A importância de aminoácidos em tripanossomatídeos vai além da síntese de aminoácidos, envolvendo processos tais como a diferenciação, osmorregulação e metabolismo energético. A disponibilidade dos aminoácidos envolvidos nestas funções depende, entre outras coisas, de seu transporte na célula. Aqui, caracterizamos o transporte de glutamato e GABA do parasita protozoário humano Trypanosoma cruzi. No transporte de glutamato dados cinéticos amostram um único sistema saturável com uma Km de 0.30 mM e uma velocidade máxima de 98.34 pmoles min-1 per 2 x 107 células para epimastigotas é 20 pmoles min-1 per 2 x 107 células para trypomastigotas, e uma Vmax de 84.45 pmoles/min/20x106 células com uma Km de 0.4 mM para o sistema de transporte de GABA. O transporte não apresentou alterações em condições de jejum de até 3 horas. Aspartato, alanina, glutamina, asparagina, metionina, oxaloacetato é alfa-cetoglutarato competiram com o substrato em concentrações dez vezes em excesso na incorporação de glutamato. Interessantemente, o transporte de glutamato aumentou fortemente na presença de GABA. O transporte de glutamato foi fortemente dependente do pH, mas não de concentrações de Na+ e K+ no meio extracelular, e o transporte de GABA foi fortemente dependente de K+. Estes dados foram consistentes com uma sensibilidade do sistema de transporte a um ionóforo (FCCP), sugerindo que o transporte é levado por um gradiente de concentração de H+ na membrana plasmática nos dois sistemas de transporte. O transporte de glutamato e GABA aumentou linearmente com a temperatura na faixa de 15 a 40o C. / The role of amino acids in trypanosomatids goes beyond protein synthesis, involving processes such as differentiation, osmoregulation and energy metabolism. The availability of the amino acids involved in those functions depends, among other things, on their transport into the cell. Here we characterize a glutamate transporter and GABA transport from the human protozoan parasite Trypanosoma cruzi. In the glutamate transport, data kinetics show a single saturable system with a Km of 0.30 mM and a maximum velocity of 98.34 pmoles min-1 per 2 x 107 cells for epimastigotes and 20 pmoles min-1 per 2 x 107 cells for trypomastigotes, and, a Vmax de 84.45 pmoles/min/20x106 cells and a Km of 0.4 mM for GABA transport system. Transport was not affected by parasite nutrient starvation for up to 3h in the two transport system. Aspartate, alanine, glutamine, asparagine, methionine, oxaloacetate and alpha-ketoglutarate competed with the substrate in 10-fold excess concentrations in the glutamate incorporation. Interestingly, the glutamate transport was strongly increased in the presence of GABA. Glutamate uptake was strongly dependent on pH, but not on Na+ or K+ concentrations in the extracellular medium, and the GABA transport was strongly dependent of K+. These data were consistent with the sensitivity of the system to the H+ ionophore carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, suggesting that transport is driven by H+ concentration gradient across the cytoplasm membrane in two transport systems. The glutamate and GABA transport increased linearly with temperature in a range from 15 to 40 degrees C.

A Doença de Chagas é uma infecção parasitária causada pelo Trypanosoma cruzi1, transmitida aos humanos principalmente pelas fezes contaminadas de insetos triatomídio. Esta patologia permanece endêmica na América Latina com grande impacto socioeconômico. O envolvimento cardíaco é a principal causa de morte, sendo que a fisiopatologia e a evolução clínica da doença não são completamente compreendidas e a estratificação de risco permanece desafiadora. A presença de disfunção miocárdica associada ou não à doença arterial aterosclerótica vem acompanhada de áreas de fibrose miocárdica e tem se mostrado como importante fator de pior prognóstico. Ressonância Magnética (RM) é um método já consagrado na detecção de fibrose miocárdica pela técnica de realce tardio (RT). Os objetivos deste trabalho foram: identificar e quantificar a área de realce tardio em pacientes com Cardiopatia Chagásica e disfunção contrátil do ventrículo esquerdo por meio da Tomografia Coronária; associar a extensão do RT pela tomografia com a FE do ventrículo esquerdo, medida pela ecocardiografia; determinar se há ou não associação da presença e extensão do realce tardio com a presença de coronariopatia significativa; determinar a presença de aterosclerose coronária neste subgrupo de pacientes chagásicos por meio do escore de cálcio; e identificar a presença de coronariopatia obstrutiva nesta população. Foram selecionados 36 pacientes com o diagnóstico confirmado de Doença de Chagas e disfunção ventricular (FE< 50%) confirmada pela ecocardiografia que respeitaram os critérios de inclusão e exclusão, e que assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Todos os pacientes foram submetidos a angiotomografia coronária com a técnica de realce tardio e escore de cálcio. Todos os pacientes completaram o protocolo sem efeitos adversos com dose de radiação média de 11,17 +- 1,26 mSv e com exames interpretáveis. Observadores cegos e independentes, sem conhecimento prévio dos dados clínicos ou dos exames, realizaram análise visual e quantitativa do grau de estenose coronária, do escore de cálcio e do realce tardio. A média da idade foi de 57,5+- 8, dos quais 61,1% eram mulheres. A média da FE foi de 38,19 +- 6,91. Foram encontradas 2 lesões significativas (>50%) em 2 pacientes. A média do escore de cálcio foi de 19,06 +- 40,72. A fibrose miocárdica foi observada em 86,1% dos 36 pacientes e sua quantificação foi realizada de acordo com o esquema de segmentação miocárdica segundo a orientação da American Hear Association. A partir dos nossos achados, concluímos que, por meio da Tomografia coronária, é possível identificar áreas de fibrose miocárdica em pacientes chagásicos, que a quantidade de fibrose é inversamente proporcional à fração de ejeção ventricular esquerda (r= 0,52 p = 0,0011) e que a fibrose segue um padrão de localização específico da doença. Nossos achados permitem também inferir que a fibrose miocárdica nesse grupo de pacientes não se correlaciona à presença de obstruções coronárias, sendo o padrão de realce tardio diferente daquele observado em portadores de doença arterial coronária. Não houve correlação entre o escore de cálcio e áreas de fibrose vistas pela técnica de realce tardio (r= 0,04 p= 0,80). Desta forma, a tomografia pode ser uma alternativa à RM