O fungo filamentoso Trichoderma reesei é uma espécie de grande importância biotecnológica no que tange a degradação de biomassa lignocelulósica para a produção de bioetanol em larga escala. Seu sistema de enzimas celulolíticas é muito eficiente, apesar de ser possuir poucas celulases, sugerindo que o controle dessas enzimas vai além da regulação transcricional. Assim, neste trabalho nós obtivemos o perfil fosfoproteômico de T. reesei cultivado em glicose e bagaço de cana-de-açúcar a partir de análise fosfoproteômica LC-MS/MS por spectral counting. A comparação entre os perfis de fosfoproteínas obtidos das linhagens parental QM6a de T. reesei e dos mutantes knockout para TMK1 e TMK2 permitiu a demonstração de que essas MAPK agem de maneira interconectada com outras vias de transdução de sinal na célula, especialmente a via de TOR e de AMPc-PKA, para regulação da produção de celulases. Além disso, também demonstramos a regulação da resposta a estresse celular por TMK2, e o papel da fosforilação no controle direto de enzimas CAZy. Nossos resultados mostram que a fosforilação desempenha papel importante na regulação dessas enzimas e de outras funções celulares no fungo após a transcrição de seus respectivos genes. O agrupamento desses dados permite melhor entendimento da via de sinalização mediada pelas MAPK TMK1 e TMK2 de T. reesei, e como as modificações pós-traducionais promovidas por elas afetam no sensing de nutrientes celulares e, por consequência, na produção de enzimas celulolíticas, de forma direta ou indireta. / The filamentous fungus Trichoderma reesei has great biotechnological importance in regards to the lignocellulosic biomass degradation for large-scale production of bioethanol. Its cellulolytic system is very efficient, despite being composed by only a few cellulases, which suggests that the control of these enzymes goes beyond their transcriptional regulation. Thus, in this study, we performed a spectral counting LC-MS/MS analysis and achieved the phosphoproteomic profile of T. reesei grown either in glucose or sugarcane bagasse as sole carbon source. The comparison between the phosphoproteins profiles obtained from the parental strain QM6a and the knockout mutants for TMK1 and TMK2 allowed us to demonstrate that these MAPK act in an interconnected manner with other signaling transduction pathways, especially the TOR and cAMP-PKA pathways, in order to regulate the cellulases production. Furthermore, we were also able to determine the regulation of cellular stress response by TMK2, and the role of phosphorylation in the direct control of CAZymes. Our results show that phosphorylation plays an important role on the control of these enzymes and other cellular functions in T. reesei after the transcription of their respective genes. Taken together, this data allows better comprehension of the signaling pathways mediated by TMK1 and TMK2 in T. reesei, and how the post-translational modification promoted by these MAPK might affect the nutrient sensing and, therefore, the production of the cellulolytic enzymes, either directly or indirectly.

Na produção de suco de uva, a adição de preparados enzimáticos durante a maceração, antes da prensagem, é um pré-requisito para a obtenção de rendimentos satisfatórios de suco, além de melhorar a qualidade organoléptica, promovendo uma maior extração de cor e compostos bioativos. Uma segunda aplicação enzimática pode ser realizada após o processo de prensagem no suco ainda turvo, buscando reduzir essa turbidez, o que facilitará os processos de clarificação e filtração posteriores, aumentando a produtividade dessas etapas. Porém, existe um grande número de enzimas comerciais disponíveis para a aplicação na indústria de sucos, sendo assim, é importante avaliar o potencial de cada preparado enzimático para uma utilização correta. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da composição dos diferentes preparados enzimáticos na extração, qualidade e compostos bioativos do suco de uva elaborado com a variedade Concord. Primeiramente, o efeito de oito diferentes preparados enzimáticos foi avaliado para extração e qualidade do suco de uva. Subsequentemente, os dois preparados enzimáticos que se destacaram (Pectinex® Ultra Clear e Lallzyme® Beta), foram utilizados de forma sinérgica em um planejamento experimental, buscando encontrar a condição ótima de tempo, temperatura, concentração de enzima e proporção de Pectinex® Ultra Clear/Lallzyme® Beta, que pudesse maximizar a extração do suco de uva. E, por fim, foram obtidos agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs), como forma de imobilização das diferentes enzimas encontradas nos preparados enzimáticos para a clarificação do suco de uva. