In dieser Arbeit werden die Synthese eines 286-Reste-langen Proteins, der γ-Untereinheit der ATP-Synthase, seine Rückfaltung und Rekonstitution zum aktiven Proteinkomplex gezeigt.

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In dieser Dissertation wurden Verfahren für die konvergente Synthese von Peptide entwickelt. Für die erweiterte native chemische Ligation kamen bisher raumbeanspruchende Auxiliare zum Einsatz, die anspruchsvolle Ligationen behinderten. Zudem waren die drastischen säure-basierten Abspaltbedinungen mit vielen post-translationalen Modifikationen nicht vereinbar. In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Auxiliargerüst mit geringerem Raumanspruch untersucht, dass eine erheblich mildere Abspaltung unter basischen Bedingungen ermöglichte. Dazu wurde ein kleiner Elektronenakzeptorsubsituent eingeführt, durch den nach der Ligation eine das Zielpeptid freisetzende Eliminierungsreaktion induziert werden konnte. Weiterhin konnte die Verwendung des kommerziell verfügbaren Penicillamins als Vorläufer in der Ligations-Entschwefelungs-Strategie demonstriert werden. Abschließend wurde die Ligation mit sequenz-internem Cystein untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Peptide mit Cystein in einer bestimmten Position bevorzugt in thioester-basierten Kondensationen reagierten. / In this thesis approaches for convergent synthesis of peptides have been developed. In the extended native chemical ligation so far space demanding auxiliaries encumbered challenging condensations. Furthermore the required drastic acidolytic cleavage conditions were furthermore incompatible with many post-translational modifications. In the thesis a nouvelle less space demanding scaffold was scrutinized which allowed a milder basic cleavage. Therefore a small electron-accepting substituent was introduced that enabled the induction of an elimination reaction liberating the target peptide after the peptide ligation had taken place. Furthermore the applicability of the commercially available penicillamine as precursor of valine in the ligation-desulfurization strategy could be demonstrated. Finally the ligation with sequence internal cysteines was scrutinized. Herein it could be shown that certain peptides with cysteine in a distinctive position of the sequence preferable reacted in thioester-based condensation reactions.

Die native chemische Ligation (NCL) ist eine der effizientesten Methoden, um Peptidfragmente zu verknüpfen. Diese Methode jedoch auf das Vorhandensein von Cystein angewiesen. Um diese Beschränkung zu überwinden, wurden Ligationsauxiliare entwickelt, die auch cysteinfreie Peptide zur Ligation befähigen können. Auxiliare ermöglichen zwar die Ligation, diese Ligationen sind jedoch weniger effizient als die ursprüngliche NCL. Der durch das Auxiliar eingeführte sterische Ballast an der Ligationsschnittstelle behindert die Anwendung dieser Hilfsmoleküle. Das bisher erfolgreichste schwefelhaltige Ligationsauxiliar ist das 2-Mercapto-2-phenethyl-(MPE)-Auxiliar, das als erstes Auxiliar die Durchführung von Ligationen an glycinfreien Schnittstellen ermöglichte. Allerdings ist auch das MPE-Auxiliar für die Ligation an anspruchsvolleren Schnittstellen nicht geeignet, da der S→N Acyltransfer unter diesen Umständen stark gehemmt wird. In dieser Arbeit wurde nach effizienteren Auxiliar-Designs gesucht, die Ligationen auch an stark sterisch belasteten Schnittstellen ermöglichen. Die Entwicklung neuer Auxiliare ging dabei vom MPE-Auxiliar aus und es wurden drei unterschiedliche Ansätze für die Verbesserung der Ligationseigenschaften untersucht: Die Einführung von Substituenten in para Position am Phenylring des MPE-Auxiliars, die Untersuchung des Einflusses des Dialkyl-Effektes auf die Auxiliareffektivität und die Einführung einer Base in das Auxiliargerüst in Form eines Pyridins. Das aus der dritten Variante resultierende 2-Mercapto-2(pyridin-2-yl)ethyl-(MPyE)-Auxiliar zeigte dabei als einziges neu entwickelte Auxiliar einen deutlich verbesserten Einfluss auf die Ligationseigenschaften. In verschiedenen Experimenten und durch quantenchemische Rechnungen konnte gezeigt werden, dass der Pyridin-Stickstoff als interne Base ligationsunterstützend fungiert. In dieser Arbeit wurde somit das erste Ligationsauxiliar entdeckt, in dem das Auxiliargerüst aktiv an der Ligation teilnimmt. / The Native chemical ligation (NCL) is one of the most efficient methods for linking peptide fragments, but