FONSECA, Thiago de Sousa. Síntese quimioenzimática do Mesilato de Rasagilina (Azilect). 2013. 114 f. Dissertação (Mestrado em química)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-06-02T20:57:05Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_tsfonseca.pdf: 1927032 bytes, checksum: 84f632bf5ae2356bf2323decdf5dbfd2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-20T20:39:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_tsfonseca.pdf: 1927032 bytes, checksum: 84f632bf5ae2356bf2323decdf5dbfd2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-20T20:39:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_tsfonseca.pdf: 1927032 bytes, checksum: 84f632bf5ae2356bf2323decdf5dbfd2 (MD5) Previous issue date: 2013 / Here we describe the synthesis of the chemoenzymatic Rasagilina mesylate (Azilect®), a drug used in monotherapy in patients with early stage Parkinson. One of the goals of this project was to carry out the introduction of chirality via biocatalysis processes. We studied two strategies: i) bioreduction of indanone in the presence of a series of yeast and ii) kinetic resolution of rac-indanol using lipases in organic solvent. In strategy (i) was conducted a screening with six yeasts. In all tests the (S)-indanol was obtained in low conversions (9.4 to 13.2%) and enantiomeric excesses of up to 97.6%. Due to low conversion rates, we decided to implement the strategy (ii). After screening of nine commercial lipases, was possible to verify that the Amano lipase AK from Pseudomonas fluorescens and Lipase from Thermomyces lanuginosus immobilized on immobead-150 were the most efficient in the kinetic resolution of rac- indanila acetate in aqueous medium with enantiomeric ratio equals 111.0 and 167.0 respectively. Thus, such lipases were selected for the kinetic resolution of rac-indanol in organic media. The best results of enzyme activity and selectivity were obtained using hexane as a solvent, reaction time of 15 minutes and 30ºC for Amano lipase AK (free enzyme) and 35ºC for Thermomyces lanuginosus, with enantiomeric ratio equals 200 for both cases. Were held assets of Amano AK (free enzyme) in various media and the best results were obtained selectivity and activity in hexane as organic solvent, reaction time of 6 hours and 30 º C using Amano Lipase AK immobilized chitosan in 2.5% low molecular weight; sodium alginate 2.5% and Amano AK lipase immobilized on chitosan 5.0% low molecular weight. The study was conducted reuse of immobilized lipase, Thermomyces lanuginosus being immobilized on immobead-150, the more efficiently compared to the others, since it has provided excellent results in higher reaction cycles. Subsequently, using a Mitsunobu reaction, (S)-indanol was converted to (R)-azidoindano with 70% yield. Then, the (R)-azidoindano was subjected to Staudinger reaction, producing (R)-indanamine in 60% yield. / Neste trabalho descrevemos a síntese quimioenzimática do Mesilato de Rasagilina (Azilect®), um fármaco utilizado na monoterapia de pacientes com Parkinson no estágio inicial. Um dos objetivos deste trabalho foi realizar a introdução da quiralidade via processos de biocatálise. Foram estudadas duas estratégias: i) biorredução da indanona na presença de uma série de leveduras e ii) resolução cinética do rac-indanol utilizando lipases, em solvente orgânico. Na estratégia (i) realizamos uma triagem com seis leveduras. Em todos os testes realizados o (S)-indanol foi obtido com baixas conversões (9,4-13,2%) e excessos enantioméricos de até 97,6%. Devido aos baixos valores de conversão, decidimos aplicar a estratégia (ii). Após uma triagem com nove lipases comerciais foi possível verificar que a Amano lipase AK a partir da Pseudomonas fluorescens e a Lipase a partir da Thermomyces lanuginosus imobilizada em immobead-150 foram as mais eficientes na resolução cinética do rac-acetato de indanila, em meio aquoso, com razão enantiomérica de 111,0 e 167,0, respectivamente. Com isso, tais lipases foram selecionadas para a resolução cinética do rac-indanol em meio orgânico. Os melhores resultados de seletividade e atividade enzimática foram obtidos utilizando hexano como solvente orgânico, tempo reacional de 15 minutos e temperatura de 30ºC para a Amano lipase AK (enzima livre) e 35ºC para a Thermomyces lanuginosus, com razão enantiomérica>200 para ambos os casos. Foram realizadas imobilizações da Amano AK (enzima livre) em vários suportes e os melhores resultados de seletividade e atividade foram obtidos em hexano como solvente orgânico, tempo reacional de 6 horas e temperatura de 30ºC empregando a Amano lipase AK imobilizada em quitosana 2,5% de baixo peso molecular; alginato de sódio 2,5% e a Amano lipase AK imobilizada em quitosana 5,0% de baixo peso molecular. Foi realizado o estudo de reuso das lipases imobilizadas, sendo a Thermomyces lanuginosus imobilizada em immobead-150, a mais eficiente comparada às demais, uma vez que proporcionou excelentes resultados em maiores ciclos reacionais. Posteriormente, empregando uma reação de Mitsunobu, o (S)-indanol foi convertido no (R)-azidoindano com rendimento de 70%. Em seguida, o (R)-azidoindano foi submetido a uma reação de Staudinger, produzindo a (R)-indanamina com 60% de rendimento.

