L’augmentation de la fréquence des pathologies vasculaires va créer ces prochaines années, des besoins importants en substituts vasculaires de petits calibres. L’idéal, à ce jour, reste l’utilisation de vaisseaux autologues réduisant les risques infectieux et immunologiques mais d’usage limité ce qui est à l’origine de l’ingénierie cellulaire. L’identification des progéniteurs vasculaires est d’un intérêt majeur dans ce domaine. Ces cellules d’origine autologues sont douées d’une grande capacité de prolifération et d’un potentiel de différenciation en cellules vasculaires (cellules endothéliales (CE) et cellules musculaires lisses (CML)) mais la difficulté réside dans le choix du recouvrement de la surface du support de culture qui favorise leur adhésion et prolifération Dans ce travail, nous avons choisi les films multicouches de polyélectrolytes et mesuré leur impact sur le comportement de ces cellules progénitrices en fonction de différentes conditions de culture (normoxie ou hypoxie). Nous avons montré dans un premier temps, que ces films multicouches de polyélectrolytes permettaient d’accélérer la différenciation de ces cellules en CE matures. Nous avons également montré que ces mêmes cellules cultivées en hypoxie étaient capables de se différencier en cellules contractiles stables dans le temps, présentant un phénotype comparable à celui des CML matures. L’association de ces résultats additionnés aux avantages apportés par des feuillets détachables est à la base de la construction d’un substitut vasculaire autologue de petit calibre, composé de CE et de CML issues d’un même pool de cellules, mais cultivées dans des conditions différentes. / The increase of vascular pathologies is going to create these next years, important needs in vascular substitutes of small calibres. The gold standard, this day, remains the use of autologous vessels reducing the infectious and immunological risks, but of limited custom, which is at the origin of tissue engineering. The identification of vascular progenitor cells is of major interest in vascular engineering. These autologous cells present a high capacity of proliferation and a potential of differentiation in vascular cells (endothelial cells (EC) and smooth muscle cells (SMC)) but the difficulty lies in the choice of the coated surface of culture which facilitates their adhesion and proliferation. In this work, we chose polyelectrolytes multilayer films and measured their impact on these vascular progenitor cells in various conditions of culture (normoxia or hypoxia). We showed at first, that these polyelectrolytes multilayer films allowed to accelerate the differentiation of these cells into matures EC. We also showed that these same cells cultivated under hypoxic conditions were able to differentiate into stable and contractile cells, presenting a phenotype comparable to the mature SMC. The association of these results added to the advantages brought by detachable sheet is the basis of the construction of an autologous small calibre vascular substitute consisting of EC and SMC differentiated from the same pool of cells, but cultivated in different conditions.

Les prokinéticines sont des hormones angiogéniques qui exercent leurs fonctions biologiques par l’intermédiaire de deux récepteurs couplés aux protéines G : PKR1 et PKR2. PKR1 a été révélé comme crucial dans l’homéostasie cardiovasculaire. L’objectif de ce projet de thèse était de développer un nouvel agoniste non–peptidique à PKR1 pour la cardioprotection et la régénération cardiaque. Les premiers résultats ont permis de caractériser le premier ligand spécifique à PKR1 : IS20. L’étude in vivo a démontré qu’IS20 est capable de prévenir les lésions après induction d’un infarctus du myocarde chez la souris. Ce composé améliore les fonctions cardiaques en activant la prolifération de cellules progénitrices cardiaques et la néovascularisation (Gasser et al, PlosOne, 2015). Dans une deuxième étude, nous avons évalué le potentiel cardioprotecteur d’IS20 face à la toxicité induite par la doxorubicine (DOX), un anticancéreux de la famille des anthracyclines très efficace mais cardiotoxique. Les résultats montrent qu’IS20 atténue l’apoptose des cardiomyocytes H9c2 et des cellules