Glicocorticoides e outras drogas imunossupressoras são comumente utilizados para o tratamento de condições inflamatórias, como as Doenças Inflamatórias Intestinais (DIIs). Apesar dos avanços na terapia medicamentosa, a remissão da doença ainda é difícil de ser mantida. Devido às suas propriedades imunomodulatórias, as Células-Tronco Mesenquimais (MSCs – Mesenchymal Stem Cells) têm emergido como reguladoras da resposta imune, e sua viabilidade e propriedades migratórias são essenciais para o sucesso da terapia celular. Entretanto, pouco se conhece sobre os efeitos das drogas convencionalmente utilizadas no tratamento das DIIs no comportamento das MSCs. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade, a morfometria nuclear, a polaridade celular, a distribuição da actina-F e da FAK (Focal Adhesion Kinase), e o comportamento migratório das MSCs na presença das drogas Azatioprina (AZA) e Dexametasona (DEXA). As células foram isoladas de membranas coriônicas humanas e caracterizadas pela diferenciação em adipócitos e osteócitos, bem como pela expressão de um painel de marcadores de superfície. As MSCs foram previamente tratadas com AZA ou DEXA por 24h ou 7d nas concentrações de 1μM ou 10μM, respectivamente. Ambas as drogas não afetaram a viabilidade celular analisada por MTT (3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) e morfometria nuclear. Entretanto, a análise do índice de polaridade resultou em uma morfologia mais alongada após o tratamento com AZA, enquanto células mais arredondadas foram observadas na presença de DEXA. Os filamentos de actina foram marcados por Rodamina-Faloidina e sua análise mostrou que a AZA preservou parcialmente a formação de lamelipódios e aumentou a presença de fibras de estresse ventrais, enquanto que a DEXA inibiu a formação de lamelipódios, evidenciou uma maior presença de fibras de estresse ventrais e diminuiu a estabilidade das protrusões de membrana, observadas em vídeo. Através da análise de microscopia de série temporal, foi observado que as células sob o efeito da AZA por 7d migraram por maiores distâncias e tiveram um aumento em sua velocidade de migração (24,35%; P < 0,05; n = 4), ao passo que a DEXA diminuiu a velocidade migratória em 24h e 7d (-28,69% e -25,37%, respectivamente; P < 0.05; n = 4) e diminuiu a distância alcançada pelas células. Em conclusão, nossos dados sugerem que as drogas AZA e DEXA podem afetar diferentemente a morfologia e o comportamento migratório das MSCs, possivelmente afetando o resultado da terapia celular. O protocolo de migração celular utilizado neste estudo foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa, sendo que um artigo científico contendo todas as etapas do protocolo foi escrito para que outros laboratórios possam utilizá-lo de maneira simples e eficaz. / Glucocorticoids and other immunosuppressive drugs are commonly used to treat inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Disease (IBD) and, despite few improvements, the remission of IBD is still difficult to maintain. Due to its immunomodulatory properties, Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have emerged as regulators of immune response, and its viability and activation of migratory properties are essential for a successful cell therapy. However, little is known about the effects of immunosuppressant drugs used on IBD treatment on MSCs behavior. In this way, the aim of this study was to evaluate MSCs viability, nuclear morphometry, cell polarity, F-actin and FAK (Focal Adhesion Kinase) distribution and cell migration properties in the presence of the immunosuppressive drugs Azathioprine (AZA) or Dexamethasone (DEX). MSCs were isolated from human chorionic membranes and characterized through adipogenic and osteogenic differentiations, as well as a panel of surface markers. Cells were previously treated with AZA or DEX for 24 hrs or 7 days at 1μM and 10μM, respectively. Both drugs had no effects on cell viability analyzed through MTT (3-(4,5- dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) and nuclear morphometry. However, polarity index analysis showed that AZA treatment induced a more elongated cell shape while a greater presence of rounded cells was observed under DEX exposure. F-actin was stained by Rhodamine-Phalloidin and showed that AZA could partially preserve lamellipodia formation and increase the presence of ventral actin stress fibers, while DEX inhibited lamellipodia formation and increased the presence of ventral actin stress fibers while decreasing protrusion stability, observed in video. Through time-lapse microscopy, it was observed that after 7 days of treatment, AZA improved cell the spatial trajectory (ST) and increased migration speed (24.35%, P < 0.05, n = 4) while DEX impaired ST and migration speed after 24 hrs and 7 days treatment (- 28.69% and -25.37%, respectively; P < 0.05, n = 4). In conclusion our data suggests these immunosuppressive drugs can differently affect MSCs morphology and migration capacity, possibly impacting the success of cell therapy. The migration protocol used in this study was successfully established by our group, leading to the writing of a protocol paper to facilitate the usage of this technique by other laboratories in a simple and efficient manner.

