Doenças negligenciadas acometem milhares de pessoas em todo o mundo, principalmente em países subdesenvolvidos. A exemplo destas encontram-se doenças como a leishmaniose e a doença de Chagas que representam relevantes problemas de saúde pública. As terapias disponíveis para estas doenças tropicais, contudo, estão longe de serem satisfatórias e eficazes, considerando-se que os quimioterápicos existentes apresentam reconhecida toxicidade, alto custo e eficácia moderada. Com o propósito de obter alternativas terapêuticas otimizadas, este projeto de pesquisa teve como objetivo a obtenção de pró-fármacos de compostos nitroderivados com comprovada atividade leishmanicida e antichagásica para serem utilizados em sistemas ADEPT visando maior eficácia e menor toxicidade no tratamento destas parasitoses. A princípio, duas frentes de trabalho em paralelo foram adotadas: uma teórica, para determinação do mecanismo catalítico da carboxipeptidase G2 (CPG2) e obtenção de informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos, e a outra sintética, para obtenção dos compostos propriamente ditos. Estudos teóricos de ancoramento e dinâmica molecular da CPG2 com um de seus reconhecidos substratos, o metotrexato, indicaram que o mecanismo de ação proposto para metaloproteases em geral também pode ser aplicado a esta enzima. Informações relacionadas ao mecanismo de clivagem dos pró-fármacos propostos também foram obtidas. A rota sintética inicialmente proposta para a obtenção dos pró-fármacos partia da ligação dos nitroderivados ao ácido glutâmico por intermédio de um agente espaçante, o ácido succínico. Com base nas informações obtidas nos estudos teóricos, entretanto, o projeto foi reformulado focando-se na síntese dos pró-fármacos sem agente espaçante, pois estes se mostraram mais favoráveis ao reconhecimento pela enzima. Com relação à síntese, a obtenção dos compostos planejados não foi alcançada a despeito dos esforços empreendidos. Estudos teóricos e experimentais de reatividade parecem comprovar a tese de que o grupo nitro desativa as funções nucleofílicas das estruturas dos nitrocompostos que seriam fundamentais para as reações de acoplamento ao transportador ácido glutâmico. Este achado, contudo, constitui um importante problema a ser solucionado, visto que nitroderivados parecem exercer suas atividades principalmente mediante redução do grupo nitro e produção de espécies reativas de oxigênio nas redondezas dos parasitas. / Neglected diseases affect millions of people around the world for the most part in underdeveloped countries. Leishmaniasis and Chagas disease are example of important public health problems spread through Africa, Asia and Latin America. Unfortunately, currently available chemotherapy to treat these diseases remains ineffective, being the most frequently applied drugs toxic, expensive and of moderate potency. By considering this actual picture and envisioning new therapeutic alternatives, the aim of this work was to design and synthesize potential antichagasic and antileishmanial prodrugs of nitroderivatives to be used in Antybody-Directed Enzyme Prodrug Therapy (ADEPT), a drug design approach which results in targeted delivery of the active compounds, increasing their potencies in addition to lowering their toxicity. Theoretical studies to determine the catalytic mechanism of the carboxypeptidase G2 (CPG2) and to obtain information about the cleavage mechanism of proposed prodrugs were performed whereas different synthetic approaches were made to obtain the compounds. Docking and molecular studies of the CPG2 considering theoretical interactions with its known substrate, methotrexate, indicated that the proposed general mechanism for metalloproteases could be indeed applied to this enzyme. Information about the cleavage mechanism of prodrugs was also obtained. Initially prodrugs proposed were composed by nitroderivatives structures attached to glutamic acid, the chosen transporter agent, by a spacer group, the succinic acid. Theoretical studies, however, had showed that prodrugs constructed without a spacer agent could be better recognized by the enzyme. These results re-directed the synthetic approach to new prodrug structure without spacer. Despite all efforts spent, it was impossible to obtain the proposed prodrug structures. Experimental reactivity studies were then accomplished, since it was possible that the nitro group, from nitroderivatives structure, was able to reduce the nucleophilic power of particular functional groups chosen to accomplish the coupling between the active compound and the transporter. The results corroborate this hypothesis and the absence of nitro group facilitates the prodrug synthesis. This, however, constitute an important problem to be solved since the nitroderivative seams to exert their function mainly by nitro group reduction and production of free radical species in the surrounding of the parasites.