Submitted by Emily Colferai Bonfá null (miemilymi@hotmail.com) on 2016-03-22T01:17:39Z No. of bitstreams: 1 Mestrado-Emily Finall.pdf: 1593107 bytes, checksum: ce9ebf44b67e4020e069a84d708f2f71 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-22T17:56:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 bonfa_ec_me_sjrp.pdf: 1593107 bytes, checksum: ce9ebf44b67e4020e069a84d708f2f71 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-22T17:56:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bonfa_ec_me_sjrp.pdf: 1593107 bytes, checksum: ce9ebf44b67e4020e069a84d708f2f71 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As celulases podem ser utilizadas na bioconversão da fração de celulose de resíduos agro-industriais em açúcares fermentáveis, visando a obtenção de combustíveis renováveis e produtos químicos. As β-glicosidases são cruciais para a total sacarificação da celulose, mas na maioria dos casos elas são fortemente inibidas pelo seu produto, a glicose. Portanto, o conhecimento das cinéticas de hidrólise e as respostas dessa enzima frente a diferentes substratos e produtos pode definir a eficiência de hidrólise e do processo biotecnológico no qual poderia ser incorporada. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar a β -glicosidase de 50 kDa (BG50) produzida pelo fungo termofílico Myceliophthora thermophila M.7.7 cultivado em estado sólido, em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (1:1). O zimograma do extrato bruto evidenciou duas isoformas, de aproximadamente 200 e 50 kDa, as quais foram separadas por cromatografia de filtração em gel. A caracterização da BG50 mostrou atividade ótima a 60 ˚C e pH 5,0 quando usado o 4-nitrofenol-β-D-glicopiranosídeo (pNPG), enquanto com celobiose o valor da temperatura e pH ótimo foram de 50 ˚C e pH 4,5, respectivamente. Testes realizados com adição de íons e reagentes mostraram diferenças nos efeitos sobre a atividade da enzima dependendo do substrato, principalmente com a adição de Ditiotreitol (DTT) utilizando celobiose, e inibição completa com Cu2+ e Fe3+ para pNPG e celobiose. Além disso, a enzima não mostrou efeito inibitório quando testada na presença de nove compostos fenólicos, uma característica significativa. Os estudos cinéticos revelaram um perfil de inibição competitiva pela glicose quando utilizado pNPG com valor de KI=1,5 mM e um Km significativamente menor (0,52 mM) pelo pNPG do que pela celobiose (Km=8,50 mM). Os parâmetros termodinâmicos mostraram que a BG50 é bastante estável, destacando seu tempo de meia vida de 855,6 minutos a 60 °C, porém desnatura facilmente acima dessa temperatura. Os resultados enfatizam a importância de investigar potencialidades de β-glicosidases baseadas na celobiose, uma vez que no processo industrial a enzima atuará sobre o substrato natural, além da compreensão da termoestabilidade da enzima. / Cellulases can be used in bioconversion of cellulose from agro-industrial waste into fermentable sugars in order to obtain renewable fuels and chemicals. The β-glucosidases are crucial to the overall saccharification of cellulose, but in most cases, they are strongly inhibited by its product, glucose. Therefore, knowledge of the hydrolysis kinetics of the enzyme and its responses against different substrates and products can set the hydrolysis efficiency and possible incorporation in biotechnological process. This study aimed to characterize the 50 kDa β-glucosidase (BG50) produced by the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila M.7.7 grown in solid state, in a mixture of sugarcane bagasse and wheat bran (1:1). The zymogram of the crude extract showed two isoforms of 200 and 50 kDa, which were separated by gel filtration chromatography. The characterization of BG50 showed optimal activity at 60 °C and pH 5.0 when used pNPG, whereas using cellobiose the values of the optimal temperature and pH were 50 °C and pH 4.5, respectively. Tests with addition of reactants and ions showed differences in the effects on enzyme activity depending on the substrate, especially with the addition of dithiothreitol (DTT) utilizing cellobiose, and complete inhibition with Cu2+ and Fe3+ for 4-nitrophenyl-β- D-glucopyranoside (pNPG) and cellobiose. Furthermore, the enzyme showed no inhibitory effect when tested in the presence of nine phenolic compounds, a remarkable characteristic. Kinetic studies showed a profile of competitive inhibition by glucose when using pNPG with Ki = 1.5 mM and Km significantly lower (0.52 mM) with pNPG than using cellobiose (Km = 8.50 mM). The thermodynamic parameters show that BG50 is quite stable, highlighting its half life of 855.6 minutes at 60 ° C, but above this temperature easily denatured. The results emphasize the importance of investigating β-glucosidases’ potential based on cellobiose, since for the industrial processes the enzyme will function with its natural substrate, in addition to understanding the thermal stability of the enzyme.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2112.pdf: 5693137 bytes, checksum: ed718439c222617a1ea873a2cb8344f3 (MD5) Previous issue date: 2008-10-24 / Universidade Federal de Minas Gerais / The present work describes the search of bioactive secondary metabolites isolated from plants, against enzymes: gGAPDH (glyceraldehydes-3- phosphate dehydrogenase from Trypanosoma cruzi and lysosomal cathepsins K, V, L and S. This work is divided in two parts: Part I: Study of the oil from the nut shells of Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - Chagas disease, a parasitic infection caused by the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi, is a major public health problem affecting millions of individuals in Latin America. On the basis of the essential role in the life cycle of T. cruzi, the enzyme gGAPDH has been considered an attractive target for the development of novel antitrypanosomatid agents. From the dicloromethane extract of A. occidentale were isolated phenolic compounds which were investigated on their inhibition activity against gGAPDH and trypomastigote forms of T. cruzi. The most promising compound was the 6-n-pentadecylsalicylic acid (AC1) with IC50 values of 28 μM against gGAPDH and 66.7 μg/mL against trypomastigote forms. In addition, a detailed mechanistic characterization of the effects of AC1 on the T. cruzi gGAPDHcatalyzed reaction showed clear noncompetitive inhibition with respect to both substrate G-3-P and cofactor NAD+. Part II: Study of natural products and synthetic derivatives searching for inhibitors of lysosomal cysteine peptidases - After completing the human genome, eleven lysosomal cysteine peptidases were identified. Those enzymes are involved in general protein degradation. The lysosomal cysteine peptidases are found in various tissues and those are found in many organs. Cathepsin K is associated to bone resorption, cathepsin L to skin cancer, at last cathepsins V and S are associated to the immune system. In this work, four enzymes (cathepsins K, V, L and S) were selected as a molecular target for the identification of new inhibitors. Some potent inhibitors of cathepsin V were found, and a study including kinetic characterization of the most potent inhibitors, including potency (IC50), mechanism of action and constant Ki was carried out. The most promising compound is the acridone alkaloid citbrasine (107), with values of IC50 of 1.2 μM and Ki of 0.24 μM. Moreover, it was determined that citbrasine is a competitive inhibitor against cathepsin V in relation to the substrate ZFRMCA. Additionally, it was carried out the study of molecular modeling for acridone alkaloids that showed significant inhibition of cathepsin V. / Este trabalho descreve a busca de metabólitos secundários bioativos de plantas, com o intuito de serem avaliados contra as enzimas: gGAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase glicossomal) do Trypanosoma cruzi e as catepsinas lisossomais K, V, L e S. A descrição deste trabalho está dividida em duas partes. Parte