Nucleus is the largest cellular organelle in animal cells. Due to its bulky nature and the stiffness of nuclear lamina the nucleus constitutes the substantial problem for migrating cells where nucleus has to move. The actomyosin generated forces and LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) complex, that is composed of SUN and nesprin proteins, play key role in nuclear movement. LINC complex mechanically couples nuclear lamina to the cytoskeleton and allows the forces exerted by the cytoskeleton to move the nucleus. Perinuclear actin fibers, also termed actin cap, mechanically link focal adhesions with nucleus and they may generate forces that position the nucleus in a way that is optimal for cellular movement. However, molecular mechanism of how perinuclear actin fibers and LINC complex orchestrate the nuclear movement and functional significance of this process remain poorly understood. The specific aim was to determine the mechanisms by which perinuclear actin fibers are formed and how are these mechanisms employed to facilitate cell migration. The role of LPA-RhoA signaling axis and LINC complex in the formation of perinuclear actin fibers was also examined. It was confirmed that LPA is essencial stimulus during actin cap formation. On the other hand, FAK kinase was found necessary for...

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2062572 bytes, checksum: 9bcbe0857802d8f4f40f9b34e5d8db1e (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The species Herissantia tiubae ( K. Schum ) Brizicky, popularly known as mela-bode or lava prato , is a plant of Malvaceae family, used in folk medicine to treat fever and influenza. Other species of the Malvaceae family are used in traditional medicine and studies have shown anti-inflammatory, antinociceptive and diuretic activities. The aim of this study was to evaluate the activity of the hydroalcoholic extract of aerial parts of Herissantia tiubae (EHt) in experimental models of acute inflammation. The toxicity of EHt at dose of 2000 mg/kg was analyzed using the parameters: consumption of water and food, body weight, mortality and rates of weight of major organs, as well as biochemical and hematological parameters. To evaluate its antiedematogenic effect, Swiss mice pretreated with EHt (50, 100 or 200 mg/kg), were submitted to the paw edema induced by carrageenan and microvascular permeability induced by acetic acid protocols. To study its anti-inflammatory effect in vivo experimental models were used, such as: carrageenan-induced peritonitis, which evaluated cell migration and cytokine production (TNF-α, IL-1β and IL-6) and in vitro: production of NO, cytokines (TNF-α and IL-6) and L- selectin expression in RAW 264.7 macrophage lineage. No signs of acute toxicity were observed by the administration of EHt in male and female mice. Furthermore, pretreatment with EHt (50, 100 or 200 mg/kg) did not reduce paw edema induced by carrageenan, and did not decrease fluids extravasation mediated by acetic acid. Migration of neutrophils and release of cytokines (TNF-α and IL-1β) induced by carrageenan was reduced in animals treated with EHt (50 or 100 mg/kg). In vitro, EHt (50 or 25 μg/mL) reduced the production of NO, cytokines (TNF-α and IL-6) and expression of the adhesion molecule L-selectin in RAW 264.7 macrophages lineage. Therefore, these data suggest that EHt has antiinflammatory activity related to inhibition of cellular but not by vascular events of inflammation / A espécie Herissantia tiubae (K. Schum) Brizicky, conhecida popularmente como mela bode ou lava-prato, é uma planta da família Malvaceae, usada na medicina popular para tratar febre e influenza. Outras espécies da família Malvaceae são utilizadas na medicina tradicional e estudos comprovaram atividades anti-inflamatórias, antinociceptivas e diuréticas. O objetivo desse estudo foi avaliar a atividade do extrato hidroalcoólico das partes aéreas de Herissantia tiubae (EHt) em modelos experimentais de inflamação aguda. A toxicidade do EHt na dose de 2000 mg/Kg foi analisada, utilizando-se os parâmetros: consumo de água e ração, peso corporal, letalidade e índices de peso dos principais órgãos, bem como parâmetros bioquímicos e hematológicos. Para avaliar seu efeito antiedematogênico, camundongos Swiss pré-tratados com EHt (50, 100 ou 200 mg/kg) foram submetidos aos protocolos de edema de pata induzido por carragenina e permeabilidade microvascular induzida por ácido acético. Para estudar seu efeito anti-inflamatório foram utilizados modelos experimentais in vivo, tais como: peritonite induzida por carragenina, onde se avaliou migração de células e produção de citocinas (TNF-α, IL-1β e IL-6); e in vitro: produção de NO, citocinas (TNF-α e IL-6) e expressão da L-selectina em culturas de macrófagos da linhagem RAW 264.7. Não foram observados sinais de toxicidade aguda com a administração de 2000 mg/kg do EHt em camundongos macho e fêmea. Além disto, o prétratamento com o EHt (50, 100 ou 200 mg/kg) não reduziu o edema de pata induzido por carragenina, bem como não diminuiu o extravasamento de fluidos mediado pelo ácido acético. A migração de neutrófilos e a liberação de citocinas (TNF-α e IL-1β) provocadas pela carragenina foram reduzidas em animais tratados com o EHt (50 ou 100 mg/kg). In vitro, o EHt (50 ou 25 μg/mL) reduziu a produção de NO, citocinas (TNF-α e IL-6) e expressão da molécula de adesão L-selectina em macrófagos da linhagem RAW 264.7. Portanto, esses dados sugerem que o EHt possui atividade anti-inflamatória relacionada com a inibição dos eventos celulares e não vasculares da inflamação