para a pesquisa de fibrose em pacientes chagásicos, aspecto que pode ser particularmente relevante naqueles que apresentam contraindicação formal à realização deste exame. / Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi1. It is transmitted to humans mainly by the infected feces of triatomine insects. This pathological condition remains endemic in Latin America, posing a major socioeconomic impact on the region. Cardiac involvement is the principal cause of death of patients, given that the physiopathological mechanism and clinical evolution of the disease are not fully understood and risk stratification remains a challenge. Whether associated with arteriosclerotic vascular disease or not, the presence of myocardial dysfunction is accompanied by areas of myocardial fibrosis and has emerged as an important factor associated with poor prognosis. Magnetic resonance (MR) imaging is a well-established method of detecting myocardial fibrosis by the delayed enhancement (DE) technique. Objectives: The objectives of this thesis are to identify and quantify DE areas on left ventricular contractile dysfunction patients with chagasic cardiopathy using coronary tomography, to associate tomography DE extension with left ventricular ejection fraction (EF) measured by echocardiography, to determine whether the presence and extension of DE are associated with the presence of significant coronaropathy, and to identify the presence of obstructive coronaropathy in chagasic patients. Background: Methods: Thirty six patients with confirmed Chagas disease and ventricular dysfunction diagnosis (EF < 50%), as verified by echocardiography. All the patients underwent coronary computed tomographic (CT) angiography using DE technic. All the patients successfully completed the protocol with a mean radiation dose of 11.17 1.26 mSv, without adverse effects and undergoing measurable tests. Independent observers blinded to the clinical data or examinations of the patients performed visual and quantitative analyses of the degree of coronary stenosis, and DE. Results: The mean age was 57.5 8 years, and 61.1% of them were female. The mean EF was 38.19 6.91%. Two significant lesions (>50%) were identified in two patients. Myocardial fibrosis was observed in 86.1% of the 36 patients, and its quantification was assessed in accordance with the myocardial segmentation scheme and the American Heart Association guidelines The amount of fibrosis is inversely proportional to left ventricular EF (r = 0.52, p = 0.0011), and that the myocardial fibrosis in these patients follows the specific localization pattern of Chagas disease. Our findings reveal that myocardial fibrosis in this patient sub group was not related to coronary obstruction and that the DE pattern is different from the one found in patients who presented ischemic events. Computed tomography DE is also inversely related to left ventricle ejection fraction, another important prognosis marker. Therefore, computed tomography can provide an adequate alternative to MR in the assessment of myocardial fibrosis particularly in patients presenting formal contraindications to MR.

Não consta resumo na publicação. / Abstract not available.

A doença de Chagas representa um grave problema de saúde em regiões endêmicas que vão desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina. O protozoário tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi é o agente causador dessa devastadora doença, que afeta milhões de pessoas. Existem em torno de 10 milhões de indivíduos contaminados e pelo menos 25 milhões de pessoas vivem em locais riscos de infecção. Os dois medicamentos, o nifurtimox e o benzonidazol, apresentam sérios efeitos colaterais além de se mostrarem ineficazes na fase crônica da doença. Esse triste perfil, felizmente, tem se alterado com recentes avanços que levaram o ravuconazol, pozaconazol e K11777 para estudos em fase clínica. Com base em seu papel fundamental no ciclo do T. cruzi, a sexta enzima da via glicolítica, a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) vem sendo considerada um alvo promissor para a descoberta e o desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos para o tratamento da doença de Chagas. É amplamente conhecida a importância do planejamento de compostos tanto por método baseado na estrutura do alvo quanto do ligante. A docagem molecular foi usada para a seleção inicial dos compostos para o teste biocalorimétrico, e a partir dessa estratégia foi possível, de 25 compostos. Os parâmetros cinéticos da catálise da TcGAPDH foram determinados (KM = 10,51 &plusmn; 0,91 &micro;M, Vmax = 4,18 &plusmn; 0,09 x 10-4 mM s-1 e kcat = 85,88 &plusmn; 3,22 s-1). Os experimentos cinéticos por ITC possibilitou na identificação de cinco compostos bioativos, sendo três com constante de inibição abaixo de 100 &micro;M (13,21 &plusmn; 0,88, 35,00 &plusmn; 1,70 e 78,45 &plusmn; 2,69 &micro;M). Processos de simulação de dinâmica molecular foram aplicados para a predição do modo de interação dos três compostos com Ki app menores que 100 &micro;M. / Chagas disease is a serious health problem in endemic regions ranging from the southern the United States to Argentina. The protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent of this devastating disease that affects millions of people. Exist about 10 million people infected and at least 25 million people live in risk of local infection. There are only two drugs used to treat Chagas disease during acute phase and it show harmful side effects. This gloomy outlook has changed due to major advances in research of anti-trypanosomatid agents; an example is posaconazole, ravuconazole and K11777 both, which currently is in clinical phase. A promising target that is receiving considerable attention is the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH, EC 1.2.1.12) a key protein in the glycolytic pathway of trypanosomatids. SBVS methods were used for the selection of 25 compounds and these were assayed against GAPDH using Isothermal Titration Calorimetry. The kinetic parameters of catalysis were determined TcGAPDH (KM = 10.91 &plusmn; 0.91 &micro;M, Vmax = 4.18 &plusmn; 0.09 x 10-4 mM s-1 and kcat = 85.88 &plusmn; 3.22 s-1). The kinetic experiments by ITC allowed the identification of five bioactive compounds, three with inhibition constant below 100 &micro;M. Simulation process of molecular dynamics were applied to predict the mode of interaction for the three compounds with Kiapp less than 100 &micro;M.

