A implantação de materiais vítreos e vitrocerâmicos bioativos representa estratégia terapêutica importante para se promover a formação de matriz extracelular mineralizada em defeitos ósseos críticos. Quando expostos a fluidos biológicos, estes biomateriais sofrem alterações químicas e topográficas de superfície que afetam as interações de células com sua superfície, reduzindo o espraiamento celular e alterando o padrão de marcação de proteínas do citoesqueleto. O objetivo deste estudo foi avaliar se as alterações no padrão de marcação para as proteínas citoesqueléticas actina e tubulina observadas in vitro em células osteogênicas sobre superfícies do vidro Bioglass® 45S5 e da vitrocerâmica Biosilicato®, são decorrentes de redução quantitativa na expressão do RNAm e das proteínas correspondentes. Células osteogênicas foram obtidas a partir da digestão enzimática de calvárias de ratos Wistar recémnascidos e plaqueadas sobre superfícies de Bioglass® 45S5, Biosilicato® e borosilicato (controle bioinerte) para a avaliação dos seguintes parâmetros: 1) detecção de actina e tubulina por microscopia de fluorescência; 2) expressão de RNAm para actina e tubulina por reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real time PCR); 3) quantificação de actina e tubulina por ensaio imunoenzimático direto (ELISA), e 4) análise da morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Aos 3 e 7 dias, células crescidas sobre borosilicato exibiam padrões de marcação para actina e tubulina típicos de células aderidas e espraiadas sobre substratos planos in vitro, enquanto que sobre Bioglass® 45S5 e Biosilicato® as células apresentavam áreas circulares destituídas de marcação para essas proteínas. Nos mesmos períodos, culturas crescidas sobre os materiais bioativos apresentavam alterações significantes da expressão de RNAm para actina e tubulina, embora fossem observadas apenas discretas variações na quantidade das proteínas correspondentes em relação ao borosilicato. Além disso, apenas para culturas crescidas sobre borosilicato observava-se correlação positiva entre RNAm e proteína e correspondência entre as observações por epifluorescência e os dados quantitativos. Aos 3 dias, imagens de MEV revelaram células aderidas e espraiadas sobre os materiais bioativos, parcial ou totalmente recobertas por acúmulos de material de aspecto semelhante ao da topografia do substrato, por vezes impedindo a visualização dos limites celulares. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que as superfícies bioativas de Bioglass® 45S5 e Biosilicato® afetam a expressão de RNAm para actina e tubulina, mas não de proteína. Assim, as alterações nos padrões de marcação por fluorescência para essas proteínas devem ser atribuídas, pelo menos em parte, a acúmulos de material sobre as células, possivelmente decorrentes das reações de superfície a que estão submetidos Bioglass® 45S5 e Biosilicato® quando em contato com fluidos biológicos. / Bioactive glasses and glass-ceramics have been successfully applied in various therapeutic strategies to promote the formation of mineralized matrix in bone defects. The exposure of these materials to biological fluids results in chemical and topographical modifications that may affect the interactions of cells with the biomaterial surface, with potential effects on cytoskeletal protein expression and/or organization and cell spreading. The aim of the present study was to evaluate whether changes in the labelling pattern for the cytoskeletal proteins actin and tubulin in osteogenic cells cultured on bioactive Bioglass® 45S5 and Biosilicate® are due to altered mRNA and protein expression levels. Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn Wistar rat calvarial bone and plated on Bioglass® 45S5, Biosilicate® and borosilicate (bioinert control) for periods of up to 7 days. The following parameters were assayed: i) qualitative epifluorescence analysis of actin and tubulin distribution; ii) quantitative mRNA expression for actin and tubulin by real time polymerase chain reaction (real time PCR); iii) quantitative actin and tubulin expression by enzymelinked immunoabsorbent assay (ELISA), and iv) qualitative analysis of cell morphology by scanning electron microscopy (SEM). At days 3 and 7, cells grown on borosilicate showed typical actin and tubulin labeling patterns of adherent and spread cells on flat, rigid substrates, whereas those on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® showed dark areas devoid of fluorescent signals for the cytoskeletal proteins. At the same time points, cultures grown on the bioactive materials showed significant changes in mRNA expression for actin and tubulin, although only slight differences in the amount of actin and tubulin were detected compared with borosilicate. Moreover, a positive correlation between mRNA and protein expression levels as well as a correspondence between epifluorescence imaging and the quantitative data were only detected for cultures grown on borosilicate. SEM analysis revealed that cells cultured on bioactive surfaces were partly or totally covered with material accumulations, whose characteristics resembled the ones for the substrate topography, and which, in some cases, prevented the visualization of the cell limits. In conclusion, Bioglass® 45S5 and Biosilicate® affect actin and tubulin mRNA levels, but not the corresponding protein expression, in osteogenic cell cultures. Thus, the observed changes in the labeling pattern for these proteins should be attributed, at least in part, to the accumulation of materials on the cell surface, likely due to substrate reactions that take place on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® when exposed to the cell culture medium.