progénitrices humaines de types EPDC, induite par la doxorubicine, sans affecter la cytotoxicité de la doxorubicine sur les cellules cancéreuses. In vivo, le traitement par IS20 atténue la diminution de la prolifération provoquée par la doxorubicine dans un modèle de cardiotoxicité juvénile. Dans un modèle de cardiotoxicité chronique, IS20 maintient l’intégrité cellulaire et tissulaire des vaisseaux et protège des défaillances produites par DOX. Par ses effets cytoprotecteurs des cardiomyocytes et des cellules progénitrices cardiaques, l’IS20 présente un potentiel thérapeutique prometteur pour protéger les patients cancéreux des effets cardiotoxiques des anthracyclines. / Prokineticins are angiogenic hormones that activate two G protein-coupled receptors (GPCRs): PKR1 and PKR2. PKR1 has emerged as a critical mediator of cardiovascular homeostasis and cardioprotection. The aim of this thesis project was to develop a first non-peptide PKR1 agonist stimulates cardioprotection and cardiac regeneration in mouse model of myocardial infarction (MI) or anti-cancer drug mediated cardiotoxicity. Collaboration with chemist and biomodelization team, we characterized the first selective/specific PKR1 agonist, named IS20. In vivo study demonstrated IS20 prevented cardiac lesion formation and improved cardiac function after myocardial infarction in mice, promoting proliferation of cardiac progenitor cells and neovasculogenesis (Gasser et al., 2015). Since use of a very potent anthracycline chemotherapeutic, Doxorubicin (DOX) is limited by cardiotoxicity, we hypothesized that IS20 could protect heart against DOX-mediated cardiotoxicity. Indeed, IS20 attenuated apoptosis induced by DOX in H9c2 cardiomyocytes and human epicardial progenitors in vitro. However, IS20 did not affect antineoplastic or cytostatic effect of DOX in cancer cell lines. In vivo, in the juvenile model of cardiotoxicity, IS20 significantly attenuated DOX-induced decrease in viability and proliferation cardiac progenitor cells. In the chronic cardiotoxicity model by DOX, IS20 improves heart structure and function by the activation of cardiac progenitor cells, diminishing cardiac cell death, improving vascular stability. IS20 has translational potential for cardioprotection in patients with cancer receiving anthracyclines.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches adultes qui sont à l’origine des cellules des lignages ostéoblastique (O), adipocytaire (A) et chondroblastique (C). Les CSM ont initialement trouvées dans la moelle osseuse mais il en existe également dans d’autres tissus comme le sang de cordon ombilical (SCO). Dotées d’un potentiel régénératif, les CSM peuvent utilisées dans diverses pathologies dégénératives dans un but de réparation tissulaire. En outre, leurs propriétés immunosuppressives ont conduit à envisager leur utilisation dans un but d’immunomodulation comme lors des réactions de greffon contre l’hôte dans les greffes de cellules souches hématopoïétiques (CSH) allo-géniques. Le but essentiel de ce travail a été de comparer les caractéristiques des CSM issues du SCO en comparaison de celles issues de la moelle osseuse (MO). Dans l’optique d’applications en médecine régénérative, nous avons tout d’abord testé la possibilité d’utiliser, dans les milieux de culture d’expansion des CSM de SCO et de MO, un lysat plaquettaire d’origine humaine (HPL) comme substitut au sérum de veau fœtal (SVF) source possible de contaminations. / The mesenchymal stem cells (MSC) are adult stem cells which are at the origin of the ostebiastic lignage cells (O), adipocytes (A) and chondrobiasts (C). The MSC are initially found in the bone marrow (BM) but it also exists there in other tissues as the umbilical cord blood (UCB).Endowed with a regenerative potential, MSC can used in diverse degenerative pathologies in a purpose of tissular repair. Besides, their immunosuppressive properties allowed to envisage their use in a purpose of immunomodulation as during the reactions of transplant against the host in allogenic hematopoietic stem cell transplants (HSC). The essential purpose of this work was to compare the characteristics of the MSC derived from the UCB in comparison to those stemming from the bone marrow (BM).

