Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T22:06:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Albuquerque_MarcosEduardoLamasde_M.pdf: 618346 bytes, checksum: d8a7d01dacd5919516d8000db3c0e660 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A leishmaniose tegumentar é uma parasitose causada por protozoários do gênero Leishmania que acomete preferencialmente a pele e/ou as mucosas e caracteriza-se pelo aparecimento de lesões ulcerosas. Histologicamente, esta lesão caracteriza-se pela desintegração da epiderme e da membrana basal, com grande incidência de histiócitos, linfócitos, granulomas e proliferação de parasitos. Como conseqüência, a região lesada apresenta redistribuição de vasos sanguíneos, e dificuldades na difusão de oxigênio, resultando em microambiente hipóxico. Macrófagos se adaptam a hipóxia, alterando seu metabolismo, produção de linfocinas e atividade fagocítica. No presente trabalho comparamos os efeitos da hipóxia (6% O2) e da normóxia (21% O2) na infecção in vitro de macrófagos humanos obtidos de monócitos de sangue periférico com o parasito Leishmania amazonensis. Culturas de macrófagos humanos expostos a hipóxia antes da infecção com L. amazonensis mostraram redução na porcentagem de células infectadas quando comparadas com culturas de macrófagos humanos que permaneceram em normóxia. Nós também investigamos se a hipóxia estaria inviabilizando a sobrevivência dos macrófagos (teste do MTT) e induzindo a produção da linfocina TNF-a (boiensaio com células L929). Macrófagos humanos submetidos à hipóxia não mostraram diferenças significativas em relação viabilidade quando comparados aos macrófagos que permaneceram em ambiente normóxico culturas de macrófagos humanos estimulados com LPS e submetidos a períodos de hipóxia produziram mais TNF- a do que culturas de macrófagos estimulados com LPS que permaneceram em normóxia. Porém quando infectados com L. amazonensis, macrófagos estimulados com LPS em hipóxia mostraram produção significativamente menor de TNF- a quando comparados a macrófagos não infectados e estimulados por LPS, em ambiente hipóxico. Verificamos também que a produção de TNF- a nas culturas de macrófagos infectados com L. amazonensis, estimuladas com LPS, em hipóxia foi similar a produção de TNF- a dos macrófagos infectados com L. amazonensis, estimulados com LPS, mas que permaneceram em normóxia. Nossos resultados indicam que hipóxia altera a susceptibilidade de macrófagos humanos obtidos de monócitos de sangue periférico para a infecção com L. amazonensis, e que a produção de TNF- a não está envolvida no mecanismo pelo qual estas células controlam a carga parasitária / Abstract: The tegumentary leishmaniasis is a parasitic disease caused by protozoa Leishmania which attacks skin and/or mucosal tissues. The lesions are histologically characterized by degeneration of epidermal and the basal membranes with infiltration of histiocytes, lymphocytes, granuloma and parasite proliferation. Cutaneous lesions are associated with rearrangement of the blood vessels and decreased oxygen diffusion, resulting in a hypoxic microenvironment. Macrophages adapt to hypoxia altering their metabolism, lymphocytes production and phagocytosis activity. In the present study we have compared the effect of hypoxia (6% O2) with normoxia (21% O2) in human macrophages, derived from peripheral blood monocytes, infected with Leishmania amazonensis. Human macrophages exposed to hypoxia before infection with L. amazonensis showed a reduction of the percentage of infected cells. Cell viability was tested by MTT and TNF- a production was detected by bioassay using cell line L929. Human macrophages exposed to hypoxia showed similar viability when compared with human macrophages in normoxia. Human macrophages stimulated with LPS and exposed to hypoxia increased TNF- a production when compared with macrophage timulated by LPS cultured in normoxia. However, macrophage, infected with L. amazonensis stimulated with LPS and exposed to hypoxia showed a reduction in TNF- a production when compared with non infected macrophage, stimulated with LPS and exposed to hypoxia. We also observed that TNF- a production in L. amazonensis infected macrophages stimulated with LPS and exposed to hypoxia was similar to TNF- a production of infected macrophages stimulated with LPS, in normoxia. Our data indicated that hypoxia cam alter human macrophages susceptibility to L. amazonensis infection and no correlation between TNF-a production and control of parasite infection in this cells under hypoxia conditions / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Orientador: Selma Giorgio / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:41:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bosetto_MairaCegatti_D.pdf: 2902672 bytes, checksum: bae8655c89b3e476b8f862025a7974fd (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As células dendríticas (DCs) são potentes células apresentadoras de antígeno envolvidas principalmente na iniciação da resposta imune primária. As DCs podem ser isoladas a partir do cultivo de monócitos do sangue periférico humano realizado na presença de GM-CSF e IL-4. Protozoários do gênero Leishmania são parasitas intracelulares obrigatórios de células do Sistema Fagocítico Mononuclear como os macrófagos e as DCs. A L. amazonensis, espécie utilizada em nossos estudos, causa principalmente lesões cutâneas que podem se cronificar resultando num