Glicocorticoides e outras drogas imunossupressoras são comumente utilizados para o tratamento de condições inflamatórias, como as Doenças Inflamatórias Intestinais (DIIs). Apesar dos avanços na terapia medicamentosa, a remissão da doença ainda é difícil de ser mantida. Devido às suas propriedades imunomodulatórias, as Células-Tronco Mesenquimais (MSCs – Mesenchymal Stem Cells) têm emergido como reguladoras da resposta imune, e sua viabilidade e propriedades migratórias são essenciais para o sucesso da terapia celular. Entretanto, pouco se conhece sobre os efeitos das drogas convencionalmente utilizadas no tratamento das DIIs no comportamento das MSCs. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade, a morfometria nuclear, a polaridade celular, a distribuição da actina-F e da FAK (Focal Adhesion Kinase), e o comportamento migratório das MSCs na presença das drogas Azatioprina (AZA) e Dexametasona (DEXA). As células foram isoladas de membranas coriônicas humanas e caracterizadas pela diferenciação em adipócitos e osteócitos, bem como pela expressão de um painel de marcadores de superfície. As MSCs foram previamente tratadas com AZA ou DEXA por 24h ou 7d nas concentrações de 1μM ou 10μM, respectivamente. Ambas as drogas não afetaram a viabilidade celular analisada por MTT (3-(4,5-dimethyltiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) e morfometria nuclear. Entretanto, a análise do índice de polaridade resultou em uma morfologia mais alongada após o tratamento com AZA, enquanto células mais arredondadas foram observadas na presença de DEXA. Os filamentos de actina foram marcados por Rodamina-Faloidina e sua análise mostrou que a AZA preservou parcialmente a formação de lamelipódios e aumentou a presença de fibras de estresse ventrais, enquanto que a DEXA inibiu a formação de lamelipódios, evidenciou uma maior presença de fibras de estresse ventrais e diminuiu a estabilidade das protrusões de membrana, observadas em vídeo. Através da análise de microscopia de série temporal, foi observado que as células sob o efeito da AZA por 7d migraram por maiores distâncias e tiveram um aumento em sua velocidade de migração (24,35%; P < 0,05; n = 4), ao passo que a DEXA diminuiu a velocidade migratória em 24h e 7d (-28,69% e -25,37%, respectivamente; P < 0.05; n = 4) e diminuiu a distância alcançada pelas células. Em conclusão, nossos dados sugerem que as drogas AZA e DEXA podem afetar diferentemente a morfologia e o comportamento migratório das MSCs, possivelmente afetando o resultado da terapia celular. O protocolo de migração celular utilizado neste estudo foi estabelecido por nosso grupo de pesquisa, sendo que um artigo científico contendo todas as etapas do protocolo foi escrito para que outros laboratórios possam utilizá-lo de maneira simples e eficaz. / Glucocorticoids and other immunosuppressive drugs are commonly used to treat inflammatory disorders, such as Inflammatory Bowel Disease (IBD) and, despite few improvements, the remission of IBD is still difficult to maintain. Due to its immunomodulatory properties, Mesenchymal Stem Cells (MSCs) have emerged as regulators of immune response, and its viability and activation of migratory properties are essential for a successful cell therapy. However, little is known about the effects of immunosuppressant drugs used on IBD treatment on MSCs behavior. In this way, the aim of this study was to evaluate MSCs viability, nuclear morphometry, cell polarity, F-actin and FAK (Focal Adhesion Kinase) distribution and cell migration properties in the presence of the immunosuppressive drugs Azathioprine (AZA) or Dexamethasone (DEX). MSCs were isolated from human chorionic membranes and characterized through adipogenic and osteogenic differentiations, as well as a panel of surface markers. Cells were previously treated with AZA or DEX for 24 hrs or 7 days at 1μM and 10μM, respectively. Both drugs had no effects on cell viability analyzed through MTT (3-(4,5- dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) and nuclear morphometry. However, polarity index analysis showed that AZA treatment induced a more elongated cell shape while a greater presence of rounded cells was observed under DEX exposure. F-actin was stained by Rhodamine-Phalloidin and showed that AZA could partially preserve lamellipodia formation and increase the presence of ventral actin stress fibers, while DEX inhibited lamellipodia formation and increased the presence of ventral actin stress fibers while decreasing protrusion stability, observed in video. Through time-lapse microscopy, it was observed that after 7 days of treatment, AZA improved cell the spatial trajectory (ST) and increased migration speed (24.35%, P < 0.05, n = 4) while DEX impaired ST and migration speed after 24 hrs and 7 days treatment (- 28.69% and -25.37%, respectively; P < 0.05, n = 4). In conclusion our data suggests these immunosuppressive drugs can differently affect MSCs morphology and migration capacity, possibly impacting the success of cell therapy. The migration protocol used in this study was successfully established by our group, leading to the writing of a protocol paper to facilitate the usage of this technique by other laboratories in a simple and efficient manner.

