Rearranjos cromossômicos estruturais estão potencialmente associados ao desenvolvimento de doenças genéticas devido à disrupção, inativação ou alteração da dosagem gênica. O objetivo deste projeto foi realizar a caracterização genômica de duas pacientes e seus familiares portadores de rearranjo cromossômico estrutural envolvendo o braço curto do cromossomo 4 e o braço longo do cromossomo 12, associando técnicas de citogenética clássica (bandamento GTG), citogenética molecular (FISH) e citogenômica (array-CGH), para definição diagnóstica e maior conhecimento sobre os fatores envolvidos na correlação cariótipo-genótipo-fenótipo. Foram avaliados seis indivíduos, duas pacientes, primas em primeiro grau que apresentavam alterações fenotípicas, assim como seus familiares, portadores de translocação aparentemente equilibrada e fenótipo normal. Apesar das duas pacientes apresentarem alteração cromossômica comum, derivativo do cromossomo 4 [der(4)], foram observados achados fenotípicos distintos. A investigação permitiu a definição do diagnóstico de deleção 4p16 e trissomia 12qter para as duas pacientes com fenótipo alterado e cariótipo 46,XX,der(4)t(4;12)(p16;q24.3), a definição precisa dos pontos de quebra em 4p16.3 e 12q24.31->q24.33, assim como a determinação da origem parental do rearranjo e a definição do diagnóstico citogenético final de quatro portadores de translocação aparentemente equilibrada e cariótipo t(4;12)(4pter->4p16.3::2q24.31->12qter;12qter->12q24.31::4p16.3->4pter),direcionando o aconselhamento genético para a família. Nas duas pacientes, a técnica de array-CGH (Plataforma 2x400K, Agilent®) detectou uma diferença sutil de tamanho entre as perdas e ganhos referentes aos cromossomos envolvidos no rearranjo, sendo diagnosticado em P1 uma perda de 2.707.221 pb na citobanda 4p16.3, além de um ganho de 12.405.205 pb em 12q24.31->q24.33. A paciente 2 apresentou uma perda de 2.710.969 pb em 4p16.3 e um ganho de 12.393.885 pb em 12q24.31->q24.33. Ambas as regiões de desequilíbrio genômico incluem genes que podem ser relevantes para manifestação fenotípica observada nas pacientes, entre eles: WHSC1, NELFA, LETM1, FGFRL1 e SPON2. Os resultados da investigação citogenômica indicaram, ainda, a presença de translocação equilibrada nos quatro indivíduos portadores, não sendo detectadas perdas e/ou ganhos genômicos nas regiões dos pontos de quebra cromossômica. Os resultados obtidos na investigação do padrão de metilação dos genes FGFRL1 e SPON2 não permitiram afirmar que uma provável repressão da expressão gênica devido ao imprinting materno e paterno esteja associada às características fenotípicas distintas observadas nas duas pacientes. Embora tenha sido possível a indicação de genes correlacionados ao fenótipo das pacientes, a correlação entre a alteração genética e o fenótipo das mesmas pode depender da ação sinérgica dos mais de 190 genes envolvidos neste rearranjo cromossômico estrutural familiar. / Structural chromosomal rearrangements are potentially associated with the development of genetic disorders due to disruption, inactivation or gene dosage alterations. The objective of this project was to perform the genomic characterization of a familial structural chromosomal rearrangement involving the short arm of chromosome 4 and the long arm of chromosome 12 in two patients and carriers. The experimental approach involved using a combination of classical cytogenetic techniques (GTG banding), molecular cytogenetics (FISH) and cytogenomics (array-CGH), to provide a diagnostic definition and a better understanding of how changes in the karyotype and genotype may be associated with the phenotype. Six individuals were evaluated, two patients with phenotypic abnormalities, as well as the carriers of an apparently balanced 4p;12q translocation with normal phenotypes. Although the two patients showed a common chromosomal abnormality, the derivative chromosome 4 [der (4)], they presented distinct phenotypic findings. The investigation provided a definition of the diagnosis of 4p16 deletion and trisomy 12qter for the two patients with abnormal phenotypes and a karyotype 46,XX,der(4)t(4;12)(p16;q24.3). In addition a precise definition of the breakpoints at 4p16.3 and 12q24.31->q24.33, and the parental origin of the rearrangement was determined. A precise definition of the cytogenetic diagnosis of four carriers with an apparently balanced translocation and karyotype t(4;12)(4pter->4p16.3::2q24.31->12qter; 12qter 12q24.31->4pter::4p16.3), facilitated the genetic counseling for the family. In both patients, the array-CGH technique (2x400K Platform, Agilent®) detected a subtle difference in size between losses and gains in the chromosomal regions involved in the rearrangement. Patient 1 presented a loss of 2,707,221 bp in the cytoband 4p16.3, and a gain of 12,405,205 bp in 12q24.31->q24.33. Patient 2 had a loss of 2,710,969 bp in 4p16.3 and a gain of 12,393,885 bp in 12q24.31 -> q24.33. Both regions of genomic imbalance included genes that may be relevant to phenotypic findings observed in our patients, including: WHSC1, NELFA, LETM1, FGFRL1 and SPON2. Genomic findings also confirmed the presence of a balanced translocation in four carriers, with no genomic losses and/or gains in the regions of chromosome breakpoints. The results of the investigation of the methylation pattern of FGFRL1 and SPON2 genes could not demonstrate that repression of gene expression due to maternal and paternal imprinting was associated with the distinct phenotypes observed in the two patients. Although it has been possible to indicate genes related to the phenotype of the patients, the correlation between the genetic alteration and phenotype may depend on the synergistic action of multiple genes from more than the 190 involved in this familial chromosomal rearrangement.