O parasita Trypanosoma cruzi (T. cruzi) é o causador da doença de Chagas e continua sendo um grave problema de saúde pública, principalmente nas regiões mais pobres da América Latina. Na busca por novas drogas terapêuticas contra T. cruzi, nós avaliamos a atividade do composto 5-hidroxi-3-metil-5-fenil-pirazolina-1-(S-benzilditiocarbazato) (H2bdtc) tanto in vitro quanto in vivo. Esta espécie foi caracterizada por análise elementar, espectroscopia UV-visível, infravermelho, RMN e espectrometria de massas. Nos experimentos biológicos, o composto H2bdtc em suspensão e/ou encapsulado em nanopartícula lipídica sólida (NLS) foi comparado com um dos medicamentos empregados atualmente, o benzonidazol (BZN). Utilizando-se o composto H2bdtc encapsulado em NLS observou-se: (a) redução de forma eficaz da parasitemia em camundongos, em concentração 100 vezes mais baixa do que aquela normalmente empregada para Benzonidazol (clinicamente aplicada a uma concentração de 400 ?mol kg-1 dia-1); (b) diminuição da inflamação e das lesões de fígado e do coração e (c) resultou em 100,0% de sobrevivência dos camundongos infectados com T. cruzi após 60 dias. Para fins de elucidação do possível mecanismo de ação do composto H2bdtc, estudo de interação com o DNA e com a albumina do soro Humano (HSA) foram realizados. Baseado nos dados relacionados à atividade tripanocida in vitro e in vivo do composto H2bdtc, este pode ser tomado como potente agente tripanocida e o estudo desenvolvido neste projeto pode concorrer ao uso de H2bdtc como possível nova droga a ser utilizada contra Doença de Chagas. / The parasite Trypanosoma cruzi causes Chagas disease, which remains a serious public health concern and continues to victimize thousands of people, primarily in the poorest regions of Latin America. In the search for new therapeutic drugs against T. cruzi, here we have evaluated both the in vitro and the in vivo activity of 5-hydroxy-3-methyl-5-phenyl-pyrazoline-1-(S-benzyldithiocarbazate) (H2bdtc). This compound was characterized by elemental analysis, UV-visible spectroscopy, infrared, NMR and mass spectrometry. Biological experiments were conducted with H2bdtc as a free compound or encapsulated into solid lipid nanoparticles; we compared the results with those achieved by using the currently employed drug, benznidazole. H2bdtc encapsulated into solid lipid nanoparticles (a) effectively reduced parasitemia in mice at concentrations 100 times lower than that normally employed for benznidazole (clinically applied at a concentration of 400 ?mol kg-1 day-1); (b) diminished inflammation and lesions of the liver and heart; and (c) resulted in 100,0% survival of mice infected with T. cruzi. Biological mechanism elucidation of H2bdtc compound was analyzed based on the interaction with DNA and Human Serum Albumin (HSA). Based on the data related to the in vitro and in vivo trypanocidal activity of H2bdtc it was taken as potent trypanocidal agent. Studies developed on this project allow concluding that H2bdtc is a possible new drug to be used against Chagas Disease.