O carcinoma espinocelular (CEC) de cabeça e pescoço é uma neoplasia maligna que implica em baixas taxas de sobrevida e prognóstico desfavorável. A perda de adesão do epitélio e a migração celular são processos biológicos envolvidos na carcinogênese. O objetivo desse estudo foi descrever o padrão de expressão da molécula cinase de adesão focal (FAK) e suas formas fosforiladas, FAK-Tyr576 e FAK-Tyr925, em amostras de CEC no centro do tumor (CT) e zona de invasão (ZI) e no tecido epitelial não neoplásico adjacente a estes tumores (EA). De acordo com a graduação histopatológica, 48,1% do total das amostras de CEC são de grau moderado. Segundo o sistema pTNM, 62,9% eram T1 e T2, 64,8% não apresentaram metástase regional e não houve metástase à distância. O tempo máximo de acompanhamento foi de 5,9 anos e obteve-se a proservação final de 46 dos 54 pacientes, onde foi observado que 58,1% apresentaram boa evolução e 41,9% exibiram evolução ruim. A média em anos para que os pacientes obtivessem o status de evolução ruim foi de 5,01. Quanto ao estadiamento clínico, houve maior imunomarcação no estádio IVa quando comparado ao estádio II no EA da FAK Tyr-576 e ocorreu maior expressão no estádio IVb quando comparado ao estádio I no CT da FAK Tyr-576. Os pacientes que apresentaram evolução ruim após o período máximo de acompanhamento tiveram alta expressão no EA e na ZI da FAK Tyr-576 e no CT da FAK Tyr-925. Na ZI, o aumento de expressão da FAK está associado ao aumento da expressão da FAK Tyr-576. À medida que há aumento da expressão no EA há aumento da expressão na ZI na FAK Tyr-576. E quando há aumento da expressão no EA há aumento da marcação na ZI na FAK Tyr-925. Apesar do papel de todas as FAKs fosforiladas não estar claro, mas sabendo-se que são essas FAKs que estão ativas no câncer, a partir dos dados do presente trabalho pode-se sugerir que a avaliação da marcação FAK Tyr -576 no EA, no CT e na ZI venha a fazer parte da rotina no diagnóstico histopatológico e das margens da peça operatória, como norteadores da conduta terapêutica e do protocolo de acompanhamento. / Squamous cell carcinoma (SCC) of the head and neck is a malignant neoplasm that implies low rates of survival and poor prognosis. The loss of adhesion and cell migration are biological processes involved in carcinogenesis. The aim of this study was to describe the pattern of expression of focal adhesion kinase molecule (FAK) and its phosphorylated forms, FAK-Tyr576, FAK-Tyr925, in SCC samples in the center of the tumor (CT) and invasion zone (ZI) and non-neoplastic epithelial tissue adjacent to these tumors (EA). According to histopathological grading, 48,1% of SCC samples are moderate. According to the system pTNM, 62,9% were T1 and T2, 64.8%, had no regional metastasis and no distant metastasis. The maximum time of follow up was 5,9 years and was obtained as the final proservation 46 of 54 patients, where it was observed that 58,1% of patients had good prognosis and 41,9% of patients had poor prognosis. The average years for patients to obtain the poor prognosis of status was 5.01. As for clinical staging, there was greater immunostaining in the stadium IVa compared to stage II in EA Tyr-576. And FAK expression was higher in stage IVb when compared to CT in stage I of FAK Tyr-576. Patients with poor prognosis after the maximum follow-up period had high expression in EA and ZI of FAK Tyr-576 and CT of FAK Tyr-925. In ZI, increased expression of FAK is associated with increased FAK Tyr-576 expression. As there is increased expression in EA's increased expression in ZI in FAK Tyr-576. And when there is increased expression in EA's increased marking the ZI in FAK Tyr-925. Despite the role of all phosphorylated FAKs not clear, but given that these are FAKs that are active in cancer, from the present data it can be suggested that the evaluation of expression of FAK Tyr 576 in EA, CT and ZI will be part of the routine histopathological diagnosis and surgical specimen margins, as guiding the therapeutic management and monitoring protocol.