O estresse oxidativo é um dos principais responsáveis pela produção de danos espontâneos no DNA, os quais podem levar à origem de diversas neoplasias, inclusive câncer de mama (CM). Além disso, dentre os diversos fatores de risco já estabelecidos para a ocorrência do CM em mulheres, como idade, hormônios, dieta e fatores genéticos, alguns tipos de lesões benignas mamárias também aparecem como importantes elementos predisponentes. Dessa forma, a pesquisa de genes envolvidos com a produção ou reparo de danos oxidativos, bem como o estudo de elementos bioquímicos relacionados à proteção antioxidante em pacientes com lesões malignas e benignas de mama são fundamentais para o entendimento do mecanismo geral que conduz ao estresse oxidativo no CM. Os objetivos deste estudo foram determinar a frequência dos polimorfismos Ser326Cys hOGG1 e Arg38Trp AHCY pela técnica de PCR-RFLP; avaliar os níveis sanguíneos de folato, vitamina B12 e glutationa peroxidase (GSH-Px); examinar o grau de lesões oxidativas espontâneas no DNA pelo Teste do Micronúcleo (MN), Índice de Divisão Nuclear (IDN) e Ensaio Cometa em linfócitos; e por fim, verificar se os polimorfismos e os elementos bioquímicos estudados exercem influência sobre tais danos oxidativos. Foram coletadas amostras de sangue periférico de 55 voluntárias sadias, 10 pacientes com adenose esclerosante (AE) e 54 pacientes com carcinoma ductal invasivo (CDI) não tratadas. Os polimorfismos foram analisados em todas as amostras. As análises bioquímica e citogenética foram realizadas numa sub-amostra composta por 21 mulheres sadias, 10 pacientes com AE e 14 pacientes com CDI. No Ensaio Cometa foi aplicada a endonuclease OGG1 para detecção de danos oxidativos. Não foi observada relação entre os alelos Ser326Cys hOGG1 e Arg38Trp AHCY e o risco de CM. O número de indivíduos portadores do alelo Arg38Trp AHCY foi insuficiente para as demais análises. Não houve deficiência ou excesso de folato e vitamina B12 entre as voluntárias. Pacientes com CDI apresentaram níveis de GSH-Px e frequência de MNs significativamente maiores do que mulheres sadias. Não houve associação entre o grau de danos espontâneos no DNA e risco de CM. O alelo Ser326Cys hOGG1 não interfere na produção de lesões espontâneas no DNA. O folato e a vitamina B12, em níveis normais, podem provocar instabilidade genômica em pacientes com AE. / Oxidative stress is one of the most important generators of DNA damage, which can lead to carcinogenesis of many cancer types, including breast cancer (BC). Several risk factors were established for occurrence of BC in women, such as age, hormones, diet and genetic factors, however, certain types of benign breast lesions also appear as important predisposing factors. Thus, the search for genes involved in production and repair of oxidative damage, as well as the study of biochemical elements related to the antioxidant protection in patients with malignant and benign breast lesions are fundamental for understanding the general mechanism leading to oxidative stress in the BC. The aims of this study were to determine the frequency of Ser326Cys hOGG1 and Arg38Trp AHCY genetic polymorphisms by PCR-RFLP to investigate their association with BC susceptibility; evaluate folate, vitamin B-12 and glutathione peroxidase (GSH-Px) blood levels; examine the extension of spontaneous oxidative damage in DNA by Micronucleus Test (MN), Nuclear Division Index (NDI) and Comet Assay with lymphocytes; and finally, verify if polymorphisms and biochemicals investigated may influence on oxidative damage. Peripheral blood samples of 119 volunteers were collected: 55 healthy women, 10 patients with sclerosing adenosis (SA) and 54 untreated patients with invasive ductal carcinoma (IDC). Molecular analysis was performed in all samples. Biochemical and cytogenetic analysis were performed on a sub-sample of 45 individuals comprised 21 healthy women, 10 AE patients and 14 ICD patients, chosen at random from the total samples. In Comet Assay, endonuclease OGG1 was applied to detect oxidative damage. No relationship was found between Ser326Cys hOGG1 and Arg38Trp AHCY alleles and risk for BC. The number of individuals carrying the allele Arg38Trp AHCY was insufficient for further analysis. There was no deficiency or excess in folate and vitamin B12 levels among the volunteers. GSH-Px levels and frequencies of MNs were significantly higher in ICD patients than healthy women. There was no association between the degree of spontaneous DNA damage and risk for BC. Ser326Cys hOGG1 allele does not interfere on production of spontaneous DNA lesions. Normal levels of vitamin B12 and folate may cause genomic instability in AE patients.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-10-21T01:01:09Z No. of bitstreams: 1 shaianysabrinalopesgomes.pdf: 8345225 bytes, checksum: 345de5fe2a909ceb0a04bbb96016c1ff (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-10-21T13:13:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 shaianysabrinalopesgomes.pdf: 8345225 bytes, checksum: 345de5fe2a909ceb0a04bbb96016c1ff (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-21T13:13:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 shaianysabrinalopesgomes.pdf: 8345225 bytes, checksum: 345de5fe2a909ceb0a04bbb96016c1ff (MD5) Previous issue date: 2017-03-22 / As orquídeas do complexo "Zygopetalum maculatum" (Kunth) Garay são típicas dos campos rupestres e de altitude do leste do Brasil. Atualmente são reconhecidas seis espécies para este grupo que, por compartilharem características morfológicas diagnósticas, são reconhecidas aqui como um complexo de espécies. De forma a contribuir para entender o padrão de variação fenotípica observado entre as populações e com