Nanotechnology applications have emerged enormously in recent times. Of particular interest is that area that overlaps the areas of nanotechnology, biology and medicine: nanomedicine. One advantage of nanomedicines is it that it can be used as an enabling technology by pharmaceutical researchers and industry to overcome issues associated with the low bioavailability of hydrophobic drugs. In the first part of the current study, nanosuspensions of two of hydrophobic steroid drugs: hydrocortisone and prednisolone were produced. Nanosuspensions were prepared using a bottom-up approach: the anti-solvent precipitation method using microfluidic reactors. Surface modification was carried out on these nanosuspensions using cationic surfactants to obtain nanoparticles with different levels of surface positive charge as indicated by ¿-potential values. Dynamic light scattering (DLS) and transmission electron microscope (TEM) techniques were used to characterize the prepared nanoparticles. Powder X-ray diffraction (PXRD) and differential scanning calorimetry (DSC) were also used to characterize hydrocortisone nanoparticles. In the second part, cellular uptake of both coated and uncoated nanoparticles by HaCaT keratinocytes cell line was examined and indicated by quantifying the anti- inflammatory effect of nanoparticles on the LPS-induced inflammation. Also, TEM was employed to evaluate the cellular uptake of hydrocortisone nanoparticles. Results showed higher ant-inflammatory effect of coated nanoparticles over uncoated nanoparticles. Furthermore, the anti-inflammatory effect of coated nanoparticles was correlated to the degree of positive surface charge. / Libyan government

Développement et évaluation de nouvelles stratégies pour le traitement des hépatites B chroniques, dans le modèle du canard de Pékin infecté par le DHBVL’infection chronique par le HBV est la cause majeure de cirrhose hépatique et de carcinome hépatocellulaire, conduisant à plus d’un million de décès chaque année. Le faible taux de réussite des thérapies actuelles des hépatites B montre la nécessité du recours à des méthodes thérapeutiques alternatives. Ainsi, nous avons étudié une stratégie pertinente reposant sur l’utilisation de molécules antisens (PNAs) couplées à des peptides perméabilisants (CPPs). Nous avons démontré que les PNAs ciblant le signal d’encapsidation du DHBV couplés au CPP pénétraient dans les cellules et conduisait à une inhibition de la réplication virale. De plus, nous avons mis en évidence une activité antivirale du CPP (Arg)8 seul. Nous avons ensuite évaluer le mécanisme d’action antivirale du CPP in vitro et avons démontré qu’il inhibait les stades tardifs de la morphogénèse virale, conduisant à une inhibition forte de la sécrétion des particules virales. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés à l’évaluation de stratégies immunothérapeutiques, reposant sur la vaccination génétique. Nous avons démontré les bénéfices de la co-administration de cytokines (IFNγ), avec un vaccin à ADN dirigé contre la grande protéine d’enveloppe du DHBV (preS/S), sur l’amplitude de la réponse humorale et sur le pouvoir neutralisant des anticorps induits. Enfin nous avons évalué les bénéfices d’une approche d’immunisation hétérologue « prime-boost » associant l’immunisation à ADN et un vecteur viral (AdénoCELO) recombinant, codant la protéine preS/S du DHBV et l’IFNγ. Nous avons montré que l’immunisation hétérologue induisait une réponse humorale plus forte que celle induite par l’immunisation homologue. / Development and evaluation of new strategies for treating chronic hepatitis B in the model of Peking duck infected with DHBVChronic infection with Hepatitis B virus (HBV) is the major cause of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma, leading to more than one million deaths each year. The low success rate of current therapies against HBV infection shows the need of alternative therapeutics. Thus, we studied a new strategy based on the use of antisense molecules (PNAs) coupled with cell penetrating peptides (CPPs). We have shown that PNAs targeting the DHBV encapsidation signal coupled to CPPs penetrated into the cells and led to an inhibition of viral replication. In addition, we have demonstrated an antiviral activity of the CCP (Arg)8 itself. We then evaluate the mechanism of antiviral action of this CPP in vitro and have shown that it inhibited the late stages of viral morphogenesis, leading to a strong inhibition of the release of viral particles. Furthermore, we were interested in evaluating immunotherapeutic strategies, based on DNA vaccination. We have demonstrated the benefits of co-administration of cytokines (IFNy), with a DNA vaccine directed against the DHBV large envelope protein (preS/S), enhancing the magnitude of humoral response and enhancing neutralizing anti-DHBV antibody response. Finally we evaluated the benefits of a heterologous immunization approach or prime-boost immunization involving DNA vaccination and a recombinant viral vector (AdenoCELO) encoding the DHBV preS/S and IFNy proteins. We have shown that heterologous immunization induced a humoral response stronger than that induced by homologous immunization. By contrast, the heterologous prime-boost strategy was less effective than homologous DNA immunization for therapy of chronic DHBV-carrier ducks.