A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e afeta aproximadamente 10 milhões de pessoas em áreas endêmicas do México, America central e do Sul. A quimioterapia disponível atualmente limita-se a dois compostos: Nifurtimox e o Benzonidazol. Ambos os fármacos reduzem os sintomas da doença e a mortalidade das pessoas infectadas, quando utilizadas na fase aguda, mas sua eficácia na fase crônica é controversa. Além do mais apresentam vários efeitos colaterais. O T. cruzi é capaz de utilizar carboidratos e aminoácidos como fonte de energia e carbono. O nosso grupo tem estudado o envolvimento do glutamato na resistência do parasita ao estresse térmico, oxidativo e metabólico como também a importância do aminoácido GABA no metabolismo do T. cruzi, visto que este também é transportado pelo parasita. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a interferência de fármacos, que atuam via receptores ou transportadores de GABA e glutamato, no ciclo de vida do T. cruzi. Os fármacos selecionados foram: Vigabatrina, Pregabalina, MK-801, MTEP e Memantina. Os resultados demonstram que apenas Memantina apresentou um melhor efeito tripanocida. Inibiu a proliferação de formas epimastigotas, interferiu na metaciclogênese, como também afetou o metabolismo energético do parasita com a diminuição dos níveis de ATP, além de desencadear mecanismos que levam a apoptose das formas epimastigotas. Memantina também interferiu no ciclo intracelular do parasita, mais especificamente no estágio amastigota. Interessantemente as fases do ciclo do parasita que são mais afetadas, são as fases que requerem mais energia: estágios replicativos (amastigota e epimastigota), como também os processos de diferenciação e invasão celular. Apesar de apresentar valores de IC50 que podem ser considerados altos em relação aos valores descritos para formas epimastigotas tratadas com Benzonidazol, esses resultados mostram perspectivas promissoras, visto que o Memantina poderá ser utilizado como composto líder para o desenho de derivados com atividade tripanocida otimizada. / Chagas disease, also known as American trypanosomiasis is caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi and affects approximately 10 million people in endemic areas of Mexico, Central America and South America, with about 25 million people living in areas at risk of infection. The currently available chemotherapy is limited to two compounds, which are: Nifurtimox and Benznidazole. Both drugs reduce symptoms of the disease and mortality of infected people when used in the acute phase, but its efficacy in chronic phase (phase in which the majority of cases are diagnosed) is still controversial. Moreover these drugs have several side effects. T. cruzi is able to utilize carbohydrate and amino acids as carbon and energy source. Our group has studied the involvement of glutamate in parasite resistance to thermal, oxidative and metabolic stress, as well as the importance of the amino acid GABA metabolism in T. cruzi. The aim of this study was to evaluate the interference of drugs, that act in GABA and glutamate transporters or receptors, in the life cycle of T. cruzi. The drugs selected were: vigabatrin, pregabalin, MK-801, memantine and MTEP. The results showed that only memantine has a better trypanocidal effect. Memantine inhibited the proliferation of epimastigotes, interfered in metacyclogenesis, and affected the energy metabolism of the parasite with decreased levels of ATP, and trigger mechanisms that lead to apoptosis of epimastigotes. Moreover interferes with intracellular cycle of the parasite, specifically in amastigote stage. Interesting that stages of the parasite that require more energy are more affected: replicative stages (epimastigote and amastigote) as well as the processes of differentiation and cell invasion. IC50 value is more than that described to epimastigotes treateds with Benznidazole, but Memantine could be used as leader compound for the design of drugs with optimized trypanocidal activity.