processo infeccioso com conseqüente hipóxia tecidual. Neste trabalho avaliamos o papel deletério/terapêutico da hipóxia em modelo in vitro de uma infecção intracelular, a leishmaniose, através da análise dos parâmetros comentados na seqüência. Culturas de DCs humanas infectadas com amastigotas de L. amazonensis foram expostas à hipóxia de 6% de oxigênio. A avaliação fenotípica das culturas indicou que a hipóxia, apesar de não afetar a viabilidade das células, reduziu a expressão dos marcadores de superfície celular CD80, CD86 e CD1a. A hipóxia não afetou a entrada do parasita nas DCs, mas modulou a atividade funcional das DCs, com diminuição da infecção em cerca de 30%. Na presença de ativadores como LPS e INF-g, as DCs foram capazes de reduzir a porcentagem de infecção em normóxia, sendo que a hipóxia não potencializou este efeito estimulador. No entanto, essas mesmas culturas ativadas e infectadas em hipóxia produziram menos IL-12 que as culturas controle em normóxia. O efeito da hipóxia sobre drogas leishmanicidas Anfotericina B, Glucantime e Miltefosine foram também avaliados. As curvas dose-resposta e análise das IC50s de Anfotericina B e Glucantime sugeriram que a hipóxia anulou ou diminuiu a ação das drogas nas culturas de DCs infectadas durante 48 horas de tratamento, quando comparados ao controle em normóxia. Já o Miltefosine agiu de forma semelhante tanto em normóxia como em hipóxia. Por fim, analisamos o processo de interação Leishmania-DC utilizando amastigotas isolados de lesões de camundongos C3H/nude (os quais não apresentam anticorpos na superfície). A porcentagem de infecção das DCs com amastigotas ¿nude¿ foi de 36%. A opsonização destes parasitas com soro humano elevou a porcentagem de infecção em torno de 40%. A inativação e a depleção de anticorpos destes soros diminuiu marcadamente a porcentagem de infecção proporcionada pela opsonização, indicando o envolvimento de receptores para Fc (FcR) e para Complemento (CRs) na fagocitose dos parasitas. A infecção das DCs também foi inibida em 50% após tratamento dos amastigotas com heparina. Nós não relacionamos os receptores de manose fucose com a entrada do amastigotas nas DCs. Nossos dados sugerem que o processo de infecção das DCs envolve a participação de pelo menos três interações receptor/ligante (FcR/anticorpos, CRs/complemento e proteoglicanas/proteína ¿ligadora¿ de heparina) / Abstract: Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells involved in the initiation of primary immune response. Human DC were obtained from peripheral blood monocytes after culturing with GM-CSF and IL-4. Leishmania parasites are intracellular protozoan that replicate in Mononuclear Phagocytic System cells, mainly macrophages and DCs. Leishmania amazonensis, a species used in our studies is associated with cutaneous infection that can become chronical lesions with a inflammatory process and small regions of hypoxia. In this work we evaluated the role of hypoxia in a in vitro model of intracellular infection, leishmaniasis. Human DCs infection with infected by L. amazonensis amastigotes were performed under normoxic (21% O2) and hypoxic (6% O2) conditions. The phenotypic analysis of DC cultured under hypoxic condition showed a reduced expression of CD80, CD86 and CD1a compared with normoxic control. In these cell cultures, viability was not affected. Hypoxia did not affect the amastigote entrance into DCs although it modulated their functional activity reducing 30% the percentage of infected DCs. Furthermore, hypoxia did not act synergistically with IFN-g plus LPS in DCs to induce killing of parasites. DCs activated and infected with amastigotes under hypoxic condition produced low levels of IL-12 compared with normoxic control. Moreover, in the abscence of stimulation, infected DCs did not produce IL-12. We also evaluated the leishmanicidal activity of Amphotericin-B, Glucantime and Miltefosine under normoxic and hypoxic conditions during 48 h. Under hypoxic condition, Amphotericin-B and Glucantime were less efective in L. amazonensis infected DCs. None effect of hypoxia was observed in Miltefosine was observed against L. amazonensis infected DC. Finally, we investigated in vitro mechanisms of entry into human DCs of L. amazonensis amastigotes isolated from lesions in nude mice (Am nude). The DC infection rate with Am nude was approximately 36%, while opsonization of Am nude with normal human serum and infected human serum increased the DC infection rates to 60% and 62%, respectively. Heat inactivation and depletion of antibodies in sera brought the DC infection rate down to 40%. The DC infection rate was inhibited after pre-treatment of Am nude with heparin. We were unable to implicate mannose-fucose receptors in the uptake of Am nude by DCs. Our data suggest that the ability of L. amazonensis amastigotes to infect human DCs involves the participation of at least three multiple receptor-ligand interactions, antibodies/FcR, complement components/CR and proteoglycans/heparin-binding protein / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O escopo dete trabalho é verificar a influência de episódios agudos de hipoxemia e subsequente reoxigenação sobre marcadores inflamatórios e sobre sinalizadores de integridade da função endotelial. / The aim of this study is to verify the effect of acute hipoxemia and subsequente reoxigenation over inflammatory markers and indicators of integrity of the endothelial function.