Fibroblastos gengivais desempenham um importante papel na regeneração de tecidos moles de proteção do periodonto. Alloderm® (MDA) é um substituto alógeno muito utilizado e estudado em periodontia. O objetivo do presente estudo foi avaliar, in vitro, se a MDA é uma matriz tridimensional adequada, através de sua resposta à cultura de fibroblastos gengivais e células neoplásicas; e, ainda, se os subprodutos da MDA influenciam o comportamento celular. Material e Métodos: Fibroblastos gengivais de cão (FGC) e fibroblastos gengivais humanos (FGH) foram obtidos pela técnica do explante a partir de tecido conjuntivo gengival de, respectivamente, três indivíduos e três cães saudáveis. As células FGC, FGH e B16F10 de melanoma murino foram cultivadas sobre a MDA por até 14 dias. Os seguintes parâmetros foram avaliados: presença, morfologia e distribuição de FGC, FGH e B16F10 por fluorescência direta; viabilidade de FGC e FGH por MTT; e o efeito do meio de cultura condicionado (MC) em MDA por 24 h na viabilidade celular de FGC por MTT. Os dados quantitativos foram submetidos aos testes estatísticos Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, seguido pelo método de Dunn para comparações múltiplas (nível de significância: 5%). Resultados: A epifluorescência revelou que, em 12 h, FGH e FGC estavam aderidos à superfície da MDA em baixa densidade celular, exibindo morfologia poligonal com núcleos esféricos, enquanto que, aos 7 e 14 dias, essas células apresentavam com formato alongado, núcleos ovalados e citoesqueleto de actina com fibras de estresse. Aos 7 e 14 dias, FGC apresentavam-se distribuídos de forma desigual sobre a MDA, formando uma camada celular descontínua, sem aumento no número de células entre os períodos; FGH formaram uma monocamada celular na superfície da MDA, estando presentes em maior número após 14 dias de cultivo (p<0,05); e B16F10 exibiram um aumento no número de células de 12 h para 7 dias (p<0,05), apresentando-se dispostas em aglomerados celulares, principalmente na superfície da MDA, com a formação de camada contínua aos 14 dias. Notou-se maior número de células nas amostras cultivadas com B16F10, seguido por FGH e FGC aos 7 dias (p<0,05). Aos 14 dias, FGH e B16F10 estavam presentes em maior número, com diferença estatística significante em relação aos FGC (p<0,05). Foi observada maior porcentagem de células na superfície (p<0,05) do que no interior da MDA e essa proporção manteve-se estável durante os períodos avaliados para todos os tipos celulares. O ensaio de MTT indicou maior viabilidade celular nas amostras cultivadas com FGH comparado a FGC (p=0,024), aos 7 e 14 dias. Notou-se um decréscimo na viabilidade celular em culturas cultivadas em MC, com diferença estatística entre os grupos em 48 e 72 horas (p<0,05). Conclusão: Podemos concluir que fibroblastos gengivais e mesmo células altamente proliferativas, como B16F10, povoam apenas superficialmente a MDA e que FGC são afetados negativamente pelos subprodutos da MDA, reduzindo sua viabilidade. / Gingival fibroblasts play a central role in oral soft tissue regeneration. Alloderm® (Alloderm® - ADM) is the most used and studied allogeneic substitute. The aim of this investigation was to verify if ADM is a suitable threedimensional matrix, through its in vitro response to gingival fibroblasts and cancerous cells lineage and, also, if ADM end products affect cellular behavior. Methods: Canine gingival fibroblasts (CGF) and human gingival fibroblasts (HGF) cultures were established by the explant technique of gingival connective tissues of three dogs and three healthy patients, respectively. CGF, HGF and B16F10 cells of murine melanoma were seeded on ADM and grown for up to 14 days. The following parameters were assessed: presence, morphology and distribution of CGF, HGF e B16F10 by direct fluorescence; CGF and HGF viability by MTT; and the effect of culture medium conditioned (CM) in the MDA for 24 h on CGF viability by MTT. Quantitative data were submitted to Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, followed by Dunn\'s method. Results: Epifluorescence revealed that CGF and HGF were adherent and exhibited a polygonal morphology at 12 h while at 7 and 14 days they were spread, exhibiting an elongated shape and the actin cytoskeleton assembled into stress fibers. CGF were unevenly distributed on ADM surface, showing no increase in cell number over the experimental periods; HGF formed a monolayer on the ADM surface, in a higher number at 14 days (p<0,05); B16F10 exhibited na increase in cell number in 7 days (p<0,05), and were mainly arranged in cell aggregates on the ADM, forming a continuous layer at 14 days. A higher percentage of cells on the ADM surface (p <0.05) compared to inside the matrix was observed for all cell types in all periods. MTT values indicated higher cell viability in samples cultured with HGF compared to CGF (p=0.024). A significantly lower cell viability for CGF grown in CM compared to cells grown in non conditioned medium at 48 and 72 h (p <0.05) was noticed. Conclusion: Gingival fibroblasts and even highly proliferative cells as B16F10 can be only superficially located on ADM and CGF are negatively affected by ADM end products, reducing its viability.

A cocaína é uma droga amplamente utilizada, e seu abuso está associado a inúmeros problemas de ordem física, psiquiátrica e social. Anormalidades em recém-nascidos têm sido reportadas devido aos efeitos tóxicos da cocaína durante o desenvolvimento fetal. O mecanismo pelo qual a cocaína causa danos neurológicos é muito complexo e envolve interações da droga com diversos sistemas de neurotransmissão, como o aumento dos níveis extracelulares de dopamina e radicais livres e a modulação de fatores de transcrição. Neste estudo investigamos a toxicidade causada pela cocaína em culturas primárias de estriado e mesencéfalo e cultura de linhagem de células dopaminérgicas (PC 12). Observamos que a exposição à cocaína causou morte destas células. Na cultura primária de mesencéfalo, a morte celular foi revertida pelo prétratamento com superóxido dismutase (SOD). A exposição à cocaína também induziu a inibição do prolongamento dos neuritos nessas culturas primárias. Já na cultura de células PC 12, a cocaína ativou os fatores de transcrição NF-kB e CREB (após 6 horas), que regulam a transcrição de genes envolvidos na morte celular. O GBR 12909 (inibidor da recaptação de dopamina), a lidocaína (anestésico local) e a dopamina não ativaram o NF-kB de maneira semelhante à cocaína, porém, a diminuição da atividade do NF-kB após pré-tratamento das células com SCH 23390, antagonista do receptor D1, sugere que a ativação do NF-kB pela cocaína ocorre, pelo menos parcialmente, via ativação de receptores D1. O NF-kB parece exercer um papel protetor nas células PC 12, pois sua inibição com PDTC e Salicilato de Sódio aumentou a indução de morte celular pela cocaína. O aumento do RNAm do BDNF, também pode estar relacionado à proteção exercida por este fator de transcrição. A diminuição do Bcl-2, o aumento da atividade da caspase 3 e o aumento da caspase 3 clivada sugerem a participação da via de apoptose na morte celular induzida pela cocaína. A compreensão dos mecanismos de morte celular regulados pela cocaína no cérebro futuramente contribuirá para o desenvolvimento de novas terapias para dependentes, a qual poderá ajudar na interrupção do desencadeamento dos processos degenerativos. / Cocaine is a drug deeply used and its abuse is associated with physical, psychiatric and social problems. Abnormalities in newly born have been demonstrated due to the toxics effects of cocaine during fetal development. The mechanism by which cocaine causes neurological damages is very complex and involves interactions of the drug with several neurotransmitter systems, such as the increase of extracellular levels of dopamine and free radicals, and modulation of transcription factors. In this study we investigated the cocaine toxicity in striatum and mesencephalic primary cultures, and dopaminergic cells (PC 12). We observed that cocaine exposure causes death to these cells. In the mesencephalic primary culture, the cellular death was blunted by superoxide dismutase (SOD) pretreatment. Cocaine exposure also induced inhibition of neurite lengthening in these primary cultures. In PC 12 cells, cocaine activated the transcription factors NFkB and CREB (after 6 hours), which regulate genes involved in cellular death. GBR 12909, an inhibitor of dopamine reuptake; lidocaine, a local anesthetic; and dopamine did not activate NFkB as cocaine did, however, the attenuation of NFkB activity after the pretreatment of the cells with SCH 23390, a D1 receptor antagonist, suggests that the activation of NFkB by cocaine is, at least partially, due to activation of D1 receptors. NFkB seems to have a protective role in these cells, because its inhibition with PDTC and Sodium Salicilate increased cellular death caused by cocaine. The increase in BDNF RNAm, can also be related to the protective role of this transcription factor. The decrease in Bcl-2, the increase in caspase 3 activity, and the increase in caspase 3 cleavage suggest that apoptose participates in the development of cocaineinduced cell death. The understanding of the mechanisms by which cocaine induces cell death in the brain will contribute to the development of new therapies for drug abusers, which can help the interruption of the progress of degenerative processes.

