O objetivo deste estudo foi avaliar quais os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) mais prescritos entre 100 ortodontistas pesquisados, para alívio da dor durante o tratamento ortodôntico corretivo. E analisar a Influência do mecanismo de ação dos fármacos selecionados e do fármaco nimesulida (seletivo COX-2) durante a movimentação dentária induzida em ratos e nas reabsorções radiculares associadas do ponto de vista celular e tecidual ao microscópio óptico. Foi utilizada uma amostra de 80 ratos albinos da linhagem Wistar com cerca de 300g, os quais obtiveram a instalação do aparelho ortodôntico preconizado por Heller e Nanda que era constituído por uma mola de secção fechada ancorada aos incisivos centrais superiores, movimentando mesialmente o primeiro molar superior esquerdo. Os animais foram divididos em quatro grupos: paracetamol, ibuprofeno, nimesulida e controle (livre de medicamentos) em cada um dos grupos havia 20 animais, os quais foram divididos em subgrupos de acordo com o tempo de tratamento da movimentação dentária induzida: três, cinco e sete dias, submetidos à medicação diariamente. Posteriormente, os animais receberam doses letais da mistura de relaxante muscular e anestésico por via intramuscular, para coleta do material, o qual foi devidamente processado e submetido à análise microscópica por meio de cortes transversais dos molares. Os resultados mostraram que os fármacos de primeira opção na prescrição medicamentosa para dor durante o tratamento ortodôntico foi o paracetamol e a segunda opção o ibuprofeno. As análises microscópicas revelaram durante a movimentação dentária induzida que não houve diferença estatisticamente significante para as reabsorções radiculares e áreas hialinas com relação ao uso do paracetamol, ibuprofeno, nimesulida e grupo controle. / This aim of this study was to investigate which non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) the most prescribed for pain relief during orthodontic treatment among 100 surveyed orthodontists; also to analyze the influence of the mechanism of action of drugs selected and the drug nimesulide (selective COX-2) during induced tooth movement in rats and associated root resorption in terms of cellular and tissue under an optical microscope. We used a sample of 80 Wistar rats (Rattus norvergicus, albinus) weighting about 300g, which obtained the installation of braces recommended by Heller and Nanda who was constituted by a spring anchored to the closed section of the upper central incisors, moving mesially the first left molar. The animals were divided into four groups: paracetamol, ibuprofen, nimesulide and control (drug free). Each group had 20 animals, and they were divided into subgroups according to duration of treatment of induced tooth movement: three, five and seven days, subjected to daily medication. Posteriorly, the animals received lethal doses intramuscular of mixture of muscle relaxant and anesthetic, to collect the material, which was duly processed and subjected to microscopic analysis using transverse sections of the molars. The results showed that the first choice drug prescribed for pain during orthodontic treatment was paracetamol and second option was ibuprofen. Microscopic analysis revealed during induced tooth movement that there was no statistically significant difference in the root resorption and hyaline areas in relation to the usage of paracetamol, ibuprofen, nimesulide and control groups.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:22:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reila Mendes.pdf: 2640941 bytes, checksum: ae80dd043b80ca7c3792d907a25ab34f (MD5) Previous issue date: 2012-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Periodontal disease is an inflammatory chronic disorder caused by a small group of gram-negatives bacteria witch colonizes the subgengival area. This disease is characterized by the destruction of the periodontal tissues, including bone resorption and loss of clinical attachment level. Observational studies have shown an increase in the risk of cardiovascular diseases, specially atherosclerosis and