I: Estudo do óleo das cascas da castanha de Anacardium occidentale (Anacardiaceae) - A doença de Chagas, uma infecção parasitária causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi, é um importante problema de saúde pública que afeta milhões de pessoas na América Latina. Com base no papel essencial no ciclo de vida de T. cruzi, a enzima gGAPDH tem sido considerada um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes tripanocidas. Do extrato diclorometânico das cascas da castanha de A. occidentale obtiveram-se compostos fenólicos que foram avaliados frente à enzima gGAPDH e as formas tripomastigotas de T. cruzi. A substância mais promissora foi o ácido 2-pentadecenil-6- hidroxibenzóico (AC 1), com valores de IC50 de 28 μM na enzima gGAPDH e 66,7 μg/mL nas formas tripomastigostas. Além disso, foi determinado que AC1 é um inibidor do tipo não-competitivo para a enzima gGAPDH em relação tanto ao substrato G-3-P (Ki = 2 μM ) quanto ao cofator NAD+ (Ki = 4 μM). Parte II: Estudo de produtos naturais e derivados sintéticos buscando inibidores de cisteíno peptidases lisossomais - Depois de completado o genoma humano, onze cisteíno peptidases lisossomais foram identificadas. Essas enzimas têm a função primária de degradar proteínas, de forma não seletiva, dentro do lisossomo e são encontradas em vários órgãos e tecidos. A catepsina K está associada ao processo de reabsorção óssea, catepsina L ao câncer de pele e as catepsinas V e S ao sistema imune. Neste trabalho, foram selecionadas quatro enzimas (catepsinas K, V, L e S) como alvos moleculares para a identificação de novos inibidores. Foi realizada a caracterização cinética dos inibidores mais potentes frente à catepsina V, através da potência biológica (IC50), mecanismo de ação e constante Ki. A substância mais promissora foi o alcalóide acridônico citibrasina (107), com valor de IC50 de 1,2 μM e Ki de 0,24 μM. Além disso, foi determinado que citibrasina é um inibidor do tipo competitivo para a catepsina V em relação ao substrato ZFRMCA. Adicionalmente foi realizado o estudo de modelagem molecular para os alcalóides acridônicos que apresentaram inibição significativa frente à catepsina V.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2138.pdf: 4301493 bytes, checksum: b5c60c6030083935e6ef824229ef53ac (MD5) Previous issue date: 2008-10-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / The continuous advances in process computing have provided in recent years several sophisticated tools for process analysis and simulation. The effective use of these tools demands the capability to interface with a pre-existent process system hierarchy. Within this perspective, an important issue is to provide meaningful and useful simulation and optimization applications for complex systems that require integration with data-intensive experimentation. This study proposes an integrated environment, using Internet as development platform, for simulation, monitoring, control and optimization of a cheese whey refinery, employing immobilized and stabilized enzymes as catalysts. The multipurpose process described here, the cheese whey biorefinery, provides, besides lactose, whey protein concentrates and hydrolysates that can be applied in food and pharmaceutical formulae. In these circumstances, it is possible to add value to this significant by-product of the dairy industry, avoiding its disposal in natura (what is mostly done by small cheese manufacturers). In parallel, relevant aspects of the enzymatic reactions within the cheese whey biorefinery were investigated. The lumping of substrate molecules in pseudo-components, using a hybrid phenomenological-neural approach for description of the enzymatic depolymerization kinetics, is the suggestion to follow the complex reaction dynamics in biorefinery. During the estimative of model parameters, global search algorithms and different post-fitting statistical strategies were implemented and evaluated. The work, thus, is concerned with two of the main dilemmas/challenges of the present millennium: reduction of environmental problems related to the disposal of agro-industrial residues (i.e., cheese whey) and development of processes for food production from alternative sources (whey refinery). The integrated web application here presented may allow small companies to access a remote engineering centre , with know-how on plant design, economic evaluation and advanced control/optimization techniques. The idea can also be extended to large dairy companies, providing the remote control of sites of production geographically sparse. All implemented algorithms for remote process monitoring and control were validated with data from laboratory-scale assays. The validation of the hydrolytic kinetic models followed the same procedure. According to the achieved results, is possible to conclude that the robustness of the integrated computational environment was demonstrated. The prediction capability of the approaches employed for description of the proteolytic enzymatic reactions was verified, as well. / O contínuo avanço no processamento computacional vem proporcionando nos últimos anos o desenvolvimento e aplicação de ferramentas cada vez mais elaboradas de análise e simulação de processos. O uso consistente dessas ferramentas demanda, entre outras competências, a capacidade de interação com uma hierarquia de sistemas pré-definida pela engenharia de processos. Por outro lado, é imprescindível, nesse contexto, validar os cálculos matemáticos com dados reais de processo. Esta tese propõe um ambiente integrado, utilizando a Internet como plataforma de desenvolvimento, para simulação, monitoramento, controle e otimização do processo de refino do soro de queijo, utilizando enzimas imobilizadas em suporte inerte como catalisadores. O processo de refino aqui apresentado, dentro do escopo de uma planta multipropósito denominada biorefinaria de soro de queijo, disponibiliza como produtos, além da lactose, concentrados e hidrolisados protéicos com aplicação vasta em formulações alimentícias e farmacêuticas. Assim, agrega-se valor a um importante resíduo da indústria queijeira, altamente poluente se descartado in natura no meio ambiente. Paralelamente, aspectos relevantes das reações enzimáticas envolvidas na biorefinaria do soro de queijo foram aprofundados. O agrupamento de moléculas de substrato em pseudocomponentes, utilizando-se um enfoque híbrido fenomenológico-neuronal para descrição da complexa cinética de despolimerização enzimática, é a proposta para o acompanhamento dinâmico dos processos ocorrendo na biorefinaria. Durante o procedimento de estimativa paramétrica desses modelos cinéticos, algoritmos globais de busca e diferentes ferramentas de análise estatística pós-ajuste foram implementadas e avaliadas. O trabalho, assim, se insere em dois dos principais dilemas/desafios do presente milênio: redução do impacto ambiental provocado por resíduos agroindustriais (soro de queijo) e desenvolvimento de processos para produção de alimentos a partir de fontes alternativas (refino do soro). Nesse contexto, com o aplicativo aqui desenvolvido, pequenas e médias empresas interessadas em implementar o processo de beneficiamento do soro de queijo têm acesso a dados para dimensionamento dos equipamentos, estimativa do custo de produção e do retorno de investimento, com base em atualizações em tempo real de preços, custos e taxas de juros pela própria Internet. Com rotinas avançadas de monitoramento e controle agregadas, o ambiente integrado também pode se tornar atrativo para grandes indústrias de laticínios que tenham várias unidades fisicamente descentralizadas. Nesse caso, cada unidade poderia ser monitorada à distância, por exemplo, por um núcleo central de engenharia (conceito este que pode ser ampliado até níveis globais, com plantas de produção em diferentes países). Todos os algoritmos de monitoração e controle remotos implementados nesta tese foram validados em ensaios experimentais em escala de laboratório. Da mesma forma, os modelos cinéticos das reações enzimáticas também foram testados, em ensaios independentes de validação. Com base no conjunto de resultados apresentados, pode-se afirmar que ficou demonstrada tanto a robustez do ambiente computacional integrado, como a propriedade dos enfoques utilizados para descrição das reações de proteólise enzimática.