Estudos mostram que a exposição ao meio hiperglicêmico ou diabetes protege o coração contra insultos patológicos, incluindo isquemia. A ativação de fatores anti-apoptóticos e proliferativos parece estar envolvida com esta cardioproteção. Este estudo foi desenhado para investigar a modulação da viabilidade de fibroblastos cardíacos submetidos à hipóxia tratados previamente com meio hiperglicêmico, e os efeitos de 15 dias de infarto do miocárdio (IM) na função ventricular em ratos diabéticos sobre os fatores de morte e sobrevida celular. Foram utilizados ratos Wistar machos e as análises foram realizadas no ventrículo esquerdo. Para as análises in vitro, os fibroblastos cardíacos foram obtidos por digestão enzimática (tripsina/colagenase), e cultivados em dois meios: baixa Glicose (5mM) e alta Glicose (25mM análogo ao plasma diabético). As células confluentes (80%) foram submetidas à hipóxia por incubadora modular com gás (5,6% de CO2 e 94,4% de N2); após as células foram mantidas em estufa a 37ºC por 6; 12; 24; 48 e 72hs. Experimentos de citometria de fluxo foram realizados para análise da viabilidade celular e fragmentação de DNA, ambas para verificação de apoptose e confirmadas pelas medidas de AnexinaV/FITC/IP. A expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi medida no sobrenadante dos meios por ELISA. Para as análises in vivo, os ratos foram divididos (N=8/grupo) em grupos: controle (C), diabético (D), infartado (I) e diabético infartado (DI). Quinze dias após a indução do diabetes ou não, com injeção de estroptozotocina (50mg/Kg) ou tampão citrato, os grupos I e DI foram submetidos à ligadura da artéria coronária. Após 15 dias de IM e/ou 30 de diabetes, a função cardíaca (sistólica e diastólica) foi analisada por ecocardiograma, além da avaliação do tamanho do IM em 24 horas e 15 dias. As citocinas inflamatórias foram medidas por ELISA, a expressão gênica dos fatores de morte e sobrevida celular foram avaliados por PCR em tempo real, a atividade da caspase 3 foi medida por espectrofluorimetria, e a expressão protéica dos transportadores de glicose (GLUT) por Western blotting. A densidade capilar e a fibrose do coração foram quantificadas por análise histológica. A viabilidade celular mostrou homogenia em todos os tempos de hipóxia e em ambos os tratamentos de glicose. Em 6 horas verificamos fragmentação do DNA com marcação dos fosfolípides de membrana (apoptose) e % elevada de morte em ambos os tratamentos até 12hs. Após 24hs, ocorreu adaptação, havendo aumento de VEGF e diminuição da fragmentação do DNA com 48hs; após 72hs, observou-se apenas que o VEGF continuava aumentado. No meio hiperglicêmico, os valores de VEGF estavam maiores e a fragmentação menor quando comparados ao meio hipoglicêmico. O grupo DI apresentou melhora na função sistólica (fração de ejeção e de encurtamento), acompanhada de manutenção da função diastólica (tempo de relaxamento isovolumétrico e tempo de desaceleração do pico E), redução de 36% do tamanho do IM, redução das citocinas pró-inflamatórias (TNF- e IL-1), com ativação da apoptose (expressão aumentada de Fas, p53, Bax e atividade de caspase 3) e aumento dos fatores de sobrevivência celular (Bcl-2, HIF-1, VEGFa e IL8r). Além disso, o grupo DI apresentou aumento do GLUT-1 com diminuição do escore de fibrose e aumento da densidade capilar; resultados comparados ao grupo I. Este cenário é, provavelmente, um mecanismo de compensação, associado ao saldo positivo entre genes regulatórios relacionados com a sobrevivência celular programada, redução de citocinas inflamatórias, aumento da utilização de glicose como substrato energético, redução da fibrose e angiogênese. Em conjunto, estes achados sugerem uma maior plasticidade e resistência celular de fibroblastos cardíacos frente à hipóxia sendo esta favorecida pela hiperglicemia crônica em ratos diabéticos / Studies showed that exposure to hyperglycemia or diabetes protects the heart against pathological insults, including ischemia. The activation of anti-apoptotic factors and proliferation seem to be involved in this cardioprotection. This study was designed to investigate the feasibility of modulation of hyperglycemic-environment pretreated-cardiac fibroblasts subjected to hypoxia, and the effects of 15 days of myocardial infarction on ventricular function in diabetic rats and on the causes of death and cell survival. Male Wistar rats were used and the analyses were performed in the left ventricle. For in vitro experiments, cardiac fibroblasts were obtained by enzymatic digestion (trypsin/collagenase) and they were cultivated in two different mediums: Low Glucose (5mM) and High Glucose (25mM similar to diabetic plasma). Confluent cells (80%) were subjected to hypoxia by modular incubator with gas (5.6% CO2 and 94.4% N2).at 37 ° C for 6, 12, 24, 48 and 72h. Flow cytometry was employed to the analysis of cell viability and DNA fragmentation, both for verification of apoptosis process and confirmed by AnexinaV / FITC / IP. The expression of vascular growth factor (VEGF) was measured in the supernatant medium by ELISA. For in vivo experiments, the rats were divided (N = 8/group) in control (C), diabetic (D), infarcted (I) and diabetic infarcted (DI).groups After 15 days of induction of diabetes by estreptozotocin (50mg/kg) or citrate buffer, the I and DI groups underwent coronary artery ligation. After 15 days of myocardium infarction (MI) and/or 30 of diabetes, cardiac function (systolic and diastolic) was analyzed by echocardiogram, as well as the size of infarction at both, 24 hours and 15 days. The inflammatory cytokines were measured by ELISA, the gene expression of factors for death and cell survival by real-time PCR, the activity of caspase 3 by spectrofluorimetry, the protein expression of glucose transporters (GLUT) by Western- blotting and, lastly, capillary density and fibrosis by histological analysis. Cell viability showed homogeneous at all times of hypoxia and in both glucose treatments. In 6 hours we found DNA fragmentation in the main phospholipid membrane (apoptosis) and high % of death in both treatments until 12 hours. After 24 hours, the cells entered into adaptation and after 48 hours it was verified an increase in VEGF expression and a decrease in DNA fragmentation. At 72 hours, no significant differences in the fragmentation were observed; however, there was an increase in VEGF expression. In the hyperglycemic medium we observed higher values of VEGF expression and less DNA fragmentation when compared to the hypoglycemic medium. In the DI group systolic function (% ejection fraction and fractional shortening) was better than in the I group and it was accompanied by the maintenance of diastolic function (IVRT and deceleration time of peak E). There was also a 36% reduction in infarction size in the DI group and reduced pro-inflammatory cytokines (TNF- and IL-1) with activation of apoptosis (increased expression of Fas, p53, Bax and caspase 3 activity) and increased cell survival factors (Bcl-2, HIF-1, VEGF and IL8r). Moreover, DI rats also showed an increase in GLUT-1 with decreased scores of fibrosis and increased capillary density when compared to the I group. This scenario is probably a compensatory mechanism associated with the positive balance of regulatory genes related to programmed cell survival, reduction of inflammatory cytokines, increased use of glucose as energy substrate, reduction of fibrosis and angiogenesis. Altogether, these findings suggest a greater plasticity and cellular resistance of cardiac fibroblasts to hypoxia and this is favored by chronic hyperglycemia in diabetic rats.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Univ., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2007. / Title from first page of PDF file (viewed on June 24, 2009). Includes bibliographical references.

Estudos mostram que a exposição ao meio hiperglicêmico ou diabetes protege o coração contra insultos patológicos, incluindo isquemia. A ativação de fatores anti-apoptóticos e proliferativos parece estar envolvida com esta cardioproteção. Este estudo foi desenhado para investigar a modulação da viabilidade de fibroblastos cardíacos submetidos à hipóxia tratados previamente com meio hiperglicêmico, e os efeitos de 15 dias de infarto do miocárdio (IM) na função ventricular em ratos diabéticos sobre os fatores de morte e sobrevida celular. Foram utilizados ratos Wistar machos e as análises foram realizadas no ventrículo esquerdo. Para as análises in vitro, os fibroblastos cardíacos foram obtidos por digestão enzimática (tripsina/colagenase), e cultivados em dois meios: baixa Glicose (5mM) e alta Glicose (25mM análogo ao plasma diabético). As células confluentes (80%) foram submetidas à hipóxia por incubadora modular com gás (5,6% de CO2 e 94,4% de N2); após as células foram mantidas em estufa a 37ºC por 6; 12; 24; 48 e 72hs. Experimentos de citometria de fluxo foram realizados para análise da viabilidade celular e fragmentação de DNA, ambas para verificação de apoptose e confirmadas pelas medidas de AnexinaV/FITC/IP. A expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi medida no sobrenadante dos meios por ELISA. Para as análises in vivo, os ratos foram divididos (N=8/grupo) em grupos: controle (C), diabético (D), infartado (I) e diabético infartado (DI). Quinze dias após a indução do diabetes ou não, com injeção de estroptozotocina (50mg/Kg) ou tampão citrato, os grupos I e DI foram submetidos à ligadura da artéria coronária. Após 15 dias de IM e/ou 30 de diabetes, a função cardíaca (sistólica e diastólica) foi analisada por ecocardiograma, além da avaliação do tamanho do IM em 24 horas e 15 dias. As citocinas inflamatórias foram medidas por ELISA, a expressão gênica dos fatores de morte e sobrevida celular foram avaliados por PCR em tempo real, a atividade da caspase 3 foi medida por espectrofluorimetria, e a expressão protéica dos transportadores de glicose (GLUT) por Western blotting. A densidade capilar e a fibrose do coração foram quantificadas por análise histológica. A viabilidade celular mostrou homogenia em todos os tempos de hipóxia e em ambos os tratamentos de glicose. Em 6 horas verificamos fragmentação do DNA com marcação dos fosfolípides de membrana (apoptose) e % elevada de morte em ambos os tratamentos até 12hs. Após 