A Doxorrubicina (DOX) é um dos antineoplásicos mais utilizados no tratamento de tumores sólidos, como os de pele. Sua baixa penetração cutânea e instabilidade frente aos tecidos biológicos impedem, no entanto, sua aplicação tópica e localizada. Dentro deste contexto, o objetivo deste trabalho foi direcionar e aumentar a penetração cutânea da DOX, além de protegê-la contra eventuais degradações na pele, através do desenvolvimento de nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) contendo DOX e da aplicação da iontoforese. As NLS foram obtidas pelo método da Microemulsão (ME), vertendo-as em excesso de água gelada e agitando o sistema vigorosamente. Foram obtidas NLS com cargas superficiais negativas (NLS-N) e NLS com cargas superficiais positivas (NLS-P). As NLS-N eram compostas por ácido esteárico, lecitina de soja, taurodeoxicolato de sódio e água. E as NLS-P por um derivado do colesterol e/ou ácido esteárico, poloxamer, cloreto de cetilpiridínio e água. As NLS com tamanho de partícula, polidispersividade e potencial zeta adequados para os estudos de permeação cutânea e celular foram definidas a partir de um planejamento fatorial completo (32). NLS-N e NLS-P selecionadas foram incorporadas com 8% de DOX e utilizadas nos estudos de permeação e citotoxicidade. O tamanho médio da NLS-N foi de 175 nm (PdI 0,278) e da NLS-P 278 nm (PdI 0,357). A eficiência de encapsulação foi de 90 e 61% para as NLS-N e NLS-P, respectivamente. Estudos de localização celular foram realizados e observou-se que as NLS-N permitiram a penetração da DOX tanto no citoplasma quanto no núcleo das células, assim como as NLS-P que também permitiram a penetração da DOX em um maior número de células tumorais. Estudos de estabilidade mostraram que a DOX encapsulada nas NLS foi estável a 4º C por até 48 h, sendo que as NLS liofilizadas foram estáveis por pelo menos 30 dias. Nos estudos de liberação da DOX das NLS observou-se que estas sustentaram a liberação da DOX. Porém, as NLS-P liberaram a DOX mais rapidamente do que as NLS-N, 40 e 25% em 72 horas, respectivamente. Nos estudos de permeação cutânea, observou-se que as NLS aumentaram significativamente a quantidade de DOX na solução receptora e na epiderme viável quando comparada com soluções de DOX. As NLS parecem penetrar/fundir na pele carregando o fármaco para camadas profundas da pele, diminuindo sua interação com o estrato córneo. A aplicação da corrente elétrica na dispersão de NLS aumentou a penetração das partículas na pele e, conseqüentemente, a penetração da DOX. As cargas superficiais das NLS positivas e negativas não influenciaram na sua penetração por iontoforese. Estudos de determinação do fluxo eletrosmótico com paracetamol mostraram que o principal mecanismo para a entrada das partículas na pele é o eletrosmótico e não o eletrorrepulsivo (proveniente das cargas). As NLS-P diminuíram o fluxo eletrosmótico significativamente, neutralizando as cargas negativas da pele e evidenciando a penetração das partículas neste tecido. Foram realizados estudos de citotoxicidade da DOX em diferentes formulações, em células B16F10 e em A431, e foi observado que a DOX encapsulada nas NLS-N é significativamente mais citotóxica do que as outras formulações, atingindo uma citotoxicidade de 100% quando em contato com as células de melanoma após apenas 6 h de incubação em concentrações superiores a 20 ng/mL. A aplicação de corrente elétrica em cultura de células aumentou também a penetração do fármaco nas células tumorais e, conseqüentemente, sua citotoxicidade. A indução dos tumores in vivo não se mostrou viável para o modelo de camundongos sem pêlo utilizado, porém o tratamento iontoforético demonstrou-se viável. / Doxorubicin (DOX) is one of the most used antineoplastic drug to treat solid tumors, such as skin cancer. Its low penetration into the skin and its instability in biological tissues, however, difficult topical and localized application. Within this context, the aim of this work was to increase DOX penetration into the skin, and to protect the drug against possible skin degradation, through the development of solid lipid nanoparticles (SLN) and the application of iontophoresis. The standardization and validation of two methodologies for the DOX quantification was performed: one of them using an UV/Vis spectrophotometer and the other using the HPLC. Both methods showed suitable linearity, sensibility, selectively, precision and accuracy, according to the in vigor specifications. SLN was obtained by microemulsion (ME) method spilling them into an excess of water with vigorously shaking. SLN were obtained with negative surface charge (SLN-N) and SLN with positive surface charge (SLN-P). SLN-N contained stearic acid, soy lecithin, sodium taurodeoxicolate, water and SLN-P containing compritol and / or stearic acid, poloxamer, sodium chloride, water. Particle size, polydispersity and zeta potential suitable for studies of skin permeation and cell were defined from a complete factorial design (32). The average size of the SLN-N was 175 nm (PdI 0.278) and the SLN-P 278 nm (PdI 0.357). The encapsulation efficiency was 90, and 61% for SLN-N and SLN -P, respectively. Studies of cellular location were made and showed that the SLN -N allowed the penetration of DOX in the cytoplasm and the nucleus of cells, as well as SLN -P that also allowed the penetration of DOX in a larger number of tumor cells. Encapsulated DOX in the SLN was stable at 4° C for 48 hours, and freeze-dried SLN are stable for at least 30 days. In release studies with DOX-SLN was observed that they control DOX release. However, SLN-P DOX release more quickly than SLN-N, 40 and 25% in 72 hours, respectively. In skin permeation studies, it is observed that SLN significantly increase the amount of DOX in the receiver compartment and in the epidermis. It seems that SLN penetrate / merge the skin carrying the drug to the deep skin layers, reducing its interaction with the stratum corneum. The application of an electrical current increased DOX permeation into the skin, and consequently, DOX penetration. SLN superficial charges do not influence DOX permeatation with iontophoresis. Electrosmotic flow studies showed DOX permeates into the skin mostly for eletrosmose mechanism. Cytotoxicity studies were performed with DOX in different formulations in B16F10 and A431 cells, and it was observed that DOX encapsulated in the SLN-N is significantly more cytotoxic than the other formulations, achieving 100% of cytotoxicity when in contact with the melanoma cells after 6 hours of incubation at concentrations above 20 ng/mL. The application of an electrical current in cell culture also increased the penetration of the drug in tumor cells and, consequently, its cytotoxicity. The induction of tumors in vivo was not feasible for hairless mice, but the iontophoretic treatment demonstrated to be feasible.