A doença de Chagas afeta milhões de pessoas e os fármacos existentes não são seguros e apresentam eficácia limitada. Muitos produtos naturais mostraram efeitos inibitórios contra uma enzima importante para a sobrevivência do Trypanosoma cruzi, a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Dentre esses produtos naturais destacam-se aqueles da classe dos flavonoides, sendo que um deles, o tilirosídeo, mostrou-se interessante por inibir a enzima com valores de IC50 e Ki iguais a 46 e 25 &micro;M, respectivamente, além de ter sido eficaz contra a cepa do T. cruzi resistente a fármacos (cepa Y) mostrando um valor de IC50 igual a 770 &micro;M. Com objetivo de identificar novos potenciais inibidores da TcGAPDH baseados no tilirosídeo foram empregados métodos computacionais nos quais combinaram-se duas diferentes estratégias: os ensaios virtuais baseados na estrutura do ligante (LBVS) e os ensaios virtuais baseados na estrutura do receptor (SBVS). Os compostos que se ajustaram ao sítio catalítico da enzima e preditos para interagir de forma efetiva com o alvo foram adquiridos e testados contra a TcGAPDH. Os estudos de inibição enzimática foram realizados utilizando as técnicas de calorimetria de titulação isotérmica e espectroscopia de fluorescência obtendo como resultados as constantes de inibição dos compostos selecionados e seus modos de inibição. Dois flavonoides, o Nequimed 214 e o Nequimed 215 inibiram a TcGAPDH na mesma grandeza que o composto de partida, o tilirosídeo, mas como possuem cerca da metade da massa molecular, houve grande aumento da eficiência do ligante. A partir dessa informação, foram selecionados uma segunda geração de compostos preditos a interagir com a TcGAPDH. Deste modo, foram adquiridos bioisósteros de flavonoides que foram testados contra essa enzima, sendo que dois dos mesmos mostraram-se ativos e com alta eficiência do ligante. Foram adquiridos também compostos pertencentes à classe das hidantoínas, rodaninas, tio-hidantoínas e pirrolidina-2,4-dionas sendo que muitos dos mesmos foram ativos e mostraram os maiores valores de eficiência do ligante já relatados para a TcGAPDH, tornando-os excelentes candidatos para otimização molecular. Os resultados obtidos sugerem que vários inibidores possuem inibição não competitiva com relação ao substrato G3P. Os inibidores mais potentes foram testados contra a GAPDH de humanos e não foi verificada seletividade relevante. / Chagas disease affects millions of people worldwide. The available drugs are not safe and show limited efficacy. Many natural products inhibit the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), an important Trypanosoma cruzi enzyme. Among them, flavonoids have stood out and one of them, the tiliroside, inhibited the enzyme with IC50 and Ki values of 46 and 25 &micro;M, respectively. Furthermore, unpublished results showed that this compound was effective against the drug-resistant strain of T. cruzi (Y strain) with IC50 value of 770 &micro;M. In order to select potential inhibitors of TcGAPDH based on the tiliroside structure, computational methods were used combining two different strategies, the ligand-based virtual screening (LBVS) and the structure-based virtual screening (SBVS). The compounds predicted to interact effectively with the target and fit into the active site of the enzyme were purchased and tested. Enzyme inhibition studies were performed using isothermal titration calorimetry and fluorescence spectroscopy from which the constants and mode of inhibition of the compounds were determined. Two of the tested flavonoids, Nequimed 214 and Nequimed 215, showed inhibition activity against TcGAPDH in the same magnitude values as the starting compound, the tiliroside, in spite of their lower molecular weight, thus greatly enhancing the ligand efficiency (LE). These data prompted us to search for some flavonoid bioisosters that were obtained and tested against this enzyme, and two of them proved to be active with high ligand efficiencies. We also purchased compounds belonging to the class of hydantoins, pyrrolidine-2,4-dione, thio-hydantoin and rhodanine. Many of them were active at low micromolar concentration range and exhibited the highest ligand efficiencies ever reported for this enzyme, therefore becoming excellent candidates for molecular optimization. The obtained results suggest that most of inhibitors tested behave as non-competitive inhibitors with respect to the G3P substrate. The most potent inhibitors were tested against human GAPDH and relevant selectivity was not observed.

Buscando sintetizar análogos de PAF imobilizados em resina para isolamento dos correspondentes receptores T. cruzi, foi adotada uma estratégia de síntese convergente que implicava no acoplamento à resina de uma cadeia hidrofóbica análoga à presente no fosfolipídio. Através de modificação sequencial do reagente comercial D-Manitol para sua ligação à resina, os análogos seriam sintetizados em um total de 12 etapas. Após a obtenção com sucesso do primeiro intermediário e de dificuldades na obtenção do segundo intermediário, a preparação de derivados de PAF a partir de D-Manitol foi abandonada já que revisão da literatura demonstrou ser possível a síntese destes mesmos análogos em apenas cinco etapas. A nova rota sintética adotada teve como ponto de partida a fosfatidilcolina extraída de gemas de ovos e, através desta nova abordagem, foram sintetizados com sucesso três intermediários. Devido a dificuldades na adaptação de protocolos sintéticos clássicos a compostos carregados como os fosfolipídios, não foi possível a obtenção dos derivados de PAF inicialmente propostos. Os estudos de bioinformática, os quais visaram localizar a sequencia deste provável receptor de PAF no proteoma do parasita, sugerem a existência de proteínas com características de receptores de membrana acoplados à proteína G (GPCRs) e entre estas, possivelmente receptores de PAF a serem explorados na terapia da doença de Chagas. / In order to synthesize resin-immobilized PAF analogs to further promote the isolation of the T.cruzi correlative receptor, we adopted a convergent synthesis strategy. The strategy implied the coupling between the resin and a hydrophobic chain resembling PAF, in which resin-immobilized PAF analogs would be synthesized by means of sequencial 12 step modification of commercially available reagent D-manitol. Despite successful achievement of the first intermediary, the synthesis of the second intermediary was accompanied by difficulties which led to an extensive literature review and subsequent change of synthetic route. The preffered route was a 5 step approach with egg phosphatidilcholine as the starting material, which rendered the successful synthesis of three intermediates. However, due to difficulties to adapt classical synthetic protocols to charged compounds as phospholipids, we could not obtain the initially proposed PAF analogs. Bioinformatic studies were conducted in order to locate the aminoacid sequence of the probable PAF receptor in T.cruzi proteome. Our data suggest the existence of a receptor resembling G protein coupled membrane receptors (GPCRs), which probably include PAF receptors, which, in turn, might be a potential target to the treatment of Chagas disease.