As células da linhagem macrofágica são fundamentais na infecção por T. cruzi. Além do reconhecimento por PRRs, a interação com anticorpos e/ou complemento facilita a internalização. Avaliamos o papel in vivo e in vitro de IgM e IgG específicas na saída de parasitas Sylvio X10/4 do sangue, um clone miotrópico de T. cruzi que causa infecção sem parasitemia patente. Devido à sua saída espontânea, estudamos a remoção no sexto dia de infecção, momento em que a parasitemia subpatente aumenta. Camundongos foram infectados e tratados com soro normal (NMS), soro crônico (B6) e soro de animais CD28KO crônicos (que produzem somente IgM). O grupo tratado com soro de CD28KO apresentou uma remoção significativa, porém menos eficiente do que com soro crônico (B6). Tais resultados foram reproduzidos em estudo in vitro na invasão de macrófagos (derivados de medula óssea ou do peritônio) com os distintos tratamentos. Concluímos que os macrófagos são fundamentais na remoção dos parasitas e os anticorpos, não somente IgG, mas também os da classe IgM reforçam este processo. / The cells of the macrophage lineage are essential for the infection by T. cruzi. Besides the recognition by PRRs, interaction with antibodies and/or complement facilitates internalization. We evaluated the role in vivo and in vitro of specific IgM and IgG in the blood output of parasites Sylvio X10/4, clone myotropic of T. cruzi which causes infection without patent parasitemia. Due to its spontaneous exit, we studied the removal on the sixth day of infection, when the parasitemia subpatent increases. Mice were infected and treated with normal mouse serum (NMS), chronic serum (B6) and serum from CD28KO chronic mice (which produce only IgM). The group treated with CD28KO serum showed a significant removal, but less efficiently than with chronic serum (B6). These results were reproduced in vitro study on the invasion of macrophages (derived from bone marrow or peritoneum) with these different treatments. We conclude that macrophages are essential in the removal of parasites and antibodies, not only IgG, but also IgM enhance this process.

A Cardiomiopatia Chagásica Crônica (CCC) é o elemento mórbido mais importante da Doença de Chagas e sua elucidação se tornou fundamental. Estudos da imunologia da CCC demonstram que o sistema imune desempenha um papel duplo no curso da doença, agindo de forma a controlar as formas parasitárias e ainda promovendo lesão tissular. Porém, pouco se sabe do papel das células estruturais, tais como os cardiomiócitos, no curso da doença. Sabe-se que, em outras patologias cardíacas, o IFN-γ, citocina produzida em abundância no coração dos pacientes com CCC, determina o priming de diversas populações celulares, modulando positivamente a sua resposta. Cardiomiócitos HL-1 e animais C3H/HePas foram primados com IFN-γ e desafiados com LPS para a dosagem de citocinas, simulando quadro agudo e crônico de infecção. Neste trabalho, determinamos que o IFN-γ modula positivamente a produção de diversas citocinas in vitro por células HL-1 (IP-10, MCP-1, G-CSF, RANTES, MIG, IL-6, MIF) e também in vivo no coração (IP-10, KC, G-CSF, LIF e IL-6). Além disso, in vitro, o IFN-γ foi capaz de diminuir a produção de VEGF e GM-CSF em relação aos grupos tratados apenas com LPS. Os dados corroboram a literatura e permitem concluir que os cardiomiócitos são capazes de participar ativamente da resposta inflamatória no coração e que são sensíveis aos produtos da mesma. O trabalho serve ainda de base para novos estudos sobre o perfil de citocinas expressas no coração no curso da infecção por T. cruzi e como os cardiomiócitos participam da resposta inflamatória em questão. / Chronic Chagasic Cardiomyopathy (CCC) is the most morbid element of Chagas Disease, the elucidation of its physiopathology being fundamental. However, little is known about the role of structural cells, such as cardiomyocytes, in the course of the disease. In other cardiac pathologies, it has been shown that IFN-γ determines the priming of several resident populations, positively modulating their response. In this work, HL-1 cardiomyocytes and C3H/HePas mice were primed with IFN-γ (in brief or extended protocols) and challenged with LPS, the cytokines produced being measured in the supernatants. We observed that IFN-γ positively modulates the in vitro production of many cytokines by HL-1 cells (IP-10, MCP-1, G- CSF, RANTES, MIG, IL-6, MIF) and also their in vivo production at the heart (IP-10, KC, G-CSF, LIF and IL-6). Besides, IFN-γ was able to decrease the LPS-induced production of VEGF and GM-CSF by HL-1 cells. Our data allow us to conclude that cardiomyocytes actively participate in the inflammatory response of the heart, being sensitive to products released by professional immune cells. This work may serve as a basis for further studies on the profile of the cytokines secreted in the heart tissue along the course of cardiac inflammation.