A técnica do enxerto de granulação óssea tem demonstrado bons resultados na recuperação do periodonto e na melhora dos parâmetros clínicos dos dentes com comprometimento periodontal. Pouco se sabe porém, a respeito de qual tipo de tratamento de superfície radicular se faz mais condizente com o emprego dessa técnica. O objetivo dessa pesquisa foi avaliar a proliferação de células de granulação óssea sobre fragmentos radiculares com os seguintes tratamentos de superfície: Controle - somente raspagem, EDTA, terapia fotodinâmica (PDT- laser InGaAIP - 30mW, 30s, 45J/cm², 660nm + azul de toluidina), e ácido cítrico com tetraciclina. Todos os grupos teste receberam previamente tratamento com raspagem e alisamento com 20 golpes de cureta. Células de granulação óssea foram cultivadas em quadruplicata sobre os fragmentos por um período de 24, 48 e 72 horas. Após esse período de cultivo os fragmentos foram fixados para análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV). Cinco campos por fragmento foram usados para a visualização e contagem de células aderidas a superfície radicular (centro, campo superior direito e esquerdo e campo inferior direito e esquerdo). A análise da calibração do examinador foi feita através de uma combinação de testes estatísticos como erro casual de Dahlberg, erro sistemático e correlação de Pearson (p<0,05). A análise da amostra foi realizada através do ANOVA de medidas repetidas complementado por Tukey, com nível de significância de 5% (p<0,05). Os resultados demostraram diferenças estatisticamente significantes, quanto ao numero de células, para as superfícies tratadas com terapia fotodinâmica no período de 72 h (p<0,05). Através de nossos resultados concluímos que o tratamento radicular com terapia fotodinâmica favorece a proliferação de células de granulação óssea humanas in vitro. / The osseous granulation graft has been demonstrating good results on the periodontal healing, resulting the improvement of clinical periodontal parameters. There are very few knowledge about what kind of dental surface would be more proper for the application of this technique. The aim of this study was to evaluate the proliferation of osseous granulation cells on human root fragments treated by different techniques as scaling and root planning (control), citric acid plus tetracycline, EDTA and photodynamic therapy (PDT InGaAIP, 45J/cm², 30mW, 30s, 660nm, toluidine blue O). All test groups were previously treated which 20 curette strikes. Osseous granulation cells was culture in quadruplicate on these fragments for 24h, 48h and 72h. After that, all fragments were fixed and prepared for analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). Aiming to counting the cells adhered on the roots, we obtained electron micrographs of 5 areas (center, upper right and left field, lower right and left field). The examiner calibration was analyzed by Dahlberg Casual Error measurement, systematic error test and Pearson correlation test (p<0.05). Statistical analysis was performed by ANOVA, followed by Tukey test, with a 5% level of significance (p<0.05). There were significant differences in cell number after 72h culture in favor of PDT group (p<0,05). We can conclude that the surface treatment of roots which PDT favor the proliferation of osseous granulation cells in vitro.