Câncer é a denominação de um conjunto de mais de cem doenças causadas pelo crescimento e multiplicação desordenados de células anormais capazes de invadir e se disseminar por diversos tecidos e órgãos. É considerado um problema de saúde mundial, sendo uma das maiores causas de morte. Dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) indicam que 15% das mortes no mundo serão causadas por câncer em 2015. No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) estima 580 mil novos casos da doença para 2014. Apesar da vasta quimioterapia disponível, os tratamentos possuem alta toxicidade e estão sujeitos à resistência. Nesse contexto, a presente dissertação de mestrado tem como foco principal a identificação e caracterização de novos compostos com propriedades anticâncer. Os estudos foram realizados com base em dois alvos principais. O primeiro foi a proteína tubulina, um alvo anticâncer validado que é modulado por moléculas importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. O segundo alvo foi a migração celular, característica relacionada ao processo de metástase, que é responsável por 90% das mortes por câncer. Uma série de acridinonas sintéticas foi avaliada in silico frente à proteína tubulina empregando métodos de modelagem molecular. Para tanto, fez-se uso de estruturas cristalográficas da proteína disponíveis no PDB (Protein Data Bank). Os resultados das análises de docagem molecular indicaram que as moléculas poderiam interagir com o sítio da colchicina e, dessa forma, atuariam como inibidoras da polimerização dos microtúbulos. Ensaios wound healing e em câmara de Boyden permitiram a identificação de quatro compostos com potente efeito de inibição da migração celular (valores de IC50 variando entre 0,294 e 1,7 &mu;M) em uma linhagem metastática (MDA-MB-231). Estes compostos foram submetidos a ensaios de citotoxicidade frente à mesma linhagem tumoral e também apresentaram boa potência, com valores de IC50 variando entre 0,110 e 3 &mu;M. Além disso, ensaios de citotoxicidade em células saudáveis mostraram que estes compostos inviabilizaram seletivamente células tumorais. Para a validação dos estudos in silico, ensaios de polimerização da tubulina foram conduzidos. Os resultados mostraram que as quatro moléculas ativas nos ensaios celulares atuam como inibidores de polimerização dos microtúbulos, com valores de IC50 variando entre 0,9 e 13 &mu;M. Estudos das relações entre a estrutura e atividade (SAR) revelaram alguns aspectos interessantes nesta série de acridinonas, como, por exemplo, a perda de atividade, que se deu tanto nos ensaios celulares quanto nos ensaios bioquímicos, causada pela substituição de um grupo nitro da posição meta- por para- em duas moléculas da série. A progressão do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo e os resultados mostraram que os compostos estudados são capazes de interromper o ciclo celular entre as fases G2 e M. A citometria fluxo também permitiu verificar a indução da apoptose celular devida à ação das moléculas. Em resumo, este trabalho possibilitou a identificação e caracterização de quatro compostos com propriedades antitumorais promissoras que serão utilizados como compostos líderes para posterior desenvolvimento como agentes anticâncer. / Cancer is a set of diseases with high diversity and aggressiveness. It is one of the major causes of death according to the World Health Organization (WHO), being responsible for 15% of worldwide deaths in 2015. In Brazil, the National Institute of Cancer (INCA) estimates 580,000 new cases of cancer for the year of 2014. Despite the vast availability of cancer chemotherapy, the treatments cause high toxic effects and are liable to resistance. In this context, the main goal of the present master\'s dissertation is the identification and the characterization of new compounds having anticancer properties. These studies were conducted based on two main targets. The first one was the protein tubulin, a validated anticancer target that is modulated by important molecules such as taxol, vinblastine and colchicine. The second target was the cellular migration, a feature related to the metastasis process, which causes 90% of the cancer deaths. A series of synthetic acridinones was studied in silico employing molecular modeling methods. For this, crystallographic structures of tubulin were collected from PDB (Protein Data Bank). The docking results indicated that the molecules could interact with the colchicine site and, thereby, could act as tubulin polymerization inhibitors. The series was assessed by the wound healing and Boyden chamber\'s assays using the metastatic cell line MDA-MB-231. In these assays, four compounds were identified as good inhibitors of cellular migration (IC50 values varying between 0.294 and 1.7 &mu;M). These compounds were evaluated in cytotoxicity assays using the same cell line and presented good potency, with IC50 values varying between 0.110 and 3 &mu;M. Furthermore, cytotoxicity assays using a healthy cell line showed that these compounds act selectively in tumor cells. For the validation of the in silico studies, tubulin polymerization assays were conducted. The results showed that the four active molecules in the cellular assays act as tubulin polymerization inhibitors, with IC50 values varying between 0.9 and 13 &mu;M. Structure-activity relationship (SAR) studies revealed interesting structural aspects in this series of acridinones, for instance, the exchange of the nitro group substituent from the meta- to the para- position in two molecules of the series led to a lack of activity in both cellular and biochemical assays. The cell cycle progression was evaluated by flow cytometry, and the results showed that the four compounds are capable of arrest cells in the G2/M phase. Moreover, the apoptosis induction was verified using flow cytometry. In summary, this work provided the identification and characterization of four new compounds with promising antitumor properties. These molecules will be used as lead compounds for further development as anticancer agents.