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCMAG.pdf: 44716096 bytes, checksum: e3e312b192d857e9515643f716291ed1 (MD5) Previous issue date: 2004-11-30 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work is part of a global project whose aim is the production of a cheese whey proteins hydrolysate with controlled composition. The process is composed by sequential hydrolysis of the whey proteins using trypsin, chymotrypsin and carboxipeptidase A (CPA). The phenylalanine (Phe) and the other aromatic amino acids released after action of CPA may be removed from the product, providing an adequate source of proteins for phenylketonurics patients and a final product with more pleasant flavor. After its separation, a final step of hydrolysis using the non-specific protease AlcalaseÒ produces a mixture of small peptides with better properties than a mixture of free amino acids. However, the use of enzymes in industrial processes requests its immobilization and stabilization. We have studied in this work the first two hydrolysis stages aiming to reach the following general objectives: to prepare derivatives of trypsin (on sepabeads, chitosan and agarose) and chymotrypsin (just on agarose), to study the sequential hydrolysis of the cheese whey proteins with trypsin and chymotrypsin immobilized on glyoxyl-agarose gel and to investigate the kinetic of the hydrolysis of these proteins with immobilized chymotrypsin. Trypsin-sepabeads derivatives were prepared on resins modified with iminodiacetic acid (IDA) or modified with IDA and copper. Yield of immobilization of approximately 100% and complete recovery of the enzyme on supports were obtained. Factors of stabilization in relation to the soluble enzyme from 90 times (Sepabeads- IDA-Cu2+) to 138 times (Sepabeads-IDA), at 55ºC, were reached and the trypsin- (Sepabeads-IDA) derivative showed to be more efficient in the casein hydrolysis than the trypsin-glyoxyl-agarose one. Trypsin-chitosan derivatives were prepared on coagulated matrices in NaOH solution (0.1 or 1N) and activated with glutaraldehyde (pH 7 or 10) or glycydol. Chitosan derivatives whose matrices were activated with glutaraldehyde reached 100% of yield of immobilization, while the ones activated with glycydol reached just 60%. In all the studied cases it was possible to recover completelly the enzyme on supports until the enzymatic load of 20mgEnz./gGel. Derivatives prepared on coagulated matrices in NaOH 0.1 or 1N and activated at pH 7 resulted in 100% of yield of immobilization and complete recovery of the enzyme on gel until the enzymatic load of 40mgEnz./gGel. At 40ºC, the glutaraldehyde-chitosan derivatives were approximately 460 times more stable than the soluble enzyme; at 70ºC, the glyoxyl-chitosan derivative showed to be approximately 13 times more stable than the glutaraldehyde-chitosan derivative. The trypsin-chitosan derivatives presented the highest hydrolysis activity at 50ºC and pH 9 (40ºC and pH 9 for the soluble enzyme). The best trypsin-chitosan derivative (coagulated in NaOH 0.1M and activated at pH 7) showed similar performance to the soluble enzyme in the hydrolysis of the cheese whey proteins (hydrolysis degree (DH) of 12%). Trypsin and chymotrypsin derivatives immobilized on glyoxyl-agarose gel were prepared following a protocol available in the literature (agarose activated with glycydol and oxidized with NaIO4 to obtain 75µmoles of aldehyde/mL of gel, at 25oC and pH 10.05). The factors of stabilization obtained for trypsin (3920 times) and chymotrypsin (14535 times) are according with results already published and were confirmed through acid hydrolysis of the soluble enzymes and stabilized derivatives. These experiments showed that 64.76% and 72.15% of the lysines present in the trypsin and chymotrypsin, respectively, were involved in the enzyme-support attachment. In consequence of this stabilization, the derivatives showed maximum hydrolysis activity of synthetic substrates in temperatures and pH higher than the obtained for the soluble enzymes (trypsin - 85ºC and pH 11; chymotrypsin - 70ºC and pH 10.5). Hydrolysis of the cheese whey proteins assays using trypsin were developed varing the DH from 0 to 12%. After that, the obtained mixtures were hydrolysates with chymotrypsin and carboxipeptidase A, sequentially, using long times and high enzymes concentrations. The results showed that removal of Phe of approximately 100% was obtained in the following conditions: DHtrypsin of 0%, DHchymotrypsin of 12.4% (3.05mgEnz./mL of solution - 10 hours) and 10 hours of reaction with CPA (200UHPHE/ gProtein), producing 15.5% of peptides with molecular mass (MM) lower than 1046Da. The kinetic of the hydrolysis of the whey proteins was studied and the apparent kinetic parameters of the Michaelis-Menten model taking into account competitive inhibition by the substrate ( app max V , app m K and app S K ) were calculated by initial rates method using a derivative with high enzymatic load - 40mgEnz./gGel. In this work, the substrate concentration was defined in terms of peptides bonds that could be cleaved by chymotrypsin. The effectiveness factor found for reactions developed in presence of difusional effects was 0.78. The long-term assays (10 hours) were perfectly fitted by a model where the first five minutes were described by the first order kinetic (V=kN) and times higher than five minutes were represented by a function of P/No (V=f(P/No)). / Obs.:Devido a restrições dos caracteres especias, verifcar resumo em texto completo para download.Este trabalho está inserido em um projeto global que visa a produção de um hidrolisado de proteínas do soro de queijo com composição controlada. O processo prevê ação seqüencial de tripsina, quimotripsina e carboxipeptidase A (CPA), remoção de fenilalanina (Phe) e demais aminoácidos aromáticos liberados após ação da CPA e hidrólise final com AlcalaseÒ, para obtenção de di e tripeptídeos. A mistura de pequenos peptídeos resultante possui propriedades melhores do que as de uma mistura de aminoácidos livres. A remoção da Phe e demais aminoácidos hidrofóbicos desses hidrolisados viabiliza sua utilização por pacientes portadores de fenilcetonúria, além de proporcionar sabor mais agradável ao produto final, pois estes têm sabor amargo. O uso de enzimas em processos industriais requer, contudo, a imobilização e a estabilização destas. Neste trabalho foram enfocadas as duas primeiras etapas de hidrólise visando cumprimento dos seguintes objetivos gerais: preparação de derivados de tripsina (sobre sepabeads, quitosana e agarose) e quimotripsina (apenas sobre agarose), estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro com tripsina e quimotripsina imobilizadas sobre gel glioxil- agarose e investigação da cinética da hidrólise dessas proteínas com quimotripsina imobilizada sobre agarose. Derivados tripsina-sepabeads foram preparados usando-se resina modificada apenas com ácido iminodiacético (IDA) ou modificada com IDA e posteriormente reagida com cobre. Foram obtidos rendimentos de imobilização de aproximadamente 100% e completa recuperação da enzima nos suportes utilizados, com fatores de estabilização em relação à enzima solúvel variando de 90 (derivados Sepabeads-IDACu2+) a 138 vezes (derivados Sepabeads-IDA), a 55ºC. Estudo do desempenho do derivado tripsina-(Sepabeads-IDA) no fracionamento da caseína mostrou sua maior eficiência frente ao derivado tripsina-glioxil-agarose. Derivados estabilizados tripsina-quitosana foram preparados sobre matrizes coaguladas em solução de NaOH (0,1 ou 1N) e ativadas com glutaraldeído (pH 7 ou 10) ou glicidol. Para todos