Os radicais livres são formados constantemente em nosso organismo, e em quantidades controladas desempenham alguns papéis fisiológicos. Entretanto, sua presença em quantidades acima daquelas aceitáveis passa a ser um fator de risco para funcionamento adequado do organismo. Muitas doenças crônicas degenerativas têm sua origem no desequilíbrio do estado redox. Apesar de possuir um sistema de proteção antioxidante endógeno, o organismo pode ser beneficiado pela presença de compostos antioxidantes exógenos, como os compostos fenólicos encontrados em alguns alimentos. A romã (Punica granatum, L) é uma fruta que apresenta elevados conteúdos destes compostos. Foram obtidos os extratos e as frações de ácidos fenólicos da polpa e das sementes da fruta, e avaliou-se a capacidade antioxidante através de três métodos in vitro: o de co-oxidação de substratos (&#946;- caroteno e ácido linoléico), o do radical DPPH&#8226; e o ORAC. Em todos os testes foram obtidos resultados que indicaram uma elevada atividade antioxidante, principalmente para a fração de ácidos fenólicos livres (AFL) da polpa. Frente a estes dados, a fração foi submetida a um ensaio de transporte celular, o qual foi possível verificar que os diferentes ácidos fenólicos ali encontrados foram capazes de atravessar a membrana celular. A fração AFL da polpa propiciou uma redução na produção de espécies reativas intracelulares e efeitos sobre a proliferação e a viabilidade em células das linhagens Caco-2, HeLa e MDCK. Por fim, o ensaio in vivo avaliou, sob condições fisiológicas normais, o efeito do extrato aquoso e da fração AFL sobre a oxidação lipídica e na atividade do sistema enzimático de defesa antioxidante. O tecido cerebral apresentou uma redução significativa nos níveis de lipoperoxidação. A atividade das enzimas superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase apresentou resultados bastante díspares e sugerem que as respostas não seguem um padrão único e podem variar de acordo com o órgão analisado, respondendo com o aumento ou a diminuição da atividade enzimática de acordo com suas funções fisiológicas. / Free radicals are continuosly formed in our organism, and under suitable amounts they play physiological roles. However, when there´s a higher presence in their levels than the acceptable ones, they turn into a risk factor to the adequate work of the organism. Most of the degenerative illness are originated from the redox state desequilibrium. Although the organism has an endogenous antioxidant defence system, it may be beneficiated by the presence of antioxidant compounds of exogenous origen, as the phenolic compounds that are found in some kinds of food. The pomegranate (Punica grantum, L.) is a high phenolic compound fruit. The extracts and phenolic fractions both from the pulp and seeds of the fruit were obtained and their antioxidant activity was obtained using three in vitro methods: the co-oxidation of substrates (&#946;-carotene and linoleic acid), the DPPH&#8226; radical and the ORAC. For all of them the results have showed a great antioxidant activity, higher than those of the free phenolics acids´fraction (FPA) of the pulp. Face to these data, the fraction was taken to a cellular transport assay, which was possible to verify that the different phenolic acids present at FPA were able to cross the cellular membrane. The FPA pulp´s fraction provocated a down in production of the the intracelular reactive species and had effects into the cellular proliferation and viability of the Caco-2, HeLa and MDCK cells. Finally, the in vivo tryout was made using rats submitted to normal physiologic conditions and the effects of the aquous extract and FPA fraction over the lipidic oxidation and the activity of the enzymatic system of antioxidant defence were avaliated. The brain tissue showed a significant reduction about the lipoperoxidation levels. The results about the activity of the enzymes superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase were so different between themselves, which suggests that the enzymes don´t follow an only standard of response, and the reply can vary in accordance with the analyzed organ. The increase or the reduction of the enzymatic activity can occur by the physiologic conditions that the organ is able to do.

Materiais poliméricos têm sido usados em um vasto número de aplicações médicas e farmacêuticas, caracterizando-se como biomateriais. Antes do uso humano, se faz necessário uma criteriosa programação de testes que permitam investigação da segurança do material e avaliação da eficácia e assim, avaliar sua biocompatibilidade. Essa atenção também tem sido aplicada a materiais nanoparticulados, inclusive de constituição polimérica. Sendo assim, antes da liberação destes materiais para uso humano, testes preliminares são feitos in vitro e in vivo, neste caso com experimentação animal. Paralelamente à crescente busca em se manter a segurança biológica, a ciência tem procurado metodologias alternativas para se obter resultados seguros e que possam substituir os obtidos in vivo. Neste contexto, surge grande interesse no uso de culturas celulares, primeiramente em monocamadas e posteriormente, o desenvolvimento de culturas celulares em estrutura tridimensional, mimetizando de maneira mais próxima o que ocorre in vivo. Considerando as diversas vantagens obtidas no estudo de culturas tridimensionais, este estudo teve como objetivo desenvolver tal modelo, visando simular sistemas de avaliação para biocompatibilidade de materiais poliméricos, testando nanopartículas de polibutilcianoacrilato. Foram cultivadas células de fibroblasto e melanócito humanos e células de melanoma (SK-Mel-103) em monocamada e em matriz tridimensional de colágeno tipo I e avaliada a citotoxicidade em 24, 48 e 72 horas das nanopartículas utilizando os testes de Exclusão Azul de Tripan e MTT. Os resultados indicam que as nanopartículas de polibutilcianoacrilato são mais citotóxicas com o aumento da concentração da amostra, assim