Ligantes oxindolimínicos foram sintetizados através de procedimentos já desenvolvidos em nosso laboratório, a partir do 2,3-dioxindol (isatina) e aminas ou diaminas selecionadas, e em seguida metalados. Foram investigados dois complexos de cobre(II) com os ligantes isaepy, preparado a partir de 2-(2-aminoetilpiridina) e isapn, a partir de 1,2-diaminoetano, e os correspondentes complexos de zinco(II). Após caracterização por diversas técnicas, sua reatividade com relação a biomoléculas (HSA e DNA) foi verificada, através de medidas de fluorescência e dicroísmo circular. Posteriormente, sua reatividade antiparasitária frente a T. cruzi foi testada. Todos eles apresentaram atividade tóxica frente às formas tripomastigota e amastigota do parasita, com índices de seletividade bastante promissores, quando comparados à droga atualmente em uso (benzonidazol) e outras alternativas descritas na literatura. Anteriormente estes complexos já haviam demonstrado atividade pró-apoptótica frente a diversas células tumorais, baseado em sua capacidade de gerar espécies reativas (EROs) e de inibir proteínas específicas, como a topoisomerase humana IB. Os resultados aqui obtidos deram origem a um pedido de patente (BR10 2013 026558-6, depositado junto ao INPI em 15/outubro/2013) visando o possível desenvolvimento de novos fármacos para a doença de Chagas. / Oxindolimine ligands were synthesized by procedures previously developed in our laboratory, from 2,3-dioxoindole(isatin) and amines or selected diamines, by condensation reactions, followed by metallation. Two copper(II) complexes with isaepy and isapn ligands, prepared from 2-(2-aminoethylpiridine) and 1,2-diaminoethane respectively, and their corresponding complexes of zinc(II) were investigated. After characterization by various techniques, their reactivity with respect to biomolecules (HSA and DNA) was verified, through measurements of fluorescence and circular dichroism. Subsequently, their antiparasitary reactivity against T. cruzi was tested. All complexes tested presents toxic activity against trypomastigote and amastigote forms of the parasite, with promising selectivity index, compared to drugs currently in use (benznidazole) and other alternative compounds described in literature. Previously, these complexes had shown pro-apoptotic activity against several tumor cells, based on their ability to generate reactive species and inhibit specific proteins, such as topoisomerases. The results obtained here gave rise to a patent application (BR10 2013 026558-6, deposited on INPI in October 15th, 2013), looking for a possible development of new drugs for Chagas disease.