os derivados tripsina-quitosana ativados com glutaraldeído obteve-se 100% de rendimento de imobilização, enquanto que o alcançado pelo derivado cuja matriz foi ativada com glicidol foi de apenas 60%. Recuperação da enzima nos géis de 100% foi obtida para todos os suportes estudados até carga de 20mgEnz./gGel. Derivados preparados sobre matrizes ativadas a pH 7, independentemente da concentração da solução coagulante (NaOH 0,1 ou 1N), resultaram em 100% de rendimento e total recuperação da enzima no gel até carga enzimática de 40mgEnz./gGel. Fatores de estabilização em torno de 460 vezes foram obtidos para derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído em relação à enzima solúvel, a 40ºC. A 70ºC, o derivado tripsina-quitosana-glioxil mostrou-se aproximadamente 13 vezes mais estável que derivados tripsina-quitosana-glutaraldeído. Temperatura de 50ºC e pH 9 foram condições nas quais derivados tripsina-quitosana apresentaram maior atividade de hidrólise (para a enzima solúvel 40ºC e também pH 9). O melhor derivado tripsina-quitosana preparado (coagulação em NaOH 0,1N e ativação a pH 7) mostrou desempenho similar ao da enzima solúvel na hidrólise das proteínas do soro (grau de hidrólise (GH) de 12%). Derivados de tripsina e quimotripsina sobre gel glioxil-agarose foram preparados utilizando-se protocolo disponível na literatura (agarose ativada com glicidol e oxidada com NaIO4 para obtenção de 75mmoles de aldeído/mL de gel, a 25oC e pH 10,05). Os fatores de estabilização aqui obtidos para tripsina (3920 vezes) e quimotripsina (14535 vezes) estão em concordância com resultados já publicados. Estes altos índices de estabilização se devem à formação de ligações multipontuais entre as enzimas e o suporte, o que pôde ser confirmado pelos resultados obtidos através de hidrólises ácidas das enzimas solúveis e derivados estabilizados. Esses experimentos mostraram que 64,76% e 72,15% do total de lisinas presentes na tripsina e na quimotripsina, respectivamente, estavam envolvidas nas multiligações enzima-suporte. Em conseqüência disso, os derivados de tripsina e quimotripsina expressaram máxima atividade de hidrólise dos substratos sintéticos em temperaturas e pHs mais elevados que os observados para as enzimas solúveis (85oC e pH 11 para tripsina e 70oC e pH 10,5 para quimotripsina). Estudo da hidrólise seqüencial das proteínas do soro foi realizado variando-se o grau de hidrólise com tripsina de 0 a 12% e submetendo-se em seguida estes hidrolisados à ação seqüencial de quimotripsina e CPA, empregando-se nessas duas últimas etapas tempo reacional prolongado e alta concentração enzimática. Os resultados obtidos mostraram que conversão em Phe próxima de 100% foi obtida quando as proteínas do soro foram diretamente hidrolisadas pela quimotripsina, atingindo-se grau de hidrólise de 12,4% com esta protease (concentração enzimática de 3,05mgEnz./mL de solução - 10 horas) e utilizando-se 200UH-PHE/gProteína nas 10 horas de reação com CPA, o que conduziu à formação de 15,5% de peptídeos com massa molecular (MM) inferior a 1046Da. O estudo das velocidades iniciais da hidrólise das proteínas do soro catalisada pela quimotripsina (derivado com alta carga enzimática 40mgEnz./gGel) forneceu os parâmetros cinéticos aparentes ap máx V , ap m K e ap S K do modelo de Michaelis-Menten com inibição pelo substrato, representado em termos de ligações peptídicas hidrolisáveis por esta enzima. O fator de efetividade determinado para reações na presença de efeitos difusionais (ensaios realizados com derivado contendo 40mgEnz./gGel) foi de 0,78 e os dados experimentais de bateladas de longa duração (10 horas) foram perfeitamente ajustados por um modelo composto onde os cinco primeiros minutos de reação foram descritos por uma cinética de primeira ordem (equação do tipo kN V = ), uma vez que neste período as proteínas ainda apresentavam elevada massa molecular e o sistema estava possivelmente sendo controlado pela difusão externa, e tempos superiores a 5 minutos por uma função de o N P , ou seja, uma equação do tipo ) N P ( f V o = . Esta última abordagem resultou em excelentes ajustes aos dados experimentais para todo o período reacional ensaiado, o que é bastante relevante dada a complexidade do sistema em questão.

O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado.O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de Baco bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca catiônica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3?M para o KM e 222 s-1para o kcat. O valor para o KM é O menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Cinco conjuntos de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75? a 1,75 ?. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75?) foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB 195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9? de resolução e em complexo com fosfato a 2,0? de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e a mesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs. / The parasite Schistosoma mansoni, unlike its mammalian hosts, lacks the \"de novo\" pathway for purine biosynthesis and depends on the salvage pathways for its purine requirements. One component of this pathway is Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to generate the corresponding purine base and ribose 1-phosphate. In the Schistosoma mansoni Genome Project the gene for this enzyme was isolated. The SmPNP cDNA was sequenced, corresponding to 1055 bases that code for a 287 amino acid protein with 49% sequence identity to its human erythrocyte homologue. The SmPNP gene was cloned into the pMAL C2G expression vector and the recombinant fusion protein was produced and purified using an amylose affinity column (approx. 80mg/mL). The fusion protein is composed of a Maltose Binding Protein adjoined to the SmPNP. After cleavage with Factor Xa, the cleavage product was purified using a cation exchange column. The KM and kcat of SmPNP for inosine phosphorolisis was determined to be 3?M and 222 s-1 respectively. This corresponds to the lowest value for KM yet described for a low molecular mass PNP. SmPNP crystals were obtained by the hanging drop method, using 18-24% PEG 1500, 20% glycerol in the presence of 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.0). When NDSB195 was used as an additive in the SmPNP crystallization the solution used was 28-30% PEG 1500, 20% glycerol and 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.O).Five datasets were obtained in the presence and absence of ligands, varying in resolution from 2,75 to 1,75?. All structures were solved by the molecular replacement method. The first structure (at 2,75?) was solved using the bovine PNP as the search model and in the remaining structures the search model was the SmPNP structure itself. The 1,75? structure was obtained from a crystal grow in the presence of the additive NDSB195, and after its determination NDSB195 was observed bound to the SmPNP active site via its phosphate binding site. Structures were also obtained for the apo SmPNP at 1,9? and its complex with phosphate at 2,0? resolution. All structures were used in the comparison with other low molecular mass PNPs. The SmPNP structure at 1,75A resolution was used in the search small molecule ligands, which potentially bind to SmPNP via virtual screening. For this purpose the program Gold together with a database of 36000 compounds with MW lower than 280Da was used. As a result 22 compounds were selected using the docking score and the H-bonding interaction with the key residues of the SmPNP active site. Using the bovine PNP and same docking approach 19 compounds were selected. These 41 compounds were assayed against SmPNP enzyme and 12 compounds were active against the SmPNP. One complex between SmPNP and one of these compound (AT2 169) was obtained and refined. This virtual screening approach was validated using known ligands of PNPs including inosine, guanosine, immucilins, etc.