La persistance et la récurrence de la réponse inflammatoire dans le foie est la principale cause de développement des lésions hépatiques et de ses complications. Cette réponse immune est caractérisée par le recrutement de cellules inflammatoires, notamment de monocytes/macrophages et de lymphocytes. Elle est aussi impliquée d'une part dans le développement de la fibrose en activant les cellules fibrogéniques du foie, et d'autre part dans les mécanismes de régénération. Récemment, la présence d'une sous-population de lymphocytes T appelés Th17 a été identifiée dans de nombreuses pathologies hépatiques incluant la fibrose. Leur présence a également été observée lors de la régénération hépatique à partir de cellules progénitrices. Ces lymphocytes Th17 sont caractérisés principalement par la production de deux cytokines l'IL-17 et l'IL-22. Alors que le rôle de l'IL-22 a été récemment caractérisé dans la fibrose et la régénération hépatique, le rôle de l'IL-17 nécessitait d'être défini.Les objectifs de ma thèse ont donc été d'étudier le rôle et la régulation de l'IL-17 dans 1) les mécanismes de développement de la fibrose, et 2) son impact sur la régénération hépatique à partir de cellules progénitrices.1) L'équipe a démontré l'implication du système endocannabinoïde dans les maladies chroniques du foie. Ce système est composé de deux types de récepteurs, CB1 et CB2, couplés aux protéines G, et de ligands lipidiques endogènes. Alors que CB1 est majoritairement exprimé dans le cerveau et faiblement dans les tissus périphériques, CB2 est très fortement exprimé par les cellules immunitaires et présente en général des propriétés anti-inflammatoires. Notre hypothèse a donc été que l'activation du récepteur CB2, exprimé par les lymphocytes T régulerait négativement la réponse de type Th17 et le développement de la fibrose hépatique. Dans un modèle murin de fibrose induite par la ligature de la voie biliaire principale, nous avons montré que des souris CB2-/- développent une fibrose plus importante associée à une réponse inflammatoire de type Th17 augmentée par rapport à des souris sauvages. De plus, l'inhibition de la production de l'IL-17 chez ces souris CB2-/- à l'aide d'un inhibiteur de la différenciation Th17 (la digoxine), permet de réduire le développement de la fibrose. In vitro, l'activation du récepteur CB2 sur les lymphocytes Th17 par un agoniste sélectif, le JWH-133, diminue leur capacité à produire l'IL-17. Par ailleurs, nous avons montré par immunocyto-fluorescence, que l'activation de CB2 inhibe la production de l'IL-17 par une voie STAT5-dépendante. Ainsi, l'immuno-modulation de la réponse inflammatoire associée à la fibrose représente une stratégie anti-fibrosante prometteuse.2) L'infiltration de ces cellules Th17 a également été observée dans de nombreuses hépatopathies associées à une accumulation de cellules progénitrices intra-hépatiques (CPIH), appelées cellules ovales chez les rongeurs. La deuxième partie de ma thèse a donc consisté en l'étude du rôle de l'IL-17 dans la régénération du foie à partir de CPIH. Dans un modèle murin de régénération hépatique à partir de CPIH induit par un régime déficient en choline, et supplémenté en éthionine (CDE), nous avons montré que des souris invalidées pour l'IL-17 (IL-17-/-) présentent une diminution du nombre de CPIH CK19+, par rapport aux souris sauvages. L'invalidation de l'IL-17-/- a également été associée à une réduction du recrutement macrophagique et de la réponse pro-inflammatoire incluant l'IL-6, l'IL-1b et l'IL-27. Parmi ces cytokines, nous avons identifié l'IL-27 comme étant un facteur clé dans la différenciation des CPIH. In vitro, nous avons également montré que la production de l'IL-27 est induite par la stimulation des macrophages par l'IL-17. Ainsi, nos résultats révèlent que l'action combinée de l'IL-17 et de l'IL-27 orchestre la régénération du foie à partir de CPIH en favorisant leur prolifération et leur différenciation en hépatocytes, respectivement. / Persistence and recurrence of inflammatory response in the liver is the major cause of liver damage and its complications. This immune response is characterized by inflammatory cell recruitment, in particular monocytes / macrophages and lymphocytes. It has also been implicated in fibrosis development by activating liver fibrogenic cells, and also in regeneration mechanisms. Recently, a sub population of T lymphocytes called Th17 has been identified in numerous liver pathologies including fibrosis. These cells have also been observed in regenerating livers from progenitor cells. Th17 lymphocytes are mainly characterized by the production of two cytokines, namely IL-17 and IL-22. While the role of IL-22 has been recently described in liver fibrosis and regeneration, the role of IL-17 remained to be studied.The aims of my thesis were to study the role and the regulation of IL-17 in 1) fibrosis development, and 2) its impact on liver regeneration from progenitor cells.1) Our team has demonstrated the implication of the