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biocatálise e Tecnologia Enzimática do ICTA/UFRGS. As uvas utilizadas nos experimentos foram da variedade Concord fornecida pela empresa Vitivinícola Jolimont, de Canela, RS. As preparações enzimáticas utilizadas foram caracterizadas em relação a cinco atividades enzimáticas, sendo elas, pectinase total (PE), poligalacturonase (PG), pectina liase (PL), pectina metil esterase (PME) e celulase (CE). Desta mesma forma, os combi-CLEAs foram caracterizados em relação as suas atividades enzimáticas, além disso, sua estabilidade, reutilização e pH e temperatura ótima foram avaliados. Os compostos bioativos foram identificados e quantificados por HPLC-DAD-MS (cromatografia líquida de alta eficiência - detector de arranjo de diodos - espectro de massa) e a atividade antioxidante foi avaliada através dos métodos de ABTS e de capacidade redutora. Rendimentos superiores de suco foram obtidos com os preparados que apresentaram altas concentrações de PG e PME ou PL. Quando, o preparado Pectinex® Ultra Clear (PUC) foi utilizado, observou-se um aumento de 8,7% na quantidade de suco extraído em comparação com o controle. Já os maiores valores de compostos bioativos foram encontrados com os preparados que apresentaram em sua composição uma maior atividade CE (Lallzyme® Beta, LB). Entretanto, quando PUC e LB foram adicionados em conjunto, maiores valores de rendimento e compostos bioativos foram encontrados. Já os combi-CLEAs, se mostraram como uma ótima forma de enzima imobilizada para a clarificação do suco de uva. Dentre os combi-CLEAs produzidos, destacaram-se o combi-CLEA-BSA devido à melhor atividade enzimática e maior estabilidade térmica (3 vezes mais que a enzima solúvel), podendo ser reutilizados por 6 ciclos com conversão total do substrato em produto. Além disso, o combi-CLEA-BSA melhorou a clarificação do suco, obtendo uma redução da turbidez de 56.7 % em 1 h. Por fim, pode-se afirmar que o trabalho atingiu melhorias produtivas e qualitativas ao suco de uva através da tecnologia enzimática. / In grape juice production, the addition of enzyme preparations during the maceration prior to pressing is a prerequisite for obtaining satisfactory juice yield, besides it improves the organoleptic quality, improving color and bioactive compounds extraction. A second enzyme application may be performed after the pressing process in cloudy juice, in order to reduce this turbidity, facilitating clarification and filtration processes. However, there are a great number of commercial enzymes available to the application on the fruit juice industry, so it is important to know the ability of each enzyme preparation for correct use. Thus, the aim of this study was to evaluate the influence of the composition of the different enzymatic preparations in the extraction, quality and bioactive compounds of grape juice from Concord variety. Firstly, the effect of eight different enzyme preparations was evaluated for extraction and quality of grape juice. Subsequently, the best enzyme preparations (Pectinex® Ultra Clear and Lallzyme® Beta) were used in an experimental design to find the optimal time, temperature, enzyme concentration and ratio of Pectinex® Ultra Clear/Lallzyme® Beta which could maximize the extraction of grape juice. Finally, cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) were obtained as a way to immobilize the different enzymes found in the enzyme preparations for grape juice clarification. The experiments were performed at the Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Technology, ICTA/UFRGS. The grapes (Concord variety) were provided by Vitivinícola Jolimont, Canela, RS. The enzymatic preparations were characterized through of five enzymatic activities, being total pectinase (PE), polygalacturonase (PG), pectinlyase (PL), pectin methyl esterase (PME) and cellulase (CE). In the same way, the combi-CLEAs were characterized regarding their enzymatic activities, thermal, pH and operational stabilities, and optimal pH and temperature. The bioactive compounds were identified and quantified by HPLC-DAD-MS (High Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detector – Mass Spectrum) and the antioxidant activity was performed by the method of ABTS and reducing capacity. High juice yield was obtained with the preparations that presented higher concentrations of PG, PME or PL activities. The Pectinex® Ultra Clear, when compared with the control, provided an increase of 8.7 % in the amount of juice extracted. On the other hand, the highest values of bioactive compounds were found for preparations with higher CE activity (Lallzyme® Beta). However, when PUC and LB were added together, higher values for yield and bioactive compounds were found. Already, regarding the combi-CLEAs, it appears to be a potential immobilized enzyme for clarification of grape juice. Among the combi-CLEAs obtained, combi-CLEAs-BSA presented the best enzyme activities, higher thermal stabilities (3 times more than the soluble enzyme) and it can be reused for 6 cycles with a total conversion of substrate to product. Furthermore, the combi-CLEA-BSA improved the juice clarification, obtaining 56.7 % in turbidity reduction in 1 h. Finally, it can be concluded that the work reached productive and qualitative improvements for grape juice through enzymatic technology.