24hs, ocorreu adaptação, havendo aumento de VEGF e diminuição da fragmentação do DNA com 48hs; após 72hs, observou-se apenas que o VEGF continuava aumentado. No meio hiperglicêmico, os valores de VEGF estavam maiores e a fragmentação menor quando comparados ao meio hipoglicêmico. O grupo DI apresentou melhora na função sistólica (fração de ejeção e de encurtamento), acompanhada de manutenção da função diastólica (tempo de relaxamento isovolumétrico e tempo de desaceleração do pico E), redução de 36% do tamanho do IM, redução das citocinas pró-inflamatórias (TNF- e IL-1), com ativação da apoptose (expressão aumentada de Fas, p53, Bax e atividade de caspase 3) e aumento dos fatores de sobrevivência celular (Bcl-2, HIF-1, VEGFa e IL8r). Além disso, o grupo DI apresentou aumento do GLUT-1 com diminuição do escore de fibrose e aumento da densidade capilar; resultados comparados ao grupo I. Este cenário é, provavelmente, um mecanismo de compensação, associado ao saldo positivo entre genes regulatórios relacionados com a sobrevivência celular programada, redução de citocinas inflamatórias, aumento da utilização de glicose como substrato energético, redução da fibrose e angiogênese. Em conjunto, estes achados sugerem uma maior plasticidade e resistência celular de fibroblastos cardíacos frente à hipóxia sendo esta favorecida pela hiperglicemia crônica em ratos diabéticos / Studies showed that exposure to hyperglycemia or diabetes protects the heart against pathological insults, including ischemia. The activation of anti-apoptotic factors and proliferation seem to be involved in this cardioprotection. This study was designed to investigate the feasibility of modulation of hyperglycemic-environment pretreated-cardiac fibroblasts subjected to hypoxia, and the effects of 15 days of myocardial infarction on ventricular function in diabetic rats and on the causes of death and cell survival. Male Wistar rats were used and the analyses were performed in the left ventricle. For in vitro experiments, cardiac fibroblasts were obtained by enzymatic digestion (trypsin/collagenase) and they were cultivated in two different mediums: Low Glucose (5mM) and High Glucose (25mM similar to diabetic plasma). Confluent cells (80%) were subjected to hypoxia by modular incubator with gas (5.6% CO2 and 94.4% N2).at 37 ° C for 6, 12, 24, 48 and 72h. Flow cytometry was employed to the analysis of cell viability and DNA fragmentation, both for verification of apoptosis process and confirmed by AnexinaV / FITC / IP. The expression of vascular growth factor (VEGF) was measured in the supernatant medium by ELISA. For in vivo experiments, the rats were divided (N = 8/group) in control (C), diabetic (D), infarcted (I) and diabetic infarcted (DI).groups After 15 days of induction of diabetes by estreptozotocin (50mg/kg) or citrate buffer, the I and DI groups underwent coronary artery ligation. After 15 days of myocardium infarction (MI) and/or 30 of diabetes, cardiac function (systolic and diastolic) was analyzed by echocardiogram, as well as the size of infarction at both, 24 hours and 15 days. The inflammatory cytokines were measured by ELISA, the gene expression of factors for death and cell survival by real-time PCR, the activity of caspase 3 by spectrofluorimetry, the protein expression of glucose transporters (GLUT) by Western- blotting and, lastly, capillary density and fibrosis by histological analysis. Cell viability showed homogeneous at all times of hypoxia and in both glucose treatments. In 6 hours we found DNA fragmentation in the main phospholipid membrane (apoptosis) and high % of death in both treatments until 12 hours. After 24 hours, the cells entered into adaptation and after 48 hours it was verified an increase in VEGF expression and a decrease in DNA fragmentation. At 72 hours, no significant differences in the fragmentation were observed; however, there was an increase in VEGF expression. In the hyperglycemic medium we observed higher values of VEGF expression and less DNA fragmentation when compared to the hypoglycemic medium. In the DI group systolic function (% ejection fraction and fractional shortening) was better than in the I group and it was accompanied by the maintenance of diastolic function (IVRT and deceleration time of peak E). There was also a 36% reduction in infarction size in the DI group and reduced pro-inflammatory cytokines (TNF- and IL-1) with activation of apoptosis (increased expression of Fas, p53, Bax and caspase 3 activity) and increased cell survival factors (Bcl-2, HIF-1, VEGF and IL8r). Moreover, DI rats also showed an increase in GLUT-1 with decreased scores of fibrosis and increased capillary density when compared to the I group. This scenario is probably a compensatory mechanism associated with the positive balance of regulatory genes related to programmed cell survival, reduction of inflammatory cytokines, increased use of glucose as energy substrate, reduction of fibrosis and angiogenesis. Altogether, these findings suggest a greater plasticity and cellular resistance of cardiac fibroblasts to hypoxia and this is favored by chronic hyperglycemia in diabetic rats.