it is dependent on the presence of cysteine. To overcome this limitation, ligation auxiliaries have been developed that can also enable cysteine-free peptide fragments to be ligated. Although auxiliaries enable ligation, these ligation reactions are less efficient than the original NCL. The steric ballast introduced by the auxiliary at the ligation junction hinders the use of these auxiliaries at most junctions. The most successful sulfur-containing ligation auxiliary to date is the 2-mercapto-2-phenethyl (MPE) auxiliary, which was the first auxiliary to allow ligations to be carried out at glycine-free junction. However, the MPE auxiliary is not suitable for ligation at more sterically demanding junctions, as the S→N acyl transfer is strongly inhibited under these circumstances. This work sought more efficient auxiliary designs that enable ligation reactions even at highly sterically loaded ligation junctions. The development of new auxiliary designs was based on the MPE auxiliary and three different approaches for improving the ligation properties were investigated: The introduction of substituents in para-position on the phenyl ring of the MPE auxiliary, the investigation of the influence of the dialkyl effect on the auxiliary efficiency and the introduction of a base into the auxiliary scaffold in the form of a pyridine. The 2-mercapto-2(pyridin-2-yl)ethyl (MPyE) auxiliary resulting from the third variant was the only newly developed auxiliary to show a significantly improved influence on its ligation properties. Various experiments and quantum chemical calculations showed that the pyridine nitrogen acts as an internal base to support ligation. In this work, the first ligation auxiliary was discovered in which the auxiliary scaffold actively participates in the ligation reaction.

La ligation chimique implique la liaison des molécules de manière covalente pour former un nouveau complexe ayant les propriétés combinées de ses composants individuels. Ainsi, les composés naturels ou synthétiques avec leurs activités individuelles peuvent être conjuguer pour créer des substances possédant des caractéristiques uniques. Un domaine d' intérêt particulier à ces procédures est le marquage de protéines. Afin de simplifier et d'accélérer la découverte de nouvelles réactions de ligation bioselectives, nous avons conçu un système de screening rapide pour attribuer de la sélectivité et de la réactivité d'un groupement fonctionnel vers une série de dérivés d'acides aminés traçable. Une fonction chimique à propriétés prometteuse – 3-arylpropiolonitrile (APN) – a été identifiée. Les études comparatives ont démontré que cette technique offrait une meilleure sélectivité et stabilité par rapport à la technologie classique basée sur l’utilisation du groupement maléimide. L’utilisation de l’APN permet d’obtenir des bioconjugués propres et résistants à la décomposition, ce qui est d’une importance cruciale pour les applications médicales. Étude structure-réactivité nous a permis d'optimiser ses propriétés et de préparer une série de sondes fonctionnelles, dont un a été utilisé pour tester la sélectivité d'APN sur les mélanges modèles de peptides. De plus, les APN ont été trouvés à posséder une sélectivité élevée vers sélénocystéine: un acide aminé rare mais très important présent dans de nombreux enzymes actives. Une série des APN a été testée pour son activité inhibitrice envers une enzyme contenant sélénocystéine – thiorédoxine réductase – et s'est révélé posséder des activités élevées Enfin, une approche combinatoire de type split and mix a été développée visant à identifier des séquences peptidiques possédant la réactivité élevée avec les réactifs biosélectifs déjà connus. / Chemical ligation involves the linking of molecules in covalent manner to form a novel complex having the combined properties of its individual components. Thus, natural or synthetic compounds with their individual activities can be chemically combined to create unique substances possessing carefully engineered characteristics. A field of especial interest in such ligation procedures is protein labeling.To accelerate the discovery of new bioselective ligation reactions, we designed a screening system for fast assigning of the selectivity and reactivity of a given functional group owards series of UVGtraceable amino acid derivatives. As a result of our screening a promising cysteineGselective scaffold–3Garylpropiolonitrile (APN)–was