Os efeitos de preparações de plasma rico em plaquetas (PRP) sobre a atividade osteogênica in vitro e in vivo em contato com biomateriais são divergentes na literatura. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão e/ou atividade de marcadores iniciais da diferenciação osteoblástica em culturas de células osteogênicas crescidas sobre titânio (Ti) e expostas a coquetel de fatores de crescimento e proteínas PRP-símile (coquetel de FCs). Células osteoblásticas primárias derivadas de calvárias de ratos recém-nascidos foram cultivadas em meio osteogênico e expostas, nos 7 primeiros dias, a coquetel de FCs nas diluições 1:1 (FCs), 1:10 (FCs/10), 1:100 (FCs/100) e 1:1000 (FCs/1000). Foram avaliados, nos tempos de 7, 10 e 14 dias: 1) os aspectos morfológicos e a imunomarcação de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN), por epifluorescência; 2) a proliferação celular, por ensaio de MTT; 3) a expressão de RNAm para o fator de transcrição Runx2, BSP e fosfatase alcalina (ALP), por PCR em tempo real; 4) a atividade de ALP, clivada da fração de membrana; 5) quantificação da mineralização, por extração do vermelho de Alizarina. Os resultados mostraram inibição da formação dos nódulos de matriz mineralizada em culturas FCs e atraso em seu desenvolvimento em FCs/10 e FCs/100, em comparação a FCs/1000 e controle. A expressão de Runx2, BSP e ALP era menor em todas as culturas expostas ao coquetel de FCs em 7 dias, sendo que para Runx2 e BSP notava-se o efeito concentração-dependente em 10 dias. Menores valores de atividade de ALP foram observados nas culturas FCs e FCs/10, com efeito concentração-dependente e correlação positiva com a mineralização em 7 dias, mas não em 10 e 14. Os resultados permitem concluir que a exposição ao coquetel de FCs inibe e/ou atrasa a diferenciação osteogênica de culturas primárias sobre Ti. Adicionalmente, a atividade de ALP de membrana pode ser considerada também um marcador inicial de diferenciação osteoblástica, indicativo do potencial osteogênico no modelo in vitro utilizado. / The effects of platelet-rich plasma (PRP) preparations on the in vitro and in vivo osteogenic activity in contact with biomaterials have been subject of debate and controversy in the literature. The aim of the present study was to evaluate the expression and/or activity of early markers of osteoblast differentiation in cultured osteogenic cells grown on titanium (Ti) and exposed to a PRP-like cocktail of growth factors and proteins (GFs cocktail). Primary osteoblastic cells derived from newborn rat calvarial bone were cultured in an osteogenic medium (control group) and exposed during the first 7 days of culture to the following dilutions of GFs cocktail: 1:1 (GFs), 1:10 (GFs/10), 1:100 (GFs/100) and 1:1000 (GFs/1000). At days 7, 10 and 14 of culture, the following parameters were assessed: 1) morphology and immunolabeling for bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN) by epifluorescence microscopy; 2) cell proliferation by MTT assay; 3) mRNA expression for the osteoblast markers Runx2, BSP and alkaline phosphatase (ALP) by real time PCR; 4) ALP activity following ALP cleavage from cell membrane; 5) mineralization by Alizarin red extraction. The results showed no mineralized nodules for the GFs group and a delayed nodule formation for GFs/10 and GFs/100 compared with GFs/1000 and control. Whereas Runx2, BSP and ALP mRNA levels were lower for all cultures exposed to the GFs cocktail at day 7, a concentration-dependent effect was noticed only for Runx2 and BSP at day 10. The GFs cocktail showed a concentration-dependent effect on ALP activity, with the lowest values for GFs and GFs/10 cultures and a positive correlation with mineralization at day 7 but not at day 10 or 14. In conclusion, inhibited and/or delayed osteogenic differentiation take place in primary cultures grown on Ti and exposed to the GFs cocktail. In addition, membrane ALP activity can also be considered an early marker of osteoblast differentiation, indicative of the in vitro osteogenic potential in the model used.