Le but de cette thèse de doctorat fut de développer des nanoparticules pour la délivrance de deux molécules hydrophobes de faible poids moléculaire, l’apigénine (AG) et un ferrocifène (FcTriOH), comme stratégie innovante pour le traitement du glioblastome(GBM). Dans un premier temps, différents types de nanoparticules, liposomes, nanocapsules lipidiques (LNC), et nanocapsules à base de polymères, furent formulés et comparés en termes de caractéristiques physico-chimiques, de libération en drogue ou encore de toxicité. Les LNCs furent ainsi sélectionnées. Dans un deuxième temps, les LNCs furent fonctionnalisées en surface par un peptide pénétrant (CPP). La concentration de peptide fut augmenté afin d’améliorer significativement l’internalisation des LNCsdans des cellules humaines de GBM. Les mécanismes de macropinocytose et d’endocytose dépendant de la clathrine et de la cavéoline furent observés. De plus, il fut montré que l’internalisation de ces LNCs fonctionnalisées était réduite dans les cellules saines humaines d’astrocyte. L’efficacité biologique des LNCs chargées en AG et chargées en FcTriOH fut évaluée et comparée : le résultat le plus prometteur fut obtenu avec les LNCs chargées en FcTriOH. Une administration intracérébrale des LNCs sur un modèle tumoral murin orthotopique montra une potentielle toxicité et un besoin d’optimiser la dose administrée. Pour finir, les études menées sur un modèle tumoral ectopique murin montrèrent des résultats prometteurs, après une administration parentérale des LNCs chargées en FcTriOH. Ainsi, cette dernière formulation pourrait ouvrir la voie au développement d’une stratégie thérapeutique alternative pour le traitement du GBM. / The aim of this thesis was to develop nanocarriers for efficient delivery of two low molecular weight hydrophobic drugs, apigenin (AG) and a ferrocifen-derivative(FcTriOH) to glioblastoma (GBM) as potential therapeutic strategies. Firstly, two liposomes, a lipid nanocapsule (LNC), and a polymer-based nanocapsule were develope dand compared by their physicochemical characteristics, drug loading capacity, storage stability, stability in biological serum, drug release profiles, complement consumption and toxicity. Due to various advantageous characteristics, the LNCs were selected for further optimization. Secondly, the LNCs were surface functionalized by adsorbing a GBM-targeting cellpenetratingpeptide (CPP). The CPP concentration increased to significantly enhance LNCinternalization in human GBM cells. The uptake mechanisms observed in U87MG cellswere : micropinocytosis, clathrin-dependent and caveolin-dependent endocytosis. Moreover, the optimized CPP-functionalized LNCs were internalized preferentially in theGBM cells compared to normal human astrocytes. Additionally, the in vitro efficacy of the AG-loaded and FcTriOH-loaded LNCs was evaluated. The FcTriOH-loaded LNC-CPP showed the most promising activity with a low IC50 of 0.5 μM against U87MG cells. Intracerebral administration of the LNCs in a murine orthotopic U87MG tumor modelshowed possible toxic effects and the need for dose optimization. Finally, studies inmurine ectopic U87MG tumor model showed promising activity after parenteral administration of the FcTriOH-loaded LNCs. Overall, these results exhibit the promising activity of FcTriOH-loaded LNCs as potential alternative GBM therapy strategy.