Submitted by Haroudo Xavier Filho (haroudo.xavierfo@ufpe.br) on 2016-02-26T13:58:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO DE MESTRADO -DARTAGNAN PIRES - OK!! (1).pdf: 6019641 bytes, checksum: 2024556a4ff3ddf948edf6eeeb9dbd55 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T13:58:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO DE MESTRADO -DARTAGNAN PIRES - OK!! (1).pdf: 6019641 bytes, checksum: 2024556a4ff3ddf948edf6eeeb9dbd55 (MD5) Previous issue date: 2013-12-13 / CNPq / Derivados de furano e tiofeno 2-substituídos são compostos bastante difundidos no meio ambiente e desempenham papel importante em processos bioquímicos. Além disso, estes compostos podem ser utilizados como building blocks na preparação de diversas moléculas bioativas. No entanto, reagentes prejudiciais ao meio ambiente e muitas etapas reacionais, são geralmente atribuídos às metodologias sintéticas que empregam estes derivados. Atualmente, poucos trabalhos têm reportado a utilização de enzimas para este tipo de sistema. Dessa forma, nosso grupo demonstrou interesse em propor uma metodologia quimioenzimática para preparação de derivados de furano e tiofeno 2-substituídos em suas formas enantiomericamente pura, e aplicá-los na preparação de moléculas bioativas enantiodependentes. A metodologia proposta emprega um número reduzido de etapas sintéticas e utiliza a enzima CAL-B na etapa chave para obtenção dos respectivos enantiômeros separadamente. Inicialmente, uma série de alcoóis secundários racêmicos contendo grupos heterocíclicos foi sintetizada em rendimentos que variaram de moderados a excelentes (40-98%) e submetidos à resolução cinética enzimática catalisada por lipase (RCE). Adicionalmente, um derivado dibromo vinilfurano 2-substituído foi empregado em estudos visando à síntese total da modiolida A, uma macrolactona de origem natural contendo 10 membros em seu anel. Este fragmento foi utilizado em uma reação do tipo Corey-Fuchs para obtenção de um intermediário avançado na síntese desta molécula. / Furan and Tiophene derivatives are widespread compounds in the environment and they also play important role on biochemical process. In addition these compounds can be employed as building blocks in the synthesis of bioactive molecules. However, environmentally harmful reagents and many reaction steps are generally assigned to synthetic methodologies that employ it. Nowadays, few works have been reported enzyme applications in this type of system. Here, we propose a chemoenzymatic methodology to prepare enantioenriched secondary alcohols containing furan and tiophene heterocyclic group and apply them in the preparation of bioactive enantiodependent molecules. The proposed methodology employs a reduced number of synthetic steps and CAL-B enzyme at the key step of deracemization. Initially, the racemic secundary alcohols containing heterocyclic groups were synthesized from moderate to good yields (40-98%) and each of them was submitted to lipase-catalyzed enzymatic kinetic resolution (EKR). Furthermore, a dibromovinylfuran 2-substituted has been employed in studies forward the total synthesis of Modiolide A, a 10-membered ring of natural lactone. This fragment has been used on Corey-Fuchs reaction in order to prepare an advanced intermediate to obtain the Modiolida A.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-09-14T13:34:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3423205 bytes, checksum: f7e924a26e324cdd27d6d271dbdfc26d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-14T13:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3423205 bytes, checksum: f7e924a26e324cdd27d6d271dbdfc26d (MD5) Previous issue date: 2018-07-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O cultivo batata-doce é amplamente distribuído em todo o mundo, em que as raízes tuberosas são muito utilizadas na alimentação humana e na industrialização. O manuseio inadequado e a brotação alteram o metabolismo e deterioram as raízes tuberosas durante o armazenamento, porém estas alterações são pouco estudadas. Os principais objetivos deste estudo foram: avaliar o controle da brotação e alterações metabólicas em raízes tuberosas de batata-doce cv. BRS Rubissol tratadas com etileno, AOA e 1-MCP; avaliar o processamento na forma de chips fritos em raízes tuberosas de batata-doce cv. BRS Rubissol tratadas com etileno, AOA e 1-MCP e armazenadas à temperatura ambiente; caracterizar cineticamente as enzimas peroxidase e polifenoloxidase em extratos brutos em polpa e casca de três cultivares de batatas-doces (BRS Amélia, BRS Rubissol e BRS Cuia) submetidas a dano mecânico; avaliar o uso de conservantes químicos na redução do escurecimento em batata-doce cv. BRS Cuia minimamente processada e armazenada a 5 oC e avaliar as alterações morfo-anatômicas e metabólicas na periderme de batata-doce cv. BRS Amélia em diferentes temperaturas e intensidades de dano. A brotação das raízes tuberosas de batata-doce cv. BRS Rubissol foi controlada pelo uso AOA e 1-MCP, e essa cultivar mostrou bom potencial para o processamento na forma de chips fritos. A atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase foi maior na casca das raízes tuberosas, devido a maior quantidade de compostos fenólicos presentes nesse tecido. As reações enzimáticas relacionadas ao escurecimento enzimático foram mais expressivas na cv. BRS Rubissol e menores na cv. BRS Cuia. Os conservantes químicos aumentaram o tempo de armazenamento da batata-doce cv. BRS Cuia minimamente processada, em que o ácido cítrico 5% foi mais eficiente na redução do escurecimento enzimático. Nos processos de cura, a perda de massa fresca foi estabilizada a partir do 7o dia de armazenamento em raízes tuberosas feridas, mostrando que ocorreu maturação da periderme de cura. As raízes com dano mecânico mostraram melhor manutenção metabólica e cicatrização de ferimentos quando armazenadas a 30°C. / The cultivation of sweet potatoes is widely distributed throughout the world, in which tuberous roots are widely used in human nutrition and industrialization. Improper handling and sprouting alter metabolism and deteriorate tuberous roots during storage, but these changes are poorly studied. The main objectives of this study were: evaluate the control of sprouting and metabolic changes in tuberous roots of sweet potato cv. BRS Rubissol treated with ethylene, AOA and 1-MCP; evaluate the processing in the form of fried chips in tuberous roots of sweet potato cv. BRS Rubisol treated with ethylene, AOA and 1-MCP and stored at room temperature; characterize kinetically the peroxidase and polyphenoloxidase enzymes in flesh and skin crude extracts of three cultivars of sweet potatoes (BRS Amelia, BRS Rubissol and BRS Cuia) subjected to mechanical damage; evaluate the use of chemical preservatives in reducing browning in sweet potato cv. BRS Cuia minimally processed and stored at 5 oC and evaluate the morpho-anatomical and metabolic changes in the periderm of sweet potato cv. BRS Amelia at different temperatures and intensities of damage. The sprouting of the tuberous roots of sweet potato cv. BRS Rubissol was controlled by AOA and 1-MCP use, and this cultivar showed good potential for processing in the form of fried chips. The activity of the enzymes peroxidase and polyphenoloxidase was higher in the skin of the tuberous roots, due to the higher amount of phenolic compounds present in this tissue. The enzymatic reactions related to enzymatic browning were more expressive in cv. BRS Rubissol and lower in the cv. BRS Cuia. Chemical preservatives increased the shelf life of sweet potato cv. BRS Cuia minimally processed, in which 5% citric acid was more efficient in reducing enzymatic browning. In the healing process, the loss of fresh mass was stabilized from the 7 th day of storage in wounds tuberous roots, showing that maturation of the healing periderm occurred. The roots with mechanical damage showed better metabolic maintenance and wound healing when stored at 30°C.