Plantas medicinais são uma fonte rica na obtenção de moléculas com potencial terapêutico. No Brasil cerca de 40% da população utiliza plantas medicinais como alternativa terapêutica. Porém, grande parte das plantas nativas brasileiras não apresentam estudos científicos que comprovem a eficácia e a segurança. Além disso, devido à enorme biodiversidade, o número de espécies estudas ainda é pequeno, e representa um vasto campo a ser explorado. Neste contexto, as oleorresinas de planta do gênero Copaifera apresentam poucos estudos sob o ponto de vista químico, farmacológico e toxicológico. Suas partes aéreas, tais como folhas os estudos ainda são escassos. Dentro deste contexto, este projeto buscou avaliar a toxicologia de oleorresinas e extratos das folhas de C. oblongifolia Mart. ex Hayne e C. duckei Dwyer, e compreender preliminarmente os mecanismos envolvidos nos processos de citoproteção e cicatrização de úlceras gástricas, bem como os processos antiinflamatórios e antinociceptivos, atribuídos popularmente e previamente descritos na literatura para a oleorresina das copaíbas. Além disso, existem poucos estudos para C. oblongifolia Mart. ex Hayne e C. duckei Dwyer. Com base nos padrões de fragmentação obtidos nas análises em CG-MS e em UHPLC-(ESI)-HRMS permitiu concluir que as oleorresinas apresentam compostos da classe de sesquiterpenos e diterpenos, assim como descrito na literatura. Nos extratos das folhas foi possível observar a presença de flavonoides e derivados galoilquínicos, já descritos para as folhas da espécie, e epicatequinas, descrito na família Fabacea, mas não isolado ainda em espécies de Copaifera spp. Os resultados dos ensaios a atividade citotóxica em linhagens não neoplásicas (CHO-k1 e L929) e neoplásicas (AGS e THP-1) por meio do ensaio de viabilidade celular por fosfatase ácida, e no ensaio de morte celular determinada por iodeto de propídio em citometria de fluxo para as células AGS e THP- 1 demonstram que as oleorresinas, extratos e substâncias isoladas de C. oblongifolia e C. duckei apresentam atividade citotóxica preferencial em células neoplásicas, confirmando a atividade antitumoral já descrita na literatura. Na avaliação da toxicidade aguda por dose fixa, o extrato das folhas de C. oblongifolia, C. duckei e o ácido polialtico são seguros até a dose de 2000 mg/kg. A administração da oleorresina promove alterações hematológicas, bioquímicas e histológicas, principalmente ligadas ao metabolismo hepático, renal e pancreático. A oleorresina de C. duckei é tóxica na dose de 2000 mg/kg, promovendo a morte dos animais após 48 h da sua administração. No experimento com doses repetidas em 90 dias não houve morte dos animais tratados com 1, 10 e 100 mg/kg de oleorresina de C. duckei, porém houveram alterações hematológicas, bioquímicas e histológicas, embora menos evidente, no metabolismo hepático, renal e pancreático. Quanto a gastroproteção, as oleorresinas e os extratos das folhas de C. oblongifolia e C. duckei promovem efeitos citoproterores sobre a mucosa gástrica nos modelos de EtOH/HCl e AINEs. As frações em diclorometano e acetato de etila do extrato das folhas de ambas as espécies de Copaifera spp. contêm os compostos que podem ser responsáveis pela citoproteção gástrica. Sesquiterpenos, diterpenos, flavonoides e derivados galoilquínicos também foram avaliados, demonstrando atividades gastroprotetoras no modelo de úlceras induzidas por EtOH/HCl. Tanto a oleorresina quanto o extrato das folhas de C. xi oblongifolia e C. duckei apresentam atividade cicatrizante gástrica no modelo de úlceras induzidas por ácido acético, e aumentam a proliferação celular no ensaio de wound scratch em L929. A oleorresina de C. oblongifolia e C. duckei não contribui para o aumento do pH estomacal, mas diminuiu a quantidade de íons H+ secretada. Os extratos das folhas de C. oblongifolia e C. duckei aumentaram significativamente a quantidade de muco, favorecendo as defesas gástricas. A oleorresina e o extrato das folhas de C. oblongifolia são ativas contra a bactéria H. pylori, tanto in vitro, quanto in vivo. Os extratos de C. oblongifolia e C. duckei possuem maior atividade antioxidante - in vitro e in vivo - quando comparados à oleorresina. Em parte, os metabólitos presentes nas oleorresinas e nos extratos das folhas de C. oblongifolia e C. duckei promovem efeitos citoprotetores e cicatrizantes, interferindo na secreção de ácido, conforme demonstrado no ensaio sobre a enzima H+, K+-ATPase, aumentando a secreção de muco e favorecendo os mecanismos de defesa antioxidantes. Procurando verificar se a atividade antinociceptiva estava relacionada a ação no SNC dos animais, avaliaram-se as oleorresinas e os extratos das folhas das espécies de Copaifera spp. na função e coordenação motora dos animais, através dos testes de Open field e Rota rod. Nenhum tratamento interferiu na função e na coordenação motora dos animais. A oleorresina de C. duckei e sua substância majoritária, o ácido poliáltico foram testados quanto a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva, tanto sob o ponto de vista agudo, quanto crônico. Foram utilizados os métodos de contorções abdominais por ácido acético, nocicepção aguda por formalina, nocicepção térmica por tail-flick, hiperalgesia mecânica, edema de pata e air pouch (avaliação do exsudato na bolsa de ar) induzida por diversos agentes, tais como formalina, carragenina, dextrana, LPS e zymosan. Além disso, foram investigadas de forma preliminar as atividades contra dor crônica induzida por avulsão do plexo braquial (APB) e hipernocicepção induzida por CFA durante 15 dias. Em todos os ensaios houve redução tanto da resposta nociceptiva quanto da atividade inflamatória, sugerindo que há ação antinociceptiva a nível periférico, ou por inibição do sinal nociceptivo ou pela diminuição de mediadores que estimulam os nociceptores, que diminuir a migração celular e a concentração de mieloperoxidase (MPO) no local da lesão. Em células THP-1 estimuladas por LPS, os tratamentos com as oleorresinas, extratos e substâncias majoritárias de C. oblongifolia e C. duckei diminuíram os níveis de citocinas pró-inflamatórias INF-?, IL-1?, IL-6 e TNF-?. Os níveis de IL-10 foram parcialmente reduzidos com estes tratamentos. A ação sobre citocinas próinflamatórias sugere atividade anti-inflamatória tanto aguda quanto crônica, tendo em vista que o experimento possui os tempos de 24 h e 72 h e esta diminuição é dose dependente. Além disso, a oleorresina de C. duckei e o ácido poliáltico interferem nos níveis de NF-?B determinados no ensaio da luciferase. Estes resultados indicam que pode estar havendo interação com os receptores TLR4 e TLR2, que interferem na via do NF-?B e diminuem os eventos inflamatórios e apoptóticos oriundos desta via, confirmando as atividades estudadas. As atividades antinociceptivas e antiinflamatórias observadas no tratamento com a oleorresina de Copaifera spp. ou suas substâncias isoladas podem ser devido a diminuição da liberação ou síntese de mediadores relacionados à resposta inflamatória, que resulta em diminuição do estímulo nociceptivo. As atividades citotóxicas descritas indicam que existe potencial efeito