hypertension, among the subjects affected by the periodontal disease. The literature also reports endothelial dysfunction among these patients. Data suggest that the systemic inflammation due to the biofilm present in periodontits and the reduction in the nitric oxide availability may be, at least in part, the cause of endothelial dysfunction, which leads to cardiovascular disorders. An increase in vascular COX-2 expression has been demonstrated among diseases related to endothelial dysfunction. COX-2 expression seems to have an important protector function through the production of arachidonic acid metabolites with vasodilator and antitrombotic properties. Therefore, COX-2 inhibition may represent negative cardiovascular implications. The purpose of this research was to evaluate the effect of COX-2 inhibition on the vascular reactivity and on the heart tissue of animals with periodontitis. At day 0, Wistar rats were subdivided into the following groups: ligature + etoricoxib (the animals received ligatures and were treated with etoricoxib 10 mg/kg p.o., for seven days, from the day 14), ligature + vehicle (the animals were treated with distilled water), sham + etoricoxib (the animals went through a sham procedure: the ligatures were positioned and immediately removed) and sham + vehicle. The rats were prepared for the data collection and sacrificed at day 21. Changes on the vasoconstrictor response were not observed. However, the group ligature + etoricoxib showed a tendency to have the vasodilator response reduced. All the groups showed histological cardiac alterations, especially the groups that received etoricoxib, when submitted to ischemia with isoprenaline. It is suggested, though, that COX-2 inhibition in an experimental model of periodontal disease may increase cardiovascular disorders. / A periodontite é uma doença inflamatória crônica iniciada e perpetuada por bactérias anaeróbicas gram-negativas que colonizam a área subgengival. Esta doença é caracterizada pela destruição do tecido periodontal de inserção, reabsorção óssea, infiltração de leucócitos e formação de bolsa periodontal. Estudos observacionais têm mostrado um significativo aumento do risco de doenças cardiovasculares, principalmente aterosclerose e hipertensão, entre pessoas com periodontite. A literatura mostra também a presença de disfunção endotelial nesses pacientes. Os dados sugerem que a inflamação sistêmica induzida pela microbiota presente na doença periodontal e a diminuição na biodisponibilidade do óxido nítrico podem ser, pelo menos em parte, a causa da disfunção endotelial, que por sua vez leva a doenças cardiovasculares. Um aumento na expressão vascular da ciclooxigenase-2 (COX-2) tem sido consistentemente demonstrado em patologias que apresentam disfunção endotelial. A expressão da COX-2 nesta condição parece ter um importante papel protetor através da produção de metabólitos do ácido araquidônico com propriedades vasodilatadoras e antitrombóticas. Dessa maneira, a inibição da COX-2 pode apresentar aspectos cardiovasculares negativos. Assim, a proposta deste trabalho foi avaliar o efeito da inibição COX-2 sobre a reatividade vascular e sobre o tecido cardíaco de animais com periodontite. No dia 0, ratos Wistar foram subdivididos nos seguintes grupos: ligadura + etoricoxibe (receberam ligaduras e foram medicados com etoricoxibe 10 mg/kg v.o. por sete dias, a partir do dia 14), ligadura + veículo (receberam água destilada), falso-operado + etoricoxibe (passaram pelo procedimento de falsa-cirurgia, as ligaduras foram colocadas e imediatamente removidas) e falso-operado + veículo. Os animais foram preparados para aferição dos dados e sacrificados no dia 21. Não foram observadas alterações na resposta vasoconstritora, porém o grupo ligadura + etoricoxibe mostrou uma tendência em ter a resposta vasodilatadora reduzida. Quando submetidos à isquemia com isoprenalina, todos os grupos apresentaram alterações histológicas cardíacas, especialmente os que receberam etoricoxibe. Sugere-se, pois, que a inibição da COX-2 em um modelo experimental de periodontite exacerbe alterações cardiovasculares.

Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

O objetivo deste estudo foi avaliar quais os anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) mais prescritos entre 100 ortodontistas pesquisados, para alívio da dor durante o tratamento ortodôntico corretivo. E analisar a Influência do mecanismo de ação dos fármacos selecionados e do fármaco nimesulida (seletivo COX-2) durante a movimentação dentária induzida em ratos e nas reabsorções radiculares associadas do ponto de vista celular e tecidual ao microscópio óptico. Foi utilizada uma amostra de 80 ratos albinos da linhagem Wistar com cerca de 300g, os quais obtiveram a instalação do aparelho ortodôntico preconizado por Heller e Nanda que era constituído por uma mola de secção fechada ancorada aos incisivos centrais superiores, movimentando mesialmente o primeiro molar superior esquerdo. Os animais foram divididos em quatro grupos: paracetamol, ibuprofeno, nimesulida e controle (livre de medicamentos) em cada um dos grupos havia 20 animais, os quais foram divididos em subgrupos de acordo com o tempo de tratamento da movimentação dentária induzida: três, cinco e sete dias, submetidos à medicação diariamente. Posteriormente, os animais receberam doses letais da mistura de relaxante muscular e anestésico por via intramuscular, para coleta do material, o qual foi devidamente processado e submetido à análise microscópica por meio de cortes transversais dos molares. Os resultados mostraram que os fármacos de primeira opção na prescrição medicamentosa para dor durante o tratamento ortodôntico foi o paracetamol e a segunda opção o ibuprofeno. As análises microscópicas revelaram durante a movimentação dentária induzida que não houve diferença estatisticamente significante para as reabsorções radiculares e áreas hialinas com relação ao uso do paracetamol, ibuprofeno, nimesulida e grupo controle. / This aim of this study was to investigate which non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) the most prescribed for pain relief during orthodontic treatment among 100 surveyed orthodontists; also to analyze the influence of the mechanism of action of drugs selected and the drug nimesulide (selective COX-2) during induced tooth movement in rats and associated root resorption in terms of cellular and tissue under an optical microscope. We used a sample of 80 Wistar rats (Rattus norvergicus, albinus) weighting about 300g, which obtained the installation of braces recommended by Heller and Nanda who was constituted by a spring anchored to the closed section of the upper central incisors, moving mesially the first left molar. The animals were divided into four groups: paracetamol, ibuprofen, nimesulide and control (drug free). Each group had 20 animals, and they were divided into subgroups according to duration of treatment of induced tooth movement: three, five and seven days, subjected to daily medication. Posteriorly, the animals received lethal doses intramuscular of mixture of muscle relaxant and anesthetic, to collect the material, which was duly processed and subjected to microscopic analysis using transverse sections of the molars. The results showed that the first choice drug prescribed for pain during orthodontic treatment was paracetamol and second option was ibuprofen. Microscopic analysis revealed during induced tooth movement that there was no statistically significant difference in the root resorption and hyaline areas in relation to the usage of paracetamol, ibuprofen, nimesulide and control groups.

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A resposta imune sistêmica contra o parasito é tipicamente do perfil Th1, com síntese de citocinas próinflamatórias, principalmente IFN, responsável pela redução da proliferação parasitária. Por outro lado, este perfil de resposta modifica-se durante o período gestacional, em que o balanço da resposta Th1 e Th2 aparentemente favorece a sobrevivência do concepto. Semelhante a isto, observa-se o mesmo padrão de resposta no sistema nervoso central (SNC), local de encistamento do parasito. Estudos anteriores apontaram que IDO (indolamina 2,3 dioxigenase) é modulada por IFN e que participa no controle da proliferação parasitária. Em estudos de neuroinflamação usando co-culturas de células gliais/neurônios infectadas por N. caninum, observou-se controle da proliferação parasitária por um mecanismo independente da enzima óxido nítrico sintase induzida por IFN. No