A doença de Chagas é uma doença negligenciada, endêmica, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, parasita intracelular obrigatório, que necessita de seres vivos de duas classes totalmente diferentes (insetos, o mais comum, Triatoma infestans, e mamíferos, como, por exemplo, o homem) para completar seu ciclo. Em 2009, a doença completou 100 anos de conhecimento pela humanidade, no entanto não há motivos para comemoração, uma vez que, apesar de quase totalmente descrita desde sua descoberta por Carlos Chagas, não há um fármaco que seja ativo na fase crônica. Sabendo que a fase aguda é de difícil diagnóstico e devido à ausência de sintomas indicativos, pode-se dizer que a doença de Chagas é praticamente incurável. Os fármacos utilizados na terapêutica, benznidazol e nifurtimox, são os mesmos há várias décadas. É, portanto, imperioso se buscar candidatos a fármacos antichagásicos que possam suprir o arsenal terapêutico altamente escasso da parasitose. O hidroximetilnitrofural (NFOH), derivado sintetizado em nosso laboratório, se mostrou antichagásico promissor, com maior atividade in vitro em relação ao benznidazol, além de ser quatro vezes menos tóxico que o nitrofural, seu precursor. Por outro lado, o bioisosterismo consiste na substituição de elementos ou grupos a fim de se obter melhores propriedades biológicas do fármaco protótipo, caracterizando-se, assim, como forma de modificação molecular. Assim sendo, o objetivo do presente trabalho foi a aplicação de bioisosterismo no anel furânico do NFOH, sintetizando derivados imidazólicos e triazólicos, além do mesmo tipo de modificação molecular na cadeia lateral, através da formação de semicarbazonas e tiossemicarbazonas. Dessa forma, pretendeu-se sintetizar compostos que atuariam sobre o parasita por três diferentes vias: a geração de peróxido de hidrogênio, tóxico por ser dificilmente reduzido pelo parasita, através de reações de oxidorredução mediadas pelo grupo nitro; a inibição da enzima cruzaína (presente somente no Trypanosoma cruzi) e inibição da14-&#945; esterol desmetilase, enzima fundamental na cascata de reações de formação de ergosterol, componente da parede celular do parasita. A síntese dos imidazóis, prevista para ser realizada em cinco ou seis etapas (há possibilidade de realizar em dez etapas através de outra rota), teve duas etapas completadas, com a proteção, utilizando tritila, do nitrogênio 1 do 4-carboxialdeído imidazol e a produção do agente nitrante. Houve problemas na proteção do hidrogênio ligado à carbonila do mesmo composto, necessária para o êxito da nitração ao carbono 2, seguida de reação de acoplamento com a semicarbazona (e tiossemicarbazona) e hidroximetilação. No caso da síntese dos triazóis, também prevista para ser realizada em cinco etapas, concluíram-se duas delas - oxidação do grupo amina a nitro do 3-aminotriazol e hidroximetilação no nitrogênio 1, utilizando formaldeído. A etapa seguinte, de oxidação e formação da carbonila, a fim de permitir reação com semicarbazona, não foi bem-sucedida, uma vez que o composto não se mostrou estável nas condições da reação. Tentativas com diferentes métodos foram realizadas, mas não houve sucesso na formação da carbonila ligada ao nitrogênio 1. Análogos do nitrofural contendo anéis nitrobenzênicos e imidazólicos (sem nitro) foram sintetizados e poderão ser ensaiados no prosseguimento deste trabalho. Através de Modelagem Molecular, realizou-se avaliação comparativa entre a capacidade de redução do grupo nitro dos quatro compostos propostos no projeto em relação aos análogos já sintetizados e conhecidos (contendo anel furânico e tiofênico), além de outros catorze compostos propostos contendo mudanças no anel aromático e na semicarbazona/tiossemicarbazona. Foi possível prever a atividade por um dos mecanismos propostos, que podem estar envolvidos também com toxicidade. Dentre os 22 derivados, o composto imidazólico contendo semicarbazona, que está sendo sintetizado, mostrou-se com maior capacidade de sofrer redução no grupo nitro. Dinâmica molecular associada ao docking foi utilizada como ferramenta a fim de se avaliar o mecanismo de inibição sobre a cruzaína. Assim, selecionaram-se o NFOH, além de outros sete bioisósteros, dentre eles os quatro que foram propostos neste projeto. Após dinâmica molecular de 3 ns, observou-se que a CYS25 da proteína se distanciou da carbonila do NFOH, sugerindo dificuldade ao ataque proposto na literatura para outros compostos contendo esta região da molécula. Estudos adicionais sobre a forma de inibição do NFOH à cruzaína se fazem necessários. / Chagas\' disease is an endemic, neglected disease caused by Trypanosoma cruzi protozoan, which is an intracellular parasite that requires another type of completely different species (insects, the most common, Triatoma infestans and mammals as human being, for example) to complete its cycle. In 2009, this sickness completed 100 years of discovery, however there is no reason for a happy celebration. In spite of being completely described by Carlos Chagas since that time, there is not even one drug that is active in the chronic phase. As the acute phase is very hard to diagnose, and due to the absence of symptoms, nowadays Chagas\' disease is practically incurable. The drugs used in the therapeutics are the same since decades ago, benznidazole