Abstract Oxygen deprivation (hypoxia) is related to many disease conditions, such as anemia, but is also a critical regulatory signal during normal development. Cellular responses to hypoxia are largely mediated through alterations in gene regulation brought about by the transcription factor known as hypoxia inducible facor (HIF). One of the most extensively studied systemic consequences of hypoxia is the induction of red blood cell production, erythropoiesis, which occurs through a HIF-dependent increase in erythropoietin (EPO) gene expression. The amount of HIF in cells is regulated by three HIF prolyl 4-hydroxylases (HIF-P4Hs) while a fourth P4H possessing a transmembrane domain (P4H-TM) is able to act on HIF at least in vitro. The putative role of P4H-TM in regulating erythropoiesis is studied here by administering a HIF-P4H inhibitor, FG-4497, to P4h-tm null and wild-type mice. By comparing the observed effects with those seen in FG-4497 treated hypomorphic Hif-p4h-2 and Hif-p4h-3 null mice, it is demonstrated for the first time that P4H-TM is involved in the regulation of Epo production in the mammalian kidney, but not in the liver. Long bones are formed via endochondral ossification, in which a cartilaginous template, the growth plate, is first laid down and then replaced with bone. The growth plate is rich in extracellular matrix (ECM) and contains a hypoxic central region in which HIF has been shown to regulate chondrocyte function. Importantly, growth plate chondrocytes are highly active in collagen synthesis. Collagen prolyl 4-hydroxylases (C-P4Hs I-III) provide collagen molecules with thermal stability and are thus necessary for the formation of a proper ECM. Through an in vitro approach it is demonstrated that hypoxia increases the amount and activity of C-P4H in primary mouse epiphyseal growth plate chondrocytes in a HIF-1-dependent manner. Lastly, it was set out to characterize mouse lines with complete inactivation of C-P4H-II with or without partial inactivation of C-P4H-I. A significant reduction in the total amount of C-P4H and its activity was found to result in mild chondrodysplasia and altered bone properties. The above mouse models provided new information on the specific in vivo roles of the C-P4H isoenzymes I and II. / Tiivistelmä Kudosten alentunut happipitoisuus (hypoksia) liittyy osana moniin elimistön patologisiin tiloihin, kuten anemiaan. Lisäksi se on tärkeä säätelytekijä normaalin yksilönkehityksen aikana. Jotta solut havaitsisivat hypoksian ja reagoidakseen siihen, on niille kehittynyt säätelyjärjestelmä, jossa hypoksiassa indusoituva transkriptiotekijä, HIF, on tärkeässä asemassa. Yksi merkittävin HIF:n indusoima systeeminen vaikutus elimistössä on punasolujen tuotannon, erytropoieesin, kiihtyminen. Sitä tapahtuu erytropoietiinia koodittavan geenin (EPO) lisääntyneen ilmentymisen kautta. HIF-tekijän määrää soluissa säätelee kolme HIF-prolyyli-4-hydroksylaasientsyymiä (HIF-P4Ht 1-3). Transmembraanisen prolyyli-4-hydroksylaasin (P4H-TM) tiedetään myös vaikuttavan HIF-tekijän määrään soluissa in vitro, mutta sen vaikutusta nisäkkään erytropoieesiin ei ole aiemmin tutkittu. Käyttämällä hyväksi kolmea eri transgeenista hiirilinjaa (P4h-tm-/-, Hif-P4h-2gt/gt, Hif-p4h-3-/-) ja HIF-P4H entsyymeitä inhiboivaa lääkeainetta, FG-4497, tässä työssä osoitettiin ensimmäistä kertaa, että P4H-TM osallistuu nisäkkään Epo-hormonin tuoton säätelyyn. Pitkät luut muodostuvat endokondraalisen luutumisen kautta. Siinä ensin muodostuu rustoinen malli, kasvulevy, joka vähitellen korvaantuu luukudoksella. Kasvulevyn sisin kerros on sen soluille, kondrosyyteille, hypoksinen kasvuympäristö. HIF:illä on todettu olevan tärkeä rooli kondrosyyttien toiminnan säätelijänä. Kasvulevyn soluvälitila sisältää runsaasti kollageeneja. Kollageenin prolyyli-4-hydroksylaasit (C-P4Ht I-III) ovat avainasemassa kollageenien biosynteesissä ja siten niiden toiminta on välttämätöntä kestävän soluvälitilan muodostumiselle. Käyttämällä in vitro menetelmiä, tässä työssä osoitettiin, että hiiren epifyseaalisten kasvulevyjen kondrosyyteissä hypoksia lisää C-P4H:n määrää ja aktiivisuutta HIF-tekijästä riippuvalla mekanismilla. Eri C-P4H-isoentsyymeiden toiminnasta ja merkityksestä in vivo tiedetään vain vähän. Tässä työssä karakterisoitiin hiirilinja, jossa C-P4H-II on täysin inaktiivinen, ja hiirilinja, jossa lisäksi C-P4H-I on osittain inaktiivinen. Merkittävästi alentuneen C-P4H:n aktiivisuuden todettiin aiheuttavan hiirimallissa lievän kondrodysplasian sekä heikentyneet luun ominaisuudet.