interesse de esclarecer o mecanismo de controle parasitário neste modelo in vitro, a atividade da IDO e da ciclooxigenase 2 (COX-2) foram estudas. Co-culturas celulares glia/neurônios obtidas de ratos foram tratadas com o inibidor da IDO (1-metil triptofano/10-3M/mL) e com inibidores da COX-1 (indometacina10-6 M/mL) e da COX- 2 (nimesulida/10-6 M/mL) antes da infecção com taquizoítos de N.caninum (1:1 célula:parasito). Após 72 horas de infecção, as atividades enzimáticas foram avaliadas e seus fenótipos foram determinados usando anticorpos anti-βIII tubulin, OX-42 and GFAP para observar neurônios, microglia e astrócitos respectivamente. O perfil da resposta imunológica foi determinado por dosagem das citocinas IL-10, IFN e TNF pelo ensaio de ELISA. Notou-se duas vezes mais o aumento na atividade da enzima IDO em co-culuturas infectadas pela dosagem de cinurenina. Em culturas tratadas com o inibidor da IDO (1-MT) e infectadas com taquizoitos ocorreu aumento na proliferação parasitária de aproximadamente 40%, bem como aumento na atividade da IDO. Pertinente a atividade da COX-2, culturas infectadas produzem PGE2, enquanto tratamento com nimesulida permite o crescimento parasitário e induz perda de aproximadamente 30% e 50% de astrócitos e microglia respectivamente, no entanto os neurônios foram preservados. A infecção por taquizoítos promove síntese de IL-10 e TNF, ainda na presença do inibidor da IDO, mas não ocorre liberação de IFN. Estes dados indicam que neste modelo experimental a atividade da IDO é ativada por um mecanismo independente IFN e que o controle parasitário pode ser mediado pelo efeito sinérgico de PGE2 e TNF. Assim, a ativação da COX-2 parece ser um importante via de controle, ao passo que PGE2 associada a IL-10 podem modular a inflamação e permitem a continuidade do parasitismo. / Neospora caninum is an obligate intracellular protozoan that has been very studied by Veterinary Medicine because it causes neuromuscular disorders in dogs and abortion in cattle. The protective systemic immune response against this parasite is predominantly Th1 pattern, which there is proinflammatory cytokines production, mainly IFN, responsible for reduction of parasite burden. However, this response profile appears to be modified during pregnancy in chronically infected animals, in which a balance of production of Th1 and Th2 cytokines appears to favors fetal survival. The same was suggested occur in the central nervous system (CNS), local of parasite encystment. Previous data showed that IDO (indolamine 2,3 dioxygenase) is modulated by IFN in cell proliferation control. In studies of neuroinflammation using neuro-glia co-cultures infected by Neospora caninum, it was verified parasite control by a mechanism independent of type 2 nitric oxide synthetase (iNOS) induced by IFN. In order to clarify the mechanism of parasite control in this in vitro model, the activities of IDO and cyclooxygenase 2 (COX-2) were studied. Co-cultures of glia/neuron obtained from rat brains were treated with the inhibitor of IDO (1-methyl tryptohan/10-3M/mL) and with inhibitors of COX-1 (indomethacin/10-6 M/mL) and COX-2 (nimesulide/10-6 M/mL) before infection with tachyzoites of N.caninum (1:1 cell:cell). After 72 hours enzymes activities were evaluated and cell phenotypes determinate using βIII tubulin, OX-42 and GFAP to observe neurons, microglia and astrocytes respectively. Immunological profile of response was determinate by ELISA tests of IL-10, IFN and TNF. It was verified that parasite infection in co-cultures increased twice IDO activity measured by kinurenin releasing. In cultures treated with IDO inhibitor 1-MT and infected with tachyzoites it was verified about 40% of parasite proliferation and an increasing of enzyme activity. Concerning to COX-2 activity, infected cultures stimulated the release of PGE2, while nimesulide allowed the parasitic growth and a lost of 30 or 50% of astrocytes and microglia respectively, however was preserved neurons in cultures infected. Infection increases IL-10 and TNF even upon IDO inhibition but it does not release IFN. These data indicate that in this in vitro system IDO is activated by a mechanism independent of IFNy and parasite control could be mediated by synergistic effects of PGE2 and TNF. In fact, COX-2 activation seems to be an important via in parasite control and PGE2 associated to IL-10 besides to modulate the inflammation, allows continuity of parasitism.

Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

O Carcinoma de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC) é uma doença freqüentemente letal e altamente resistente à terapia oncológica convencional, como por exemplo, o tratamento quimioterápico com cisplatina e paclitaxel. A superexpressão de Ciclooxigenase-2 (COX-2) é constantemente observada em pacientes com NSCLC, estando associada ao prognóstico ruim destes pacientes. Acredita-se que a alta expressão de COX-2 produz efeitos anti-apoptóticos, porém pouco é conhecido sobre os mecanismos de regulação desta enzima. Muitos sinais capazes de ativar COX-2 também induzem a proteína supressora de tumor p53, conhecida pelo seu papel fundamental no controle da proliferação celular e apoptose. Dados recentes indicam que a proteína p53 é um importante regulador da expressão de COX-2. O objetivo desta dissertação foi avaliar os efeitos da quimioterapia na expressão da enzima COX-2 em linhagens celulares com diferente status do gene TP53, e ainda, correlacionar a expressão de COX-2 e o status mutacional de TP53, com as características clínico-patológicas de pacientes com NSCLC. Como ferramentas experimentais foram usadas técnicas de biologia celular e molecular como interferência de RNA, PCR em tempo real, análise mutacional e imuno-histoquímica. Com os resultados obtidos, observamos que as linhagens celulares de câncer de pulmão que apresentam p53 na sua forma selvagem, quando expostas ao tratamento com cisplatina, apresentaram indução da expressão de COX-2 (RNAm e proteína), em adição ao aumento da síntese de Prostaglandina E2 (PGE2). Em contrapartida, a expressão de COX-2 não foi alterada após o tratamento com cisplatina nas linhagens celulares que apresentavam mutação no gene TP53. Ao avaliar o tratamento com paclitaxel, foi observado um aumento da expressão de COX-2 nas linhagens A549 e H460 (linhagens celulares do tipo selvagem para p53), entretanto não foi observada alteração nos níveis de PGE2. Em adição, o tratamento com paclitaxel induziu um aumento da expressão de COX-2 na linhagem com deleção em TP53, ACC LC-319. Em seguida, após silenciamento de p53 na linhagem celular A549, por interferência de RNA, a cisplatina passou a não ser mais capaz de induzir o aumento da expressão de COX-2. No tratamento com paclitaxel, o silenciamento de TP53 não mudou a expressão de COX-2, indicando assim um efeito independente de p53. Dessa maneira, sugerimos que a indução de COX-2, por cisplatina, em linhagens celulares NSCLC é dependente de p53. Na análise dos pacientes NSCLC, os resultados demonstram que 54% dos pacientes apresentam expressão positiva de COX-2. Mutações em TP53 foram observadas em 57% dos pacientes, incluindo 56% de fumantes correntes e 37% de ex-fumantes. Uma associação entre a expressão de COX-2 e o status selvagem de TP53 foi observada, entre os pacientes que apresentaram expressão positiva de COX-2, 80% apresentaram TP53 selvagem. Um número maior de pacientes é necessário para aumentar o poder estatístico e confirmar as tendências observadas nesse estudo / Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) is a lethal disease and highly resistant to conventional chemotherapeutic agents, like cisplatin and paclitaxel. Overexpression of cyclooxygenase-2 (COX-2) is frequently found in NSCLC, and is associated with a bad prognosis. High COX-2 expression is thought to exert antiapoptotic effects in cancer, but little is known about COX-2 regulation. Many signals that activate COX-2 also induce the tumor suppressor protein p53, which is believed to play a pivotal role in controlling proliferation and apoptosis. Recent data indicate the tumor suppressor protein p53 as an important regulator of COX-2. The main objective of this work was to analyze the effect of chemotherapy on the expression of COX-2 according to TP53 status and also evaluate the relationship between COX-2 expression and TP53 mutational status, according to clinic pathological features in NSCLC patients. As experimental tools techniques of cell and molecular biology such as RNA interference, real time PCR, mutational analysis and immunohistochemistry were used. We report herein that lung cancer cell lines expressing wild-type p53 when exposed to cisplatin