A cromoblastomicose é uma micose subcutânea, com alto índice de morbidade, sendo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi) considerado o maior agente etiológico dessa micose, caracterizando uma doença crônica, geralmente confinada na pele e tecidos subcutâneos. Raramente os indivíduos apresentam cura dessa doença, pois as terapias contemporâneas mostram-se deficientes e poucos trabalhos relatam a relação parasito-hospedeiro. As células dendríticas (DCs) são especializadas na apresentação de antígenos para linfócitos T naive induzindo respostas imunes primárias. Diante disso, propomos estudar a capacidade migratória de DCs após infecção com conídios de F. pedrosoi, uma vez que o processo de migração dessas células está intimamente ligado com a sua função sobre as células T, levando ao desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa protetora. O fenótipo de DCs foi avaliado através de células obtidas dos linfonodos poplíteos, inguinais e patas de camundongos BALB/c após 12, 24 e 72 horas de infecção com conídios do fungo. Células obtidas foram marcadas com anticorpos específicos e analisadas por citometria de fluxo. Após 24 e 72 horas de infecção verificamos uma diminuição significativa na porcentagem de DCs nas patas, e um aumento significativo dessas células nos linfonodos após 72 horas. A expressão de marcadores de superfície como CCR7 e moléculas co-estimulatórias, mostraram-se diminuídas nas células obtidas das patas. Como no processo de imunofenotipagem podemos analisar DCs vindas de diversos locais, para melhor avaliar a capacidade migratória das DCs, células das patas foram marcadas in vivo injetando-se subcutaneamente o corante CFSE juntamente com conídios do fungo. Verificamos que após 12 e 72 horas, as DCs das patas dos animais infectados, migraram para os linfonodos regionais. Assim constatamos que o fungo F. pedrosoi é capaz de induzir a migração de macrófagos e neutrófilos para o sítio de infecção em poucas horas, leva ao aumento de células B nos linfonodos após 12 e 72 horas de infecção, e também leva ao aumento de linfócitos T CD4+ tanto no local de infecção quanto nos linfonodos. Os resultados também comprovam que o fungo F. pedrosoi foi capaz de ativar as DCs, induzindo sua migração para os linfonodos regionais. / The chromoblastomycosis is a subcutaneous mycosis with a high morbidity rate, Fonsecaea pedrosoi (F. Pedrosoi) being the largest etiologic agent of this mycosis, featuring a chronic disease, usually confined to the skin and subcutaneous tissues. Rarely do people have cure for this disease, because the therapies shown to be deficient contemporary and few studies report the host-parasite relationship. Dendritic cells (DCs) are specialized in presenting antigens to naïve T lymphocytes inducing primary immune responses. Therefore, we propose to study the migratory capacity of DCs after infection with conidia of F. pedrosoi, since the migration of these cells is intimately linked to its function on T cells, leading to development of a protective adaptive immune response. The phenotype of DCs was evaluated using cells obtained from popliteal lymph nodes, sub cutaneous tissue of BALB/c mice after 12, 24 and 72 hours of infection with conidia of the fungus. Cells were labeled with specific antibodies and analyzed by flow cytometry. After 24 and 72 hours of infection we found a significant decrease in the percentage of DCs in the sub cutaneous tissue, and a significant increase of these cells in the lymph nodes after 72 hours. The expression of surface markers such as CCR7 and costimulatory molecules, were reduced in cells obtained from the sub cutaneous tissue. Like the process of immunophenotyping we can analyze DCs coming from various locations, to better assess the migratory capacity of DCs, cells were stained paws in vivo by injecting dye subcutaneously with CFSE conidia of the fungus. We found that after 12 and 72 hours, DCs sub cutaneous tissue of infected animals migrated to regional lymph nodes. We found that the fungus F. pedrosoi is capable of inducing migration of macrophages and neutrophils to the site of infection within a few hours, leads to increased B-cells in lymph nodes after 12 and 72 hours of infection, and also leads to an increase of CD4 + T lymphocytes in both the site of infection and in the lymph nodes. The results also show that the fungus F. pedrosoi was able to activate the DCs, inducing their migration to regional lymph nodes.

O carcinoma espinocelular (CEC) de cabeça e pescoço é uma neoplasia maligna que implica em baixas taxas de sobrevida e prognóstico desfavorável. A perda de adesão do epitélio e a migração celular são processos biológicos envolvidos na carcinogênese. O objetivo desse estudo foi descrever o padrão de expressão da molécula cinase de adesão focal (FAK) e suas formas fosforiladas, FAK-Tyr576 e FAK-Tyr925, em amostras de CEC no centro do tumor (CT) e zona de invasão (ZI) e no tecido epitelial não neoplásico adjacente a estes tumores (EA). De acordo com a graduação histopatológica, 48,1% do total das amostras de CEC são de grau moderado. Segundo o sistema pTNM, 62,9% eram T1 e T2, 64,8% não apresentaram metástase regional e não houve metástase à distância. O tempo máximo de acompanhamento foi de 5,9 anos e obteve-se a proservação final de 46 dos 54 pacientes, onde foi observado que 58,1% apresentaram boa evolução e 41,9% exibiram evolução ruim. A média em anos para que os pacientes obtivessem o status de evolução ruim foi de 5,01. Quanto ao estadiamento clínico, houve maior imunomarcação no estádio IVa quando comparado ao estádio II no EA da FAK Tyr-576 e ocorreu maior expressão no estádio IVb quando comparado ao estádio I no CT da FAK Tyr-576. Os pacientes que apresentaram evolução ruim após o período máximo de acompanhamento tiveram alta expressão no EA e na ZI da FAK Tyr-576 e no CT da FAK