and nifurtimox. So, it is peremptory to find new candidates of antichagasic drugs that may supply the scarce of therapeutic options to this parasitosis. Hydroxymethylnitrofurazone (NFOH), which is already synthesized in our laboratory, has shown to be promising antichagasic with higher activity and four times less toxic in vitro when compared to benznidazole, its precursor. On the other hand, bioisosterism is a useful kind of molecular modification that consists of substitution of elements and groups in order to obtain better biological properties of a prototype. Therefore, the aim of this work was the application of bioisosterism in the furan ring of NFOH by synthesizing imidazole and triazole aromatic ring compounds. Bioisosterism is also applied in the side chain, while semicarbazone and thiosemicarbazone compounds were designed for these possessing nitrogen aromatic rings. So, it was attempted to synthesize compounds that are able to kill the parasite by three different ways: generation of hydrogen peroxide by nitro group, which is highly toxic to the parasite that have problems to neutralize it; inhibition of cruzain, a major cysteine-protease that is present in some catalytic ways of the parasite, and inhibition of 14-&#945; sterol demethylase, a fundamental enzyme in the pathway of ergosterol production, which is a cell wall component. In the imidazole synthesis route, two of the five or six steps (there is possibility to achieve in ten steps, by another route), planned were completed, with the trityl protection of the nitrogen 1 of 4-carboxaldehyde imidazole and the nitrating agent was also produced successfully. Some problems were observed in the protection of the hydrogen bound to the same compound carbonyl by ketal production, which is necessary to provide the nitration in the carbon 2, followed by coupling reaction to the semicarbazide or thiosemicarbazide and the hydroxymethylation, which is the last step of synthesis. In the triazole synthesis, which was predicted to be achieved in five steps, only two were also concluded oxidation of the amino group to produce 3-nitrotriazole and hydroxymethilation of the nitrogen 1, using formaldehyde. The next step, oxidation to produce carbonyl, in order to allow reaction with the thio or semicarbazone moiety, was not well succeeded, because this compound was not stable in the reaction conditions. Different methods were tempted, but no success was observed for the carbonyl formation on the nitrogen 1. Nitrofurazone (NF) analogs containing nitrobenzenic and imidazolic nucleus (without nitro presence) were synthesized and now are able to be tested in a possible continuation of this work. By using molecular modeling, a comparative evaluation of the nitro reduction capacity by the nitrocompounds designed in this project related with other bioisosters that were already synthesized by our group have been made, in addition to other selected bioisosters. It was possible to predict the activity of these compounds by one of the proposed mechanisms, which can also be evolved with toxicity. Among the 22 calculated compounds, the imidazole compound with sulfur in the side chain presented higher ability to nitro reduction. Molecular dynamics, associated with docking, was used as a tool in order to evaluate the inhibition mechanism over the cruzain. So, NFOH and seven other bioisosters were chosen. After 3 ns of simulation, it was observed that the CYS 25 residue of the protein was distant to the NFOH carbonyl, suggesting difficulty in the proposed in the literature interaction for other compounds containing the moiety. Additional studies to clarify the inhibition form of NFOH to cruzain are necessary.

Uma biblioteca genômica de T. cruzi, construída no vetor &#955;gt11, foi selecionada com um soro anti-tripomastigota. Dois clones, denominados B12 e B13, foram isolados, verificando-se que expressam proteínas que contém repetições seriadas de 20 aminoácidos (B12) e 12 aminoácidos (B13). Os insertos respectivos foram subclonados e expressos em fusão com &#946;-galactosidase no vetor pMSgt11. A caracterização dos antígenos em T. cruzi foi feita por Western blot, utilizando soros de coelho contra as proteínas de fusão ou anticorpos imuno-selecionados de soros de pacientes chagásicos. Concluiu-se que B12 corresponde a antígenos de 230 kDa e 200 kDa expressos em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. Anticorpos contra B13 reconheceram antígenos de 140 kDa e 116 kDa nas duas formas evolutivas. A imunoprecipitação de parasitas radioiodados indicou que o antígeno de 140 kDa está localizado na superfície de tripomastigotas, enquanto os demais polipeptídios correspondem a antígenos internos em ambos os estágios evolutivos. As proteínas recombinantes B12 e B13 foram avaliadas no diagnóstico sorológico da doença de Chagas por radioimunoensaio. Foi feito um levantamento com 128 soros, sendo 70 de pacientes chagásicos, 38 de pacientes com outras parasitoses e 20 de indivíduos normais. B12 e B13 obtiveram índices Kappa, que estimam a proporção de acertos verdadeiros, de 0,94 e 0,61, respectivamente. Esses resultados indicam que o antígeno B13 é um candidato potencial para ser empregado no diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Os insertos dos clones B12 e B13 foram usados como sondas