identified. Its remarkable selectivity, high reactivity and of both starting and addition products in aqueous and organic media represents an important advantage compared to methodologies classically used for cysteine tagging. StructureGreactivity study allowed us to optimise its properties and toprepare a series of funcional probes, one of which was used for!an accurate test of APN selectivity on model mixtures of peptides. Furthermore, APN were found to possess an elevated selectivity towards selenocysteine:ararebut very important amino!acid found in many active enzymes.A series of APN was tested for their inhibitory activity towards one of such selenocysteineGcontaining enzyme–thioredoxine reductase–and was found to possess promising activities, which however still must be!optimised.Lastly, a screening system devoted to the discovery of reagents reactivity towards a sequence of amino acid residue was elaborated and allowed us to determine presumable discrepancy in reactivity of APN depending on the amino acid residue neighbouring the cysteine moiety. Such difference in reactivity may represent an important advantage for bioconjugation, and is currently under further investigation.

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Reaktionen zwischen reaktiven Oligonukleotiden, die durch komplementäre Nukleinsäuretemplate in hoher effektiver Molarität angeordnet werden, haben auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik an Bedeutung gewonnen. Sie bieten die Möglichkeit zur Erzeugung von mehreren Signalmolekülen pro Templat, wenn die templatgebundenen Produkte durch neue Reaktanden verdrängt werden. Da die Produkte ebenfalls hohe Templataffinitäten aufweisen, schränken sie jedoch die katalytische Templataktivität ein (Produktinhibierung). In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein neuer Ansatz zur Umgehung der Produktinhibierung entwickelt. Dazu wurde eine DNA-vermittelte PNA-Verknüpfungsreaktion in eine PCR integriert. Die Reaktion wurde direkt durch das während der PCR vervielfältigte Templat ausgelöst und erfolgreich in der einzelbasenspezifischen Genotypisierung von genomischer DNA eingesetzt. Die Nachweisgrenze war mit 30 Templatmolekülen im Vergleich zu bisherigen templatgesteuerten Reaktionen um etliche Größenordnungen niedriger. Ein alternativer Ansatz widmete sich neuen Strategien zur Verminderung der Produktinhibierung. Templatgesteuerte Verknüpfungs-Zyklisierungsreaktionen lieferten zyklische Verknüpfungsprodukte, welche gegenüber ihren linearen Pendants durch deutlich geringere Templataffinitäten gekennzeichnet waren. Daher überstiegen die Ausbeuten jene von Verknüpfungsreaktionen ohne Zyklisierung. Die Zunahme der Templataffinität in Folge der Verknüpfung wurde jedoch durch die Zyklisierung nicht vollständig kompensiert. Daher wurden templatgesteuerte Transferreakionen entwickelt, bei denen das DNA-Templat die Zyklisierung von nicht verknüpften Reaktionsprodukten steuert. Diese waren durch geringere Templataffinitäten als die linearen Reaktanden gekennzeichnet. Die Transfer-Zyklisierungsreaktionen lieferten bei fortgeschrittener Reaktion höhere Ausbeuten als Transferreaktionen ohne Zyklisierungsschritt. Dies bestätigte die erfolgreiche Verminderung der Produktinhibierung. / Reactions between reactive oligonucleotides that are aligned by complementary nucleic acid templates at high effective molarities have gained considerable attention in the field of nucleic acid diagnostics. They are capable of generating multiple signaling molecules per target, if the template-bound products are replaced by fresh reactants. However, since product molecules usually exhibit high template affinities, they impede the catalytic activity of the template (product inhibition). This work initially describes the development of a new approach that bypasses product inhibiton. To this end, a DNA-mediated PNA-ligation reaction was integrated in a PCR. The reaction was directly triggered by the template which was amplified during PCR. Furthermore, the reaction was successfully applied in single base-specific genotyping of genomic DNA. The limit of detection (30 template molecules) was several magnitudes lower compared to previous template-controlled reactions. In an alternative approach, new strategies to reduce product inhibition were developed. Template-mediated ligation-cyclization (“cycligation”) reactions generated cyclic ligation products that were characterized by