O objetivo deste trabalho foi avaliar se as enzimas secretadas pelo fungo de decomposição parda Gloeophyllum trabeum podem atuar como auxiliares às celulases comerciais na hidrólise de substratos celulósicos oxidados. Para isto foi realizada a oxidação de celulose microcristalina Avicel mediante reação de Fenton (Fe+2, H2O2) e tratamento com CuSO4. O substrato oxidado foi caracterizado e posteriormente foi determinado o efeito desta modificação sobre a eficiência hidrolítica de enzimas comerciais (Celluclast/Novozym) e sobre misturas destas enzimas comerciais suplementadas com extrato enzimático obtido de G. trabeum. As reações realizadas com Avicel indicaram que ambos tratamentos químicos foram efetivos para modificar grupos funcionais presentes na celulose. A caracterização fisicoquímica dos substratos oxidados permitiu concluir que o tratamento Fenton gerou transformações mais intensas na celulose do que o tratamento com CuSO4. O análise dos hidrolisados ácidos das amostras oxidadas por Fenton mediante espectrometria de massas (GC-MS) confirmou que a oxidação ocorre principalmente no C1. As hidrólises enzimáticas utilizando preparações com diferentes cargas das enzimas comerciais apresentaram uma diminuição significativa da conversão de celulose quando as amostras são tratadas com o reagente Fenton. Por outro lado, a celulose oxidada gerada pelo tratamento com CuSO4 ainda é eficientemente hidrolisada pelas enzimas. As duas amostras de celulose Avicel oxidadas também foi hidrolisada utilizando misturas de enzimas comerciais e extratos enzimáticos de G. trabeum. Em todas as condições ensaiadas a suplementação da mistura reacional com extratos enzimáticos do fungo de decomposição parda G. trabeum diminuíram a eficiência de hidrólise enzimática da celulose oxidada. O emprego do dobro de carga enzimática de enzimas comerciais permitiu recuperar os níveis de hidrólise observados na celulose in natura. / The goal of this work was to evaluate whether enzymes produced by the brown-rot fungus Gleophyllum trabeum would be able to act as auxiliary enzymes of commercial cellulases during the enzymatic hydrolysis of oxidized cellulose. To reach this goal an oxidation of microcrystalline-cellulose (Avicel) was performed by two differente reaction systems: Fenton reaction (Fe2+, H2O2) or CuSO4 treatments. The oxidized subtracts were characterized and the effect of cellulose modification on the hydrolytic efficiency of commercial enzymes, supplemented or not with the enzymes recovered from a G. trabeum culture, was determined. The Avicel treatment by the oxidative systems resulted in cellulose structural changes as evidenced by infrared spectroscopy, viscosity measurements and chemical characterization by HPLC and GC/MS chromatography of the monomers recovered after acid hydrolysis. The physicochemical characterization of the oxidized celluloses allowed to conclude that the transformation of the cellulose was more intense when Fenton treatment was used as compared with the CuSO4 treatment. The analysis of the acid hydrolysates by GC-MS indicated that the oxidation by Fenton reaction occurred mainly at the C1 of the cellulose chain, resulting in gluconic acid in the acid hydrolysates. A meaningful decrease of the cellulose conversion was observed when Fetnon-treated samples were submitted to enzymatic hydrolysis using different amounts of commercial enzymes. On the other hand, the CuSO4-oxidized cellulose was still efficiently hydrolyzed by high enzyme dosages. The oxidized Avicel substrates were also hydrolyzed using a mixture of the commercial enzymes with enzymes recovered from G. trabeum cultures. At all tested conditions, the supplementation of the reaction mixture with enzymatic extracts from G. trabeum decreased the enzymatic hydrolysis efficiency. Nevertheless, the normal levels of enzymatic hydrolysis were recovered when the commercial enzymes dosage two-fold increased.

Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 Å, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 Å, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 °C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 °C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 °C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 °C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de α-hélice e 42% de folhas- β. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and β-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both β-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 Å, and Rg of 20 and 27 Å, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 °C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 °C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 °C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 °C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de α-helices and 42% de β-sheet.