para o isolamento de clones genômicos de uma biblioteca em &#955;EMBL3.O mapa de restrição de uma região de 32 kb do genoma de T. cruzi indicou que os genes B12 e B13 são contíguos. Em ensaios de Northern blot B12 hibridizou com transcritos de 7,2 e 8,8 kb e B13 com mRNAs de 3,5 e 4,2 kb. O arranjo genômico de B12 e B13, deduzido de Southern blots de DNA e de cromossomos separados por eletroforese de campo pulsado, é compatível com genes de cópia única. A seqüência completa de um gene homólogo a B13 foi previamente descrita por Buschiazzo e cols. (Mol. Biochem. Parasitol, 54: 125-128, 1992), indicando que 75 repetições seriadas de 36 pb estão presentes em um único bloco. A seqüência completa do gene B12 e da região intergênica entre B12 e B13 foi determinada. B12 codifica uma proteína de 223 kDa contendo um domínio de 173 aminoácidos repetido 3 vezes ao longo da proteína e intercalado por blocos contendo um número variável de repetições seriadas de 20 aminoácidos. A estrutura de B12 é peculiar, uma vez que em outros antígenos de T. cruzi clonados as repetições seriadas estão contidas em um único bloco. Uma busca no banco de dados GenBank demonstrou homologia com proteínas ricas em prolina, incluindo a subunidade pesada da proteína triplet de neurofilamento (NF-H)de mamíferos. Um terceiro gene, denominado B11, e que hibridiza com um transcrito de 5,5 kb, foi localizado a cerca de 9,5 kb a montante de B12. Análises de Southem blot, feitas a partir de DNA de T. cruzi digerido com enzimas de restrição ou de cromossomos, demonstrou que B11 apresenta múltiplas cópias dispersas no genoma do parasita. A seqüência nucleotídica de um fragmento de 0,7 kb de B11 revelou homologia, a nível protéico, com o produto de TRS-1, um elemento semelhante a retrotransposon, isolado de T. brucei (Murphy et al.: J. Mol. Biol. , 195: 855-871, 1987). / Characterization of two contiguous antigen genes of Trypanosoma cruzi presenting immunodominant repetitive epitopes A genomic library of T. cruzi in the vector &#955;gt11 was screened with antitrypomastigote serum. Two clones, named B12 and B13, were isolated and shown to express proteins which contain tandemly repeated units of 20 amino acids (B12) and 12 amino acids (B13). lnserts from clones B12 and B13 were subcloned in the vector pMSgt11 and expressed as &#946;-galactosidase fusion proteins. The characterization of T. cruzi antigens coded by recombinants B12 and B13 was performed by Western blot, using either rabbit antisera to the fusion proteins or immunoselected antibodies from chagasic patients. It was concluded that B12 corresponds to antigens of 230 kDa and 200 kDa found, respectively, both in trypomastigotes and epimastigotes, whereas B13 corresponds to polypeptides of 140 kDa and 116 kDa expressed in both evolutive stages. Immunoprecipitation of radioiodinated parasites indicates that the 140 kDa antigen is located on the surface of trypomastigotes, whereas the other polypeptides correspond to internal antigens. B12 and B13 recombinant proteins were evaluated by radioimmunoassay in the serological diagnosis of Chagas\' disease. Analysis of 128 sera from 20 normal individuals, 70 chagasic patients and 38 patients with other parasitoses indicated kappa indexes of 0.94 and 0.61, respectively, for the B12 and B13 proteins. These data indicate that B13 polypeptide is a potential candidate for the diagnosis of Chagas\' disease. The inserts of B12 and B13 were used to isolate genomic clones from a &#955;EMBL3 library. The restriction map of a region of 32 kb from T. cruzi genome indicated that B12 and B13 genes are contiguous. Northern blots showed that B12 corresponds to 7.2 and 8.8 kb mRNAs, whereas B13 hybridizes to transcripts of 3.5 and 4.2 kb. Southern blot analysis of total digested T. cruzi DNA and pulse field-separated chromosomes lead to the conclusion that B12 and B13 correspond to single copy genes. The entire sequence of a gene homologous to B13 was previously reported (Buschinazzo et aI.: MoI. Biochem. Parasitol. , 54: 125-128, 1992), indicating that ca. 75 units of the 36 bp repeat motif are organized in a single cluster. The complete sequence of B12 gene and the intergenic region between B12 and B13 genes were determined. B12 encodes a 223 kDa protein bearing a 173 amino acids motif repeated 3 times along the sequence and intercalated by clusters containing a variable number of tandemly repeated 20 amino acids units. The sequence of B12 gene is peculiar since in other cloned antigen genes of T. cruzi the repeat units are generally located in a single cluster. A search for homology, with the BLAST program, revealed some homology to proline-rich proteins, like mammalian heavy neurofilament subunit (NF-H). A third gene, denominated B11 and hybridizing to a 5.5 mRNA species, was identified 9.5 kb upstream from the 5\' end of B12 gene. Southern blots of digested DNA and pulse field-separated chromosomes hybridized with the B11 probe, indicating that B11 is a multicopy gene distributed in many chromosomes. The nucleotide sequence of a 0.7 kb fragment from B11 was determined and a search in GenBank database, performed with BLAST program, revealed a significant homology at the protein leveI to the product of TRS-l element, a retrotransposon-like sequence of T. brucei (Murphy et aI.:J MoI. Biol., 195:855-871).