Cyclotides are plant proteins with a unique topology, defined as the cyclic cystine knot motif. The motif endows cyclotides with exceptional chemical and biological stability. They also exhibit a wide range of biological activities including insecticidal, cytotoxic, anti-HIV and antimicrobial effects. Hence, cyclotides have become potential candidates in the development of peptide-based drugs; either as scaffolds to stabilize susceptible peptide sequences or as drugs by their own right. In this thesis, important parameters that could be inputs toward this development have been tuned. An extraction protocol that can be extended to industrial scale production of the cyclotides from natural sources was developed; accordingly, a single maceration with hydroalcoholic solutions of medium polarity represented an optimum extraction method. Moreover, it was shown that investigating the cyclotide content of cyclotide-bearing plants from diverse environments is a promising approach for extending the knowledge of both structural and biological diversity of these proteins. Five novel cyclotides with new sequence diversity were isolated and characterized from a violet that grows on Ethiopian highlands at an altitude of 3400 m. One of the areas where the cyclotide framework has attracted interest is the development of stable antimicrobial peptides. A stability study was carried out to determine the stability of the cyclotide framework in a cocktail of bacterial proteases and serum where the native forms of tested cyclotides exhibited high stability profile. Understanding the modes of cyclotide-cell interaction is certainly an important factor for the potential development of cyclotide-based drugs. Cellular studies were carried out using the comet assay and microautoradiography. A bell-shaped dose response curve was obtained for the DNA damaging effect of the cyclotides in the comet assay, which was the first toxicological assay of its kind on this class of proteins. The microautoradiography study revealed that the cyclotides penetrate into the cells even at cytotoxic concentrations. From previous reports, it was known that the cyclotides interact with membranes; the cellular studies in this thesis added to this knowledge by clearly demonstrating that these proteins have multiple modes of action.

My thesis concerns spectroscopic studies (NMR, CD and fluorescence) of peptides with functions in biotechnology and biology, and their interactions with a model membrane (large unilamellar phospholipid vesicles). The resorufin-based arsenical hairpin binder (ReAsH) bound to a short peptide is a useful fluorescent tag for genetic labeling of proteins in living cells. A hairpin structure with some resemblance to type II β-turn was determined by NMR structure calculations (Paper I). Cell-penetrating peptides (CPPs) are short (30-35 residues), often rich in basic amino acids such as Arg. They can pass through the cell membrane and deliver bioactive cargoes, making them useful for biotechnical and pharmacological applications. The mechanisms of cellular uptake and membrane translocation are under debate. Understanding the mechanistic aspects of CPPs is the major focus of Papers II, III, and IV. The effect of the pyrenebutyrate (PB) on the cellular uptake, membrane translocation and perturbation of several CPPs from different subgroups was investigated (Paper II). We concluded that both charge and hydrophobicity of the CPP affect the cellular uptake and membrane translocation efficiency. Endosomal escape is a crucial challenge for the CPP applications. We modeled the endosome and endosomal escape for different CPPs to investigate the corresponding molecular mechanisms (Papers III and IV). Hydrophobic CPPs were able to translocate across the model membrane in the presence of a pH gradient, produced by bacteriorhodopsin proton pumping, whereas a smaller effect was observed for hydrophilic CPPs. Dynorphin A (Dyn A) peptide mutations are associated with neurodegenerative disorders, without involvement of the opioid receptors. The non-opioid activities of Dyn A may involve membrane perturbations. Model membrane-perturbations by three Dyn A mutants were investigated (Paper V). The results showed effects to different degrees largely in accordance with their neurotoxic effects. / <p>At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 4: Manuscript.</p>