Made available in DSpace on 2017-07-10T14:38:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAcaoO-MESTRADO-SANDRA-VERSaO-FINAL.pdf: 1113857 bytes, checksum: e8421d0365b2d79f28487d63317ac109 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The production of xylanolitic enzymes have been widely explored in the past few years by several species of filamentous fungi. The objective of this study was to evaluate the production of xylanases by Penicillium brefeldianum an isolated filamentous fungus of Parana Atlantic Forest using brewers spent grain and evaluate its potential in the agro-waste saccharification. The enzyme extract was obtained from liquid culture using 1% (w / v) brewers spent grain in modified under stationary conditions at 28 ° for 9 days. The fungus had large capacity in the production of xylanase (830 U mL-1), pectinase (295 U mL-1), β-xylosidase (3,46 U mL-1), FPase (0,60 U mL-1), avicelase (13, 71 U ml-1), cellulase (1.89 U mL-1) and β -glycosidase (29,45 U mL-1). The optimum pH of 4.5 was found for xylanase and stability in 98% range of 2.5 to 8.0 for 96 hours. The optimum temperature was 55 °C with a half life of 90 minutes. The zymogram of the crude extract of P. brefeldianum exhibited three bands of xylanase activity with molecular masses of 60 and 97kDa. P. brefeldianum crude enzymatic extract was used for saccharification of various waste (sugarcane bagasse, brewers spent grain, rice straw, corn stover, wheat straw, sorghum biomass and sorghum low-lignin) untreated and previously treated with NaOH 30°C for 12h (NaOH30) and at 121°C for 30 minutes (NaOH121). The best results were obtained with waste treated under high pressure and temperature (121°C). Among waste, wheat straw showed higher amount of total sugar (63%) released after the enzymatic hydrolysis, followed brewers spent grain (60%), corn straw (58%), sorghum biomass (54%) and sorghum low-lignin (35%). The pentose released after saccharification showed that sorghum low-lignin treated at high temperature and pressure was the best substrate releasing 7,35 times more pentose compared to sorghum low-lignin untreated, followed by straw rice (5,52x) and sorghum biomass (4,39x). Thus, the filamentous fungus P. brefeldianum isolated from the West of Paraná Atlantic Forest was able to use the brewers spent grain as inductor of various degrading enzymes the cell wall, and furthermore, showed potential for saccharification of lignocellulosic biomass from agro-waste. / A produção de enzimas xilanolíticas tem sido amplamente explorada nos últimos anos por diversas espécies de fungos filamentosos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de xilanases por Penicillium brefeldianum, um fungo filamentoso isolado da Mata Atlântica do Paraná, utilizando bagaço de cervejaria para avaliar seu potencial na sacarificação de resíduos agroindustriais. O extrato enzimático foi obtido a partir de cultivo líquido contendo 1% de bagaço de cervejaria (p/v) e cultivado em condições estacionárias a 28° por 9 dias. O fungo apresentou versatilidade em produzir diversas enzimas tais como: xilanase (830 U mL-1), pectinase (295 U mL-1), β -glicosidase (29,45 U mL-1), avicelase (13,71 U mL-1) β-xilosidase (3,46 U mL-1), celulase (1,89 U mL-1) e Fpase (0,60 U mL-1). A xilanase produzida por esse fungo apresentou pH ótimo de atividade enzimática de 4,5 e estabilidade de 98% na faixa de pH 2,5 a 8,0 por até 96 horas. A temperatura ótima de atividade da xilanase foi 55°C com meia vida de 90 minutos. No processo de sacarificação enzimática de resíduos (bagaço de cana, bagaço de cervejaria, palha de arroz, palha de milho, palha de trigo, sorgo biomassa) com extrato bruto de P. brefeldianum foi obtido que o bagaço de cervejaria apresentou melhor resultado sem qualquer tipo de pré-tratamento, exibindo 35% de sacarificação. Porém, o pré-tratamento dos resíduos com NaOH 1% a 30°C por 12 horas ou a 121°C e pressão de 1 atm por 30 minutos resultaram em melhores rendimentos de açúcares redutores totais. E dentre os resíduos sacarificados, o bagaço de cervejaria (60%) liberou maior quantidade de açucares totais, seguido de palha de trigo (58,73%), palha de milho (58%) sorgo biomassa (54%) e sorgo com baixa lignina (35%). Entretanto, as pentoses produzidas após sacarificação mostraram que o tratado com NaOH (121ºC e pressão de 1 atm) apresentou 7,35 vezes mais pentoses quando comparado ao in natura, seguido de casca de arroz (5,52 vezes) e sorgo biomassa (4,39 vezes). Dessa forma, o fungo filamentoso P. brefeldianum isolado da Mata Atlântica do Oeste do Paraná foi capaz de utilizar o bagaço de cervejaria como indutor de hemicelulases, celulases e pectinases, além disso, exibiu potencial de sacarificação de resíduos agroindustriais para produção de açucares redutores.

O presente trabalho teve como principal objetivo correlacionar a composição química do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com H2SO4 diluído com a eficiência da sacarificação enzimática da celulose presente no material. Primeiramente, o bagaço in natura foi extraído com água, etanol ou água seguida de etanol, e as composições químicas determinadas. Posteriormente, o bagaço in natura foi pré-tratado com H2SO4 diluído em êmbolos de 200 mL, utilizando 15% de teor de sólidos (m/v). A temperatura (112,5-157,5 °C), o tempo de residência (5-35 min) e a concentração ácida (0-3,0% m/v) variaram de acordo com um planejamento fatorial 23 completo. Após o pré-tratamento, as amostras foram caracterizadas quimicamente. Em seguida, dois extratos enzimáticos comerciais foram caracterizados quanto às atividades de enzimas hidrolíticas e fenoloxidases, e aos teores de proteínas. As condições adequadas de sacarificação enzimática da celulose para a amostra de bagaço pré-tratada com H2SO4 diluído (15% sólidos, 2% ácido, a 150ºC por 30 min) foram determinadas através de planejamentos fatoriais 23 completos, variando teor de sólidos (1,19-4,81% m/v), carga enzimática (1,91-38,09 FPU/g de bagaço) e carga de surfactante (0-0,1 g/g de bagaço), para os dois extratos enzimáticos. As amostras de bagaço pré-tratadas sob diferentes condições de temperatura, tempo