Orientador: Paulo Câmara Marques Pereira / Resumo: A Doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi (T. cruzi), é uma patologia infecciosa crônica que apresenta grande incidência no Brasil e, nos últimos anos, passou a ser endêmica em centros urbanos. É acompanhada por alterações no sistema imune com variações nos níveis séricos das citocinas pró-inflamatórias. O tratamento disponível no Brasil é o benzonidazol, com baixa eficácia na fase crônica e efeitos colaterais importantes. Sabe-se que os adipocitos são reservatórios de T. cruzi, aspecto importante que é a relação com as citocinas pro-inflamatórias e com o aumento de T.cruzi nos adipocitos interferindo na evolução da doença. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da obesidade e das citocinas pro inflamatórias em camundongos balb/c machos infectados com T. cruzi tratados ou não com benzonidazol. Foram utilizados 120 animais, divididos em seis grupos, sendo 3 com dieta normal e 3 com dieta hipercalórica. Esses foram avaliados em cinco momentos: M1-1°dia, M2-3°dia, M3-5°dia, M4-7°dia e M5-8°dia. Para infecção utilizou a cepa aguda Y, com pico de parasitemia no sétimo dia (M4). A eutanásia foi realizada em cinco animais de cada grupo, em cada momento. Para determinação das citocinas utilizou o Kits de CBA –Cytometric Beads Array, através de citômetro de fluxo. Além disso, foi verificado o peso da gordura. O medicamento foi ofertado na dosagem de 100 mg/Kg/dia. A análise estatística foi realizada por medidas descritivas com o cálculo de média, de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is a chronic infectious disease that has a high incidence in Brazil and, in recent years, has become endemic in urban centers. It is accompanied by changes in the immune system with variations in serum levels of pro-inflammatory cytokines. The available treatment in Brazil is benzonidazole, with low efficacy in the chronic phase and important side effects. It is known that the adipocytes are reservoirs of T. cruzi, an important aspect that is the relation with the pro-inflammatory cytokines and with the increase of T. cruzi in the adipocytes interfering in the evolution of the disease. Therefore, the objective of the present study was to evaluate the effects of obesity and proinflammatory cytokines in T. cruzi infected or non-treated male balb / c mice with benzonidazole. A total of 120 animals were used, divided into six groups: 3 with normal diet and 3 with hypercaloric diet. These were evaluated in five moments: M1-1 day, M2-3 day, M3-5 day, M4-7 day and M5-8 day. For infection, the acute Y strain was used, with a peak of parasitemia on the seventh day (M4). Euthanasia was performed in five animals from each group, at each moment. In order to determine the cytokines, the CBA-Cytometric Beads Array Kits were used by flow cytometer. In addition, the fat weight was checked. The drug was offered in the dosage of 100 mg / kg / day. Statistical analysis was performed by descriptive measures with mean, standard deviation, mi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Camundongos C3H/HePAS infectados com Trypanosoma cruzi Sylvio X10/4 desenvolvem cardiomiopatia chagásica crônica semelhante aquela observada em pacientes portadores da doença de Chagas. A análise das células que infiltram o coração na fase crônica mostra uma maior frequência de leucócitos e maior expressão de PD-1 e PD-L1, moléculas inibitórias do sistema imune. Visando restaurar a resposta, tratamos camundongos primeiramente com anticorpos anti-PD-L1 e posteriormente com anticorpos anti-PD-L1 e anti-PD-1 em diferentes experimentos, que falharam em exercer uma diferença significativa na patologia cardíaca, parasitemia do sangue ou do coração associado ao aumento da resposta imune. Para fornecer co-estímulo além de bloquear interações inibitórias, realizamos o tratamento com anti-PD-1 e anti-PD-L1 associado a T. cruzi irradiado, que aumentou a patologia cardíaca e a bradicardia, assim como diminuiu a parasitemia sanguínea, sem mudanças no perfil das células T. O bloqueio das interações inibitórias associado ao desafio e ao co-estímulo das células T, leva a uma piora no funcionamento cardíaco associado à diminuição da parasitemia nos camundongos crônicos. / C3H/HePAS mice infected with T. cruzi Sylvio X10/4 parasites develop a chronic cardiomyopathy like the observed in human chagasic patients. Flow cytometry analysis of heart-infiltrating cells in chronically infected mice revealed higher leukocyte frequency with increased PD-1 and PD-L1 expression. In order to restore the immune response, mice were treated with anti-PD-L1 or with anti-PD-L1 and anti-PD-1, but neither exerted effects at heart pathology and parasitemia nor restored T cell response. Hence, we evaluated the possibility of using irradiated T. cruzi challenge to provide parasite antigen and co-stimulatory signaling to exhausted cells. Thus, association of anti-PD-1 and anti-PD-L1 treatment with irradiated T. cruzi challenge increased heart pathology and bradycardia as well as reduced blood parasitemia. Additionally, the treatment does not change T cell phenotype. Blocking both inhibitory interactions and provide antigen with co-stimulation seems to cause a loss in heart function despite decreasing parasitemia.