Die Rasterionenleitfähigkeitsmikroskopie (scanning ion conductance microscopy, SICM) stellt eine kontaktfreie Methode zur Ermittlung sowohl der Topographie als auch lokalen Ionenleitfähigkeit einer Oberfläche dar. Besonders vorteilhaft ist die Vermeidung mechanischer Beeinflussung bei der Untersuchung flexibler Strukturen, z.B. Lipiddoppelschichten wie Zellen oder künstlich erzeugter Lipidmembranen. Porenüberspannende Membranen (pore-suspending membranes, PSMs) verbinden als ein Beispiel für Modellsysteme eine hohe Stabilität mit lateraler Mobilität und dem Vorhandensein wässriger Kompartimente ober- und unterhalb der Doppelschicht, wie sie auch in der Natur gefunden werden. Ein wichtiges Forschungsgebiet stellt die Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden, besonders zellpenetrierenden Peptiden (cell penetrating peptides, CPPs), mit Lipiden und anderen Membranbestandteilen dar. Häufig untersuchte Beispiele sind Melittin, Hauptbestandteil des Giftes der Honigbiene Apis mellifera, sowie Penetratin, dritte Helix der Antennapedia Homöodomäne von Drosophila melanogaster. Generalisierte Protokolle zur Herstellung lösungsmittelfreier PSMs werden vorgestellt. Riesige unilamellare Vesikel (giant unilamellar vesicles, GUVs) unterschiedlicher Lipidzusammensetzung wurden hierzu auf porösem Siliziumnitrid (Si3N4), welches mit Cholesterylpolyethylenoxythiol (CPEO3, hydrophob) bzw. Mercaptoethanol (ME, hydrophil) funktionalisiert worden war, gespreitet. Verwendet wurden GUVs aus reinen Phosphatidylcholin (PC)-Lipiden sowie aus Mischungen von PC-Lipiden mit Cholesterol und PC-Lipiden mit Phosphatidylserin (PS)-Lipiden. Der Erfolg des Spreitvorgangs wurde durch Abbilden mittels konfokaler Rasterlasermikroskopie (confocal laser scanning microscopy, CLSM) und SICM verifiziert. Der Hauptteil dieser Arbeit behandelte die Entwicklung und Anwendung CLSM- und SICM-basierter CPP-Titrationsassays zur Aufklärung des Einflusses der Substratfunktionalisierung und der Lipidzusammensetzung der Membranen auf die Wechselwirkung zwischen Melittin bzw. Penetratin und den Lipiddoppelschichten. CLSM-Experimente wurden mit Melittin auf allen zur Verfügung stehenden PSMs sowohl auf hydrophob als auch hydrophil funktiona-lisierten Substraten durchgeführt, während Penetratin auf den drei unterschiedlichen PSMs auf hydrophil funktionalisierten Substraten verwendet wurde. Ein Reißen der Membranen wurde im Fall hydrophil funktionalisierter Substrate für beide Peptide im Bereich von 1–3 µM beobachtet. Bei hydrophob funktionalisierten Substraten induzierte eine dreifach geringere Melittinkonzentration die Zerstörung der Membranen. Sowohl auf hydrophob als auch auf hydrophil funktionalisierten Substraten wurde bei einem Cholesterolanteil von 10% eine Erhöhung der zum Reißen notwendigen Melittinkonzentratin erhalten, während bei 20% PS-Anteil eine Verschiebung zu geringeren Konzentrationen evident wurde. SICM-Experimente wurden mit Melittin auf PC/Cholesterol-PSMs auf hydrophob und hydrophil funktionalisierten Substraten und mit reinen PC-PSMs auf hydrophil funktionalisierten Membranen durchgeführt. Es wurden keine signifikanten Konzentrationsunterschiede beobachtet; die gefundenen Konzentrationsbereiche jedoch stimmten mit denen der CLSM-Experimente überein. Darüberhinaus wurde vor dem Reißen der Membranen ein Ansteigen der Porentiefe gefunden, das mit einer erhöhten Membranpermeabilität korrespondiert.