antitumoral que justifica o estudo para o desenvolvimento de substâncias com atividade antitumoral, em especial atenção para os cânceres gástricos e ligados ao sistema imunológico, tendo em vista a seletividade citotóxica em linhagens tumorais AGS e THP-1. Os resultados apresentados neste trabalho são inéditos, tendo em vista que é escasso na literatura dados sobre a C. oblongifolia, e dados sobre o uso a longo xii prazo de oleorresinas e extratos de Copaifera. Além disso, os achados fitoquímicos sugerem que existe potencial investigação química, pois muitas substâncias ainda não foram isoladas das espécies. Ainda, estes resultados contribuem para a confirmação das atividades farmacológicas atribuídas popularmente para as espécies de Copaifera spp., sendo que pela primeira vez observou-se que a oleorresina é efetiva para o tratamento de doenças inflamatórias e dolorosas crônicas, tornado a planta alvo para o estudo mais aprofundado dos mecanismos de ação farmacológicos envolvidos, fornecendo subsídios para estudos posteriores que poderão servir ao desenvolvimento de um novo fitoterápico no Brasil. / Medicinal plants are a rich source of potentially bioactive molecules. In Brazil, about 40% of the population use medicinal plants as an alternative therapy. However, most Brazilian native plants have no scientific studies proving their effectiveness and safety. Additionally, due to the enormous Brazilian biodiversity, the number of studied species is still small, and it represents a vast field to be explored. In this context, oleoresins from plants belonging to the genus Copaifera have few studies regarding its chemical, pharmacological and toxicological properties. For its aerial parts such as leaves, the studies are also scarce. Within this context, this project sought to assess the toxicology of oleoresins and leaf extracts of C. oblongifolia Mart. ex Hayne and C. duckei Dwyer, and understand preliminarily the mechanisms involved in wound healing processes and cytoprotection of gastric ulcers, as well as the anti-inflammatory and antinociceptive processes, commonly assigned and previously described in the literature for the copaiba oleoresin. Furthermore, there are few studies of C. oblongifolia Mart. ex Hayne and C. duckei Dwyer. Based on the fragmentation patterns obtained in the GC-MS and UHPLC-(ESI)-HRMS analyses it was concluded that oleoresins possess compounds of the sesquiterpene and diterpene class, as described in the literature. In leaf extracts, it was observed the presence of flavonoids and galoilquinic acid derivatives, as previously described for the leaves of this species, and epicatechins, described in the Fabaceae family, but not reported thus far in species of Copaifera spp. The results of the cytotoxic tests on neoplastic (AGS and THP-1) and non-neoplastic lines (CHO-k1 and L929) by cell viability assay for acid phosphatase, and cell death assay determined by propidium iodide in flow cytometry for AGS and THP-1 cells demonstrate that oleoresins, extracts and compounds isolated from C. oblongifolia and C. duckei present preferred cytotoxic activity on neoplastic cells, thus confirming the antitumor activity already described in literature. In the evaluation of acute toxicity by a fixed dose, leaf extracts from C. oblongifolia, and C. duckei and polyalthic acid are safe at doses up to 2000 mg / kg. The administration of oleoresin promotes hematological, biochemical and histological changes, mainly linked to liver, kidney and pancreatic metabolism. C. duckei oleoresin is toxic at a dose of 2000 mg / kg, promoting death of animals after 48 hours of its administration. In the experiment with repeated doses in 90 days there was no death of animals treated with 1, 10 and 100 mg / kg of C. duckei oleoresin, but there were hematological, biochemical and histological changes, although less obvious, in hepatic, renal and pancreatic metabolism. Regarding gastroprotection, the oleoresins and extracts from C. oblongifolia and C. duckei leaves promote cytoprotective effects on gastric mucus in EtOH/HCl and NSAIDs models. The dichloromethane and ethyl acetate fractions from crude leaves extract of both species Copaifera spp. contain compounds which may be responsible for gastric cytoprotection. Sesquiterpenes, diterpenes, flavonoids and galoilquinic acid derivatives were also evaluated, demonstrating gastroprotective activities in the model of ulcers induced by EtOH/HCl. Oleoresin and leaf extracts from C. oblongifolia and C. duckei present gastric healing activity in the model of ulcers induced by acetic acid, and increase cell proliferation in the L929 wound scratch assay. C. oblongifolia and C. duckei oleoresin do not increase the stomach pH, but decrease the amount of H + ions secreted. C. oblongifolia and C. duckei leaf extracts significantly increased the quantity of mucus, favoring gastric defense. Oleoresin and leaf extract of C. oblongifolia are active against the bacteria H. pylori, both in vitro and in vivo. C. oblongifolia and C. duckei leaf extracts have higher antioxidant activity - in vitro and in vivo - compared to their oleoresins. In part, the metabolites present in oleoresins and in leaf extracts of C. oblongifolia and C. duckei promote healing and cytoprotective effects, interfering in the secretion of acid, as demonstrated in enzyme test against H +, K + -ATPase, increasing the secretion of mucus and favoring the antioxidant defense mechanisms. In order to verify whether the antinociceptive activity was related to ab effect in the CNS of animals, we evaluated oleoresins and leaf extracts in the function and motor coordination of animals, through the Open field and Rota rod test. No treatment interfered in the function and motor coordination of animals. C. duckei oleoresin and its major substance, polyalthic acid were tested for anti-inflammatory and antinociceptive activity, both in the acute and chronic models. Different methods were used such as writhing by acetic acid, acute nociception formalin, thermal nociception by tail-flick, mechanical hyperalgesy, paw edema and air pouch (exudate assay in air pouch) induced by various agents, such as formalin, carrageenan, dextran, zymosan and LPS. Additionally, there were preliminarily investigated activities against chronic pain induced by brachial plexus avulsion (APB) and hyperalgesy induced by CFA for 15 days. In all experiments there was a reduction of in nociceptive response and inflammatory activity, suggesting that there is antinociceptive activity in the peripheral level, by inhibition of the nociceptive signal or by a decrease of mediators that stimulate nociceptors, which decrease cell migration and concentration of myeloperoxidase (MPO) at the site of injury. In THP-1 cells stimulated by LPS, treatments with oleoresins, extracts and Major compounds from C. oblongifolia and C. duckei decreased levels of proinflammatory cytokines INF-?, IL-1?, IL-6 and TNF-?. IL-10 levels were partially reduced with these treatments. The action of proinflammatory cytokines suggests both acute and chronic anti-inflammatory activity, considering that the experiment has the times of 24 h and 