Tyr-925. Na ZI, o aumento de expressão da FAK está associado ao aumento da expressão da FAK Tyr-576. À medida que há aumento da expressão no EA há aumento da expressão na ZI na FAK Tyr-576. E quando há aumento da expressão no EA há aumento da marcação na ZI na FAK Tyr-925. Apesar do papel de todas as FAKs fosforiladas não estar claro, mas sabendo-se que são essas FAKs que estão ativas no câncer, a partir dos dados do presente trabalho pode-se sugerir que a avaliação da marcação FAK Tyr -576 no EA, no CT e na ZI venha a fazer parte da rotina no diagnóstico histopatológico e das margens da peça operatória, como norteadores da conduta terapêutica e do protocolo de acompanhamento. / Squamous cell carcinoma (SCC) of the head and neck is a malignant neoplasm that implies low rates of survival and poor prognosis. The loss of adhesion and cell migration are biological processes involved in carcinogenesis. The aim of this study was to describe the pattern of expression of focal adhesion kinase molecule (FAK) and its phosphorylated forms, FAK-Tyr576, FAK-Tyr925, in SCC samples in the center of the tumor (CT) and invasion zone (ZI) and non-neoplastic epithelial tissue adjacent to these tumors (EA). According to histopathological grading, 48,1% of SCC samples are moderate. According to the system pTNM, 62,9% were T1 and T2, 64.8%, had no regional metastasis and no distant metastasis. The maximum time of follow up was 5,9 years and was obtained as the final proservation 46 of 54 patients, where it was observed that 58,1% of patients had good prognosis and 41,9% of patients had poor prognosis. The average years for patients to obtain the poor prognosis of status was 5.01. As for clinical staging, there was greater immunostaining in the stadium IVa compared to stage II in EA Tyr-576. And FAK expression was higher in stage IVb when compared to CT in stage I of FAK Tyr-576. Patients with poor prognosis after the maximum follow-up period had high expression in EA and ZI of FAK Tyr-576 and CT of FAK Tyr-925. In ZI, increased expression of FAK is associated with increased FAK Tyr-576 expression. As there is increased expression in EA's increased expression in ZI in FAK Tyr-576. And when there is increased expression in EA's increased marking the ZI in FAK Tyr-925. Despite the role of all phosphorylated FAKs not clear, but given that these are FAKs that are active in cancer, from the present data it can be suggested that the evaluation of expression of FAK Tyr 576 in EA, CT and ZI will be part of the routine histopathological diagnosis and surgical specimen margins, as guiding the therapeutic management and monitoring protocol.

As células T Natural Killer (NKT) são linfócitos que expressam o rearranjo V24V11 com TCR invariante e reconhecem glicolipídeos como o alfagalactosilceramida (-GalCer) apresentado no contexto da molécula MHC-não clássica chamada CD1d. As NKT são divididas em subgrupos distintos: os fenótipos CD4+ e CD4- em camundongos e humanos, e CD8+ e CD4-CD8- em humanos. Após estímulo, as NKT secretam citocinas Th1 e Th2. A frequência das NKT representa menos de 1% da população de linfócitos T no sangue periférico humano. O objetivo deste trabalho é primeiro, identificar a frequência, o fenótipo e a função da população de células NKT nos grupos de indivíduos saudáveis de procedências distintas. Segundo, avaliar a influência da idade, gênero e país de moradia na frequência das NKT, incluindo suas subpopulações, no sangue periférico; Terceiro, verificar se há variabilidade ou não na apresentação da molécula CD1d. Quarto, verificar se há alteração na função das NKT utilizando o estímulo -GalCer e por fim, verificar o perfil das NKT quanto ao seu estado de ativação e migração celular quando submetidas a expansão. As amostras são provenientes de São Paulo, Brasil; São Francisco, Estado Unidos da América e Estocolmo, Suécia. Os parâmetros imunológicos foram analisados por citometria de fluxo. Demonstramos que o grupo de São Paulo, não apresentou maiores valores de linfócitos T CD3+, no entanto, apresentou valores significantes de células NKT V24+/V11+. Não estabelecemos a expressão dos marcadores de ativação e migração nas NKT. Estabelecemos, no grupo de São Paulo, a capacidade funcional das NKT que expressaram IFN- e TNF- assim como de expansão, sob estímulo de -GalCer. Os resultados sugerem que vários fatores podem alterar a quantidade das células NKT na periferia. Mais estudos devem ser endereçados para esclarecer melhor estes fatos / Natural Killer T cells (NKT cells) are lymphocytes that express the invariant TCR rearrangement V24V11 and recognize glycolipid as alpha-galactosylceramide (-GalCer) presented in conjunction with a non-MHC pathway molecule named CD1d. The NKT cells are divided into distinct subsets: the CD4+ and CD4- phenotype in mice and humans and the CD8+ and CD4-CD8- phenotype in humans. After stimulation, the NKT secrete Th1 and Th2 cytokines. The frequencies of NKT cells represent <1% of the population of T lymphocytes in human peripheral blood. The objective of this study is to 1) identify the frequency, phenotype and function of NKT cell population in groups of healthy individuals from different racial/ethnic origins, 2) evaluate the influence of age, gender and country of residence on the frequency of NKT cells/subpopulations, 3) investigate the variability of presentation of the CD1d molecule, 4) investigate the functional variability of NKT cells using -GalCer stimulation, and 5) study the activation and migration profile of NKT cells after expansion. Immunologic parameters of clinical samples from Sao Paulo, Brazil; San Francisco, California and Stockholm, Sweden were analyzed by flow cytometry. We demonstrate that the São Paulo group does not have an elevated number of CD3+ T lymphocytes, but does have significantly more NKT V24+/V11+ cells. We have not yet determined expression of NKT markers for activation and migration. Thus, we have shown that among sample obtained in São Paulo, there is increased functional capacity of IFN- and TNF--expressing NKT cells along with NKT cells expansion under stimulation with the -GalCer. These results suggest that there are several factors that can modulate NKT cell number and function in the peripheral blood and additional studies are needed to further clarify these findings