treatment induced COX-2 (mRNA and protein), with concurrent synthesis of prostaglandins (PGE2). In contrast, COX-2 expression was not detected or changed after cisplatin treatment of cells containing an inactive form of p53. For paclitaxel treatment, an increase in COX-2 mRNA expression was observed in H460 and A549 (wild-type p53 cell lines), although the same was not observed on PGE2 production. Moreover, paclitaxel treatment increased COX-2 expression in ACC-LC-319 cell lines (p53 null). Further, after silencing wild-type p53 expression in A549 cells by RNA interference, cisplatin was no longer able to induce COX-2 mRNA and protein expression. While in treatment with paclitaxel the silencing of wild type TP53 did not change COX-2 expression, showing a p53-independent effect. Therefore, we suggest that induction of COX-2 by cisplatin in NSCLC cell lines is dependent on p53. In the NSCLC patients analysis, the results showed a COX-2 positive staining in 54% patients. TP53 mutations were found in 57% of the patients, including 56% in current smokers and 37% in former smokers. There was an association between COX-2 expression and wild-type TP53. Among COX-2 positive patients, 80% were wild-type TP53. A higher number of patients are necessary to increase statistical power and confirm the tendencies observed in this study

Submitted by Alison Vanceto (alison-vanceto@hotmail.com) on 2016-09-27T12:14:06Z No. of bitstreams: 1 TeseNB.pdf: 25264059 bytes, checksum: f823e6e565d3555a5d49056afd7c39fe (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T20:08:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseNB.pdf: 25264059 bytes, checksum: f823e6e565d3555a5d49056afd7c39fe (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-27T20:08:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseNB.pdf: 25264059 bytes, checksum: f823e6e565d3555a5d49056afd7c39fe (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-27T20:08:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseNB.pdf: 25264059 bytes, checksum: f823e6e565d3555a5d49056afd7c39fe (MD5) Previous issue date: 2015-06-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / In this work are presented the in silico study of the formation of complexes between organochalcogens compounds with enzymes COX-1 and COX-2 that were carried out in order to study their potential to act as selective inhibitors of COX-2 and thus as anti-inflammatories, as well as the results of in vitro and in vivo experiments of this activity. There were modeled and studied 15 organochalcogens compounds and their enantiomers, with a structure similar to that of the selective drug celecoxib. Compounds 2-(phenylseleno)-2-(2-ethyl-X)acetophenones-4’Y-substituted , with Y = H, Br, CH3, OCH3, NO2 and X = SO2, SO, S, were modeled using as starting point the crystallographic structure of the compound with Y = Br and X = SO. The three dimensional structures of the COX-1 and COX-2 enzymes were obtained from the PDB. The results of the molecular docking calculations were evaluated considering the patterns of orientations/conformations, intermolecular interactions, π interactions and scores. The results of these experiments allowed to propose a mechanism of action as well as a preferred bonding mode that would explain the activity of these compounds as possible inhibitors of COX-2, which is a condition necessary to act as anti-inflammatory. In particular, the compound where Y = OCH3 and X = SO2 (5-OCH3) being selective to COX-2 is the one with the best chances to act as an anti-inflammatory. This is because the OCH3 substituent occupied the S1 subsite of the enzyme, maintaining the interaction with His90 and the SO2 moiety interacts with the Tyr355, an important amino acid for the metabolism of the COX-2 substrate, the arachidonic acid. The other interactions made by the compound, such as π interactions, are important for fixing the ligand in the active site, although they are not directly related to its selectivity. The experiments in vitro and in vivo confirm the in silico results, as the enzyme immunoassay showed that this compound exhibits greater inhibition of COX-2 relative to COX-1. Furthermore, the activity of the 5-OCH3 compound was evaluated with the classical models of edema