isso tentar esclarecer a formação deste complexo, este trabalho caracterizou do ponto de vista genético ar 22 populações de "Z. maculatum", sendo 21 provenientes do Brasil e uma da Bolívia. As análises compreenderam estimativa da quantidade de DNA nuclear, determinação do número cromossômico, comportamento meiótico e diversidade genética identificada por marcadores do tipo ISSR. O conteúdo médio de DNA revelou três níveis de ploidia no complexo, 7,36 pg, 10,52 pg e 14,09 pg de DNA, sendo estes relacionados a números cromossômicos de 2n=48; 2n=72; 2n=96, respectivamente. Tal variação ocorreu entre e dentro das populações. Dados cariotípicos (morfometria, DNAr 5S e 45S) evidenciaram similaridade entre os três níveis de ploidia. A meiose mostrou-se irregular, com ocorrência de atraso e perda cromossômica, pontes, “cromossomos aderentes”, micronúcleos e assincronia em todos os níveis de ploidia. O dendrograma baseado em marcadores ISSR revelou tendência de agrupamento de indivíduos com o mesmo nível de ploidia e originados das mesmas regiões geográficas. Os resultados sugerem que as populações possuem baixos índices de diversidade genética entre indivíduos e que a maior diversidade encontra-se entre as populações. De forma geral, os resultados indicam que eventos de poliploidização estejam relacionados à diversificação e especiação de “Z. maculatum”, sendo um processo importante para explicar as variações morfológicas observadas dentro do complexo. / The orchids of the "Zygopetalum maculatum" (Kunth) Garay complex are typical of the “campos rupestres” of the east side of Brazil. Currently, six species are recognized for this group which, due to their morphological similarity, is recognized here as a species complex. In order to understand the phenotypic pattern observed among the populations and contribute to clarify the formation of this complex, this study characterized 22 populations of “Z. maculatum”, being 21 populations from Brazil and one population from Bolivia. The study included DNA amount estimation, determination of the chromosome number, meiotic behavior and genetic diversity estimation. The average of DNA content revealed three 2C values, 7.36 pg, 10.52 pg and 14.09 pg of DNA, which were associated to 2n = 48; 2n = 72 and 2n = 96 chromosomes, respectively. The variation was observed within and among populations. Karyotypic data (morphometry, 5S and 45S rDNA) showed similarity among all ploidy levels. Meiosis behavior was not regular being observed chromosome delay and loss, bridges, micronuclei, chromosomal stickiness and asynchrony. The dendrogram based on ISSR revealed similarity regarding the ploidy level and the geographical distribution of the individuals. The data also suggested low genetic diversity within populations being most of the diversity observed among populations. In general, the results indicate that polyploidization events are probably related to the Zygopetalum diversification and speciation, being an important process to explain the morphological variations observed within the complex.

Orientador: Eliana Regina Forni Martins / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:43:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Braga_KlenyaRosaRocha_D.pdf: 3638781 bytes, checksum: f3a0b3548e4388cdabb276fb9662c32a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A família Asteraceae (Compositae) possui cerca de 23.000 espécies e 1.600 gêneros. Sua distribuição é cosmopolita, com representantes em todos os continentes. Sua maior diversidade está na América do Sul. A família está bem representada no Brasil (cerca de 300 gêneros e 2.000 espécies), ocorrendo principalmente em formações abertas, como cerrados e campos. Cassini, em 1817 foi o primeiro a propor um sistema de classificação para a família, que foi alterado por vários autores. Atualmente a família está dividida 12 subfamílias e 43 tribos. Dentre os parâmetros que podem ser obtidos a partir de estudos citogenéticos, o número cromossômico é o mais amplamente utilizado. Estima-se que cerca de 61,6% dos gêneros de Asteraceae possuem pelo menos uma contagem de números cromossômicos, sendo relatada grande variação (2n= 4 a ca. 432). O número básico x=9 é o mais frequente. Apesar do número considerável de trabalhos referentes à contagem cromossômica e análise de cariótipos de espécies de Asteraceae, este número ainda é muito pequeno quando comparado com a riqueza de espécies da família. No que diz respeito aos estudos cromossômicos utilizando bandamento cromossômico e hibridização de DNA in situ, os trabalhos são mais escassos. Diante da riqueza de espécies, da diversidade cariotípica da família e da carência de dados citogenéticos para subsidiar a reavaliação das delimitações de seus grupos taxonômicos, este trabalhou objetivou caracterizar o cariótipo de diversas espécies nativas de Asteraceae proveniente da Reserva Biológica Municipal (RBM) da Serra do Japi uma das últimas grandes áreas de floresta contínua do Estado de São Paulo, que apresenta uma grande diversidade de espécies de Asteraceae. Foram feitos a determinação do número cromossômico, o detalhamento de caracteres morfológicos dos cromossomos (tamanho e forma) e a aplicação de técnicas de bandamento CMA/DAPI e técnica de FISH. Foi determinado o número cromossômico de 35 espécies, as quais estão distribuídas em 14 tribos e 26 gêneros, com variação de 2n=16 a 72. As tribos mais bem representadas foram Eupatorieae (9spp.), Vernonieae (6spp.) e Astereae (5spp.). Seis novas contagens foram determinadas e quatro divergiram de relatos anteriores: Bidens subalternans (2n=72), Chromolaena odorata (2n=30), Praxelis kleineoides (2n=30) e Vernonia diffusa (2n=34). Os cariótipos podem ser considerados