A doença de Chagas é um problema de saúde pública, com dados preocupantes referentes ao número de pessoas contaminadas e daquelas que ainda permanecem expostas ao risco de infecção. As doenças tropicais desafiam as pesquisas científicas, pois os medicamentos existentes apresentam sérios efeitos colaterais. As tripanossomíases são doenças de grande importância no Brasil, como é o caso da doença de Chagas. Estudos realizados em diversos países têm relatado que muitas espécies vegetais possuem atividade contra o agente etiológico da doença de Chagas, Trypanosoma cruzi. Ácido ursólico e seu isômero, ácido oleanólico, pertencem à classe de compostos triterpenóides e são amplamente distribuídos no reino vegetal e têm sido frequentemente isolados como mistura isomérica. Nesse sentido, a proposta para o presente estudo foi avaliar a atividade tripanocida, sobre a cepa Y e Bolívia de T. cruzi, dos triterpenos ácido ursólico e ácido oleanólico, sintetizar e avaliar a atividade tripanocida do sal derivado de ácido ursólico. As substâncias foram administradas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg por via intraperitoneal e oral, após a avaliação da dose letal média (DL50). As três substâncias empregadas nas concentrações de 20 e 50 mg/kg, administradas por via intraperitoneal não foram capazes de reduzir a parasitemia dos animais experimentalmente infectados com as cepas Y e Bolívia de T. cruzi. Entretanto, as três substâncias exibiram atividade tripanocida significativa, na concentração de 50 mg/kg, administradas por via oral, em animais infectados com a cepa Y de T. cruzi. Para a cepa Bolívia de T. cruzi, as substâncias administradas por via oral exibiram atividade biológica na concentração de 20 mg/kg, sendo significativa apenas para o triterpeno ácido ursólico. A análise histológica realizada não demonstrou uma correlação significativa entre os níveis parasitêmicos e o parasitismo tecidual, para todos os grupos avaliados. A avaliação do perfil hepatobiliar e renal das substâncias foi realizada a fim de se verificar possíveis efeitos tóxicos das mesmas. Entretanto, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os grupos tratados e o grupo controle, indicando que o aumento dos níveis parasitêmicos não está associado ao efeito das substâncias no tecido. Através da avaliação do efeito dos triterpenos sobre a resposta imune, verificamos uma diminuição dos níveis plasmáticos de IFN- e um aumento das concentrações de IL-10. Dessa maneira, nós sugerimos que o tratamento com essas substâncias pode direcionar a resposta imune para o padrão Th2 e, em conseqüência desse efeito imunossupressor, uma maior quantidade de formas tripomastigotas poderia ser observada na circulação do hospedeiro. / Chagas disease is a public health problem with worrisome data on the number of infected people, not to mention the population that still remains at risk of infection. Tropical diseases defy scientific research since the existing drugs have serious side effects. Trypanosomiases, such as Chagas disease, are of great importance in Brazil. Studies in several countries have reported that many plant species display activity against Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. Ursolic acid and its isomer, oleanolic acid, belong to a class of triterpenoid compounds that is widely distributed in the plant kingdom and has frequently been isolated as an isomeric mixture. In the present study, the trypanocidal activity of the triterpenoids ursolic acid and oleanolic acid was evaluated against the Y and Bolivia strains of T. cruzi. In addition, the potassium salt derivative of ursolic acid was synthesized and also tested. The triterpenoids were administered intraperitoneally and orally at concentrations of 20 and 50 mg / kg, after evaluation of the median lethal dose (LD50). At the concentrations of 20 and 50 mg / kg, the intraperitoneal administration of each of the substances was not able to reduce parasitemia of the animals infected with the Y and Bolivia strains of T. cruzi. However, ursolic and oleanolic acid, as well as the potassium salt derivative of ursolic