INTRODUÇÃO: Apesar do amplo uso da medida da saturação central de oxigênio como meta terapêutica em pacientes de terapia intensiva, diferenças absolutas em relação à saturação venosa mista existem. As causas desses gradientes, bem como o comportamento das mesmas ao longo do tempo nas doenças graves não foram completamente esclarecidas. Considerando que a maioria das intervenções atualmente empregadas para reverter desequilíbrios de oxigenação tecidual presentes nos pacientes graves é direcionada, direta ou indiretamente, ao coração; a situação particular de elevada taxa de extração de oxigênio basal do miocárdio e a ausência de ferramentas de monitorização do impacto miocárdico dessas intervenções, o presente estudo, diante da possibilidade teórica da participação do efluente do seio coronário nessas diferenças centrais para pulmonares, não só para a saturação de oxigênio (SO2), analisou o comportamento da SO2, pressão parcial de dióxido de carbono (PCO2), lactato e glicose, em diferentes modelos de hipóxia e compartimentos vasculares, com ênfase na avaliação do metabolismo miocárdico e seu impacto nos gradientes centrais para pulmonares. MÉTODOS: 37 porcos, machos, com peso em torno de 35 Kg, sedados e ventilados mecanicamente, foram estudados após indução de quatro diferentes tipos de injúria hipóxica (hipóxia anêmica, estagnante, hipóxica e sepse), sendo 8 animais por grupo e mais 5 controles. Além de variáveis hemodinâmicas e de oxigenação, SO2, PCO2, lactato e glicose foram medidos, em diferentes momentos, em 9 compartimentos vasculares distintos, incluindo o seio coronário (artéria femoral, veia cava inferior e superior, átrio direito, ventrículo direito, artéria pulmonar, veia suprahepática direita e veia porta). PRINCIPAIS RESULTADOS: As concentrações de O2, lactato e glicose no efluente do seio coronário apresentaram padrões distintos entre os grupos: troca de substrato energético de lactato por glicose nos grupos hipóxia hipóxica e anêmica, aumento no consumo de ambos os substratos na sepse e ausência de tendência clara no grupo da hipóxia estagnante. Os gradientes de PCO2 entre seio coronário e artéria femoral mantiveram-se estáveis com tendência de alargamento tardio em todos os modelos. Na análise dos demais gradientes regionais, o seio coronário apresentou a menor SO2 do organismo, as menores concentrações de lactato, os maiores níveis de PCO2, e esses padrões variaram ao longo do tempo. Mesma tendência evolutiva foi percebida entre os gradientes centrais para pulmonares de O2, lactato, CO2 e glicose e a medida desses mesmos parâmetros no seio coronário. CONCLUSÕES: As concentrações de O2, lactato e glicose no efluente do seio coronário estão relacionadas ao tipo de injúria e não apenas à disponibilidade de substrato energético. Padrões de gravidade, comuns às fases tardias de todos os grupos, puderam ser identificados: qualquer redução da SO2 coronariana; incremento do metabolismo de glicose; produção de lactato pelo miocárdio e surgimento de igualdade ou inferioridade dos níveis da PCO2 coronariana em relação aos valores dos demais compartimentos vasculares do organismo (independentemente da trajetória). A tendência dos gradientes de PCO2 transmiocárdicos seguiu a do débito cardíaco e, certamente, deve refletir fluxo coronariano. A análise dos gradientes regionais se mostrou capaz de permitir a avaliação de contextos orgânicos regionais específicos, como na avaliação do metabolismo hepático, na qual foi possível demonstrar que na hipóxia, a produção de glicose hepática é mantida até o óbito, diferentemente do padrão descrito para a sepse. Por fim, com a análise dos dados do grupo sepse, foi possível demonstrar que: a) assim como os gradientes centrais para pulmonares de SO2 e lactato já foram descritos, gradientes de glicose e PCO2 também existem; b) o seio coronário participa, significativamente, na formação desses gradientes de lactato, CO2 e glicose / INTRODUCTION: Despite of the widespread use of the central venous oxygen saturation measurement as a therapeutic goal in critically ill patients, absolute differences between this measurement and the mixed venous oxygen exist. Causes of these differences, as well the behavior of these gradients in critical illness, are not completely understood. Considering current therapeutic interventions aimed to reverse tissue oxygenation impairment are mediated by increases in cardiac output; the particular scenario in which the heart is not physiologically able to further increase oxygen extraction and the absence of tools to monitoring the myocardium impact of those interventions, the present study, facing the theoretical possibility of the coronary sinus effluent participation in those central to mixed venous differences, has analyzed the oxygen saturation (SO2), carbon dioxide partial pressure (PCO2), lactate and glucose concentrations behaviors over time, in different models of tissue hypoxia and in different vascular sites. Emphasis on the myocardial energetic metabolism and its impact over central to mixed venous gradients was placed. METHODS: 37 pigs, males, weighting about 35 Kg, sedated and mechanically ventilated, were studied after induction of four different hypoxic injury models (sepsis, and anemic, stagnant, hypoxic hypoxia), eight for group and five controls. In addition to hemodynamic and oxygen variables, SO2, PCO2, lactate and glucose were measured in different phases, in 9 distinct vascular sites, including coronary sinus (femoral artery, inferior and superior vena cava, right atria, right ventricle, pulmonary artery, right suprahepatic vein and portal vein). MAIN RESULTS: Concentrations of O2, lactate and glucose in the coronary sinus effluent presented distinctive patterns among groups: shift from lactate to glucose consumption in hypoxic hypoxia and anemic hypoxia groups, increase in both glucose and lactate consumption in sepsis and absence of clear trend in stagnant hypoxia group. PCO2 gradients from systemic artery to coronary sinus presented late enlargement trend in all groups. In the regional gradients analysis comparisons, coronary sinus presented the lowest SO2, the lowest lactate concentrations, the highest PCO2 levels, and these patterns changed over time. Similar evolution trends were observed between central to mixed venous O2, PCO2, lactate and glucose gradients and the same