moderadamente simétricos, com o índice TF% variando de 29 em Praxelis kleineoides (2n=30) a 44 into G. intermedia (2n=20). Dezesseis espécies foram submetidas à técnica de bandamento CMA/DAPI. Houve variação de 2 a 12 bandas CMA+/DAPI-. A técnica de FISH revelou diferenças cariotípicas em cinco espécies estudadas: Conyza sumatrensis var. leotheca, Bidens pilosa, Mikania sp, Vernonia diffusa e V. remotiflora, que apresentaram 2 a 6 sítios de DNAr 45S e 2 a 3 sítios de DNAr 5S. Nossos dados de bandamento CMA/DAPI e FISH são inéditos para todas as espécies estudadas / Abstract: The Asteraceae family (Compositae) comprises around 23.000 species and 1.600 genera. Its distribution is comospolitan, with representatives in all continents. The highest diversity is found in South America. The family is well represented in Brazil (with 300 genera and 2.000 species), mainly occurring in the opened formations, like savannas and fields. Cassini, in 1817 was the first to propose a system of classification for the family, which was later changed by several authors. Nowadays the family is divided in 12 subfamilies and 43 tribes. Among the parameters that can be obtained from cytogenetic studies, the number of chromosomes is the most commonly used. Its estimated that about 61,6% of Asteraceae genera have at least a count chromosome numbers, being reported wide variation (2n= 4 a ca. 432). The basic number x=9 is the most frequent. In spite of considerable number of works on the chromosomal count and karyotpe analysis from species of Asteraceae, this number is still very small when compared with species richness within the family. In respect of chromosomal studies used in the chromosome banding and in situ DNA hybridization, the works are more scarce. Before wealth of species, of karyotype diversity of family and of lack of data cytogenetics to subsidize the revaluation of delimitations of its taxonomic groups, this work aims to characterize the karyotype of several native species of Asteraceae from the Municipal Biological Reserve (MBR) of Japi, one of the last large areas of continuous forest of São Paulo, that has a great diversity of species of Asteraceae. We determined the chromosomal number, detailing the morphological characters of chromosomes (size and shape), and applied techniques of CMA/DAPI banding and FISH. We determined the chromosome number of 35 species, which are distributed in 14 tribes and 26 genera, ranging from 2n = 16-72. The most well represented tribes were Eupatorieae (9spp.), Vernonieae (6spp.) and Astereae (5spp.). Six new counts were determined and four differed from previous scores: Bidens subalternans (2n=72), Chromolaena odorata (2n=30), Praxelis kleineoides (2n=30) and Vernonia diffusa (2n=34). The karyotpes can be considered moderately symmetric, with index TF% ranging from 29 in Praxelis kleineoides (2n=30) to 44 in G. intermedia (2n=20). Sixteen species were submitted to technique of banding CMA/DAPI. There were variations of 2 to 12 CMA+/DAPI- bands. The technique of FISH revealed varied karyotypes in five species: Conyza sumatrensis var. leotheca, B. pilosa, Mikania sp, Vernonia diffusa and V. remotiflora showed 2 to 6 sites of 45S rDNA and 2 to 3 sites of 5S rDNA. Our data of banding CMA/DAPI and FISH are original for all studied species / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutora em Biologia Vegetal

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The economic potential of the medicinal species native to Brazil is huge, rendering it important to maintain the available plant genetic diversity via studies characterizing germplasm. Between these studies, highlights the characterization meiotic and pollen viability, genotoxic and antiproliferative activitie, beyond determination of phenolic compounds. Sambucus australis Cham. & Schltdl. ( sabugueiro ) numbers among the native species with medicinal potential, being widely used in the treatment of symptoms of skin eruptions, influenzas and common colds, for its diaphoretic, anti-inflammatory and analgesic actions. The objective of the present study was to investigate the antiproliferative, genotoxic and antigenotoxic activity of aqueous extracts of two accesses of S. australis, using the Allium cepa test, and to determine the phenolic compounds present in these extracts, as well as to analyze the meiotic behavior and estimate the pollen viability of different accesses of S. australis collected in Rio Grande do Sul state. Antiproliferative, genotoxic and antigenotoxic activities were determined by assessing the effect of aqueous extracts from the inflorescences and leaves of two accesses of S. australis, at concentrations of 3 g.L-1 and 12 g.L-1, on the cellular cycle of A. cepa. High performance liquid chromatography (HPLC) was employed to determine the phenolic compounds present in the extracts. For the meiosis analysis, slides were prepared by squashing technique of the anthers removed from the flower buds. The phases of association and distribution of the chromosomes were observed and meiotic indexes determined. To estimate pollen viability, the slides were prepared by squashing the anthers, comparing three stains: 2% acetic-orcein, 2% acetic-carmine, and Alexander´s reaction. All statistical analyses of the data were performed using the Scott-Knott test (p<0.05). Results showed that the aqueous extracts of S. australis exerted antiproliferative activity on the cellular cycle of A. cepa. The extracts prepared from S. australis (12g.L-1) leaves, for both accesses, also exhibited antigenotoxic activity. Chromatographic analysis disclosed the presence of the following compounds: gallic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, ellagic