significantly lower template affinities compared to their linear counterparts. The yields upon cycligation were higher than those from ligation reactions without cyclization. However, the increase in template affinity gained upon ligation of the reactants could not be completely compensated through product cyclization. Therefore, template-mediated transfer reactions were designed in which the DNA-template actuates the cyclization of non-ligated products. These were characterized by reduced template affinities compared to the linear reactants. The transfer-cyclization reactions produced higher yields than transfer reactions without a cyclization step, thereby confirming the successful reduction of product inhibition.

In dieser Arbeit wurde geprüft, ob eine sequenzspezifische Hybridisierung von zwei Peptid-PNA-Konjugaten an einem komplementären DNA-Templat die Bildung eines neuen Peptids auslösen kann, welches proapoptotische Eigenschaften besitzt. Dazu binden zwei kurze PNA-Oligomere an einem komplementären DNA-Templat und ermöglichen dadurch den Transfer einer Aminoacylgruppe. In den vorgestellten Untersuchungen trug ein Oligomer einen Alaninrest, welcher C-terminal als Thioester gebunden war. An das zweite PNA-Oligomer war ein Peptid mit N-terminalem Cysteinrest geknüpft. Mittels einer Cystein-vermittelten Transferreaktion wurde die Aminoacyleinheit auf das Akzeptor-Konjugat übertragen und es entstand das freie PNA-Oligomer sowie ein neues Peptid. Die so generierten Peptid-PNA-Konjugate waren so konstruiert, dass sie an BIR3 binden und damit dessen Interaktion mit Caspase-9, einem Schlüsselenzym der Apoptose, entgegenwirken konnten. Es wurde ein Assay entwickelt, bei dem die DNA-gesteuerte Transferreaktion mit der Aktivierung der Caspase-9 aus dem inhibitorischen Komplex mit BIR3 in HEK293-Zelllysat kombiniert wurde. Als Vorbereitung für eine intrazelluläre Anwendung der Nukleinsäuretemplat-katalysierten Peptidsynthese wurde zunächst die Stabilität der Konjugate in Zelllysat untersucht und weiterhin eine Synthesestrategie zur PEGylierung der verwendeten Peptid-PNA-Konjugate entwickelt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass mit dem DNA-gesteuerten Aminoacyltransfer zum ersten Mal eine Methode aufgezeigt wurde, welche die in Nukleinsäuren kodierte Information für die Generierung eines Wirkstoffes nutzt, der die Aktivität eines Proteins kontrollieren kann. Die Synthese des aktiven Peptidwirkstoffes gelang in der komplexen Umgebung von Zelllysat, erfolgte sequenzspezifisch und in Gegenwart substöchiometrischer Konzentrationen des Templats. / In this thesis it was investigated, whether the sequence specific hybridisation of two peptide-PNA conjugates could trigger the formation of a new peptide with proapoptotic properties. The method draws upon a nucleic acid-templated reaction, in which two short PNA oligomers bind adjacently on a complementary DNA template enabling the transfer of an amino acyl group. In the presented study one oligomer carried an alanine residue that was C-terminally attached to the PNA sequence via a thioester linkage. The second PNA oligomer conferred a peptide with an N-terminal cysteine residue and served as acceptor. In a cysteine mediated transfer reaction an amino acyl moiety was transferred to the acceptor conjugate yielding a free PNA oligomer and a new peptide. The generated peptide-PNA conjugates were designed to bind BIR3 protein and therefore interrupt its interaction with caspase-9 a key enzyme of apoptosis. In a cell free functional assay, which included recombinant BIR3 protein and HEK293 cell lysate, the peptide-PNA conjugates formed upon the DNA-triggered peptide synthesis acted as BIR3 antagonists and allowed reactivation of inhibited initiator caspase-9 as well as of the executioner caspase-3. Preliminary studies for future intracellular applications of this method included the investigation of the stability of the peptide-PNA conjugates in cell lysate and the development of a synthetic strategy for the PEGylation of the conjugates. With the DNA-triggered peptide synthesis via aminoacyl transfer we introduced a method, which allows for the translation of nucleic acid information into the output of molecules that interfere with disease-related protein-protein interactions. The synthesis of the active peptide drug proceeds sequence specifically and shows turnover in template even in a complex biomolecular environment such as cell lysate.