como o IC50 foi decrescente ao longo dos dias, demonstrando a intensificação da resposta biológica no decorrer do tempo e foram mais citotóxicas para as células de melanoma. Este perfil de aumento de citotoxicidade com o passar do tempo também foi observado no ensaio clonogênico, onde as células foram cultivadas em monocamada e incubadas com a amostra até 14 dias. Os testes de viabilidade celular em cultura tridimensional evidenciaram faixa de IC50 um pouco maior do que em monocamada, demonstrando uma pequena redução na citotoxicidade quando avaliada no ambiente 3D. Foram feitos testes de caracterização do tipo de morte utilizando citometria de fluxo, confirmando os dados dos testes de viabilidade que indicam aumento de morte com o aumento da concentração de teste. A morte acontece por apoptose tardia. Nas concentrações próximas ao IC50, há indicação que as nanopartículas de polibutilcianoacrilato inibem a autofagia em fibroblastos e células de melanomas cultivados em monocamada, característica que é anulada quando o comportamento é avaliado em ambiente tridimensional. Os resultados indicam que nanopartículas de polibutilcianoacrilato podem levar a modificação da resposta celular dependendo da concentração empregada e do ambiente de cultivo das células, mostrando serem promissores o estudo e o emprego de ambiente tridimensional na avaliação de citotoxicidade de nanopartículas poliméricas. / Polymeric materials have been widely used as biomaterials in medical and pharmaceutical applications. Before their use in humans, a number of tests is necessary to investigate the safety and effectiveness of the biomaterial in order to determine its biocompatibility. This attention has been given to nanoparticulate materials, including those of polymeric composition. Thus, in vitro and in vivo preliminary tests are done before these materials are released for human use. In parallel with the concern with biological safety studies, there has been a continuous effort in finding alternative methods to replace the current in vivo animal tests and provide reliable results regarding safety. In this context, great interest arises in the use of cell culture, firstly as monolayer and secondly as three-dimensional cell culture systems that mimic more closely the in vivo morphology. Taking into account all the advantages of three-dimensional cell culture studies, the aim of this work is to develop a three-dimensional model that can effectively evaluate polymeric biomaterials biocompatibility using polybutylcyanoacrylate nanoparticles. Cell culture of human fibroblasts, melanocytes and melanoma cells (SK-Mel-103) were cultured in monolayer and on type I collagen matrix. Polybutylcyanoacrylate nanoparticles cytotoxicity was evaluated in 24, 48 and 72 hours using Tripan Blue and MTT assays and the results found were dose and time-dependent to all cell types. Moreover, melanoma cells were significantly more sensitive to the nanoparticles toxicity. The same profile of cytotoxic response was observed in the clonogenic assay, where cells were cultured in low-density monolayer and incubated with the nanoparticles for 14 days. Cell viability assays in 3D culture had a slightly higher IC50 range when compared to the monolayer results, which suggests a reduction in the nanoparticle cytotoxicity in the 3D environment. Cell death analysis using flow cytometry confirmed the dose-dependent response obtained by cell viability assays. Cell death occurred mostly via late apoptosis. There is suggestive evidence that treatment with polybutylcyanoacrylate nanoparticles in concentrations close to the IC50 inhibits autophagy in fibroblasts and melanoma cells when cultured in monolayers, but this response could not be observed in the 3D environment. Our results showed that polybutylcyanoacrylate nanoparticles can modify cell response depending on the concentration used and the conditions of cell culture. We conclude that the 3D cell culture is a promising method for the evaluation of polymeric nanoparticles cytotoxicity.

As raízes de Pfaffia paniculata têm sido popularmente utilizadas com vários propósitos, assim como adjuvante na terapia contra o câncer. Recentemente demonstramos que as raízes pulverizadas de Pfaffia paniculata causam uma atenuação do crescimento do tumor de Ehrlich em sua forma ascítica. Os objetivos do presente estudo foram caracterizar os efeitos do extrato etanólico, resíduos aquoso ou butanólico de Pfaffia paniculata sobre o desenvolvimento do tumor de Ehrlich, assim como investigar seus possíveis mecanismos. Em um primeiro experimento, foi demonstrado que camundongos machos Swiss, portadores do tumor de Ehrlich ascítico, tratados com resíduo aquoso ou butanólico, apresentaram uma maior sobrevida em relação aos animais controle. Nos experimentos com o tumor na forma sólida ou ascítica, os animais receberam, diariamente, o resíduo butanólico por 16 dias (experimento com o tumor sólido) ou 15 dias (experimento com o tumor ascítico). No 8º dia de tratamento, foram inoculados com 2,5 x 106 células tumorais, no coxim plantar esquerdo, ou com 5,0 x 106 células tumorais, Intraperitonealmente. O tumor ascítico foi avaliado, 7 dias após a inoculação do tumor, pela quantificação do volume de fluído ascítico, concentração de células tumorais e número total de células tumorais. O tumor sólido foi avaliado pela mensuração diária das patas e pela morfometria da área de necrose em meio à massa tumoral em cortes corados por HE, e proliferação celular, por imunoistoquímica, 8 dias após a inoculação do tumor. Nesses experimentos, nenhum destes parâmetros avaliados apresentaram alterações nos camundongos tratados com este resíduo. A fim de se avaliar a toxicidade do resíduo butanólico, os animais foram tratados com este resíduo por 14 dias. Os animais tratados com este resíduo apresentaram uma discreta diminuição de ganho de peso. Não houve evidências de toxicidade hepática e renal, pela mensuração das atividades de enzimas indicativas de necrose