acid, rutin, quercitrin, isoquercitrin, quercetin and kaempferol. Ultimately, the accesses of S. australis studied exhibited regular meiotic behavior, gametic number n=19, meiotic index > 90% and high pollen viability, being stain Alexander´s reaction the most efficient to estimate pollen viability in the specie. / O potencial econômico de espécies medicinais nativas no Brasil é imenso, sendo necessário conservar a diversidade genética vegetal disponível através de estudos de caracterização de germoplasma. Entre esses estudos, destacam-se a caracterização meiótica, a viabilidade polínica, a análise da atividade genotóxica e antiproliferativa, além da determinação dos compostos fenólicos. Dentre as espécies nativas com potencial medicinal, Sambucus australis Cham. & Schltdl. (sabugueiro) tem grande popularidade no tratamento sintomático de moléstias eruptivas, gripes e resfriados, por suas ações diaforética, anti-inflamatória e analgésica. O presente trabalho teve por objetivo verificar a atividade antiproliferativa, genotóxica e antigenotóxica de extratos aquosos de dois acessos de S. australis, através do teste de Allium cepa, bem como determinar os compostos fenólicos presentes nesses extratos, além de analisar o comportamento meiótico e estimar a viabilidade polínica de diferentes acessos de S. australis coletados no Rio Grande do Sul. Para determinação das atividades antiproliferativa, genotóxica e antigenotóxica, foi avaliado o efeito dos extratos aquosos das inflorescências e folhas de dois acessos de S. australis, nas concentrações de 3 g.L-1 e 12 g.L-1, sobre o ciclo celular de A. cepa. Os compostos fenólicos presentes nesses extratos foram determinados por meio da técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Para a análise da meiose, foram preparadas lâminas pela técnica de esmagamento das anteras retiradas dos botões florais, observando-se as fases de associação e distribuição dos cromossomos, sendo também determinados os índices meióticos. Para estimativa da viabilidade polínica, as lâminas foram preparadas por esmagamento das anteras, comparando-se três corantes: orceína acética 2%, carmim acético 2% e reativo de Alexander. Todos os dados foram analisados estatisticamente pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). A partir dos resultados, pode-se observar que os extratos aquosos de S. australis apresentaram atividade antiproliferativa sobre o ciclo celular de A. cepa. Os extratos preparados a partir das folhas de S. australis (12g.L-1), em ambos acessos, também apresentaram atividade antigenotóxica. A partir da análise cromatográfica foi possível determinar a presença dos seguintes compostos: ácido gálico, ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido elágico, rutina, quercitrina, isoquercitrina, quercetina e canferol. Por fim, os acessos de S. australis estudados possuem comportamento meiótico regular, número gamético n=19, índice meiótico superior a 90% e alta viabilidade polínica, sendo o corante reativo de Alexander o mais eficiente para estimar a viabilidade polínica na espécie.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1695521 bytes, checksum: 9a0915b224b9fc02033cedd8cfc42515 (MD5) Previous issue date: 2014-07-30 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The species of the genus Astyanax are widely distributed in the Neotropical region and have few morphological, ecological and behavioral differences, which complicates the taxonomic classification of this taxon. The nominal species Astyanax bimaculatus was described by Linnaeus in 1758 and currently species with two oval spots that occur in several Neotropical basins are considered as belonging to bimaculatus complex. The objective of this study was to determine the cytogenetic and molecular characteristics (mitochondrial DNA) of 19 populations currently assigned to Astyanax bimaculatus from complex coastal basins of southeastern Minas Gerais using conventional staining, nucleolar organizer regions Ag-NORs, C-band, DAPI, FISH and the gene cytochrome oxidase I - COI. Data were compared with other species of the complex. The karyotype 6m +20 sm +18 st +6 t occurred in all populations, with Ag-NORs ranging from two to eight stained chromosomes. The C-banding showed centromeric and pericentromeric markings, evidenced by the fluorochrome DAPI. Fluorescent 18S and 5S rDNA probes marked one chromosome pair respectively. The phylogeny obtained with the COI gene indicated the presence of two haplogroups with large molecular distance between them: haplogroup I was more closely related to the populations of the São Francisco River Basin, while haplogroup II was subdivided into a group which was more related to populations from the upper Paraná (IIA) and another group formed exclusively by coastal haplotypes (IIB). The karyotype uniformity of coastal populations is greater than the recognized Astyanax altiparanae, suggesting the persistence of large populations. Polymorphisms involving C-band patterns indicate that the addition and reduction of heterochromatin blocks are compatible with intraspecific variation. The molecular data suggest that coastal basins received migrants from continental basins, with more recent geodispersion of a coastal haplogroup, probably related to the dynamic confluence of coastal basins during glacial periods. The genetic similarity between São Francisco River Basin and coastal basins indicates that the nominal species Astyanax lacustris does not represent a valid taxon. While the Upper Paraná Basin maintained a molecular identity consistent with the existence of the nominal taxon Astyanax altiparanae that, agreeing with the cytogenetic data, also occurs in the Paraíba do Sul River Basin. It is concluded that the bimaculatus