72 h and this decrease is dose-dependent. Furthermore, C. duckei oleoresin and polyalthic acid and interfere with NF-?B levels determined in the luciferase assay. These results indicate that there may be an interaction with the TLR4 and TLR2 receptors that affect the NF-?B pathway and decrease the inflammatory and apoptotic events from this pathway, confirming the studied activities. The antinociceptive and anti-inflammatory activity observed in the treatment with Copaifera spp oleoresin. or its isolated substances may be due to a decrease in the release or synthesis of mediators related to the inflammatory response, which results in a decreased nociceptive stimulus. The described cytotoxic activities indicate that there is potential antitumor effect that justifies the study for the development of substances having antitumor activity, especially regarding to gastric cancers and those related to the immune system, considering the cytotoxic selectivity in AGS and THP-1 tumor cell lines. The results presented herein are new, considering the scarce studies regarding C. oblongifolia, and long-term use of oleoresins and extracts from Copaifera. Moreover, phytochemicals findings suggest that there is potential in the chemical research, as many substances have not yet been isolated from these species. Furthermore, these results contribute to the confirmation of the pharmacological activities assigned commonly to the species of Copaifera spp., and this is the first time that oleoresins are found to be effective for the treatment of chronic inflammatory and painful disorders. Thus, this study makes the studied plants an alternative target for further studies concerning the pharmacologic mechanisms of action involved, providing support for further studies that will serve for the development of a new phytotherapy medicine in Brazil.

Cultura de células de carrapatos, é uma ferramenta importante, para isolar e estudar os agentes de doenças transmissíveis. Amblyomma sculptum é o principal vetor de Rickettsia rickettsii, o agente da febre maculosa. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar as células deste carrapato, além de testar seu potencial uso, como substrato para o crescimento e isolamento de patógenos. A partir de massas de ovos de A. sculptum, culturas primárias foram, preparadas em meio L-15B, subcultivadas ao atingirem a confluência necessária e criopreservadas em diversas passagens. A boa recuperação celular estabeleceu a linhagem IBU/ASE-16, a qual foi testada para, Rickettsia spp, Trypanosoma theileri e Leishmania infantum chagasi, obtendo-se bons resultados. A citometria de fluxo analisou a expressão de marcadores de células-tronco, proliferação, diferenciação e regulação do ciclo celular, nas IBU/ASE-16. O &Delta;&psi;m mostrou atividade das mitocôndrias e ausência de células inativas. A microscopia confocal, localizou estruturas celulares marcadas com fluorocromos, enquanto que a MEV,mostrou, junções intercelulares, matriz extracelular e redes neuronais. O teste de tumorigênese em camundongos Balb/c nu/nu, não resultou em crescimento de tumores. / Cell cultures of ticks are important tools to isolate and study agents of transmissible diseases. Amblyomma sculptum is the main vector of Rickettsia rickettsii, the agent for spotted fever. The aim of this study was to establish and characterize the cells of this tick, and test their potential use as a substrate for the growth and isolation of pathogens. From a egg masses of A. sculptum, primary cultures were prepared in L-15B medium, subcultured as they reached the necessary convergence and cryopreserved in several passages. The good cell recovery established IBU/ASE-16 lineage, which was tested for Rickettsia spp, Trypanosoma theileri and Leishmania infantum chagasi, yielding good results. Flow cytometry analyzed the expression of stem cell markers, proliferation, differentiation and regulation of the cell cycle, in the IBU/ASE-16 lineage. The &Delta;&psi;m showed activity of mitochondria and absence of inactive cells. Confocal microscopy located cell structures marked with fluorochromes, while MEV showed intercellular junctions, extracellular matrix and neural networks. Tumorigenesis tests in Balb/c nu/nu mice resulted in no tumor growth.

O mastocitoma é o tumor cutâneo mais comum dos cães, representando 7% a 21% dos tumores da pele e tecidos moles, 11% a 27% dos tumores malignos cutâneos nessa espécie. Eles possuem uma grande variedade de aparência e comportamento, o qual o torna um desafio seu tratamento. Os retinóides são uma promessa na luta contra o câncer. Entretanto, há poucos estudos sobre os efeitos dos retinóides em neoplasias caninas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a cultura primária de mastocitomas caninos assim como investigar a quimiosensibilidade deste tumor ao ácido retinóico todo-trans (ATRA). A cultura primária de mastocitomas caninos foi realizada em co-cultivo com fibroblastos, que demonstrou uma interação favorável entre mastócitos e fibroblastos, com uma sobrevida média de 30 dias. A quimiosensibilidade dos mastocitomas caninos ao ATRA não mostrou diferenças entre os graus de mastocitomas, ou seja, tanto um mastocitoma grau II ou III respondem igualmente ao ATRA nas doses estudadas. Foi constatado também que o mastocitoma é mais sensível na concentração 10-4M de ATRA (p < 0,002). Existe também um efeito já nas primeiras 24h, mas esse não se altera em 48h, entretanto se intensifica após 72h. Podemos inferir, então, que a maior quimiosensibilidade de mastocitomas caninos ao ATRA se dá após 72h de exposição na dose de 10-4M. Podemos concluir que o ATRA apresenta efeitos sobre as células de mastocitomas caninos e pode ser usado como potencial adjuvante no tratamento desta neoplasia. / Mast cell tumor (MCT) is one of the most frequent neoplasms that affect the skin and soft tissue of the dog, representing about 7% a 21% of all skin tumors and 11% a 27% of malignant skin tumors in this specie. They present a great variety of appearance and behavior, which becomes a challenge to the treatment. The retinoids are well recognized as promising antitumor agents. However, there have only been a few reports about the effect of retinoids in canine cancers. The aim of this study was to characterize the primary mast cell tumor culture and to investigate the chemosensitivity of this tumor to all trans retinoic acid (ATRA). The primary cell culture of MCT was performed as co-cultive with fibroblasts, showing a positive interaction between mast cells and fibroblasts, with a lifetime of 30 days. The chemosensitivity of MCT to ATRA showed no difference between grade II or III, thus either a MCT grade II or grade III has the same response with ATRA at the doses studied. It has been shown that the MCT is more sensible at the dose 10-4M (p < 0,002). There is also an effect on first 24h untill 48h, changing after 72h. According to these results, it is possible to state that the great chemosensitivity of MCT to ATRA is after 72h of exposition at 10-4M. We can conclude that ATRA may be a potential adjunctive chemotherapeutic agent for the treatment of canine mast cell tumor.