acid exhibited significant trypanocidal activity at a concentration of 50 mg / kg when they were orally administered to animals infected with the Y strain of T. cruzi. On the other hand, oral administration of the tested compounds at a concentration of 20 mg / kg evidenced biological activity, which was significant for ursolic acid only. For the most of studied groups, histological analysis did not demonstrate a significant correlation between the levels of parasitemia and tissue parasitism. Determination and evaluation of biochemical parameters in the serum of experimental animals was performed, to assess the hepatic, biliary, and renal toxic effects of the substances. There were no statistically significant differences between the treated groups and the control group, indicating that the increase in parasitemia is not associated with the effects of the substances in the tissue. We suggest the hypothesis of an immunosuppressive effect, since there was a decreased plasma levels of IFN- after treatment with the triterpenes. Moreover, the treated groups also exhibited increased levels of IL-10. Therefore, we suggest that treatment with the substances could be directing the immune response toward the Th2 type and, as a consequence of this immunosuppressive effect, a greater amount of trypomastigotes could be observed in the circulation of the host.

The trypanosomatid parasites T. brucei, T. cruzi and Leishmania spp. are responsible for the ‘neglected diseases’ Human African Trypanosomiasis, Chagas disease and Leishmaniasis respectively. In their human infective form in the bloodstream all three trypanosomatid parasites rely heavily on glycolysis for ATP production. Phosphofructokinase (PFK) catalyses the third step of the glycolytic pathway in all organisms using aerobic respiration. It facilitates the phospho transfer from ATP to fructose 6-phosphate (F6P) to make the products fructose 1,6- bisphosphate (F16BP) and ADP. RNAi knockout of T. brucei PFK has shown the enzyme is essential for survival of the bloodstream form parasites. Trypanosomatid PFKs have a unique set of structural and regulatory differences compared to the mammalian host enzyme. These differences, coupled with the availability of trypanosomatid PFK crystal structures present an opportunity for the structure-based design of specific inhibitors against the enzyme. Here we present an enzymatic characterisation of recombinant PFKs from T. brucei, T. cruzi and Leishmania infantum trypanosomatids, their regulation by the allosteric activator AMP, and their inhibition by drug-like inhibitor compounds. Inhibitor compounds (‘CTCB compounds’) were designed against T. brucei PFK with the aim of developing novel treatments against Human African Trypanosomiasis (HAT). We describe the testing, ranking and biophysical characterisation of these compounds as part of a Wellcome Trust Seeding Drug Discovery program. We found that CTCB inhibitor compounds bound to an allosteric pocket unique to trypanosomatid PFKs. We show that the compounds are specific; neither competing with the natural substrates ATP or F6P nor inhibiting the human PFK enzyme. We describe the development and testing of highly potent and specific low molecular weight PFK inhibitors that translate to both killing of cultured T. b. brucei parasites and a cure of stage I HAT in mice models. We describe the tight, 1:1 binding of these compounds with trypanosomatid PFKs, and the thermodynamic characteristics of binding through various biophysical assays. We also show the unprecedented characterisation of the reverse PFK reaction by trypanosomatid and human forms of the enzymes. We found that PFK can also carry out the reverse enzymatic reaction, under physiologically relevant concentrations of ADP and F16BP to produce F6P and ATP. We show that the reverse reaction is also subject to allosteric regulation by AMP, and can be inhibited by the CTCB compounds with a similar potency to the forward reaction. Finally, we describe the mechanism of allosteric activation by AMP and inhibition by the drug-like compounds against trypanosomatid PFKs.