The inflammatory arthritis Ankylosing Spondylitis (AS) is linked to the human leucocyte antigen HLA-B27. HLA-B27 is thought to drive AS because it misfolds during assembly in the endoplasmic reticulum (ER), inducing ER cell stress. Modulating HLA-B27 folding in the ER is therefore a therapeutic target pathway. The recent discovery of polymorphisms in the ER-resident peptidase ERAP1 that can impact on HLA-B27 and AS, makes ERAP1 one such target. Exosomes are small, typically 50-200 nm sized particles, formed in the endosomal recycling pathway, which can be released into the extracellular environment. Exosomes have a wide range of biological activities depending on the cell type of origin, and on the delivered cargo, which can include bio-active proteins, lipids, mRNA and miRNA. There is interest in the use of exosomes as drug delivery agents. Here, exosomes were studied as a delivery agent to modulate ERAP1, as a potential therapeutic tool for the treatment of AS. Exosomes, isolated from cell lines including CEM and Jurkat (T cell lineage), Jesthom (B cell lineage), U937 (monocyte lineage) and the epithelial HeLa cell line, were characterized by nanoparticle tracking analysis, flow cytometry and immunoblotting using markers including CD9, CD63, CD81 and TSG101. Differential expression of these markers in the immune cell lines indicated the complexity of defining exosomes. EVs were then tested using cell penetrating peptides, electroporation, lipid transfection and sonication for their ability to load FITC-siRNA or FITC-antibody as cargo. Significantly, post-loading RNase A or trypsin incubation demonstrated that many techniques do not lead to efficient cargo loading of exosomes. Sonication proved the most effective technique, with up to 30% efficiency. Loading of exosomes with ERAP1-targetted siRNA did not however lead to notable ERAP1 inhibition. The data indicates that external loading of exosomes with cargo remains a significant challenge in developing exosomes as therapeutic tools.

La maurocalcine (MCa) est une toxine de 33 acides aminés initialement issue du venin du scorpionScorpio maurus palmatus, et est considérée comme faisant partie de la famille des CPP(Cell Penetrating Peptides) depuis de nombreuses années déjà. La MCa présente donc un intérêtthérapeutique certain dans le domaine de la délivrance intracellulaire de cargos, et lestravaux exposés ici cherchent à caractériser au mieux les propriétés de pénétration de la moléculenative ainsi que celle de certains de ses variants.Après avoir quantifié l’internalisation de plusieurs variants tronqués (linéaires), j’ai pu mettreen évidence le fait que tous ces analogues testés ont une capacité à être internalisés bien plusélevée que celle des CPP de référence (notamment Tat et la pénétratine). Parmi ces variants,l’analogue MCaUF1−9 présente l’avantage d’un temps de rétention relativement élevé au seindes cellules, ainsi que d’une accumulation légèrement accrue en environnement acide (ce quiadvient lors de la formation tumeurs solides). Ce nouveau CPP possède donc un certain potentielthérapeutique mais l’étude de la MCa native, remarquablement stable in vivo, reste plusque jamais d’actualité. / Maurocalcine (MCa) is a 33-mer toxin originally isolated from the venom of the scorpioScorpio maurus palmatus, and has been considered as a cell-penetrating peptide (CPP) for severalyears. MCa presents a therapeutic interest for the intracellular delivery of cargoes, andthis thesis aims to characterise the cell penetration properties of the native molecule as well assome of its variants’.After quantifying several truncated (linear) variants’ internalisation, I have been able tohighlight the fact that all of those analogs possess a higher internalization ability than those ofstandard CPP (especially Tat and penetratin). Among those variants, the analog MCaUF1−9 hasa relatively high rentention time within cells, as well as a slightly increased accumulation whenin an acidic environment (which occurs during solid tumours formation). This new CPP showsa certain therapeutic potential but the study of nativeMCa, remarkably stable in vivo, remainsa priority.