formation, that is the carrageenan and zymosan induced inflammation in the rat paw, resulting in a significant reduction in paw thickness after two hours and decreasing of the temperature after one hour of the application of the anti-inflammatory agent. As the best results were obtained for the model of paw edema elicited by carrageenan this suggests that the compound acts better in the case of acute inflammation. / Neste trabalho são apresentados o estudo in silico da formação de complexos entre compostos organocalcogênios e as enzimas COX-1 e COX-2 realizado com o objetivo de estudar seu potencial para atuar como inibidores seletivos da COX-2, e portanto como anti-inflamatórios, bem como os resultados dos experimentos in vitro e in vivo desta atividade. Na presente pesquisa, foram modelados e estudados 15 compostos organocalcogênios e seus enantiômeros, com estrutura similar à do fármaco seletivo celecoxibe. Os compostos da família 2-(fenilseleno)-2-(etil-X)acetofenonas-4’Y-substituídas, com Y = H, Br, CH3, OCH3, NO2 e X = SO2, SO, S, foram modelados tendo como ponto de partida a estrutura cristalográfica do composto da mesma família com Y = Br e X= SO. As estruturas tridimensionais das enzimas COX-1 e COX-2 foram obtidas no PDB. Os resultados dos cálculos de docking molecular foram avaliados considerando-se o padrão de orientações/conformações, as interações intermoleculares, as interações π e os escores. OS resultados desses experimentos permitiram propor um mecanismo de ação, bem como um modo de ligação preferencial para explicar a atuação desses compostos como possíveis inibidores da COX-2, condição necessária para atuar como anti-inflamatório. Em particular, o composto com Y = OCH3 e X = SO2 (5-OCH3) é o que apresentou o melhor potencial para atuar como anti-inflamatório, sendo seletivo à COX-2. Isto porque o substituinte OCH3 ocupou o subsítio S1 dessa enzima, mantendo a interação com a His90 e o grupo SO2, apresentou interação com a Tyr355, aminoácido importante para o metabolismo do substrato da COX-2, o ácido araquidônico. As outras interações feitas pelo composto, como as interações π, são importantes para fixação do ligante ao sítio ativo, embora não estejam diretamente ligadas com a sua seletividade. Os experimentos in vitro e in vivo permitiram confirmar os resultados dos experimentos in silico, uma vez que o ensaio imunoenzimático mostrou que este composto apresenta maior inibição da COX-2 em relação à COX-1. Ainda, a atividade do composto 5-OCH3 foi avaliada em modelo de edema de pata induzido por carragenina e zymosan, como agentes irritantes, resultando em uma diminuição significativa da espessura das patas após duas horas e diminuição da temperatura após uma hora da aplicação do agente anti-inflamatório. Uma vez que os melhores resultados foram obtidos para o modelo do edema de pata com a carragenina isto sugere o composto atua melhor no caso da inflamação aguda.

O Carcinoma de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC) é uma doença freqüentemente letal e altamente resistente à terapia oncológica convencional, como por exemplo, o tratamento quimioterápico com cisplatina e paclitaxel. A superexpressão de Ciclooxigenase-2 (COX-2) é constantemente observada em pacientes com NSCLC, estando associada ao prognóstico ruim destes pacientes. Acredita-se que a alta expressão de COX-2 produz efeitos anti-apoptóticos, porém pouco é conhecido sobre os mecanismos de regulação desta enzima. Muitos sinais capazes de ativar COX-2 também induzem a proteína supressora de tumor p53, conhecida pelo seu papel fundamental no controle da proliferação celular e apoptose. Dados recentes indicam que a proteína p53 é um importante regulador da expressão de COX-2. O objetivo desta dissertação foi avaliar os efeitos da quimioterapia na expressão da enzima COX-2 em linhagens celulares com diferente status do gene TP53, e ainda, correlacionar a expressão de COX-2 e o status mutacional de TP53, com as características clínico-patológicas de pacientes com NSCLC. Como ferramentas experimentais foram usadas técnicas de biologia celular e molecular como interferência de RNA, PCR em tempo real, análise mutacional e imuno-histoquímica. Com os resultados obtidos, observamos que as linhagens celulares de