Protein-Arrays sind das Mittel der Wahl, um eine Vielzahl von Proteinen parallel zu untersuchen. Ziele dieser Untersuchungen sind meistens Proteininteraktionsnetzwerke zu entdecken oder besser verstehen zu können. Bisher wurden die benötigten Proteine fast ausschließlich mit biologischen Methoden gewonnen. Diese bieten allerdings keinen generellen Zugang zu posttranslational-modi-fizierten (PTM)-Proteinen. Somit war es bisher nicht möglich den Einfluss von PTMs auf Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) im Arrayformat zu untersuchen. Die chemische Synthese kann dagegen Proteine mit ortsspezifischen PTMs liefern. Daher ist es verwunderlich, dass bislang noch keine Berichte über chemisch hergestellte PTM-Protein-Arrays existieren, besonders da PTMs meist entscheidend für proteomische Interaktionsnetzwerke sind. In der vorliegenden Arbeit wird eine Methodik beschrieben, die es ermöglicht PTM-modifizierte Protein-Domänen-Arrays auf der Oberfläche zu synthetisieren und zu analysieren. Mit der Methodik wurden 20 SH3-Domänen synthetisiert und 64 PPIs gemessen. Neben vier Hefe-SH3-Domänen wurden je acht humane (Phospho)SH3-Domänen der Abl- und Arg(Abl2)-Tyrosinkinase synthetisiert und funktionell untersucht. Es wurde gefunden, dass die Ligandenspezifität von Abl-SH3-Domänen durch Phosphorylierung feinreguliert wird. Je nach Phosphorylierungsmustern wurde die Affinität für spezifische Liganden erhöht oder erniedrigt. Der Ursprung dieser Phosphoregulierung wurde für die Abl-SH3-Domäne mit Hilfe der NMR-Spektroskopie und durch Zellexperimente versucht zu entschlüsseln und weiter validiert. / Protein-arrays are the method of choice to investigate a variety of proteins in a parallel fashion. Objectives of these studies are mostly to discover or to investigate protein interaction networks. So far, the necessary proteins were almost exclusively gained by biological methods. Unfortunately, generic access to proteins bearing post-translational modifications (PTM) is not provided by these techniques. Therefore, it was not possible to investigate the impact of PTMs on protein-protein-interactions (PPIs) on arrays so far. Chemical synthesis in contrast offers proteins with site-specific PTM incorporation. In this context, it is surprising, that chemical methods of PTM-protein array synthesis remained virtually unexplored, especially since these modifications are usually crucial for proteomic interaction networks. In this thesis, a methodology is described, that allows to synthesize and functional analyse post-translationally modified protein domain arrays on the surface. By using this methodology, 20 SH3 domains were synthesized and 64 protein-pep-tide interactions were measured. In addition to 4 yeast SH3 domains, 8 human (phospho) SH3 domains of the Abl and Arg(Abl2) tyrosine kinase were synthesized and functionally investigated. The experiments revealed that phosphorylation might serve as a means to fine tune the ligand recognition. Depending on the phosphorylation pattern the affinity to specific interaction partners were enhanced or reduced. The origin of this phosphoregulation was further investigated for the Abl SH3 domain by means of NMR spectroscopy and cellular experiments.