endocannabinoid system in chronic liver disease. This system is composed of two G-protein coupled receptors, CB1 and CB2, and their endogenous lipidic ligands. While CB1 is mainly expressed in the brain and slightly in peripheral tissues, CB2 is strongly expressed by immune cells and generally displays anti-inflammatory properties. Our hypothesis was that CB2 receptor activation, expressed by T lymphocytes, would negatively regulate Th17 response and liver fibrosis development. In a murine fibrosis model induced by bile duct ligation and section, we have showed that CB2-/- mice have an enhanced fibrosis associated with an increased Th17 inflammatory response as compared to wild-type animals. Additionally, IL-17 production inhibition in these CB2-/- mice with an inhibitor of Th17 differentiation (digoxin), reduced fibrosis development. In vitro, CB2 receptor activation on Th17 lymphocytes by a selective agonist, JWH-133, diminished their ability to produce IL-17. Moreover, we demonstrated by immunocyto-fluorescence, that CB2 activation inhibits IL-17 production in a STAT5-dependent manner. Thus, the modulation of the inflammatory response associated with fibrosis is a promising strategy against fibrosis.2) Th17 cell infiltration has also been observed in liver disease associated with liver progenitor cell (LPC) accumulation, called oval cells in rodents. The second part of my thesis was aimed to study IL-17 role in liver regeneration from LPC. In a murine model of liver regeneration from LPC induced by a choline deficient and éthionine supplemented diet (CDE), we have demonstrated that IL-17 deficient mice (IL-17-/-) have a reduced number of CK19+ LPC as compared to wild-type animals. IL-17 deficiency was also associated with a decrease in macrophage recruitment and reduced pro-inflammatory response including IL-6, IL-1b and IL-27. Among these cytokines, we identified IL-27 as a key factor in LPC differentiation. In vitro, we also showed that IL-27 production is induced after IL-17-induced macrophage activation. Thereby our results revealed that the combined action of IL-17 and IL-27 leads to LPC driven liver regeneration by enhancing their proliferation and their differentiation towards hepatocytes, respectively.

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L’activation du système complément, qui se produit à la suite d’une infection ou d’un trauma, génère de puissants signaux moléculaires capables d’initier la réaction inflammatoire. Parmi ces signaux, le fragment actif C5a permet de recruter sur le site lésé les cellules qui expriment son récepteur (le C5aR/CD88). Bien que le C5aR/CD88 soit initialement connu pour être exprimé par les cellules inflammatoires, il est établi que de nombreuses cellules non immunitaires expriment ce récepteur indiquant son implication dans d’autres processus. Nos résultats ont permis de démontrer que l’activation du système du complément au niveau de la pulpe dentaire est réalisée non seulement à partir des protéines plasmatiques mais aussi des protéines synthétisées par les fibroblastes pulpaires. Ainsi, l’activation locale du système du complément, produit à la suite d’une infection, d’un trauma ou de l’application de biomatériaux, génère du C5a qui induit la migration des cellules progénitrices. Ce travail démontre pour la toute première fois l’implication du fragment actif C5a dans le recrutement de progénitrices pulpaires, étape clef au processus de régénération pulpo-Dentinaire. Ces travaux pourraient donc constituer une piste sérieuse dans l’établissement de nouvelles thérapies permettant de cibler les cellules progénitrices au cours du processus de régénération. / After tissue injury or infection, Complement activation provides powerful signals initiating the inflammatory reaction. These events are mediated by biologically active fragments such as C5a which attracts cells expressing its receptor (C5aR/CD88) to the injury site. Besides inflammatory cells as the main C5aR-Expressing cells, various tissue cells have been reported to express this receptor suggesting its involvement in other processes. In order to investigate the possible relationship between complement activation and pulp regeneration, we investigated Complement activation in the dental pulp and progenitor cell migration from their perivascular niches to the pulp injury site to initiate the regeneration process.Our results indicate that complement activation in the dental pulp is the result of both plasma and fibroblast secreted complement proteins. Thus upon local complement activation, which can occur after pathological injury or biomaterials application, C5a induces pulp progenitors’ migration which is critical in initiating the regenerative processes. To our knowledge, this is the first work to demonstrate the involvement of C5a biologically active fragment in the recruitment human pulp progenitor cells. This may provide a useful future therapeutic tool in targeting the progenitor cells in a dentin/pulp regeneration process.