câncer de pulmão que apresentam p53 na sua forma selvagem, quando expostas ao tratamento com cisplatina, apresentaram indução da expressão de COX-2 (RNAm e proteína), em adição ao aumento da síntese de Prostaglandina E2 (PGE2). Em contrapartida, a expressão de COX-2 não foi alterada após o tratamento com cisplatina nas linhagens celulares que apresentavam mutação no gene TP53. Ao avaliar o tratamento com paclitaxel, foi observado um aumento da expressão de COX-2 nas linhagens A549 e H460 (linhagens celulares do tipo selvagem para p53), entretanto não foi observada alteração nos níveis de PGE2. Em adição, o tratamento com paclitaxel induziu um aumento da expressão de COX-2 na linhagem com deleção em TP53, ACC LC-319. Em seguida, após silenciamento de p53 na linhagem celular A549, por interferência de RNA, a cisplatina passou a não ser mais capaz de induzir o aumento da expressão de COX-2. No tratamento com paclitaxel, o silenciamento de TP53 não mudou a expressão de COX-2, indicando assim um efeito independente de p53. Dessa maneira, sugerimos que a indução de COX-2, por cisplatina, em linhagens celulares NSCLC é dependente de p53. Na análise dos pacientes NSCLC, os resultados demonstram que 54% dos pacientes apresentam expressão positiva de COX-2. Mutações em TP53 foram observadas em 57% dos pacientes, incluindo 56% de fumantes correntes e 37% de ex-fumantes. Uma associação entre a expressão de COX-2 e o status selvagem de TP53 foi observada, entre os pacientes que apresentaram expressão positiva de COX-2, 80% apresentaram TP53 selvagem. Um número maior de pacientes é necessário para aumentar o poder estatístico e confirmar as tendências observadas nesse estudo / Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) is a lethal disease and highly resistant to conventional chemotherapeutic agents, like cisplatin and paclitaxel. Overexpression of cyclooxygenase-2 (COX-2) is frequently found in NSCLC, and is associated with a bad prognosis. High COX-2 expression is thought to exert antiapoptotic effects in cancer, but little is known about COX-2 regulation. Many signals that activate COX-2 also induce the tumor suppressor protein p53, which is believed to play a pivotal role in controlling proliferation and apoptosis. Recent data indicate the tumor suppressor protein p53 as an important regulator of COX-2. The main objective of this work was to analyze the effect of chemotherapy on the expression of COX-2 according to TP53 status and also evaluate the relationship between COX-2 expression and TP53 mutational status, according to clinic pathological features in NSCLC patients. As experimental tools techniques of cell and molecular biology such as RNA interference, real time PCR, mutational analysis and immunohistochemistry were used. We report herein that lung cancer cell lines expressing wild-type p53 when exposed to cisplatin treatment induced COX-2 (mRNA and protein), with concurrent synthesis of prostaglandins (PGE2). In contrast, COX-2 expression was not detected or changed after cisplatin treatment of cells containing an inactive form of p53. For paclitaxel treatment, an increase in COX-2 mRNA expression was observed in H460 and A549 (wild-type p53 cell lines), although the same was not observed on PGE2 production. Moreover, paclitaxel treatment increased COX-2 expression in ACC-LC-319 cell lines (p53 null). Further, after silencing wild-type p53 expression in A549 cells by RNA interference, cisplatin was no longer able to induce COX-2 mRNA and protein expression. While in treatment with paclitaxel the silencing of wild type TP53 did not change COX-2 expression, showing a p53-independent effect. Therefore, we suggest that induction of COX-2 by cisplatin in NSCLC cell lines is dependent on p53. In the NSCLC patients analysis, the results showed a COX-2 positive staining in 54% patients. TP53 mutations were found in 57% of the patients, including 56% in current smokers and 37% in former smokers. There was an association between COX-2 expression and wild-type TP53. Among COX-2 positive patients, 80% were wild-type TP53. A higher number of patients are necessary to increase statistical power and confirm the tendencies observed in this study

Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.