O controle do parasita na fase crônica da infecção por Trypanosoma cruzi se dá principalmente por uma resposta mediada por anticorpos, uma resposta celular TH1 e uma resposta mediada por linfócitos T CD8. Na fase crônica, co-existem linfócitos T CD8 com fenótipo CD8Low CD45RCLow (CD8LL que apresentam marcadores de células sensibilizadas pelo antígeno) junto com células CD8High CD45RCHigh (CD8HH, que em grande parte apresentam fenótipo de célula naive). Células CD8High CD45RCLow (CD8HL) podem ser também observadas. As células CD8LL se apresentam no camundongo independente da cepa de T. cruzi infectante. Verificou-se que na sua grande maioria as células CD8LL tem fenótipo de células em repouso, baixa expressão de CD62L baixa expressão de CD127 (CD62LLOWCD127LOW), sendo estas as características de células efetoras de memória (EM). Este tipo celular ainda pode chegar a expressar marcadores de células NK de significado incerto. Observa-se, na análise funcional, que na estimulação in vitro das células CD8 com anticorpos anti-CD3/CD28 há uma recuperação baixa de CD8 por provável morte por AICD. Este fato é reforçado pelo aumento da ligação à anexina nas células sobreviventes, bem como através da expressão de CD69. Estudos anteriores relataram que o número de células CD8 diminuía após desafio in vivo com o parasita; porém o observado foi uma diminuição das células CD8LL na estimulação inespecífica in vivo com Poli-IC, um ligante de TLR-3. O desafio in vivo com antígeno de tripanossoma na cavidade pleural ocasiona uma migração preferencial de células CD8 e entre estas migram células de fenótipos CD8LL e CD8HL. No entanto, ao contrário do esperado, este estímulo resulta em uma diminuição da expressão de CD69 nas células CD8 infiltrantes. Visando determinar in vivo o papel protetor das células CD8, em um primeiro momento células de baço total foram tranferidas para camundongos sadios e, após a infecção com T. cruzi, observou-se um controle parcial da infecção, caracterizado por um retardo no pico de parasitemia e diminuição na intensidade de infecção, evidenciando um papel protetor parcial in vivo. Na determinação de fatores envolvidos na geração e manutenção das células CD8LL, observou-se que os camundongos deficientes em CD28, INOS ou CD4 têm geração normal de células CD8LL. Os camundongos IL-12p40-KO têm uma deficiência parcial na geração de células CD8LL. Já os camundongos deficientes em INF-gama, por sua vez, possuem uma deficiência acentuada destas células, apesar de que a diminuição poderia se dever a um aumento da necessidade periférica. Por outro lado, os camundongos IL-12p40-KO e INF-gama-KO desenvolvem um quadro neurológico sub-agudo progressivo, onde as células CD8 infiltrantes na medula espinhal apresentam um fenótipo misto CD8LL e CD8HL, e não são anérgicas, por sinal. / The control of the parasite in the chronic phase of infection by Trypanosoma cruzi occurs mainly by an antibody response mediated by a TH1 response and a cellular response mediated by CD8 T lymphocytes. In the chronic phase, co-exist with CD8 T lymphocyte phenotype CD8Low CD45RCLow (CD8LL showing markers of cells sensitized by antigen) with cell CD8High CD45RCHigh (CD8HH which have largely naive cell phenotype). Cells CD8High CD45RCLow (CD8HL) can also be observed. CD8LL cells were present in mice independent of the strain of T. cruzi infecting. It was found that in most cells CD8LL cell phenotype is at rest, low expression of CD62Llow expression of CD127 (CD62LLOWCD127LOW), which are the characteristics of effector memory cells (MS). This cell type can still get to express markers of NK cells of uncertain significance. There is, in functional analysis, which in vitro stimulation of CD8 cells with anti-CD3/CD28 antibodies there is a low recovery of CD8 by probable death IACD. This fact is reinforced by the increase in connection anexina cells survived, and through the expression of CD69. Previous studies reported that the number of CD8 cells decreased after in vivo challenge with the parasite, but the observed was a decrease in cell CD8LL the nonspecific stimulation in vivo with poly-IC, a ligand of TLR-3. The challenge with antigen in vivo of trypanosome in the pleural cavity causes a preferential migration of CD8 cells and between the migrating cells CD8LL phenotypes and CD8HL. However, unlike the expected, this stimulation results in a decrease in the expression of CD69 on CD8 cells infiltrating. To determine the in vivo protective role of CD8 cells in a first time total spleen cells were transferred to healthy mice and after infection with T. cruzi, there was a partial control of infection, characterized by a delay in peak parasitemia and decrease in intensity of infection, indicating a partial protective role in vivo. In determining the factors involved in the generation and maintenance of cells CD8LL, it was observed that mice deficient in CD28, iNOS and generation have normal CD4 cell CD8LL. The mouse IL-12p40-KO have a partial deficiency in the generation of cells CD8LL. But the mice deficient in INF-gamma, which in turn have a marked deficiency of these cells, although the decrease could be due to increased peripheral need. Moreover, the mice IL-12p40-KO and INF-gamma-KO develop a progressive neurological sub-acute, where the infiltrating CD8 cells in the spinal cord showed a mixed phenotype CD8LL and CD8HL, and are not anergic, by signal.