Les adipocytes (cellules spécialisées dans le stockage des graisses) sont formés à partir de cellules immatures appelées cellules progénitrices lors du processus d'adipogenèse. Chez l'homme, les différentes étapes de ce processus sont mal connues ainsi que les signaux qui le régulent. La première partie de mon travail de thèse a eu pour but de caractériser la cellule intermédiaire entre la cellule progénitrice et l'adipocyte : le préadipocyte. La deuxième partie a consisté à évaluer le rôle des protéines morphogénétiques de l'os (ou BMP), des inducteurs de l'adipogenèse décrits chez la souris, dans l'adipogenèse humaine. Nous avons montré que les BMP2, 4 et 7 sont produites dans le tissu gras humain et BMP7 est modulée par l'obésité. Les BMP2 et 4 induisent l'adipogenèse des cellules progénitrices humaines mais seule la BMP7 permet la production d'adipocytes particuliers " beiges " décrits pour consommer les lipides et produire de la chaleur. Ces travaux affinent nos connaissances sur les mécanismes impliqués dans l'expansion du tissu gras et permettront d'élaborer des stratégies pour lutter contre le développement des pathologies liées à l'obésité. / Adipocytes (cells specialized in fat storage) arise from immature cells, called progenitor cells, during the process of adipogenesis. In human, the different stages of adipogenesis are not well defined as well as the signals involved in adipogenic modulation. The first part of my thesis work aimed to characterize the intermediate cell state between progenitor cell and mature adipocyte: the preadipocyte. The second part aimed to evaluate the role of bone morphogenetic proteins (BMPs) in human adipogenesis. In mice, BMP2 and BMP4 induce classical adipogenesis whereas BMP7 leads to the production of "brite" adipocytes with the capacity to use lipids to produce heat. We have shown that BMP2, 4 and 7 are produced in human fat depots and BMP7 is modulated by obesity. BMP2 and 4 induce classical adipogenesis and BMP7 only induces brite adipogenesis from human progenitor cells. These works improve our knowledge about the mechanisms involved in the expansion of fat depot and may allow the identification of new strategies to fight against the development of obesity-associated pathologies.