Die Verwendung von nukleinsäuretemplatgesteuerten Reaktionen stellt einen innovativen Ansatz zur Therapie von Krankheiten dar, deren Ursprung in einer genetischen Veränderung von Zellen liegt. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit erfolgte eine Weiterentwicklung der RNA-templatgesteuerten Acyltransferreaktion nach Seitz et al. hinsichtlich des Aufbaus von aromatischen Amidbindungen, wie sie in vielen niedermolekularen Wirkstoffen vorkommen. Als Modellverbindungen dienten die Bcr-Abl-Tyrosinkinaseinhibitoren Nilotinib, Ponatinib und GZD824, die durch zentrale Benzanilidmotive charakterisiert sind und zur Therapie der chronischen myeloischen Leukämie eingesetzt werden. Das konzipierte Reaktionssystem beruht auf dem Mechanismus der nativen chemischen Ligation, weswegen die Bcr-Abl-Inhibitoren durch die Einführung einer Thiolgruppe modifiziert werden mussten. Es wurde gezeigt, dass diese Modifikation in den meisten Fällen nur zu einer geringen Beeinträchtigung der biologischen Aktivität führt. Der RNA-templatgesteuerte Aufbau der Benzanilidstrukturen konnte sowohl mit PNA- als auch mit DNA-verknüpften Inhibitorfragmenten basierend auf Ponatinib und GZD824 erzielt werden. In Gegenwart eines komplementären RNA-Templats erfolgte die benachbarte Hybridisierung der reaktiven Konjugate, infolgedessen ein Benzoyltransfer von einem thioestermodifizierten Donor auf ein ortho-Mercaptoanilinderivat als Akzeptor stattfand. Mit PNA/PNA-Reaktionssystemen wurde auch in Abwesenheit des RNA-Templats eine signifikante Produktbildung beobachtet, was auf hydrophobe Wechselwirkungen der Konjugate zurückgeführt wurde. Unter Verwendung von DNA/DNA- bzw. PNA/DNA-Konjugatpaaren blieb die templatunabhängige Produktbildung hingegen ausreichend gering. Die entsprechenden Reaktionssysteme wurden hinsichtlich der erzielten Produktausbeuten optimiert, wobei sowohl die Linkerlänge bzw. -struktur der reaktiven Konjugate als auch die Templatarchitektur variiert wurde. / The use of nucleic acid-templated reactions represents an innovative approach to the therapy of diseases that originate in genetic alterations of cells. In this work, the RNA-templated acyl transfer reaction invented by Seitz et al. was extended towards the formation of aromatic amide bonds which occur in a variety of small molecule drugs. The Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors nilotinib, ponatinib, and GZD824 were used as model compounds, as they are characterized by central benzanilide motifs and find application in the treatment of chronic myeloid leukemia. The designed reaction system is based on the mechanism of native chemical ligation which required the modification of the Bcr-Abl inhibitors by introducing a thiol group. It was shown that thiolation affected the biological activity only moderately. The RNA-templated formation of the benzanilide structures was achieved with both PNA- and DNA-linked inhibitor fragments of ponatinib and GZD824. The presence of a complementary RNA template enabled adjacent binding of the reactive conjugates, triggering a rapid benzoyl transfer from a thioester-linked donor to an ortho-mercaptoaniline derivative as an acceptor. With PNA/PNA reaction systems, significant product formation was observed in absence of the RNA template, which was attributed to hydrophobic interactions between the conjugates. However, the template-independent product formation remained low when DNA/DNA or PNA/DNA conjugate pairs were used. The product yields of the corresponding reaction systems were optimized by varying the linker length and structure of the conjugates as well as the template architecture.