Organ formation is an important step during development of an organism that combines different scales from the molecular to the tissue level. Many organogenesis phenomena involve epithelial morphogenesis, where sheets of cells undergo rearrangements to form complex architectures – organ precursors, which subsequently develop into mature organs. Timely development of the characteristic architectures of the organ precursors is crucial for successful organogenesis and is determined by the choice of epithelial rearrangements that organise the constituent cells in space and time. However, for many organogenesis events the cellular dynamics underlying such epithelial rearrangements remain elusive. In the work presented here, I investigated the morphogenesis of the hemispherical retinal neuroepithelium (RNE), that serves as an organ precursor of the neural retina. Formation of RNE is an important event in vertebrates that shapes the optic cup and sets the stage for subsequent eye development. I investigated RNE morphogenesis in the developing zebrafish embryo by visualising and investigating the cellular dynamics of the process in vivo. My findings show that the zebrafish RNE is shaped by the combined action of two different epithelial rearrangements – basal shrinkage of the neuroepithelial cells and involution of cells at the rim of the developing optic cup. The basal shrinkage of the neuroepithelial cells bends the neuroepithelial sheet and starts the process of invagination. However, my results show that the major player in RNE morphogenesis is rim involution. Rim involution translocates prospective RNE cells to their designated location in the invaginating layer and contributes to RNE invagination. My work unravelled the so far unknown mechanism of rim involution. I show that the rim cells involute by collective epithelial migration using directed membrane protrusions and dynamic cell-matrix contacts. If rim migration is perturbed, the prospective RNE cells cannot reach the invaginating layer. As a result, these migration-defective cells attain the RNE fate at an ectopic location and disrupt the tissue architecture. Therefore, rim migration coordinates the cellular location with the timing of RNE fate determination and orchestrates RNE morphogenesis in space and time. Overall, my work highlights how morphogenetic processes shape the organ precursor architecture and ensure timely organ formation. These findings provide important insights not only for eye development but also for epithelial morphogenesis and organogenesis in many other systems. / Für die Entwicklung eines Organismus ist die Bildung von Organen (Organogenese) von zentraler Bedeutung. Organogenese umfasst Prozesse auf allen Ebenen der Längenskala: von der molekularen Ebene, der Gewebeebene, bis hin zur Ebene des ganzen Organismus. Viele Phänomene der Organogenese beinhalten dabei Veränderungen von Epithelien, bei der sich Schichten von Zellen zu komplexen Strukturen - Organvorläufern - umwandeln. Diese entwickeln sich später zu vollständigen Organen. Die rechtzeitige Entwicklung der charakteristischen Architektur der Organvorläufer ist entscheidend für eine erfolgreiche Organogenese und wird durch die Wahl der epithelialen Umwandlungsprozessen bestimmt, welche die Zellen in Raum und Zeit koordinieren müssen. Für viele dieser Prozesse ist jedoch genau diese zugrundeliegende Zelldynamik unklar. In der hier vorgestellten Arbeit untersuchte ich die Bildung des hemisphärischen retinalen Neuropepithels (RNE). Das RNE ist der Organvorläufer der neuralen Retina, weshalb dessen korrekte Bildung die Voraussetzung für die korrekte Entwicklung der Augen ist. Ich untersuchte die RNE-Morphogenese in sich entwickelnden Zebrafisch-Embryos durch Visualisierung und Untersuchung der zellulären Dynamik der beteiligten Prozesse in vivo. Meine Ergebnisse zeigen, dass das RNE in Zebrafischen durch die kombinierte Umwandlung von zwei verschiedenen Epithelien geformt wird. Zum einen findet eine Verkleinerung des basalen Prozesses der neuroepithelialen Zellen statt, zum anderen die Involution von Randzellen. Die basale Verkleinerung der neuroepithelialen Zellen verbiegt die neuroepitheliale Schicht und führt zur Einstülpung des RNE. Meine Ergebnisse zeigten allerdings, dass Involution von Randzellen noch bedeutsamer für die RNE-Morphogenese ist. Die involution von Randzellen transportiert potenzielle RNE-Zellen in das Neuroepithel und trägt zur RNE-Einstülpung bei. Die Bedeutung meiner Arbeit liegt darin, den bisher unbekannten Mechanismus der Randzell-Involution entdeckt zu haben. Ich zeigte, dass die Randzellen sich aktiv durch kollektive epitheliale Migration bewegen indem sie gerichtete Membranforsätze und dynamische Zell zu Matrix Kontakte etablieren. Wird die Migration der Randzellen inhibiert, so führt dies dazu, dass diese Zellen die eingestülpte RNE Schicht nicht erreichen. Sie landen dann an den falschen Positionen, wo sie die Gewerbearchitektur stören können. Daher koordiniert die Randzellmigration die Position der Zellen und orchestriert die RNE-Morphogenese in Raum und Zeit. Insgesamt zeigt meine Arbeit, wie morphogenetische Prozesse die Organvorläuferarchitektur prägen und eine rechtzeitige Organbildung sicherstellen. Diese Erkenntnisse sind sowohl für das Verständnis der Augenentwicklung, als auch für das der epithelialen Morphogenese und Organogenese in anderen Systemen von großer Bedeutung.