Les gliomes sont des tumeurs qui seforment par prolifération anormale de cellules dansle tissu cérébral. La dangerosité de ces tumeursréside dans le fait que la plupart des gliomes sontinvasifs : les cellules tumorales migrent dans le tissusain autour de la tumeur. Ces cellules tumoralesisolées provoquent des récidives quasi systématiquesaprès traitement (chirurgie, chimiothérapie,radiothérapie), rendant ces tumeurs incurablesactuellement et conduisant au décès du patient. Il estimportant d'associer des études fondamentales pourmieux comprendre leur évolution dès l'origine et desétudes plus appliquées en développant de nouveauxsubstrats pour reproduire in vitro leur évolution. Lescellules progénitrices des oligodendrocytes (OPC)représentent la plus grande population de cellules enprolifération et la plus largement distribuée dans lecerveau adulte, ce qui en fait un suspect idéal del’origine des gliomes. A partir de donnéesexpérimentales de la littérature sur la dynamique invivo de ces cellules, un modèle mathématiquereproduisant cette dynamique dans un tissu sain a étédéveloppé.Ce modèle montre également que les OPC pourraientêtre à l’origine de toutes les formes de gliomerencontrées aussi bien de bas grade que de hautgrade. Par ailleurs, l’approche expérimentale utiliséevisait à développer un substrat de culture cellulaireadapté à l’étude des gliomes in vitro. Ainsi, unhydrogel biocompatible, minimaliste et contrôlable aété élaboré. Celui-ci mime l’élasticité de la matriceextracellulaire (MEC) cérébrale avec une rigidité del’ordre de 200 Pa et l’effet adhésif des molécules dela MEC impliqué dans l’adhésion et la proliférationdes cellules tumorales. Grâce à ses propriétés,l’hydrogel favorise la survie de près de 90% desmodèles cellulaires de gliome utilisés dans notreétude et supporte la croissance en trois dimensionsd’agrégats multicellulaires semblables à lamorphologie de micro-tumeurs in vivo. Le modèled’hydrogel est donc validé pour favoriser la viabilitéet la prolifération cellulaires. Les perspectives detravail futures porteront sur l'optimisation de sacomposition pour mimer de manière encore plusréaliste la croissance tumorale in vivo. / Gliomas are brain tumors arising fromanomalous cell proliferation into the brain tissue.The hazard of these tumors resides in their invasiveability : tumor cells migrate into the healthy tissuesurrounding the tumor. These isolated cells causequasi systematic recurrences after treatment(surgery, chemotherapy, radiotherapy) making thesetumors currently incurable and leading to patientdeath. Hence, it is important to associatefundamental studies for better understanding of theirevolution from their origin with more appliedstudies developing new substrates for reproducingtheir evolution in vitro. Oligodendrocyte progenitorcells (OPC) are the most widely spread proliferatingpopulation in the adult brain, which makes them themain suspect of causing gliomas origin. Fromexperimental data in the literature about in vivodynamic of OPC, a mathematical model that depictsthis dynamic into a healthy tissue has beendeveloped.This model also shows that OPC could be at theorigin of all glioma forms from low to high grade.Furthermore, the experimental approach used aimedat designing a cell culture substrate adapted toglioma studies in vitro. Thus, a biocompatible,minimalistic and controllable hydrogel has beenperformed. It mimics brain extracellular matrix(ECM) elasticity around 200 Pa and the adhesiveeffect of ECM molecules involved in tumor celladhesion and proliferation. Due to these properties,the hydrogel contributes to around 90% of gliomacell models survival used in our study and promotesmulticellular aggregates growth in three dimensionsthat look like in vivo microtumors morphology. Thishydrogel model is thus validated for cell viabilityand proliferation. Future works will be devoted tothe optimization of its composition for bettermimicking of tumor growth in vivo in a morerealistic manner.