e pelo exame histopatológico de figado e rim, onde não se observou necrose. Em outro experimento, alguns parâmetros da atividade macrofágica, 24 após a inoculação do tumor, foram avaliados, por citometria de fluxo. Os animais receberam o resíduo butanólico por 7 dias, e foram inoculados com 5 x 106 células tumorais, intraperitonealmente. O burst oxidativo ativado por Staphylococcus aureus foi menor em animais tratados com o resíduo, porém não foram observadas diferenças ma fagocitose e burst oxidativo espontâneo ou ativado por PMA. Por fim, estudos in vitro foram realizados. Os efeitos deste resíduo sobre a viabilidade, medido pelo ensaio do MTT, e sobre o ciclo celular, utilizando citometria de fluxo, de células do tumor de Ehrlich foram avaliados. As maiores concentrações do resíduo levaram a uma diminuição da viabilidade e um aumento de morte celular. Assim, o tratamento com este resíduo, in vivo, causou uma atenuação do desenvolvimento tumoral, provavelmente devido a uma diminuição na formação do fluído ascítico ou a morte celular. Os efeitos deste resíduo foram mais pronunciados em cultura celular. / The roots of Pfaffia paniculata have been popularly used for various purposes, as well as an adjuvant for cancer therapy. Recently we have shown that the powdered roots of Pfaffia paniculata promote an attenuation of the Ehrlich tumor growth in its ascitic form. The aims of the present study were to characterize the effects of the ethanolic extract, aqueous or butanolic residues of Pfaffia paniculata on Ehrlich tumor development in mice, as well as investigate its possible mechanisms. In a first experiment, it was shown that aqueous or butanolic residues-treated Swiss mice bearing Ehrlich ascites tumor presented a higher survival time than control animal. In the experiments with the tumor in its solid or ascitic forms, the animals were given, daily, the butanolic residue for 16 days (experiment with solid tumor) or 15 days (experiment with ascitic tumor). On the 8o day of treatment, they were inoculated with 2,5 x 106 tumor cells, on the left footpad, or with 5 x 106 tumor cells, intraperitoneally. The ascitic tumor was evaluated, 7 days after the inoculation of the tumor, by the quantification of the volume of the ascitic fluid, concentration of tumor cells and total number of tumor cells. The solid tumor was evaluated by the daily measurement of the footpads and morphometry of the necrosis within the tumor area on HE stained slices, and cell proliferation by immunohistochemistry, 8 days after the inoculation of the tumor. In these experiments, none of these parameters showed any alterations in mice treated with the residue. In order to evaluate the toxicity of butanolic residue, the animals were treated with this residue (200mg/Kg) for 14 days. The animals treated with the residue showed a discrete decrease on weight gain. There were no evidences of hepatic and renal toxicity, by measurement of enzymes activities of necrosis, and also lack of necrosis by histopathological analysis of liver and kidney. In another experiment, some parameters of macrofagic activity, 24 hours after the inoculation of tumor, were evalueted, by flow citometry. The animals received the butanolic residue for 7 days and then were inoculated with 5 x 106 tumor cells, intraperitoneally. The oxidative burst activated by Staphylococcus aureus was reduced on animals treated with the residue, but no differences on fagocytosis and spontaneous or oxidative burst esimulated by PMA were found. Finally, in vitro studies were performed. The effects of this residue on the cell viability, measured by the MTT assay, and on the cell cycle, by flow cytometry, in Ehrlich tumor cells were evaluated. The highest concentrations of the residue caused a decrease of the cell viability and an increase of death cell. Thus, the treatment with this residue, in vivo, caused an attenuation of the tumor development, likely due to a decrease in the ascitic fluid formation or cell death. The effects of this residue on cell death were more pronounced in cultured cells. These results point to a novel agent for the cancer therapy, but further studies must be performed to elucidate the mechanisms responsible for these effects.

Para a avaliação do potencial irritante de substâncias aplicadas topicamente tem-se utilizado metodologias que baseiam nos estudos de Draize, onde preconiza-se o uso de animais. Devido à forte oposição a estes testes, intensa tem sido a busca por métodos alternativos visando diminuir ou eliminar a utilização de animais. Este estudo avaliou o potencial irritante de diversas substâncias através de duas metodologias: o teste in vivo , empregando metodologia oficial do Food and Drug Administration (FDA), onde utiliza-se coelhos e o teste de citotoxicidade in vitro - método de difusão em camada de agar sobreposta à monocamada de células - empregando as linhagens celulares He La e NCTC L 929 e o corante vital vermelho neutro. As amostras de produto acabado abrangeram colírios, testados sem diluição e xampus de uso adulto e infantil testados puros e diluídos a 25%, 5%, 1% e 0,1%. As matérias-primas compreenderam tensoativos aniônicos, não-iônicos e anfóteros testados após diluição. O material de acondicionamento foi representado por frascos de polietileno para colírios, testados através dos seus extratos em solução de NaCI 0,9%. Os resultados obtidos com as amostras de colírios e frascos de acondicionamento foram negativos quanto à irritação ocular em coelhos e comprovaram ausência de citotoxicidade nas duas linhagens celulares. As amostras de xampus apresentaram boa correlação dos resultados quando testadas sem diluição ou diluídas a 1,0% e 0,1 %. Foi calculada a correlação de Spearman entre os dados obtidos com as duas linhagens celulares sendo o valor do coeficiente r = 0,950 indicando uma correlação direta entre os resultados obtidos com as duas células. Os resultados demonstram a possibilidade de desenvolvimento de metodologias alternativas, sujeitas