Orientador: Leonardo Perez Faverani / Coorientadora: Roberta Okamoto / Banca: Daniela Ponzoni / Banca: Ellen Cristina Gaetti Jardim / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar um novo método de texturização por PEO com incorporação de Ca e P na superfície do Ti-6Al-4V em ossos de baixa densidade, por meio de avaliação in vitro, ex-in vivo e in vivo, em função de parâmetros topográficos e reparacionais. 57 ratas Wistar (Rattus novergicus), sendo 38 ratas com 6 meses de idade (Grupos OXV - submetidas à ovariectomia e SHAM - cirurgia fictícia) e 19 ratas senis (18 meses de idade: Grupo SENIL), foram divididas para realização do estudo ex-in vivo (n=9) e in vivo (n=48). Os grupos para análise ex-in vivo foram submetidos à eutanásia e os fêmures foram removidos e transportados em meio de cultura contendo meio essencial mínimo modificação alfa (α- MEM) suplementado com 500 µg/mL de gentamicina e 3 µg/mL de fungisona. As células-tronco mesenquimais de medula óssea (CTMs-MO) dos fêmures, foram isoladas e cultivadas em meio de crescimento para manterem-se como CTMs. Após alcançar a subconfluência, as células foram cultivadas em 3 superfícies de discos de Ti-6Al-4V, grupo CONTROLE (superfície usinada) grupo AC (superfície tratada por Ataque Ácido e Jateamento) e grupo PEO (superfície tratada por Oxidação de Plasma Eletrolítico com associação de Cálcio e Fosforo). Para avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de viabilidade celular, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, imunolocalização de sialoproteina óssea (BSP) e osteopontina (OPN), atividade da fosfatase alcalina (ALP) e formação de matriz mi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to evaluate a new PEO texturing method with Ca and P incorporation on the Ti-6Al-4V surface in low bone density, by means of in vitro, ex vivo and in vivo evaluation through topographic and repairment parameters. 57 Wistar rats (Rattus novergicus), being 38 at 6 months of age (OXV Groups - submitted to ovariectomy and SHAM surgery) and 19 senile rats (18 months of age: SENIL Group) were divided into three subgroups: ex-in vivo (n = 9) and in vivo (n = 48). The Groups for ex-in vivo analysis were euthanized and femurs were removed and transported in culture medium containing minimal alpha modification (α- MEM) medium supplemented with 500 μg / ml gentamicin and 3 μg / ml fungizone. The mesenchymal stem cells from bone marrow (MSC-M) of the femur were isolated and cultured in growth medium to remain as MSCs. After reaching the subconfluence, the cells were grown on 3 surfaces of Ti-6Al-4V discs, CONTROL group (machined surface) group AC (surface treated by etched-acid) and PEO group (surface treated by Electrolytic Plasma Oxidation with the association of Calcium and Phosphorus). Cell viability assays, gene expression of osteoblastic markers, bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN), alkaline phosphatase (ALP) activity, and mineralized matrix formation were performed to evaluate cellular responses. Data were submitted to ANOVA 1 factor test or Kruskal-Wallis test (P <0.05). In the groups for the in vivo study, after 90 days, an implant was i... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A deficiência de vitamina A é um problema global de saúde pública que afeta especialmente crianças com menos de 5 anos, mulheres durante o parto e 1 ano pós-parto e é a principal causa de cegueira evitável em crianças. Biofortificação é uma estratégia que visa reduzir as deficiências de micronutrientes em populações vulneráveis ao redor do mundo através do aumento da concentração de nutrientes nos alimentos básicos. Investigou-se os efeitos de genótipos e estilos de cocção sobre o conteúdo, retenção e biodisponibilidade de ?-caroteno (?C) em mandiocas biofortificadas e batatas-doces de polpa laranja (BDPL). Cinco genótipos de mandioca biofortificada, três acessos parentais, e uma mandioca branca foram fornecidos por dois programas de melhoramento. Adicionalmente, foram avaliados dois genótipos de BDPL e duas marcas de alimentos infantis. Tanto as raízes de mandioca quanto de batatas-doces foram analisadas cruas, cozidas em água a 100°C, e fritas em óleo de soja a 180°C após cozimento. Os carotenoides foram extraídos e analisados por HPLC-DAD. A biodisponibilidade foi determinada utilizando a digestão oral, gástrica e duodenal in vitro e absorção por culturas celulares Caco-2. Somente o ?C foi detectado em todos os genótipos de mandioca, embora os teores tenham variado significativamente dependendo do genótipo. As mandiocas melhoradas continham pelo menos 10 vezes mais ?C do que a branca. O cozimento e a fritura foram associados com a perda e isomerização de ?C na mandioca bem como na BDPL. Houve interação significativa entre genótipo e processamento nos perfis e teores de ?C. Eficiência de micelarização do trans-?C nas mandiocas cozidas foi menor do que nas fritas. As mandiocas biofortificadas prontas para consumo podem fornecer até 28% da IDR de retinol. A absorção pelas células Caco-2 do trans-?C foi analisada em quatro genótipos. Dois deles não foram afetados pela cocção em relação à absorção celular, no entanto, os outros dois genótipos apresentaram aumento com a fritura. Com relação às batatas-doces, o trans-?C foi o principal carotenoide encontrado, embora também tenham sido identificados três isómeros do ?C e ?-caroteno em quantidades menores. O teor do trans-?C em um dos genótipos de BDPL foi duas vezes maior do que nos alimentos infantis. Nos alimentos infantis foi encontrada presença relativa de 13-cis-?C maior do que nas BDPLs. A eficiência de micelarização de trans-?C das batatas-doces foi considerada baixa, e não teve diferença com os processamentos. A absorção por Caco-2 não foi diferente para os genótipos de BDPL e alimentos infantis investigados. A quantidade intracelular acumulada de trans-?C foi proporcional à concentração do material inicial. Em resumo, as culturas biofortificadas estudadas podem aumentar a concentração de ?C na dieta. A mandioca frita apresenta mais ?C biodisponível do que ela cozida. Tanto o genótipo da mandioca quanto o tipo de processamento influenciam a absorção de trans-?C. Por outro lado, não foram encontradas evidências de que a redução de partículas, utilizada no alimento infantil, ofereça maior biodisponibilidade de beta-caroteno das BDPLs / Vitamin A deficiency is a world public health problem that affects especially infants, children less than 5 years of age, women during birthing and 1 year post-partum and is the primary cause of avoidable blindness in children. Biofortification is a strategy aimed at decreasing global micronutrient deficiencies in vulnerable populations by increasing the nutrient density in staple food crops. It was investigated the effects of genotype and cooking styles on the content, retention and bioavailability of ?