complex in southeastern Brazil is composed by three lineages, including only two species Astyanax aff. bimaculatus present in São Francisco and coastal basins and A. altiparanae present in the Upper Paraná. / As espécies do gênero Astyanax apresentam ampla distribuição na região neotropical e apresentam poucas diferenças morfológicas, ecológicas e comportamentais, o que dificulta a classificação taxonômica desse táxon. A espécie nominal Astyanax bimaculatus foi descrita em 1758 por Linnaeus e, atualmente, espécies com duas manchas ovaladas que ocorrem em diversas bacias neotropicais são consideradas como pertencentes ao complexo bimaculatus. O objetivo deste trabalho foi determinar as características citogenéticas e moleculares (DNA mitocondrial) de 19 populações consideradas como pertencentes ao complexo Astyanax bimaculatus das bacias costeiras do sudeste de Minas Gerais utilizando coloração convencional, regiões organizadoras de nucléolos Ag-NOrs, banda C, DAPI, FISH e o gene citocromo oxidase I - COI. Os dados foram comparados com outras espécies do complexo. O cariótipo 6m+20sm+18st+6t ocorreu em todas as populações, com Ag-NORs variando de dois a oito cromossomos marcados. A banda C mostrou marcações centroméricas e pericentroméricas, evidenciadas pelo fluorocromo DAPI. As sondas 18S e 5S marcaram apenas um par cromossômico respectivamente. A filogenia obtida com o gene COI indicou a presença de dois haplogrupos com grande distância molecular: o haplogrupo I mais aparentado com populações da bacia do rio São Francisco, enquanto o haplogrupo II subdividiu-se em um grupo mais aparentado com populações do alto Paraná (IIA) e outro grupo formado exclusivamente por haplótipos costeiros (IIB). A uniformidade cariotípica das populações costeiras é maior que a reconhecida em Astyanax altiparanae, sugerindo a persistência de grandes populações. Polimorfismos envolvendo padrões de banda C indicam que a adição e redução de blocos de heterocromatina são consideradas variações intraespecíficas. Os dados moleculares sugerem que as bacias costeiras receberam aporte de bacias continentais, com geodispersão mais recente de um haplogrupo costeiro, provavelmente relacionado com a dinâmica de confluência de bacias costeiras durante os períodos glaciais. A similaridade genética entre a bacia do rio São Francisco e as bacias costeiras indica que a espécie nominal Astyanax lacustris não representa um táxon válido. Enquanto a bacia do alto Paraná manteve uma identidade molecular condizente com a existência do táxon nominal Astyanax altiparanae que, condizente com os dados citogenéticos, também ocorre na bacia do rio Paraíba do Sul. Conclui-se que o complexo bimaculatus no sudeste brasileiro é composto de três linhagens, englobando apenas duas espécies: Astyanax aff. bimaculatus presente no São Francisco e nas bacias costeiras e A. altiparanae presente no alto Paraná.

Viguiera arenaria Baker é uma Asteraceae de Cerrado de porte herbáceo, filotaxia alterna, inflorescência em capítulo e que apresenta formação de raízes tuberosas. Apesar de análises fitoquímicas terem encontrado substâncias com atividades biológicas de interesse terapêutico, sabe-se pouco sobre a biologia da planta. Neste trabalho, buscou-se contribuir para o conhecimento de aspectos relacionados ao desenvolvimento de V. arenaria, visando atingir três objetivos específicos: verificar a taxa de germinação em condições in vitro; estabelecer um protocolo de regeneração in vitro; verificar modificações epigenéticas (metilação de citosina) no DNA de células cambiais de raízes tuberizadas e não-tuberizadas que possam estar associadas ao processo de tuberização. As sementes e raízes foram coletadas em área de Cerrado no Estado de São Paulo, Brasil, em duas épocas diferentes: em maio de 2008 (apenas sementes) e março de 2009 (sementes e raízes). Sementes e embriões de V. arenaria foram colocados para germinar, respectivamente, em papel filtro embebido com solução de nistatina e em meio de cultura sólido (MS com metade da concentração de macronutrientes), sendo mantidos em sala de crescimento (24°C e 16 horas/ luz) para avaliação do tempo e da porcentagem de germinação e embriões viáveis. No experimento de regeneração in vitro, folhas de plântulas, sete semanas após a germinação e segmentos hipocotiledonares, uma semana após a germinação, foram inoculados no mesmo meio, porém acrescido de diferentes concentrações de NAA (0,0; 0,01 e 0,05 mg.L-1), BAP (0,0; 0,2; 0,4 e 0,8 mg.L-1) e Zeatina (0,0; 0,2; 0,4 e 0,8 mg.L-1). Os explantes foram mantidos sob condições idênticas ao experimento de germinação. No estudo sobre imunolocalização de 5-metilcitosina, lâminas permanentes contendo cortes transversais de raízes tuberizadas e não-tuberizadas foram coradas com anticorpos fluorescentes contra 5-metilcitosina e contracoradas com DAPI. Foi observado um efeito de época de coleta de sementes, sendo aquela realizada em março de 2009 a que apresentou maiores porcentuais de embriões viáveis (72%) e de germinação de sementes e embriões (> 62% e 87%, respectivamente), embora o tempo de germinação tenha sido maior (~7 dias), comparativamente à coleta feita em maio de 2008 (~3 dias). Os experimentos de regeneração demonstraram certa recalcitrância da espécie na regeneração adventícia de brotos, pois os porcentuais de explantes com brotos foram inferiores a 25% na maioria dos tratamentos. Porém, houve 100% de formação de calos em diversos tratamentos. Por fim, verificaram-se mudanças no padrão de metilação e aumento de três vezes no conteúdo de DNA nas raízes tuberizadas relativamente às raízes não-tuberizadas. / Viguiera arenaria Baker is an herbaceous Asteraceae from Cerrado presenting alternate phyllotaxis, capitulum