à validação, que resultem em procedimentos sensíveis, reprodutíveis, não sujeitos a critérios subjetivos de interpretação, visando assim, num primeiro estágio diminuir o uso de animais pelo emprego destas metodologias em avalições prévias do potencial irritante de substâncias químicas. / To evaluate the irritability potential of toppically laid on substances, some methodologies based on Draize\'s study where the use of animals is demanded, have been used. Due to the strong opposition of society and scientific comunity, the search for alternative methods having in view the reduction or even the elimination of animals have been intense, either through the use of volunteers or of in vitro methodologies. The present study has evaluated the irritability of several substances including finished products, raw materials and packagíng materials through two methodologies: the in vivo test which makes use of official methodology from Food and Drug Administration (FDA), where rabbits are employed and the citotoxicity in vitro test - method of diffusion in agar layer added to the monolayer of cells - using He La and NCTC L 929 cells lines and neutral red. The samples of the finished products embraced eye drops, tested without dilution, and shampoos for adults and children use both concentrated and diluted to 25%, 5%, 1% and 0.1 %. Raw materiais included anionis, non-anionic and amphoteric surfactants tested after dilution. The packaging material, represented by eye drops polyethylene bottles, was tested through its extracts in a NaCI 0,9% solution. The results obtained with the samples of eye drops and packaging materials were negative as for ocular irritation in rabbits and confirmed the absence of cytotoxicity in both cells lines. The samples of shampoos presented good correlation of results when tested without dilution or diluted to 1% and 0.1 %. It has been calculated Spearman correlation considering dates obtained with two cells lines, with value of coefficient r = 0,950 showing a direct correlation between results obtained with two cells. The results obtained with this study are likely to lead to sensitive and reproductive procedures, which won\'t arise subjective criteria of interpretation. Thus, the elimination of the use of animals will be possible at a first stage of previous evalution, and once a posterior validation of this methodology is done, the rational use of a smaller number of animais will be a reality.

O laser de baixa intensidade ou terapêutico promove a biomodulação das respostas reparadoras naturais de células pulpares como os odontoblastos, sendo uma estratégia de tratamento a ser utilizada na terapia pulpar. O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro o efeito da irradiação do laser terapêutico de arseniato de gálio e alumínio (GaAlAs) no comportamento da linhagem odontoblástica (MDPC-23) de camundongos. Células odontoblásticas foram plaqueadas na concentração de 104 células/poço (n=5) e submetidas às irradiações nos dias 0, 1, 2 e 3 após o plaqueamento. Foram avaliadas as doses de 0,2 e 1,0 J/cm2 e comparadas ao grupo controle não irradiado. Os parâmetros analisados foram proliferação e viabilidade celular, quantidade de proteína total, atividade de fosfatase alcalina após 3, 7, 10 e 14 dias; detecção e quantificação de matriz mineralizada após 14 dias e quantificação do fator de crescimento VEGF no sobrenadante das culturas após 7 e 10 dias. Imunofluorescência para proteínas colágenas e não-colágenas após 3, 7 e 10 dias foi realizada para verificar sua expressão qualitativa nos grupos propostos. Os resultados mostraram que o laser não afetou a viabilidade celular que ficou acima dos 90% em todos os grupos e períodos experimentais. De modo geral, os grupos irradiados apresentaram redução na proliferação, maior conteúdo de proteína total e maior atividade de ALP em relação ao observado no grupo controle. A marcação com vermelho de alizarina mostrou maior quantidade de áreas nodulares de matriz calcificada no grupo irradiado com 0,2 J/cm2, dados comprovados pela análise quantitativa. Uma maior concentração de VEGF no sobrenadante da cultura foi observada no grupo irradiado com a menor dose. A imunofluorescência revelou que a menor dose favoreceu a secreção de proteínas colágenas e não colágenas Portanto, o laser de baixa potência, dentro dos parâmetros empregados, favoreceu a expressão do fenótipo odontoblástico. / Low-level laser therapy (LLLT) has been studied as a strategy to be used in pulp therapy through biomodulation of its cells, like odontoblasts. The purpose of this investigation was to evaluate the effect of biomodulation on odontoblastic cells using low-level GaAlAs laser. Odontoblastic cells were cultured in a concentration of 104 cells/well (n=5) and submitted to the energy fluencies of 0,2 and 1,0 J/cm2 and compared to control group. There were evaluated cell proliferation and viability, total protein content and alkaline phosphatase activity ( 3, 7, 10 and 14 days), as well as detection and quantification of mineralized nodules after 14 days and VEGF quantification after 7 and 10 days. Immunofluorescence for collagen and non-collagen proteins was performed to verify their qualitative expression in the proposed groups after 3, 7 and 10 days. The results showed that LLLT did not affect cell viability in all the experimental groups. The irradiated cultures presented reduction in the proliferation, higher total protein content and ALP activity compared to the control group. Staining with red alizarin showed greater amount of nodular areas of calcified matrix in the group irradiated with 0,2 J/cm2, data confirmed by quantitative analysis. It was also observed a higher concentration of VEGF in the culture of the cells irradiated with the lowest energy fluence as well as an enhancement of the secretion of collagen and non-collagen proteins revealed through immunofluorescence. It was concluded that therapy with LLLT favors the expression of odontoblastic phenotype.