parameters measured in coronary sinus. CONCLUSIONS: Different concentrations of O2, PCO2, lactate and glucose in coronary sinus are related to the type of hypoxic injury and not only to energetic substrate availability. Severity-related patterns, common to all groups in late phases, were identified: any reduction of coronary SO2, shift to glucose consumption, net lactate myocardial production and equality or inferiority of PCO2 levels related to other vascular compartments (independently of trend). Trends in transmyocardial PCO2 gradients followed cardiac output ones and, certainly, should mirror coronary blood flow. Regional gradients analysis showed suitable to explore specific regional metabolic settings, as in the described example of liver metabolism, in which production of glucose were maintained in all phases by this organ in hypoxic hypoxia groups, differently from the impaired production described in literature for sepsis. At last, data from sepsis group have showed: a) as to the previously known central to mixed venous SO2 and lactate gradients, PCO2 and glucose gradients also exist; b) coronary sinus has participated significantly in formation of central to mixed venous lactate, PCO2 and glucose gradients

INTRODUÇÃO: Pré-condicionamento isquêmico remoto (PCIR) é o fenômeno pelo qual curtos períodos de isquemia sub-letal sobre um órgão ou tecido, intercalados com reperfusão do mesmo, conferem a outros órgãos ou tecidos distantes deste, um aumento na capacidade da resistir a episódios subsequentes de isquemia, a qual os mesmos possam ser expostos. Com base nesse fato, testamos a hipótese de que o pré-condicionamento isquêmico remoto em pacientes portadores de claudicação intermitente de membros inferiores poderia aumentar a capacidade de deambulação desses pacientes, extrapolando o conceito do PCIR de aumento da capacidade de preservação da integridade celular frente à isquemia, para a manutenção da função celular, tornando a célula mais apta ao trabalho em situações de privação de oxigênio, geradas pela restrição do fluxo sanguíneo, como ocorre nos pacientes com claudicação intermitente de membros inferiores, durante o exercício. OBJETIVOS: Avaliar se o PCIR aumenta a distância de início de claudicação e/ou a distância total de claudicação em pacientes com doença arterial obstrutiva periférica. MÉTODOS: Foram estudados 52 pacientes ambulatoriais que apresentavam queixa de claudicação intermitente dos membros inferiores, associada a um pulso arterial ausente ou reduzido no membro sintomático e/ou um índice tornozelo-braço <0,90. Estes pacientes foram randomizados em três grupos (A, B e C). Todos os pacientes foram submetidos a dois testes de caminhada em esteira de acordo com o protocolo de Gardner. O grupo A fez o primeiro teste de esteira sem o pré-condicionamento isquêmico remoto e, após 7 dias, foi submetido a um novo teste de esteira, agora precedido pelo pré-condicionamento isquêmico remoto. O grupo B foi submetido ao pré-condicionamento isquêmico remoto antes do primeiro teste de esteira e, após 7 dias, realizou novo teste de esteira, agora sem o pré-condicionamento isquêmico remoto. Já no Grupo C (grupo controle), ambos os testes de esteira foram realizados sem pré-condicionamento isquêmico remoto, também com 7 dias de intervalo. RESULTADOS: Os grupos A e C mostraram um aumento na distância de início de claudicação, no segundo teste, em comparação com o primeiro teste. O grupo A teve um aumento estatisticamente significativo, em relação ao grupo C (grupo controle). Com relação à distância total de claudicação, todos os grupos (A, B e C), mostraram um aumento estatisticamente significativo a favor do segundo teste, porém não foi observada diferença entre os grupos (A, B e C). CONCLUSÕES: O pré-condicionamento isquêmico remoto aumentou a distância inicial de claudicação em pacientes com claudicação intermitente, no entanto, ele não afetou a distância total de claudicação dos pacientes portadores de claudicação intermitente de membros inferiores / INTRODUCTION: Remote ischemic preconditioning (RIPC) is a phenomenon in which a short period of sub-lethal ischemia in one organ protects against subsequent bouts of ischemia in another organ. Extrapolating the RIPC concept of increasing the preservation of cell integrity capability against ischemia, for the maintenance of cellular function, making the cell more able to work in oxygen deprivation generated by the restriction of blood flow, as occurs in patients with intermittent claudication of the lower limbs during exercise, we hypothesized that RIPC in patients with intermittent claudication would increase muscle tissue resistance to ischemia, thereby resulting in an increased ability to walk. OBJECTIVES: To test this hypothesis, we performed gait tests in patients with claudication with and without prior RIPC and then compared the initial claudication distance (ICD) and the total walking distance (TWD). METHODS: In a claudication clinic, 52 ambulatory patients who presented with complaints of intermittent claudication in the lower limbs associated with an absent or reduced arterial pulse in the symptomatic limb and/or an ankle-brachial index < 0.90 were recruited for this study. The patients were randomly divided into three groups (A, B and C). All of the patients underwent two tests on a treadmill according to the Gardener protocol. Group A was tested first without RIPC. Group A was subjected to RIPC prior to the second treadmill test. Group B was subjected to RIPC prior to the first treadmill test and then was subjected to a treadmill test without RIPC. In Group C (control group), both treadmill tests were performed without RIPC. The first and second tests were conducted seven days apart. Brazilian Clinical Trials: RBR-7TF6TM. RESULTS: Group A and C showed an increase in the initial claudication distance in the second test compared to the first test. Group A had a statistically significant increase, compared with C group (control group). With respect to total claudication distance, all the groups (A, B and C) showed a statistically significant increase in favor of the second test, but there was no difference between groups (A, B and C). CONCLUSIONS: RIPC increased the initial claudication distance in patients with intermittent claudication; however, RIPC did not affect the total walking distance of the patients