Résumé: Le muscle squelettique possède une excellente capacité à se regénérer notamment grâce à ses cellules progénitrices stromales (mrSC) et myogéniques (CPM). À la suite de certains traumas et pour des raisons encore méconnues, la qualité de sa régénération est compromise ce qui mène à l’apparition de structures aberrantes tel l’os mature, aussi appelée ossification hétérotopique (OH) post-traumatique. Notre laboratoire a montré dans un modèle murin que les mrSC sont pleinement impliquées dans cette pathologie. De plus, un facteur fortement ostéoinducteur, BMP9, ne cause l’OH que si, et seulement si, le muscle est endommagé. Ce modèle d’étude est unique puisqu’il présente les particularités physiopathologiques de l’OH post-traumatique, un dommage du muscle étant essentiel à la formation d’os. De plus, ce modèle a permis de mettre en évidence le rôle prédominant du microenvironnement des cellules progénitrices dans le développement de cette pathologie. Nous avons donc émis l’HYPOTHÈSE selon laquelle le microenvironnement du muscle endommagé contient des facteurs qui peuvent influencer le phénotype de ses cellules progénitrices stromales et myogéniques favorisant ainsi le développement de l’OH. Nos résultats montrent que l’état hypoxique d’un muscle sévèrement endommagé augmente la prolifération et la différenciation ostéogénique des mrSC. De plus, l’hypoxie induit spécifiquement l’expression de BMP9 par les mrSC. L’impact de BMP9 a également été évalué sur la différenciation des CPM. Les résultats montrent qu’à des concentrations physiologiques, BMP9 inhibe le potentiel myogénique des CPM en faveur d’une différenciation ostéogénique, et cela tant dans la lignée myoblastique murine C2C12 que chez les CPM primaires humaines. En résumé, le muscle endommagé développant l’OH possède un microenvironement spécifique responsable du débalancement de la capacité régénérative de ses progéniteurs. Nos travaux montrent que ce microenvironnement cause un retard de la myogenèse et une ostéogenèse où participeront non seulement les mrSC mais également les CPM. L’identification et la compréhension des mécanismes régulant ces facteurs s’avèrent clé pour offrir aux cliniciens des outils de diagnostic mais également des alternatives ou des approches complémentaires aux traitements prophylaxiques actuels. / Abstract: Skeletal muscle has an extraordinary ability to regenerate due to its resident stromal cells (mrSCs) and myogenic progenitor cells (MPCs). Following certain traumas, the quality of the regeneration of skeletal muscle can be compromised for unknown reasons, leading to the appearance of aberrant structures such as mature bone, a process called posttraumatic heterotopic ossification (HO). Our laboratory developed a mouse model to show that mrSCs are fully involved in this pathology. We also showed that BMP9, a highly osteoinductive factor, causes HO if and only if the muscle is damaged. This model is unique in that it recapitulates the pathophysiological features of post-traumatic HO in which muscle damage is essential for bone formation. The model was also used to show that the progenitor cell microenvironment plays a predominant role in the development of this pathology. Based on these results, we HYPOTHESIZED that the microenvironment of the damaged muscle contains factors that can influence the phenotype of its progenitor cell populations, thus promoting the development of HO. Our results showed that the hypoxic state of a severely damaged muscle increases the proliferation and osteogenic differentiation of mrSCs and also specifically induces the expression of BMP9 by mrSCs. The impact of BMP9 on the differentiation of MPCs was also evaluated. At physiological concentrations, BMP9 inhibited the myogenic differentiation potential of murine myoblast C2C12 cells and primary human MPCs, and triggered their differentiation into an osteogenic lineage. In summary, we showed that damaged muscle that develops HO has a specific microenvironment that is responsible for the loss of the regenerative capacity of progenitor cells, leading to a delay in myogenesis, and that mrSCs and MPCs are both involved in osteogenesis. The identification and understanding of the mechanisms regulating these key factors could provide clinicians with valuable diagnostic tools as well as alternative and/or complementary approaches to current prophylactic treatments.