A pele é o maior órgão do corpo humano e constitui a principal defesa do organismo contra agentes físicos e químicos, sendo também fundamental para evitar a perda de água por dessecação. Formada por três camadas distintas, mas complementares, sendo as duas principais denominadas derme e epiderme, contendo diferentes tipos celulares, como fibroblastos, queratinócitos, melanócitos, células de Merkel e células de Langerhans, sendo que estas últimas desempenham um papel fundamental na hipersensibilidade de contato. Devido à importância da manutenção da pele saudável para a vida humana, existe uma crescente necessidade da elaboração de substitutos de tecidos para o tratamento de feridos e doentes, assim como, há grande demanda de pele para testes químicos das áreas farmacêutica e cosmética. Outro fator de fundamental importância para o desenvolvimento de métodos alternativos in vitro, é a pressão mundial para que estes testes substituam os modelos animais. Esta abordagem vai de encontro aos novos conceitos de substituição, redução e refinamento na utilização de animais em estudos científicos, ditando o futuro da cultura celular e bioengenharia de tecidos. Graças ao grande desenvolvimento do cultivo celular e descoberta de que as células cultivadas podem ser reagrupadas de acordo com o delineamento experimental, se torna possível à criação de equivalentes dermoepidérmicos para estudos in vitro, como por exemplo, testes de cito e fototoxicidade ou avaliação da fase inicial da reação alérgica e processos de sensibilização da pele. Neste caso, se faz necessária a obtenção de grande quantidade de células de Langerhans imaturas. As células de Langerhans (CLs) são células dendríticas imaturas localizadas na epiderme e epitélio superficial que desempenham um papel central na imunidade da pele, agindo como verdadeiras sentinelas capazes de captar antígenos de contato. Desta forma, foram testados quatro diferentes protocolos para extração e criopreservação destas células, sendo ainda analisadas as suas características morfológicas e fenotípicas. Obtivemos resultados não expressivos quanto ao isolamento, pureza e marcação positiva para CD1a no Protocolo 2 (Expansor de Pele). Os Protocolo 1A (Coleta de Sobrenadante) e 3 (Epiderme + Gradiente de Ficoll Paque) ofereceram altos níveis de células marcadas positivamente para CD1a, apresentando a mesma qualidade de marcação. No entanto, o Protocolo 3 forneceu um maior número de células viáveis, e uma maior pureza da amostra, uma vez que só utiliza a epiderme para a obtenção da suspensão de células, o que o coloca como modelo a ser seguido em posteriores experimentos. Os métodos aqui apontados como mais promissores, podem ser reproduzidos em laboratórios de cultura celular convencionais, contribuindo para aumentar a reprodutibilidade e confiabilidade de resultados experimentais relativos às CLs. Da mesma forma, avaliamos a utilização dos equivalentes de pele humana para a realização de testes in vitro de cito e fototoxicidade, os quais podem de fato reduzir a utilização de modelos animais para identificação do perfil tóxico de uma substância ou de formulações mais complexas. / The skin is the largest organ from the human body and constitutes the main protection of the organism against physical and chemical agents and it is also fundamental to avoid water loss by desiccation. Formed by three distinct stratus, yet complementary, being the two main called dermis and epidermis, containing different cell types, as fibroblasts, keratinocytes, melanocytes, Merkel cells and Langerhans cells (LCs), being these latter fundamental in the contact hypersensitivity. Due to the importance of the healthy skin maintenance to the human´s life, there is a growing need of elaboration of skin models to the treatment of injured and diseased, as well as there is a big demand of skin models to chemical tests from the pharmaceutics and cosmetology fields. Another factor of fundamental importance to the development of alternative in vitro methods is the worldwide pressure for these tests to replace animal models. This approach meets new concepts of replacement, reduction and refinement in the use of animals in scientific studies, dictating the future of cell culture and bioengineering of skin models. Thanks to the large development of cell culture and the discovery that the cultured cells can be regrouped according to the experimental delineation, the creation of skin models to in vitro studies is made possible, as for instance, tests of cytotoxicity and phototoxicity or evaluation of the initial phase from the allergic reaction and processes of skin sensitization. In this case, it is necessary the achievement of a large amount of immature Langerhans cells. The LCs are immature dendritic cells located in the epidermis and superficial epithelium that perform a central role in the skin immunity, acting as real sentinels able to collect contact antigens. Accordingly, were tested four different protocols for extraction and cryopreservation of these cells, and further analyzed its morphological and phenotypic features. We obtained no significant results in relation to the isolation, purity and CD1a positive expression in the Protocol 2. The Protocols 1A and 3 offered high levels of CD1a positively marked cells, showing the same expression levels. However, the Protocol 3 provided a bigger number of viable cells and a high purity yield, since it only uses the epidermis to obtain the single cell suspension, which places it as a model to be followed in subsequent experiments. The methods appointed here as the most promising, can be reproduced in conventional cell culture labs, contributing to increase the reproducibility and reliability of experimental results related to the LCs. In the same way, we evaluated the use of the human skin equivalents to the accomplishment of in vitro tests of cyto and phototoxicity, which can in fact reduce the use of animal models to the identification of single substances toxicity or even complex formulations.