Les traitements actuels dirigés contre le VIH ne sont que partiellement efficaces en raison de l'apparition de mutations qui confèrent au virus une grande capacité de résistance aux antirétroviraux existants. Un moyen d'améliorer la lutte contre le virus consiste par conséquent à trouver de nouvelles stratégies d'inhibition. Le complexe de reverse transcription est une des principales cibles pour le développement de traitement anti-SIDA, il catalyse une étape obligatoire du cycle de réplication du virus. Cependant, l'ensemble des inhibiteurs de la transcriptase inverse sont limités par l'apparition rapide de souches résistances. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de développer des inhibiteurs ciblant spécifiquement la reverse transcriptase (RT) du VIH-1, basée sur des fragments d'anticorps dérivés des anticorps chaînes lourdes de dromadaire appelés VHHs ou encore Nanobodies. Associé à une stratégie de vectorisation non invasive basée sur l'utilisation de peptides vecteurs pénétrants, les Nanobodies ont été délivré efficacement dans les cellules et par conséquent ils présentent tous une forte activité antivirale de l'ordre du nanomolaire. L'étude du mécanisme d'action du Nanobody leader NbRT20 montre qu'il agit en tant qu'inhibiteur conformationnel. Il interagit avec la forme intermédiaire inactive de la RT et empêche la mobilité du sous-domaine thumb requis pour le positionnement correct de la matrice/amorce sur la RT et inhibant l'incorporation des nucléotides dans la chaîne d'ADN naissante déstabilisant l'enzyme dans une conformation inactive, non processive. Pris ensemble, ces résultats montrent que la plate-forme Nanobody peut être très efficace pour générer des intracorps extrêmement puissants et sélectifs pour neutraliser la RT et la réplication virale.Mots clés : HIV-1, RT, Nanobodies, peptide vecteur pénétrant / The rapid emergence of drug-resistant viruses against all approved HIV clinical drugs together with inaccessible latent virus reservoirs and side effects of currently used compounds have limited the potency of existing anti-HIV-1 therapeutics. Therefore, there is a critical need for new safer drugs, active against resistant viral strains. Reverse transcriptase (RT) plays an essential role in the replication of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and remains a primary target of anti-HIV-1 drugs. To develop specific HIV inhibitors, we have elaborated a new strategy based on short antibody fragments derived from the unique Heavy-chain antibodies present in Camelidae called Nanobodies that targets RT-activation. The immunization of dromedaries with RT has lead to the isolation of a panel of Nanobodies that tightly bind the two subunits of RT and inhibit its DNA-dependent DNA polymerase activity at nanomolar range. From that screen we have elaborated an intrabody (cell penetrating anti-RT Nanobody) NbRT20 that constitutes a potential interesting anti-HIV compound.We demonstrated that NbRT20 inhibits RT polymerase activity and exhibiting a potent antiviral activity with a subnanomolar IC50. NbRT20 binds the thumb subdomain and restricts its flexibility and mobility resulting in an inactive/non processive dimeric conformation of the enzyme. From a mechanistic point of view, we have showed that NbRT20 is a conformational inhibitor. it prevents proper binding of primer/template and of dNTP and destabilizes the enzyme in an inactive/non processive dimeric conformation.Taken together, these results demonstrated that, the Nanobody platform may be highly effective at generating extremely potent and selective intrabody to neutralize RT and HIV proliferation.Key words: HIV-1, RT, Nanobodies, cell penetrating peptide

Les « cell penetrating peptides » (CPPs) sont des vecteurs peptidiques capables de délivrer diverses molécules (acides nucléiques, protéines, peptides, petites molécules, etc.) à l'intérieur des cellules de mammifères. Notre laboratoire a élaboré le vecteur amphipatique secondaire CADY capable de transporter, indépendamment de toute voie d'endocytose, des molécules thérapeutiques telles que les petits ARN interférents (siRNA). En effet, leur potentiel thérapeutique réside dans leur capacité à inhiber de manière spécifique l'expression de protéines dérégulées dans un cadre pathologique.Le sujet de ma thèse s'est centré sur la caractérisation et l'optimisation des complexes CADY/siRNA. Au cours de mes travaux, nous avons pu mettre en évidence que CADY adoptait une structure en hélice alpha en présence du siRNA ce qui conduit à la formation des nanoparticules. Notre étude a eu pour but d'optimiser la séquence de CADY et de contrôler sa formulation pour permettre le transfert de notre système de vectorisation d'une application in cellulo à une application in vivo. En premier lieu, nous avons mené une étude