de residência e concentração de H2SO4 (primeiro planejamento fatorial) foram submetidas à sacarificação enzimática com um dos extratos. Por fim, amostras selecionadas foram caracterizadas quanto às alterações morfológicas provocadas pelo pré-tratamento e pela hidrólise enzimática, por microscopia eletrônica de varredura. Os resultados mostraram que água seguida de etanol extraiu maior quantidade de extrativos do bagaço. Os extrativos apresentaram absorção de luz apenas na região do ultravioleta. A porcentagem de lignina nos bagaços extraídos com água, etanol e água seguida de etanol foi menor que aquela encontrada no bagaço in natura. De acordo com a condição de pré-tratamento, os teores de celulose, hemicelulose e lignina nos bagaços pré-tratados diferiram substancialmente. A maior variação foi observada para hemicelulose (3,67-27,27%). Os três fatores avaliados no pré-tratamento influenciaram na composição química do bagaço pré-tratado. Por sua vez, os dois extratos enzimáticos apresentaram um complexo celulolítico completo e considerável atividade de xilanases, porém não foi observada atividade de fenoloxidases. O extrato II apresentou maior quantidade de proteínas (152,45±10,0 mg/mL), comparado ao extrato I (105,2±6,6 mg/mL). Para 24 horas de hidrólise enzimática com o extrato I, as três variáveis independentes influenciaram na digestão do bagaço pré-tratado. Somente os efeitos das cargas de enzima e surfactante foram significantes, utilizando o extrato II. Posteriormente, foi possível aumentar o teor inicial de sólidos sem comprometer o rendimento de sacarificação com o extrato II. Não foi possível correlacionar a conversão de celulose com o fator de severidade do pré-tratamento. Por outro lado, foi observada correlação negativa entre o conteúdo de hemicelulose e a conversão enzimática de celulose, enfatizando a influência da composição química do bagaço de cana na hidrólise enzimática da celulose. Observaram-se diferenças morfológicas entre o bagaço in natura e amostras pré-tratadas sob condições branda e severa, bem como após suas respectivas hidrólises enzimáticas. / This study aimed to correlate the chemical composition of a sugarcane bagasse pretreated with dilute H2SO4 with the efficiency of cellulose enzymatic saccharification of this material. First, the sugarcane bagasse was extracted with water, ethanol or water followed by ethanol, and its chemical composition was determined. Subsequently, the sugarcane bagasse was pretreated with dilute H2SO4 in 200 mL stainless steel containers, using 15% of solids loading (w/v). The temperature (112.5-157.5°C), time of residence (5-35 min) and acid concentration (0-3.0% w/v) varied according to a 23 full factorial design. After the pretreatments, the chemical compositions of the pretreated bagasses were determined. Then, two commercial enzymatic extracts were characterized regarding the activities of hydrolytic enzymes and phenoloxidases, and protein contents. The enzymatic saccharification conditions for the bagasse sample pretreated with dilute H2SO4 (15% solids, 2% acid, 150°C for 30 min) were determined through 23 full factorial designs, varying the solids loading (1,19-4.81% w/v), enzyme loading (1.91-38.09 FPU/g of bagasse) and surfactant loading (0-0.1 g/g of bagasse) for the two enzymatic extracts. The bagasse samples pretreated under the different conditions of temperature, time of residence and H2SO4 concentration (first factorial design) were subjected to enzymatic saccharification using one of the extracts. Finally, selected samples were analyzed for morphological changes caused by pretreatment and enzymatic hydrolysis, by scanning electron microscopy. The results showed that water followed by ethanol extracted the highest amount of extractives. The extractives showed light absorption only in the ultraviolet region. The percentage of lignin in the bagasse samples extracted with water, ethanol and water followed by ethanol was lower than that found in the raw material. According to the pretreatment conditions, the amount of cellulose, hemicellulose and lignin in the pretreated bagasse differed substantially. The greatest variation was observed for the hemicellulose content (3.67-27.27%). All the three factors evaluated in the pretreatment affected the chemical composition of the pretreated bagasse. In turn, the two enzymatic extracts showed complete cellulolytic complexes and considerable activities of xylanases, without activities of phenoloxidases. The extract II showed higher protein content (152.45±10.0 mg/mL) when compared with the extract I (105.2±6.6 mg/mL). For 24 hours of enzymatic hydrolysis using the extract I, all the three independent variables influenced the saccharification of pretreated bagasse. Only the enzyme and surfactant loadings were significant, when using the extract II. Later, it was possible to increase the initial solids content without hindering the saccharification yield, using the extract II. It was not possible to correlate the cellulose conversion with the pretreatment severity. On other hand, it was possible to observe a negative correlation between the hemicellulose content and the efficiency of enzymatic conversion, emphasizing the influence of the sugarcane bagasse chemical composition in the enzymatic hydrolysis of cellulose. Morphological differences were observed between the raw material and sugarcane bagasse samples pretreated under high or low severity, as well as after their corresponding enzymatic hydrolysis.

