont instables lorsqu'ils sont solubilisés dans un détergent. Dans le dernier projet, nous avons étudié la relation structure-fonction de la sous-unité auxiliaire DPP6 pour les canaux Kv4.2 (chapitre cinq). Ici, nous avons progressivement tronqué le grand domaine extracellulaire de 700 acides aminés de DPP6 et étudié son effet sur les courants macroscopiques en utilisant la technique du cut-open voltage clamp. Nous avons constaté que les sous-unités DPP6 avec un domaine extracellulaire court ne parviennent pas à moduler les propriétés du canal aussi efficacement que la DPP6 pleine longueur. Plus précisément, la seconde moitié du domaine extracellulaire b-propeller de DPP6 est responsable d'une inactivation du canal considérablement accélérée. Sur la base de la structure cristalline du domaine extracellulaire, nous avons proposé qu'un domaine b-propeller stable et possiblement la formation de dimères DPP6 sont responsables de la déstabilisation efficace de l'état du canal ouvert. / Ion channels are key macromolecular complexes expressed in all cell types and are involved in various physiological processes including the generation and propagation of action potentials. Defective channels lead to severe diseases including epilepsy, arrhythmias and pain syndromes making them an interesting potential drug target. To improve our understanding of these biological assemblies and eventually find specific treatments for channelopathies, it is crucial to study the structure and function of ion channels. The main purpose of this thesis has been to investigate such structural and functional details of three ion channel complexes from the field of pain sensors and voltage-gated potassium channels using fluorescence and electrophysiological techniques. In the first project, we studied the stoichiometry of heteromeric Kv2.1/6.4 channel complexes (chapter three). Single subunit counting (SSC) allows to directly count the number of fluorescently labeled subunits by determining the number of irreversible, step-wise photobleaching events. To determine the most probable stoichiometry, we used weighted likelihood calculations and found that Kv2.1/6.4 channels express in a 2:2 arrangement. More precisely, functional studies of concatemeric channels (performed by our collaborators) illustrate that Kv6.4 and 2.1 subunits need to be arranged in an alternating fashion. The second project was also based on SSC experiments and aimed at determining the oligomeric state of the novel ion channel TACAN (chapter four). We found a significant amount of channels in the intracellular which caused background fluorescence in traditional SSC experiments performed in cells. To improve the signal to background ratio, we performed SSC experiments on purified channels that were immobilized on Ni-NTA functionalized glass coverslips. Using the model selection method described in the first project, we found different oligomeric states and propose that native TACAN channels assemble as tetramers which are unstable when solubilized in detergent. In the last project, we investigated the structure-function relation of the auxiliary DPP6 subunit in Kv4.2 channel complexes (chapter five). Here, we progressively truncated DPP6’s 700 amino acids long extracellular domain and studied its effect on macroscopic currents using the cut-open voltage clamp technique. We found that DPP6 subunits with a short extracellular domain fail to modulate the channel properties as efficiently as the full length DPP6. More precisely, the second half of the extracellular b-propeller domain of DPP6 is responsible for drastically accelerated channel inactivation. Based on the crystal structure of the extracellular domain, we proposed that a stable b-propeller domain and possibly DPP6 dimer formation is responsible for destabilizing the open channel state efficiently.