L’athérosclérose est à l’origine d’importantes obstructions vasculaires. La sévérité de l’ischémie tissulaire provoquée par l’athérosclérose dépend en partie de la capacité de l’organisme à former de nouveaux vaisseaux (néovascularisation). Les mécanismes de néovascularisation sont modulés par la balance oxydo-réductive. Une exacerbation du stress oxydant est retrouvée dans tous les facteurs de risque cardiovasculaire, et en particulier lors du vieillissement. Au niveau vasculaire, la CuZnSOD est la principale enzyme antioxydante. Cependant, son rôle spécifique dans le vieillissement vasculaire et dans le développement de nouveaux vaisseaux en réponse à l’ischémie n’est pas connu. Nos hypothèses de recherche sont: 1) qu’une absence de CuZnSOD diminue la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie 2) que cette diminution de la néovascularisation est dûe au vieillissement de la vasculature affectant à la fois les cellules endothéliales matures et les cellules progénitrices endothéliales. Nous avons démontré qu’une déficience en CuZnSOD diminue significativement la néovascularisation en réponse à l’ischémie. Cette diminution de néovascularisation est associée à une augmentation du stress oxydant et une réduction de la biodisponibilité du NO. La déficience en CuZnSOD réduit significativement le nombre de EPCs (moelle, rate). De plus, ces EPCs présentent une augmentation significative des niveaux de stress oxydant, une diminution de la production de NO et une capacité réduite à migrer et à s’intégrer à un réseau tubulaire. Fait important, il iv est possible d’améliorer la néovascularisation des souris déficientes en CuZnSOD par une supplémentation en EPCs provenant de souris contrôles. Nous avons également démontré que la récupération du flot sanguin suivant l’ischémie est significativement réduite par l’âge. À la fois chez les jeunes et les vieilles souris, la déficience en CuZnSOD mène à une réduction additionnelle de la néovascularisation. Fait intéressant, le potentiel néovasculaire des jeunes souris déficiente en CuZnSOD est similaire à celui des vieilles souris contrôles. Les niveaux de stress oxydant sont également augmentés de façon similaire dans ces deux groupes de souris. L’âge et la déficience en CuZnSOD sont tous deux associés à une réduction du nombre d’EPCs isolées de la moelle et de la rate. L’effet de l’âge seul sur la fonction des EPCs est modeste. Par contre, la déficience en CuZnSOD en condition de vieillissement est associée à d’importants effets délétères sur l’activité fonctionnelle des EPCs. En résumé, nos résultats suggèrent que la protection contre le stress oxydant par la CuZnSOD est essentielle pour préserver la fonction des EPCs et la néovascularisation réparatrice en réponse à l’ischémie. Le défaut de néovascularisation observé en absence de CuZnSOD est associé à un vieillissement vasculaire accéléré. Nos résultats suggèrent que dans le contexte du vieillissement, la CuZnSOD a un rôle encore plus important pour limiter les niveaux de stress oxydant, préserver la fonction des EPCs et maintenir l’intégrité des tissus ischémiques. / When atherosclerotic vascular obstructions are so extensive that direct revascularization techniques cannot be undertaken successfully, the severity of residual tissue ischemia will depend in large part on the ability of the organism to spontaneously develop new blood vessels (neovascularization). The mechanisms involved in neovascularization depend on the oxidative stress balance. Increased oxidative stress is a common feature of all cardiovascular risk factors and particularly aging. In the vascular wall, CuZnSOD is the predominant antioxidant enzyme. Nevertheless, its specific role in vascular aging and new blood vessels formation is currently unknown. Accordingly, we hypotheze that 1) CuZnSOD deficiency reduces neovascularization in response to ischemia 2) this reduction is partly due to vascular aging affecting mature endothelial cells and endothelial progenitor cells. We have demonstrated that CuZnSOD deficiency significantly reduces neovascularization in response to ischemia. This reduction is associated with increased oxidative stress and reduced NO bioavailability. CuZnSOD deficiency significantly decreases EPCs number (bone marrow, spleen). Moreover, these EPCs present significant increased oxidative stress levels, reduced NO production and decreased migration and incorporation into tubular-like structures capacities. Importantly, neovascularization in CuZnSOD deficient-mice can be rescued by an EPCs supplementation from control mice. vii We have also demonstrated that the blood flow recovery following ischemia was significantly reduced with aging. Both in old and young mice, CuZnSOD deficiency led to a further reduction of neovascularization. Interestingly, the resulting neovascularization potential in young CuZnSOD-deficient mouse was similar to that of an older wild type mouse. Oxidative stress levels were also increased to similar levels in these two groups. Both aging and CuZnSOD deficiency were associated with reduced number of bone marrow and peripheral EPCs. The effect of moderate aging alone on specific functional activities of EPCs was modest. However, CuZnSOD deficiency was associated with severe age-dependent defect in EPC fucntional activities. In summary, our resultats suggest that CuZnSOD protection against oxidative stress is essential for EPC functional activities and neovascularization in response to ischemia. The defective neovascularization observed in CuZnSODdeficient mice is associated with accelerated vascular aging. Our results suggest that in aging context, CuZnSOD has a critical role limiting increased oxidative stress and protecting both EPC functional activities and ischemic tissues integrity.