Bioethanol from lignocellulose is expected to be the most likely fuel alternative in the near future. SEKAB E-Technology in Örnsköldsvik, Sweden develops the technology of the 2nd generation ethanol production; to produce ethanol from lignocellulosic raw material. The objective of this master’s thesis was to achieve a better knowledge of the potential and limitations of separate hydrolysis and fermentation (SHF) as a process concept for the 2nd generation ethanol production. The effects of enzyme concentration, temperature and pH on the glucose concentration in the enzymatic hydrolysis were investigated for pretreated spruce at 10% DM using a multiple factor design. Enzyme concentration and temperature showed significant effects on the glucose concentration, while pH had no significant effect on the concentration in the tested interval of pH 4.5-5.5. To obtain the maximum glucose concentration (46.4 g/l) for a residence time of 48 h, the optimal settings within the studied parameter window are a temperature of 45.7⁰C and enzyme concentration of 15 FPU/g substrate. However, a higher enzyme concentration would probably further increase the glucose concentration. If enzymatic hydrolysis should be performed for very short residence times, e.g. 6 h, the temperature should be 48.1⁰C to obtain maximum glucose concentration. The efficiency of the enzymes was inhibited when additional glucose was supplied to the slurry prior to enzymatic hydrolysis. It could be concluded that end product inhibition by glucose occurs and results in a distinct decrease in glucose conversion. No clear conclusions could be drawn according to different techniques for slurry and enzymes, i.e. batch and fed-batch, in the enzymatic hydrolysis process. Investigations of the fermentability of the hydrolysate revealed that the fermentation step in SHF is problematic. Inhibition of the yeast decrease the fermentation efficiency and it is therefore difficult to achieve the 4% ethanol limit. Residence time for enzymatic hydrolysis (48 h) and fermentation (24 h) need to be prolonged to achieve a sufficient SHF process. However, short processing times are a key parameter to an economically viable industrial process and to prolong the residence times should therefore not be seen as a desirable alternative. SHF as a process alternative in an industrial bioethanol plant has both potential and limitations. The main advantage is the possibility to separately optimize the process steps, especially to be able to run the enzymatic hydrolysis at an optimal temperature. Although, it is important to include all the process steps in the optimization work. The fermentation difficulties together with the end product inhibition are two limitations of the SHF process that have to be improved before SHF is a preferable alternative in a large scale bioethanol plant.

There is an increasing trend in the world for using renewable sources of fuels and chemicals due to the continuous depletion of fossil fuel reserves besides the environmental issues related with the exploitation of these resources. Lignocellulosic biomass is seen as the most promising candidate to be used instead of fossil sources because of its availability, relatively low price and less competition with food and feed crops. In this study, corn cobs, a lignocellulosic agricultural waste, were subjected to alkaline pretreatment for the co-production of glucose and hemicellulose based films with a multi-product approach in order to diversify the product range and to increase the revenues of the process. The pretreatment applied to lignocellulosic agricultural waste has a significant impact on the quantities and properties of the products that can be produced from the lignocellulosic feedstock upon pretreatment. Within the context of this study, the parameters utilized during the alkaline pretreatment of corn cobs were investigated in terms of their effect on the amount of glucose obtained through the enzymatic v hydrolysis of the cellulosic portion and on the mechanical properties of the films obtained through the solvent casting of the hemicellulosic portion of corn cob. The pretreatment parameters including the alkaline type and concentration, addition and type of boron compound as well as the duration of pretreatment, were optimized with respect to the amounts and the properties of the products. Following the pretreatments conducted with 24 % KOH and 1% NaBH4, which were the initial pretreatment parameters in the study, a glucose yield of 22 % and a tensile energy to break of 2.1 MJ/m3 were obtained. Upon the optimization of the pretreatment procedure, the optimum pretreatment conditions were determined as 5 % NaOH, 1 % NaBH4 and 3 hours and a glucose yield of approximately 31% and a tensile energy to break of around 1.7 MJ/m3 were obtained.