Submitted by Fabíola Silva (fabiola.silva@famerp.br) on 2016-09-27T15:41:08Z No. of bitstreams: 1 marcelomaiacaixetademelo_tese.pdf: 11249406 bytes, checksum: 55e0affbf2716e2a9db836ff23bb3bc8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T15:41:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marcelomaiacaixetademelo_tese.pdf: 11249406 bytes, checksum: 55e0affbf2716e2a9db836ff23bb3bc8 (MD5) Previous issue date: 2014-06-27 / Introduction: Chagasic megaesophagus (ME) is associated with a higher occurrence of esophagus cancer, while adenomas and adenocarcinomas are rare in the Chagasic Megacolon (MC). Concentration alterations in some proteins may be associated either with esophagic and colorectal carcinogenesis or with chagasic megacolon and megaesophagus. Objective: Study the association between digestive Chagas disease and carcinogenesis, considering the influence of c-Myc, GBP-2, APC, IFN- and T.cruzi proteins. Material and Method: Blocks of paraffin wax containing fragments of mucous membrane early diagnosed as 1 – normal esophagus (n=16); 2 – chagasic megaesophagus (n=10); 3 – normal colon (n=10) and 4 – chagasic megacolon (n=10) were selected. These tissues were analysed by means of immunohistochemical technique using c-Myc, GBP-2, APC, IFN- and T.cruzi antibodies. Results: The result of the GBP-2 protein expression showed higher positivity in ME (100%) when compared to MC (40%) (p = 0.011). Comparing ME with normal esophagus there was significant difference (p = 0.001), having 100% of positivity for GBP-2 in megaesophagus and 31.3% in normal esophagus. In the analysis of the IFN- expression in MC and normal colon a higher positivity was observed in MC (90%) in relation to normal colon (30%) being the difference significant (p = 0.02). As for the expression of IFN- protein, a higher positivity was observed in MC (90%) in relation to ME (40%). Conclusions: A higher frequency of expression of GBP-2 protein in chagasic megaesophagus and IFN- in chagasic megacolon explains, respectively, the increase of espinocellular carcinoma incidence in patients with chagasic megaesophagus and the protector effect of the chagasic megacolon against the colorectal adenocarcinoma. / Introdução: Megaesôfago chagásico (ME) está associado a maior ocorrência do câncer de esôfago enquanto no megacólon chagásico (MC) adenomas e adenocarcinomas são raros. Alteração nas concentrações de algumas proteínas pode estar associada tanto à carcinogênese esofágica e colorretal como ao megacólon e megaesôfago chagásicos. Objetivo: estudar a associação entre forma digestiva da doença de Chagas e carcinogênese, considerando-se a influência das proteínas c-Myc, GBP-2, APC, IFN- e T. cruzi. Material e Método: Foram selecionados blocos de parafina contendo fragmentos de mucosa anteriormente diagnosticados como; (1) esôfago normal (n=16); (2) megaesôfago chagásico (n=10); (3) cólon normal (n=10) e (4) megacólon chagásico (n=10). Esses tecidos foram analisados por meio de técnica imunoistoquímica utilizando os anticorpos c-Myc, GBP-2, APC, IFN- e T. cruzi. Resultados: O resultado da expressão da proteína GBP-2 mostrou maior positividade no ME (100%) quando comparado com MC (40%) (P = 0,011). Comparando ME com esôfago normal houve diferença significativa (P = 0,001), tendo 100% de positividade para GBP-2 no megaesôfago e 31,3% no esôfago normal. Na análise da expressão do IFN- no MC e cólon normal verificou-se maior positividade no MC (90%) em relação ao cólon normal (30%), sendo a diferença significativa (P = 0,02). A expressão da proteína IFN- apresentou maior positividade no MC (90%) em relação ao ME (40%). Conclusões: A maior frequência de expressão das proteínas GBP-2 no megaesôfago chagásico e IFN- no megacólon chagásico explicam, respectivamente, o aumento da incidência de carcinoma espinocelular em portadores de megaesôfago chagásico e o efeito protetor do megacólon chagásico contra o adenocarcinoma colorretal.