Os osteoblastos são responsáveis pelo início do processo de biomineralização óssea mediada pela liberação de vesículas da matriz (MVs). As MVs surgem por brotamento das superfícies laterais dos osteoblastos e são secretadas para a matriz. A membrana das MVs possuem níveis elevados de Fosfatase Alcalina (TNAP), entre outra enzimas/proteínas, bem como de Chol, em comparação com a membrana plasmática. O objetivo deste estudo foi a construção de proteolipossomos constituídos por Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ou Dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), com Colesterol (Chol) em diferentes proporções para a caracterização cinética da TNAP, utilizando os substratos ATP, PPi e ADP, a fim de se obter um sistema que mimetize as MVs. O aumento da concentração de Chol dificultou a incorporação da TNAP aos sistemas constituídos com DPPC, e facilitou a sua incorporação aos constituídos por DOPC. A presença do Chol em todos os sistemas miméticos preparados afetou os parâmetros cinéticos de hidrólise da TNAP para todos os substratos estudados. Entretanto, independentemente da presença do Chol, a hidrólise do PPi apresentou sempre uma maior eficiência (maior kcat/K0.5), sugerindo que este substrato provavelmente possa ser hidrolisado preferencialmente. O tratamento com 2 mM de ciclodextrina (bmCD), resultou na remoção de apenas 70% do Chol de proteolipossomos constituídos por DPPC:Chol 36% mol. Estudos de calorimetria diferencial (DSC) revelaram que a bmCD fica ligada ao sistemas vesiculares causando interferência para os demais ensaios. Quando 36% mol de colestenona (Achol), um análogo de Chol, foi empregado na construção dos proteolipossomos de DPPC, foram encontrados comportamentos cinéticos distintos para a TNAP. O ATP foi hidrolisado com uma Vmáx menor que a os sistemas constituídos por DPPC:Chol 36% e maior do que para sistemas de DOPC:Chol 36% mol. Os valores de K0.5 foram menores para DPPC:Achol 36 % mol em comparação aos sistemas análogos. Com relação a hidrolise do PPi, os parâmetros cinéticos foram similares, em relação aos sistemas estudados contendo DPPC:Chol ou DOPC:Chol. Por fim, foi avaliada a capacidade de propagação de nódulos de mineralização pelos sistemas vesiculares contendo DPPC, DPPC:Chol e DPPC:Achol (com e sem TNAP incorporada), utilizando o ATP como substrato. A mineralização foi cerda de 16 vezes mais eficiente na presença de protelipossomos que continham tanto Chol ou colestenona, do que para o sistema somente constituído por DPPC (cerca de 4 vezes), quando comparados com os respectivos sistemas de lipossomos (na ausência de enzima). Diante destas diferenças apresentadas, tanto no comportamento cinético, quanto na capacidade de mineralização, pode-se suger que o microambiente lipídico tem um importante papel das MVs. Uma explicação que pode ser sugerida é que fatores termodinâmicos como: a diminuição da entalpia de transição; perda de pré-transição; presença de cargas superficiais; presença de diferentes substratos; bem como, orientações das ligações de hidrogênio com a molécula de água na superfície dos proteolipossomos, podem acarretar em modificações conformacionais na TNAP. A relevância dos resultados apresentados pode contribuir no entendimento da função dos lipídios e de suas interações com as proteínas presentes na MVs no processo de biomineralização. / Osteoblasts are responsible for initiating the bone biomineralization process mediated by the release of matrix vesicles (MVs). The MVs arise by budding from the membrane of the osteoblasts and are secreted into the matrix. The MVs membrane has high levels of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), among other enzymes/proteins, as well as cholesterol, compared with the plasma membrane. The objective of this study was to build proteoliposomes constituted by Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), with cholesterol (Chol) in different molar ratios for the kinetic characterization of TNAP, using the substrates ATP, ADP and PPi, in order to obtain systems that mimic the MVs. The increase in the cholesterol concentration hampered the incorporation of TNAP into the DPPC systems, but favored its incorporation into the DOPC liposomes. The presence of cholesterol in all prepared mimetic systems affected the kinetic parameters of hydrolysis for all substrates studied. Regardless of the presence of cholesterol, PPi hydrolysis always showed greater catalytic efficiency (kcat/K0.5), suggesting a preferential hydrolysis of this substrate. Treatment with 2 mM cyclodextrin (BMCD) resulted in removal of 70% of the cholesterol from the proteoliposome constituted of DPPC:Cholesterol 36% (molar ratio). Differential scanning calorimetry (DSC) studies showed that BMCD was bound to the vesicular systems interfering with the other assays. When 36% of cholestenone (Achol), an analogue of cholesterol, was employed in the construction of DPPC proteoliposomes, a different kinetic behavior was observed for TNAP. The Vmax for ATP hydrolysis was lower compared with the systems constituted of DPPC:Chol 36% and higher than that obtained for the DOPC:Chol 36% system. The values of K0.5 were lower for DPPC:Achol 36% compared to the similar systems. With respect to the hydrolysis of PPi, the kinetic parameters were similar for the systems constituted of DPPC:Chol and DOPC:Chol. Finally, we evaluated the ability of the vesicular systems containing DPPC, DPPC:Chol and DPPC:Achol (with and without TNAP incorporated) to propagate mineralization nodules, using ATP as substrate. The mineralization was about 16 times more efficient in the presence of proteoliposomes containing Chol or Achol than for the system constituted of DPPC only (about 4 times more efficient) compared with the corresponding liposome (in the absence of enzyme). Given the differences observed for both the kinetic behavior and the mineralization ability of the different systems, we suggest that the lipid microenvironment plays an important role in MVs function. A possible explanation for these differences is that thermodynamic factors such as the decrease in the enthalpy of transition and the loss of pre-transition, as well as the presence of surface charges, the presence of different substrates, and the orientation of hydrogen bonds with the water molecule on the surface of the proteoliposomes, may cause conformational changes in TNAP molecule. These relevant results can contribute for the understanding of the role of lipids and their interactions with proteins present in MVs in the biomineralization process.