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O desenvolvimento deste projeto envolveu as seguintes etapas: caracteriza??o centesimal dos res?duos agroindustriais; avalia??o do potencial indutor de cada res?duo agroindustrial sobre a produ??o enzim?tica de holocelulases por cada uma das linhagens f?ngicas pesquisadas; otimiza??o da produ??o das hidrolases de interesse com o uso da linhagem f?ngica e do res?duo agroindustrial que se destacaram; caracteriza??o do extrato enzim?tico obtido na condi??o otimizada; e avalia??o da aplica??o do extrato enzim?tico obtido na condi??o otimizada na sacarifica??o de biomassas lignocelul?sicas. Cinco linhagens de fungos filamentosos, Aspergillus niger INCQS:40065, Aspergillus tubingensis AN1257, Fusarium oxysporum INCQS:40144, Penicillium oxalicum INCQS:40103 e Trichoderma reesei CCT2768, e seis res?duos agroindustriais, tortas de caro?o de algod?o, dend?, girassol, maca?ba, mamona e pinh?o manso, usados como fontes de carbono, foram avaliados para a produ??o das enzimas de interesse. Dentre as linhagens testadas, Aspergillus tubingensis AN1257 foi a que se destacou para a produ??o de enzimas celulol?ticas e xilanol?ticas, especialmente quando combinado com a torta de caro?o de algod?o. A otimiza??o de processo conduzida com A. tubingensis e a torta de caro?o de algod?o para a produ??o das atividades de CMCase, FPase, ?-glucosidase e xilanase apontou a raz?o s?lido:l?quido (S/L) de 35%, a fonte de nitrog?nio de 1,30 g de (NH4)2SO4 /100g torta, e o tamanho do in?culo de 1,00 x 107 con?dios/g de torta, como determinantes para a condi??o fermentativa otimizada. Nesta condi??o fermentativa otimizada foram obtidos valores de atividade aproximados de 20 U/g para CMCase, 50U/g para FPase, 300 U/g para ?-glucosidase e 1300 U/g para xilanase, ap?s 8 dias de fermenta??o. Os efeitos combinados da temperatura e do pH sobre as atividades das enzimas holocelulol?ticas produzidas por A. tubingensis AN1257 denotam uma boa aplicabilidade destas enzimas sob temperaturas entre 40 e 60?C, e pH em torno de 4,0 a 5,0. O extrato enzim?tico produzido por A. tubingensis AN1257 na condi??o fermentativa otimizada mostrou-se eficiente na sacarifica??o das pr?prias tortas vegetais usadas inicialmente como fontes de carbono, sobretudo quando aplicado em processo de sacarifica??o e fermenta??o simult?nea da torta de girassol pr?-tratada. Este processo resultou na produ??o de 16 g de etanol por 100g de torta de caro?o de algod?o e um mosto fermentado com a concentra??o de 20g/L de etanol. O conjunto dos resultados obtidos nesta tese aponta como promissor o uso de alguns res?duos agroindustriais e fungos filamentosos selecionados para a produ??o de enzimas holocelulol?ticas com potencial aplica??o para a produ??o de bioetanol de 2? gera??o. Palavras / Programa de P?s-gradua??o em Biocombust?veis, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2015. / The demand for hollocelulolytic enzymes has increased in recent years, driven mainly by the newly established market for 2ndgeneration ethanol. The potential of selected filamentous fungi and derivatives of agro-industrial waste oil, used here as carbon sources for the production of cellulolytic and xylan-degrading enzymes, was evaluated. The development of the project involved the following steps: partial characterization of agro-industrial waste; the inducing potential of each agroindustrial residue on enzyme production by each filamentous fungus strain was investigated; optimization of the production of the hydrolases by the fungal strain and the agro-industrial waste that showed the greatest potential; characterization of the enzyme extract obtained under the optimum conditions; and evaluation of the implementation of the enzymatic extract obtained under the optimum condition for saccharification of lignocellulosic biomass. Five strains of filamentous fungi - Aspergillus niger INCQS: 40065, Aspergillus tubingensis AN1257, Fusarium oxysporum INCQS:40144, Penicillium oxalicum INCQS:40103 and Trichoderma reesei CCT2768 -- and six agro-industrial wastes -- cottonseed, palm, sunflower, maca?ba, castor and jatropha cakes, used as carbon sources -- were assessed for production of the enzymatic activities of interest. Among the strains tested, Aspergillus tubingensis AN1257 was most noteworthy for the production of cellulolytic and xylanase enzymes, especially when combined with cottonseed cake. The optimization conducted with A. tubingensis and cottonseed cake for the production of CMCase, FPase, ?-glucosidase and xylanase activities indicated that the conditions for an optimum fermentation were a solid/liquid (S/L) ratio of 35%, 1.30 g (NH4)2SO4/100 g cake as the source of nitrogen, and an inoculum size of 1.00 x 107 conidia/g of cake. Activity values of approximately 20 U/g for CMCase, 50 U/g for FPase, 300 U/g for ?-glucosidase and 1300 U/g for xylanase were obtained after 8 days of fermentation under optimized fermentation conditions. The combined effects of temperature and pH on the activities of the holocellulolytic enzymes produced by A. tubingensis AN1257 indicated that these enzymes were most efficient at temperatures between 40 and 60 ?C and pH between 4.0 and 5.0. The enzyme extract produced by A. tubingensis under optimized fermentation conditions was efficient in the saccharification of the same vegetable cakes initially used as carbon sources, especially when applied to the simultaneous saccharification and fermentation of pretreated sunflower cake. This process resulted in the production of 16 g of ethanol per 100 g of cottonseed cake and a fermented must with a concentration of 20 g/L of ethanol. Thus, the use of some agro-industrial wastes and selected filamentous fungi for the production of holocelulol?ticas enzymes with potential application for the production of 2nd generation bioethanol was shown to be very promising.