de relations structure-activité avec six peptides analogues de CADY, en réalisant des mutations sur les résidus tryptophanes (PSF1, PSF2, PSF3 et PSW) et sur la zone initiatrice de l'hélice alpha (PG9, PG16). L'analyse approfondie de ces analogues a permis de confirmer que la limitation du caractère amphipathique et du polymorphisme structural des vecteurs conduisaient à une réduction de l'efficacité d'internalisation. Parmi les 6 analogues, seules les nanoparticules à base de PG9 et PG16 présentent des résultats in cellulo comparables à ceux obtenus avec les nanoparticules CADY/siRNA. A ce jour, la séquence primaire de CADY étant la plus adaptée pour la transfection de siRNA, nous avons établi une procédure de formulation standardisée permettant un autoassemblage CADY/siRNA reproductible et homogène, dont la taille moyenne est de 106 ± 31 nm et l'indice de polydispersité de 0,357 ± 0,053. De plus, nous avons mis en place une procédure d'extrusion/lyophilisation afin de stocker les nanoparticules sous forme de poudre. Celle-ci peut être resuspendue en milieu aqueux sans modifications des propriétés colloïdales des nanoparticules ni de leur capacité de transfection.Dans le but d'améliorer la spécificité tissulaire et la biodisponibilité des nanoparticules CADY/siRNA pour une application in vivo, nous avons greffé des motifs de ciblage (YIGSR-S) et de furtivité (PEG) sur la séquence de CADY. L'ajout de ces deux entités, de natures très différentes, ne modifie que faiblement les caractéristiques physico-chimiques (ex. taille moyenne des complexes) et biologiques (transfection cellulaire) des nanoparticules. Ces résultats sont très encourageants pour le développement de nanoparticules dites de 3ème génération, sur lesquelles on peut greffer plusieurs sortes de molécules d'intérêts (ciblage, polymère, agent de contraste etc.).L'ensemble des résultats obtenus au cours de ma thèse marque un réel progrès dans l'optimisation de la formulation du vecteur CADY, et nous incitent à exploiter davantage son potentiel pour le transfert de siRNA in vivo. / Cell penetrating peptides (CPPs) are short peptides that can enter many cell types and transduce into cells a wide range of molecular therapeutics (nucleic acid, proteins, peptides, small molecules, etc.). Our laboratory has developed the secondary amphipathic peptide CADY able to promote the transport of small interfering RNA (siRNA) independently of all endocytotic pathways. Indeed, siRNA therapeutic interest lies on its ability to inhibit specifically deregulated proteins in the context of pathology. The subject of my thesis focused on the characterization and optimization of CADY/siRNA complexes. During my work, we have been able to show that CADY adopts a helical structure while interacting with the siRNA leading to the formation of nanoparticles. The goal of my study was to optimize CADY sequence and control its formulation to consider the transferring from an in cellulo to an in vivo application of our vectorization system. First, we conducted a structure-activity study with six analogues by mutating CADY on tryptophane residues (PSF1, 2, 3 and PSW) and in the area initializing helical structure (PG9, PG16). A thorough analysis of these analogues has confirmed that the limitation of the amphipathic character and structural polymorphism is directly related to the reduction of internalization efficiency of our CPPs. Among the six analogues, only PG16/siRNA and PG9/siRNA nanoparticles show in cellulo results equal to those obtained with CADY/siRNA. Based on the fact, that CADY is the most suitable vector for the transfection of therapeutic molecules such as siRNA, we have established a standard formulation procedure to obtain reproducible and homogeneous CADY/siRNA complexes with an average size of 106 ± 31 nm and a polydispersity index of 0.357 ± 0.053. In addition, we have implemented an extrusion/lyophilization step to allow nanoparticle storage as powder, which can be re-suspended in an aqueous solution without losing their colloidal and transfection properties.In order to improve tissue specificity and bioavailability of CADY/siRNA nanoparticles for an in vivo application, we have grafted ether a targeting sequence (YIGSR-S) or a stealth motif (PEG) to the CADY sequence. These two entities of very different nature provoke only few changes in the physicochemical (e.g. average size) and biological (cell transfection) characteristics of the nanoparticles formed with a siRNA. These results are very encouraging for the development of the so-called 3rd nanoparticle generation which includes several kinds of molecules (targeting, polymer, contrast agent etc.).These outcomes mark the real progress in CADY formulation optimization, and encourage us to further exploit its potential for the in vivo transfer of siRNA.