inflorescence and tuberized roots. Although phytochemical analyses have found substances with biological activities of therapeutic interest, little is known about the biology of the plant. In this study, we sought to contribute to the knowledge of aspects related to the development of V. arenaria, aiming to achieve three specific goals: to determine the germination rate under in vitro conditions; to establish a protocol for in vitro regeneration; to check epigenetic modifications (cytosine methylation) in DNA of cambial cells in tuberized and non-tuberized roots, which may be associated with the tuberization process. The seeds and roots were collected in a Cerrado area in the State of Sao Paulo, Brazil, in two different times: in May 2008 (seeds only) and March 2009 (seeds and roots). Seeds and embryos of V. arenaria were placed to germinate, respectively, on filter paper soaked with a solution of nystatin and solid medium (MS with half-strength macronutrients), and maintained in a growth chamber (24 ° C and 16 hours/ light) to evaluate time for germination and percentages of germination and viable embryos. In the experiment of in vitro regeneration, leaves of seedlings, seven weeks after germination and hypocotyl segments, one week after germination were inoculated in the same medium supplemented with different concentrations of NAA (0, 0.01 and 0.05 mg.L-1), BAP (0.0, 0.2, 0.4 and 0.8 mg.L-1) and Zeatin (0.0, 0.2, 0.4 and 0.8 mg.L-1). Explants were kept under the same conditions of the germination experiment. In the study of immunolocalization of 5- methylcytosine, permanent slides containing transverse sections of tuberized and non-tuberized roots were stained with fluorescent antibodies against 5-methylcytosine and counterstained with DAPI. We observed an effect of harvest time, as the one held in March 2009 presented the highest percentage of viable embryos (72%) and germination of seeds and embryos (> 62% and 87% respectively), although the germination rate was higher (~7 days) compared to the harvest made in 2008 (~3 days). The in vitro assays showed some recalcitrance of the species in the regeneration of adventitious buds, as the percentage of explants with shoots were less than 25% in most treatments. However, there was 100% callus formation in different treatments. Finally, changes in the methylation pattern were observed as well as three-fold increase in DNA content in tuberized roots relatively to non-tuberized roots.

A Síndrome de Martin-Bell é uma forma hereditária de retardo mental determinada pela perda da expressão do gene FMR1 que está associado com a expansão da repetição dos tri-nucleotídeos citosina-guanina¬-guanina (CGG). Os indivíduos com um alto grau dessa expansão apresentam o silenciamento da expressão desse gene, com conseqüente alteração no desenvolvimento do sistema nervoso do embrião, causando danos neurológicos irreparáveis. A citogenética é uma metodologia clássica que contribui para o diagnóstico da síndrome em casos sem esclarecimentos, porém sua sensibilidade isoladamente em muitos casos é insuficiente para um diagnóstico positivo mesmo diante de características clínicas evidentes. Na busca de uma alternativa para suprir esta necessidade de definir exatamente as alterações encontradas em cada caso propôs-se a otimização de uma PCR de alta fidelidade no diagnóstico diferencial da Síndrome e simultaneamente comparar com os dados da citogenética clássica. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue periférico de 102 pacientes e avaliou-se 100 a 150 metáfases para cada indivíduo pela citogenética clássica e para a PCR duplex. Os resultados demonstram pelo teste de Kruskal-Wallis que a PCR com a citogenética não apresentou diferenças significativas (p&#62;0,05). Porém quando avaliadados pelo índice de Kappa sugere-se que os dois critéiros de diagnósticos devem ser utilizados simultaneamente com caracteristicas clínicas do paciente. A PCR mostrou-se rápida e com custo relativamente menor, sendo portanto, aplicável no auxílio ao aconselhamento genético dos indivíduos e suas famílias, bem como para um acompanhamento psico-pedagógico adequado. / The Martin-Bell Syndrome is a heredity mental retard form determined by the loss of FMR1 gene expression which is associated with the tri-nucleotides cytosine-guanine-guanine (CGG) repetition expansion. The individuals showing a high degree of this expansion present the silencing of this gene expression, with a consequent alteration of the embryo nervous system evolution, causing irreparable neurological damage The cytogenetics is a classical methodology that contributes for diagnosing the syndrome in cases without clarification, thus its sensitivity isolated in many cases is insufficient for a positive diagnosis even in front of evident clinical characteristics. On searching for an alternative to fulfill this need to define the found alterations in each case, an optimization of a high fidelity PCR to Syndrome diagnosis and simultaneously to compare with classical cytogenetics. Peripheral blood samples were collected from 102 patients for evaluating 100 to 150 metaphases evaluation by classical cytogenetics for each sample and to duplex PCR. The results showed by the Kruskal-Wallis test that the PCR with the cytogenetics have not presented significant differences (p&#62;0,05). However, when evaluated by the Kappa index it was suggested that the two diagnosis criteria should be used simultaneously with patient s clinical characteristics. The PCR showed itself quick and with a relatively lower cost , and in this way, applicable in helping genetically counseling individuals and their families, as well as sending them to a more adequate psycho-pedagogical treatment.