Na produção de suco de uva, a adição de preparados enzimáticos durante a maceração, antes da prensagem, é um pré-requisito para a obtenção de rendimentos satisfatórios de suco, além de melhorar a qualidade organoléptica, promovendo uma maior extração de cor e compostos bioativos. Uma segunda aplicação enzimática pode ser realizada após o processo de prensagem no suco ainda turvo, buscando reduzir essa turbidez, o que facilitará os processos de clarificação e filtração posteriores, aumentando a produtividade dessas etapas. Porém, existe um grande número de enzimas comerciais disponíveis para a aplicação na indústria de sucos, sendo assim, é importante avaliar o potencial de cada preparado enzimático para uma utilização correta. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da composição dos diferentes preparados enzimáticos na extração, qualidade e compostos bioativos do suco de uva elaborado com a variedade Concord. Primeiramente, o efeito de oito diferentes preparados enzimáticos foi avaliado para extração e qualidade do suco de uva. Subsequentemente, os dois preparados enzimáticos que se destacaram (Pectinex® Ultra Clear e Lallzyme® Beta), foram utilizados de forma sinérgica em um planejamento experimental, buscando encontrar a condição ótima de tempo, temperatura, concentração de enzima e proporção de Pectinex® Ultra Clear/Lallzyme® Beta, que pudesse maximizar a extração do suco de uva. E, por fim, foram obtidos agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs), como forma de imobilização das diferentes enzimas encontradas nos preparados enzimáticos para a clarificação do suco de uva. Os experimentos foram realizados no Laboratório de Biocatálise e Tecnologia Enzimática do ICTA/UFRGS. As uvas utilizadas nos experimentos foram da variedade Concord fornecida pela empresa Vitivinícola Jolimont, de Canela, RS. As preparações enzimáticas utilizadas foram caracterizadas em relação a cinco atividades enzimáticas, sendo elas, pectinase total (PE), poligalacturonase (PG), pectina liase (PL), pectina metil esterase (PME) e celulase (CE). Desta mesma forma, os combi-CLEAs foram caracterizados em relação as suas atividades enzimáticas, além disso, sua estabilidade, reutilização e pH e temperatura ótima foram avaliados. Os compostos bioativos foram identificados e quantificados por HPLC-DAD-MS (cromatografia líquida de alta eficiência - detector de arranjo de diodos - espectro de massa) e a atividade antioxidante foi avaliada através dos métodos de ABTS e de capacidade redutora. Rendimentos superiores de suco foram obtidos com os preparados que apresentaram altas concentrações de PG e PME ou PL. Quando, o preparado Pectinex® Ultra Clear (PUC) foi utilizado, observou-se um aumento de 8,7% na quantidade de suco extraído em comparação com o controle. Já os maiores valores de compostos bioativos foram encontrados com os preparados que apresentaram em sua composição uma maior atividade CE (Lallzyme® Beta, LB). Entretanto, quando PUC e LB foram adicionados em conjunto, maiores valores de rendimento e compostos bioativos foram encontrados. Já os combi-CLEAs, se mostraram como uma ótima forma de enzima imobilizada para a clarificação do suco de uva. Dentre os combi-CLEAs produzidos, destacaram-se o combi-CLEA-BSA devido à melhor atividade enzimática e maior estabilidade térmica (3 vezes mais que a enzima solúvel), podendo ser reutilizados por 6 ciclos com conversão total do substrato em produto. Além disso, o combi-CLEA-BSA melhorou a clarificação do suco, obtendo uma redução da turbidez de 56.7 % em 1 h. Por fim, pode-se afirmar que o trabalho atingiu melhorias produtivas e qualitativas ao suco de uva através da tecnologia enzimática. / In grape juice production, the addition of enzyme preparations during the maceration prior to pressing is a prerequisite for obtaining satisfactory juice yield, besides it improves the organoleptic quality, improving color and bioactive compounds extraction. A second enzyme application may be performed after the pressing process in cloudy juice, in order to reduce this turbidity, facilitating clarification and filtration processes. However, there are a great number of commercial enzymes available to the application on the fruit juice industry, so it is important to know the ability of each enzyme preparation for correct use. Thus, the aim of this study was to evaluate the influence of the composition of the different enzymatic preparations in the extraction, quality and bioactive compounds of grape juice from Concord variety. Firstly, the effect of eight different enzyme preparations was evaluated for extraction and quality of grape juice. Subsequently, the best enzyme preparations (Pectinex® Ultra Clear and Lallzyme® Beta) were used in an experimental design to find the optimal time, temperature, enzyme concentration and ratio of Pectinex® Ultra Clear/Lallzyme® Beta which could maximize the extraction of grape juice. Finally, cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) were obtained as a way to immobilize the different enzymes found in the enzyme preparations for grape juice clarification. The experiments were performed at the Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Technology, ICTA/UFRGS. The grapes (Concord variety) were provided by Vitivinícola Jolimont, Canela, RS. The enzymatic preparations were characterized through of five enzymatic activities, being total pectinase (PE), polygalacturonase (PG), pectinlyase (PL), pectin methyl esterase (PME) and cellulase (CE). In the same way, the combi-CLEAs were characterized regarding their enzymatic activities, thermal, pH and operational stabilities, and optimal pH and temperature. The bioactive compounds were identified and quantified by HPLC-DAD-MS (High Performance Liquid Chromatography - Diode Array Detector – Mass Spectrum) and the antioxidant activity was performed by the method of ABTS and reducing capacity. High juice yield was obtained with the preparations that presented higher concentrations of PG, PME or PL activities. The Pectinex® Ultra Clear, when compared with the control, provided an increase of 8.7 % in the amount of juice extracted. On the other hand, the highest values of bioactive compounds were found for preparations with higher CE activity (Lallzyme® Beta). However, when PUC and LB were added together, higher values for yield and bioactive compounds were found. Already, regarding the combi-CLEAs, it appears to be a potential immobilized enzyme for clarification of grape juice. Among the combi-CLEAs obtained, combi-CLEAs-BSA presented the best enzyme activities, higher thermal stabilities (3 times more than the soluble enzyme) and it can be reused for 6 cycles with a total conversion of substrate to product. Furthermore, the combi-CLEA-BSA improved the juice clarification, obtaining 56.7 % in turbidity reduction in 1 h. Finally, it can be concluded that the work reached productive and qualitative improvements for grape juice through enzymatic technology.