FORTES, S.S. Estudo de metabolismo in vitro e inibição enzimática do produto natural Licarina A empregando microssomas hepático de humanos. 2017. Tese (Doutorado) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Muitos fármacos comercializados tiveram sua origem em produtos naturais e seus derivados. Devido ao grande potencial farmacológico destas novas moléculas pesquisadas, uma etapa importante e inicial no desenvolvimento de um novo fármaco é a avaliação do seu comportamento frente as enzimas do citocromo P450 (CYP 450), incluindo os estudos de interações medicamentosas. Neste contexto, um substrato que merece destaque é a Licarina A (Lic A). Este composto é uma neolignana encontrada em algumas espécies de plantas e vêm demonstrando várias propriedades biológicas promissoras, dentre elas destaca-se a atividade anti-leishimania. No entanto, para que esta substância com comprovada atividade se torne um fármaco é necessário realizar, na fase pré-clínica, estudos sobre seu perfil metabólico frente às enzimas do CYP450 e estudos de interação medicamentosa. Portanto, esta Tese teve como objetivo determinar os parâmetros enzimáticos utilizando microssomas hepáticos de humanos através do estudo de metabolismo in vitro com esta molécula e realizar estudos de interação medicamentosa através dos estudos de inibição enzimática e pesquisar a isoforma do CYP450 que metaboliza predominantemente este produto natural através do emprego de enzimas recombinantes de humanos. Primeiramente, foi desenvolvido um método analítico para a determinação do produto natural Licarina A em meio microssomal. As análises foram realizadas por cromatografia liquida de alta eficiência empregando a coluna Ascentis C18 e fase móvel composta por metanol: solução aquosa de ácido fórmico 0,1% (75:25, v/v); a vazão empregada foi de 1,0 mL min-1. O método foi validado na faixa de concentração de 0,383 a 76,65 ?mol L-1, com coeficiente de correlação linear de 0,99 e limite de quantificação de 0,383 ?mol L-1. A precisão e exatidão apresentaram resultados dentro do recomendável pela ANVISA. Após validação do método, estabeleceram-se as condições lineares para a depleção da Lic A no meio microssomal e posteriormente, a cinética foi determinada em condições de velocidade inicial utilizando para tanto 0,20 mg mL-1 de concentração de proteínas microssomais e 20 minutos de tempo de incubação. O comportamento observado na cinética enzimática para a depleção da Lic A foi um comportamento atípico, caracterizada pelo modelo cinético de Hill. Os valores de Vmax, S50 e coeficiente de Hill foram, 1,651 ?mol mg-1 min-1, 3,87 ?mol L-1 e 2,0 respectivamente. A partir dos parâmetros cinéticos o valor de clearance intrínseco (CLint) para a Lic A foi de 0,22 mL min-1 mg-1. Posteriormente, a correlação in vitro in vivo foi realizada e foi observado um clareance hepático (CLhep) de 20 mL min-1 kg-1 e taxa de extração hepática (E) de 1. As isoformas do CYP450 envolvidas no metabolismo da Lic A foram CYP 1A2 e 2B6. Os estudos de inibição mostraram que a Lic A é um inibidor fraco frente as isoformas do CYP450 estudadas, com valores de IC50 maiores do que 80 ?mol L-1. Embora já tenha sido estudada diferentes vias metabólicas da licarina A com vários metabólitos identificados, esta foi a primeira vez que foi observado a formação de um metabólito in vitro com o uso de microssomas hepático humano. Com o auxílio da espectrometria de massa foi possível a identificação do metabólito de m/z 343 [M+H]+, possivelmente um composto epoxidado, da licarina A. / FORTES, S.S. In vitro metabolism and enzymatic inhibition study of the natural product Licarin A employing human liver microsomes. 2017. Thesis (Doctoral) - Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2017. Many marketed drugs had their origin in natural products and their derivatives. Due to the biological potential of these new molecules, an important initial step in the development of a new drug is the evaluation of its behavior in front of cytochrome P450 enzymes (CYP 450), including studies of drug interactions. In this context, a substrate that deserves attention is Licarin A (Lic A). This compound is a neolignan found in some species of plants and several promising biological properties have been describing for this natural product, among them anti-leishimania activity. However, for this substance to become a drug, it is necessary to perform, in the preclinical phase, studies regarding its metabolic profile and drug interactions. Therefore, this thesis aimed to determine the enzymatic parameters by using human liver microsomes through in vitro metabolism study with this molecule and to conduct drug interaction studies through the enzyme inhibition studies and finally, to investigate the CYP450 isoforms that metabolize predominantly this natural product through the use of recombinant human enzymes. Firstly, an analytical method was developed for the quantification of the natural product Licarin A in microsomal medium. The analyzes were performed by high performance liquid chromatography employing an Ascentis C18 column and mobile phase composed of methanol: 0.1% formic acid aqueous solution (75:25, v / v); the flow rate used was 1.0 mL min-1. The method was validated in the concentration range of 0.333 to 76.65 ?mol L-1, with a linear correlation coefficient of 0.99 and a quantification limit of 0.333 ?mol L-1. Accuracy and precision showed results in agreement with ANVISA guidelines. After method validation, the linear conditions for depletion of Lic A in the microsomal medium were established. Subsequently, the kinetics were determined under initial velocity conditions using 0.20 mg mL-1 of microsomal protein concentration and 20 minutes of incubation time. The behavior observed in the enzymatic kinetics for the depletion of Lic A was an atypical behavior, characterized by the Hill kinetic model. The values of Vmax, S50 and Hill coefficient were 1.651 ?mol mg-1 min-1, 3.87 ?mol L-1 and 2.0, respectively. From the kinetic parameters, the intrinsic clearance (CLint) for Lic A was 0.22 mL min-1 mg-1. Subsequently, in vitro in vivo correlation was performed and a hepatic clareance (CLhep) of 20 mL min-1 kg-1 and a hepatic extraction rate (E) of 1 was observed. The CYP450 isoforms involved in the metabolism of Lic A were CYP 1A2 and 2B6. Inhibition studies have shown that Lic A is a weak CYP450 inhibitor, with IC50 values greater than 80 ?mol L-1. Although different metabolic pathways of licanin A have been studied and several metabolites were identified, this is the first report about the formation of an in vitro metabolite after metabolism by human liver microsomes. With the aid of mass spectrometry it was possible to identify the metabolite of m/z 343 [M+H]+, possibly an epoxidized compound, of licanin A.