Orientador: Mary Massumi Itoyama / Banca: Fernanda Cristina Alcantara dos Santos / Banca: Sandra Regina de Carvalho Marchesin / Resumo: No presente trabalho verificamos que os testículos possuem morfologias diferentes podendo ser arredondados, arredondados/espiralados ou alongados/espiralados. Com relação à morfometria das células em prófase I, B. micantulum e R. zela foram as que apresentaram as menores células, G. f. flavus foi a que apresentou maior tamanho e R. c. crassifemur e M. brasiliensis apresentaram tamanho intermediário. A avaliação da espermatogênese nos permitiu concluir que as características observadas são semelhantes às das outras espécies de Heteroptera, descritas na literatura, diferindo apenas com relação à morfologia dos testículos, o número de cromossomos e o sistema cromossômico do sexo. A análise das ultraestruturas observadas durante a espermatogênese de Gelastocoris flavus flavus e Martarega uruguayensis mostraram a presença de várias mitocôndrias pequenas e uniformemente distribuidas pelo citoplasma em células em profase I, de ambas espécies, que foram se unindo formando o complexo mitocondrial, que possui no seu interior as mitocôndrias enoveladas, posteriormente este complexo mitocondrial se divide em duas estruturas denominadas derivados mitocondriais, que se dispõem bilateralmente ao axonema. O axonema dessas espécies possui o padrão de 9+9+2. A formação do acrossomo inicia-se nos primeiros estágios da espermiogênese sendo composto de muitas vesículas acrossomais que se unem formando uma única estrutura, sendo observada regiões e algumas estruturas mais coradas em seu interior. Basicamente o processo de espermiogênese não diferiu entre as duas espécies analisadas / Abstract: In this study, we found different morphologies for testes of the Heteroptera species Belostoma anurum, B. micantulum, Gelastocoris angulatus, G. flavus flavus, Rheumatobates crassifemur crassifemur, Buenoa amnigenus, B. unguis, Martarega brasiliensis, M. membranacea, M. uruguayensis, Rhagovelia tenuipes and R. zela. They can by round, round/spiral and elongated/spiral. The size of prophase I cells also varied, being the smallest ones detected in B. micantulum and R. zela, the largest in G. f. flavus, and the intermediate in R. c. crassifemur and M. brasiliensis. The analyses of spermatogenesis allowed us to conclude that, in the studied species, the features are similar to those of other previously described Heteroptera species, differing only as to the testicular morphology, the chromosome number, and the sex chromosome system. Ultrastructural analysis of the spermatogenesis showed several small mitochondrias evenly distributed throughout the cytoplasm, in cells at prophase I of G. f. flavus and M. uruguayensis. The small mitochondrias joined to form the mitochondrial complex. Later, this mitochondrial complex divided into two structures called mitochondrial derivatives, located bilaterally to the axoneme. The axoneme of these species showed the flagellar pattern 9+9+2. The acrosome started to be formed in the early stages of spermiogenesis, being composed of many acrosome vesicles that join to form a single structure. Some regions within this structure were more strongly stained. Basically the process of spermiogenesis did not differ between the species G. f. flavus and M. uruguayensis / Mestre

Chromosome abnormalities are one of the most important causes of congenital disorders. The main goal of this research is to give a broad view of the use and evolution of prenatal and postnatal cytogenetic diagnosis in Girona province between 1999 and 2009. It also aims at linking prenatal cytogenetic diagnosis with the existing screening methods. The main conclusions are the following: - A rise in the use of cytogenetic diagnosis has been detected. This has been caused by a growing preventive medicine trend. - Case studies match the literature consulted when the study population is similar in accordance with national health policies. - The overall sensitivity of obstetric ultrasound scan was 60,8%, and this result matches, and in many cases exceeds, those found in the literature consulted. - The moving from second-trimester to first-trimester aneuploidy prenatal screening has meant a significant increase in aneuploidy detections. - Prenatal cytogenetic diagnosis appears as an interdisciplinary field in which the extent of prenatal screening tests, like obstetric ultrasound scans and aneuploidy screening, is crucial. / Les anomalies cromosòmiques són una de les causes més importants dels defectes congènits. L’objectiu d’aquest treball és donar una visió global de l’ús i l’evolució del diagnòstic citogenètic prenatal i postnatal a les comarques de Girona en el període 1999-2009 i relacionar el diagnòstic citogenètic prenatal amb els diferents mètodes de cribratge. Les conclusions principals són: - Es constata un augment de l’ús del diagnòstic citogenètic com a resultat d’una tendència creixent en medicina preventiva. - La casuística coincideix amb la bibliografia consultada quan la població d’estudi és semblant, atenent a la política sanitària del país. - La sensibilitat global de l’ecografia obstètrica va ser del 60,8%, i és un resultat concordant i en molts casos millor en comparació amb la literatura consultada. - La substitució del cribratge del segon trimestre pel cribratge del primer trimestre ha suposat un increment important en la detecció d’aneuploïdies. - El diagnòstic citogenètic prenatal es mostra com a una àrea interdisciplinària en què la contribució de les proves de cribratge prenatal com l’ecografia obstètrica i el cribratge d’aneuploïdies són importants.