INTRODUÇÃO: As alterações cromossômicas são a primeira suspeita etiológica em indivíduos com múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. Verifica-se que em alguns pacientes esse fenótipo está associado a alterações pigmentares como as manchas cutâneas. Porém, nem sempre o resultado do cariótipo em sangue periférico para esses pacientes revela alterações cromossômicas. Dessa forma, a análise cromossômica de outro tecido, como a cultura e cariotipagem dos fibroblastos da pele, torna-se importante para verificar a ocorrência de mosaicismo oculto que poderia explicar o fenótipo clínico. OBJETIVOS: Padronizar e implantar um protocolo para cultura de fibroblastos de pele humana, oriunda de manchas cutâneas de pacientes com atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. Estabelecer o método de cariotipagem molecular de fibroblastos em tecido epitelial e realizar a correlação com o fenótipo. MÉTODOS: Os pacientes foram provenientes do ambulatório de Genética do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). Foram realizados cariótipos de fibroblastos de pele de 15 pacientes com cariótipo de sangue periférico normal, portadores de manchas cutâneas associadas ao atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. A análise citogenética dos fibroblastos foi feita a partir de biópsia cutânea das manchas, seguida dos seguintes procedimentos: cultura de fibroblastos, processamento, cariotipagem por bandamento G e análise citogenética molecular. RESULTADOS: Dentre os 15 casos estudados, 8 apresentaram isocromosomo de 12p (síndrome de Pallister-Killian), 1 apresentou um mosaicismo sexual atípico e os outros 6 apresentaram resultado normal. CONCLUSÃO: A análise cromossômica de fibroblastos foi imprescindível para o diagnóstico de pacientes com manchas cutâneas associadas à múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. A abordagem diagnóstica adequada é fundamental para conduzir o tratamento de forma apropriada e para definir o prognóstico desses pacientes, sendo também imprescindível para a realização do aconselhamento genético / INTRODUCTION: Chromosomal aberrations are the first suspected etiology in individuals with multiple congenital anomalies, developmental delay and/or intellectual disability. This phenotype is sometimes associated with pigmentary skin anomalies. However, in some cases the peripheral blood cells karyotype is normal. Therefore, the cytogenetic analysis of other tissues such as culture and karyotyping of skin fibroblasts is important to verify the occurrence of cryptic mosaicism that may explain the clinical phenotype. OBJECTIVES: To standardize and set a protocol for culture of human skin fibroblasts. To perform molecular karyotyping of fibroblasts and establish the correlation with phenotype. METHODS: Patients were recruited from the outpatient clinic of the Genetics Unit of Instituto da Criança do Hospital das Clínicas d Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). The karyotypes of skin fibroblasts were performed in 15 patients with normal blood karyotype, presenting with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The cytogenetic analysis of fibroblasts was made from skin biopsy of the spots, followed by fibroblast culture, processing, karyotyping by G-banding analysis and molecular cytogenetics. RESULTS: Among the 15 cases studied, 8 showed isochromosome 12p (Pallister-Killian syndrome), 1 had atypical sexual mosaicism and the other 6 had normal results. CONCLUSION: The cytogenetic analysis of skin fibroblasts is crucial for the diagnosis of patients with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The proper diagnosis is fundamental for the appropriate treatment, to define prognosis for these patients and essential for the genetic counselling

O estudo de agentes que interferem no funcionamento das proteínas relacionadas com o ciclo celular é importante para a compreensão dos processos de transformação e de morte celular. Alterações de ploidia, embora presentes na maioria dos tumores humanos, não têm ainda seu papel conhecido no processo de oncogênese. A alteração do número cromossômico é conseqüência primária de erros que envolvem o fuso mitótico e o cinetócoro. Dessa maneira, drogas que agem sobre os microtúbulos são consideradas aneugênicas potenciais. O presente trabalho enfocou o estudo do mecanismo pelo qual drogas que atuam sobre microtúbulos levam ao aparecimento de células multinucleadas e o significado biológico destas. Os resultados mostraram que a vincristina induziu bloqueio em mitose das células BBnt e MDCK, com conseqüente entrada em interfase no estado multinucleado. As células multinucleadas não apresentaram sinais de morte celular por apoptose, entretanto, quando em prófase apresentaram vários centrossomos, que poderiam originar divisões celulares com fusos multipolares. Estes resultados indicam que essas linhagens celulares possuem pontos de checagem mitótico funcionais e células multinucleadas são viáveis e capazes de prosseguir no ciclo celular. A presença de mitoses com fusos multipolares é indício de que as células multinucleadas passam por divisões anormais, que progrediriam para apoptose resultando na eliminação desta população. / The study of agents that interfere in the functionality of proteins related to cell cycle is important for the understanding of the transformation and cell death processes. Although ploidy alterations are presented in the majority of human tumors, their role in oncogenic process is not understood yet. The alteration on chromosomal number is the primary consequence of errors involving the mitotic spindle and kinetocore. Thus, drugs acting on the microtubules are considered as potentially aneugenic agents. The present work aimed to study the mechanism of multinucleated cells induction by action of antimicrotubule drug and biological meaning of these cells. The results showed that vincristine induced mitotic arrest of both BBnt and MDCK cells, with consequent entrance into interphasic-multinucleated status. Multinucleated cells did not present features of cell death by apoptosis; they were still viable and able to go further in cell-cycle progression. The presence of many structures suggested microtubule enucleation, centrosomes-like were detected on treated cells and could be responsible for the multi-spindle assembling that leads the multinucleated cells to abnormal divisions. Later on, when the multinucleated cells accumulated more abnormalities they were eliminated from the cell population by apoptosis.