-carotene (?C) in biofortified cassava and orange fleshed sweet-potatoes (OFSP). Five genotypes of biofortified cassava, three parental accessions, and one white cassava were provided by two different breeding programs. Additionally, two genotypes of OFSP and two brands of high processed baby foods were evaluated. Both cassava and OFSP roots were analyzed raw, after boiling in water at 100°C only or after subsequent frying in soybean oil at 180°C. Carotenoids were extracted and analyzed by HPLC-DAD. Bioavailability was assessed using an in vitro oral, gastric and small intestinal digestion coupled with the Caco-2 human intestinal cell model. Only ?C was detected in all tested genotypes of cassava root, although its content varied markedly depending on genotype. Biofortified genotypes contained at least 10-fold higher ?C than the white variety. Boiling and frying were associated with loss and isomerization of ?C in cassava as well as OFSP. There was an interaction of genotype and cooking style on profile of ?C contents. Efficiency of micellarization of trans-?C in boiled cassava was lower than in fried. Biofortified cassava ready to eat can provide up to 28% of the IDR of retinol. Uptake of trans-?C in micelles generated during digestion by Caco-2 cells was analyzed for the four of the five biofortified genotypes. Cell uptake of ?C from two genotypes were not affected by processing, however the other two genotypes had increased with frying. Regarding sweet-potatoes, trans-?C was the major carotenoid found, although it was identified three ?C isomers and ?-carotene in minimal quantities. The concentration of trans-?C in one genotype of OFSP was two times higher than baby foods and the other genotype. Baby foods had relative presence of the 13-cis-?C higher than in the OFSP. Efficiency of micellarization of trans-?C from cooked OFSP or Baby foods was considered low, and had no statistic differences between boiling and frying. The Caco-2 cells uptake were not different for the genotypes and baby foods investigated. The absolute amount of accumulated trans-?C intracellular was proportional to the concentration of the starting material. In summary, biofortified crops can increase ?C contents in diet. Fried cassava presents more bioavailable ?C than boiled. Cassava genotype and cooking style may influence uptake of trans-?C by absorptive intestinal cells. In contrast, there is no evidence that high processed OFSP has more bioavailability of ?C than homemade boiled or fried OFSP

O mastocitoma é o tumor cutâneo mais comum dos cães, representando 7% a 21% dos tumores da pele e tecidos moles, 11% a 27% dos tumores malignos cutâneos nessa espécie. Eles possuem uma grande variedade de aparência e comportamento, o qual o torna um desafio seu tratamento. Os retinóides são uma promessa na luta contra o câncer. Entretanto, há poucos estudos sobre os efeitos dos retinóides em neoplasias caninas. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a cultura primária de mastocitomas caninos assim como investigar a quimiosensibilidade deste tumor ao ácido retinóico todo-trans (ATRA). A cultura primária de mastocitomas caninos foi realizada em co-cultivo com fibroblastos, que demonstrou uma interação favorável entre mastócitos e fibroblastos, com uma sobrevida média de 30 dias. A quimiosensibilidade dos mastocitomas caninos ao ATRA não mostrou diferenças entre os graus de mastocitomas, ou seja, tanto um mastocitoma grau II ou III respondem igualmente ao ATRA nas doses estudadas. Foi constatado também que o mastocitoma é mais sensível na concentração 10-4M de ATRA (p < 0,002). Existe também um efeito já nas primeiras 24h, mas esse não se altera em 48h, entretanto se intensifica após 72h. Podemos inferir, então, que a maior quimiosensibilidade de mastocitomas caninos ao ATRA se dá após 72h de exposição na dose de 10-4M. Podemos concluir que o ATRA apresenta efeitos sobre as células de mastocitomas caninos e pode ser usado como potencial adjuvante no tratamento desta neoplasia. / Mast cell tumor (MCT) is one of the most frequent neoplasms that affect the skin and soft tissue of the dog, representing about 7% a 21% of all skin tumors and 11% a 27% of malignant skin tumors in this specie. They present a great variety of appearance and behavior, which becomes a challenge to the treatment. The retinoids are well recognized as promising antitumor agents. However, there have only been a few reports about the effect of retinoids in canine cancers. The aim of this study was to characterize the primary mast cell tumor culture and to investigate the chemosensitivity of this tumor to all trans retinoic acid (ATRA). The primary cell culture of MCT was performed as co-cultive with fibroblasts, showing a positive interaction between mast cells and fibroblasts, with a lifetime of 30 days. The chemosensitivity of MCT to ATRA showed no difference between grade II or III, thus either a MCT grade II or grade III has the same response with ATRA at the doses studied. It has been shown that the MCT is more sensible at the dose 10-4M (p < 0,002). There is also an effect on first 24h untill 48h, changing after 72h. According to these results, it is possible to state that the great chemosensitivity of MCT to ATRA is after 72h of exposition at 10-4M. We can conclude that ATRA may be a potential adjunctive chemotherapeutic agent for the treatment of canine mast cell tumor.