Esta tese de doutoramento relata estudos sobre a interação de nanotubos de carbono com nanomateriais, biomoléculas e células, com o propósito de obter informações relevantes para o desenvolvimento de biossensores e para o campo da nanotoxicologia. No primeiro estudo, foram produzidos e caracterizados três tipos de eletrodos modificados com filmes multicamadas obtidos através da técnica de automontagem. Estes filmes continham nanotubos de carbono de parede simples (SWNT), ftalocianina tetrasulfonada de níquel (NiTsPc) e o dendrímero poli(amidoamina) de geração 2 (PAMAM G2), e estes polieletrólitos foram organizados nos seguintes sistemas: (PAMAM G2/NiTsPc), (PAMAM G2/SWNT) e (nanocompósito SWNT/PAMAM G2 / NiTsPc). Medidas de voltametria cíclica com a sonda ferrocianeto de potássio revelaram que os três sistemas podem ser aplicados como eletrodos descartáveis por serem instáveis e que os dois sistemas com NiTsPc apresentam um amplo intervalo de potencial para detecção de analitos sem a interferência dos picos redox da Pc. Também foram conduzidos ensaios de citometria de fluxo para avaliação da toxicidade de nanocompósitos contendo nanotubos de carbono e poli(amidoamina) de gerações 2, 4 e 6 em células F C3H, correspondentes a fibroblastos saudáveis de fígado humano. Os resultados mostraram que o contato com os nanomateriais provoca uma queda significativa na viabilidade deste tipo de célula, e apontam para a necessidade de aprofundar a investigação sobre os efeitos biológicos deste nanocompósito para que ele seja aplicado com segurança como um vetor de drogas e material genético. A última parte da tese é dedicada a explorar ferramentas computacionais para elucidar os mecanismos de formação do nanocompósito SWNT/PAMAM G2 e sua interação com modelos de membrana celular. Simulações por dinâmica molecular revelaram que a estabilidade do nanocompósito é mantida por interações entre as paredes apolares dos nanotubos e as cadeias internas não polares do dendrímero. O estudo envolvendo bicamadas lipídicas sugeriu que a presença de espécies aniônicas, como as fosfatidilserinas, é crucial para iniciar a ligação desta nanopartícula à membrana celular. O contato do nanocompósito com a bicamada resultou na extração destrutiva de lipídeos da membrana, um efeito deletério que pode causar danos às células. / This thesis describes the interaction between carbon nanotubes and nanomaterials, biomolecules and cells, to obtain relevant information for the development of biosensors and the progress of the nanotoxicology field. In a first study, we produced and characterized three types of modified electrodes made from layer-by-layer films. These nanostructures had single-walled carbon nanotubes (SWNT), nickel tetrasulfonated phthalocyanine (NiTsPc) and poly(amidoamine) dendrimer, generation 2 (PAMAM G2). These polyelectrolytes were organized in the following multilayers: (PAMAM G2/NiTsPc), (PAMAM G2/SWNT) and (SWNT/PAMAM G2 nanocomposite / NiTsPc). Cyclic voltammetry measurements with a potassium ferrocyanide probe revealed that the three systems can be used as disposable electrodes for being unstable and that the two systems with NiTsPc exhibit a wide useful potential interval for detection without the interference of the Pc redox peaks. We also performed flow cytometry experiments to evaluate the toxicity of nanocomposites containing carbon nanotubes and poly(amidoamine) generations 2, 4 and 6 in F C3H cells, derived from healthy human liver fibroblasts. The results showed that the contact with these nanomaterials decreases the viability of this type of cell and point to the need to further determine the biological effects of this nanocomposite before it can be safely applied as a vector for drugs and genetic material. The last part of the thesis explores computational tools to unravel the mechanisms behind the formation of the nanocomposite SWNT/PAMAM G2 and its interaction with cell membrane models. Molecular dynamics simulations revealed that the stability of the nanocomposite is kept mainly by interactions between the apolar nanotube walls and the inner non polar chains of the dendrimer. The study involving lipid bilayers suggested that the presence of anionic species, such as phosphatidylserines, is crucial to trigger the binding of this nanoparticle to the cell membrane. The contact of the nanocomposite with the bilayer resulted in the destructive extraction of lipids from the membrane, an effect that ultimately causes cell damage.

Tubarões e Raias pertencem à classe dos Chondrichthyes, por serem animais que possuem esqueleto cartilaginoso. O Tubarão-azul (Prionace glauca), popularmente conhecido como \"cação-azul\" dentre todas as espécies de tubarão é a mais abundante no ambiente marinho, podendo ser encontrado em toda a parte do mundo. O estudo teve como objetivo estudar a morfologia das nadadeiras do tubarão-azul (Prionace glauca) e os efeitos sobre células tumorais \"in vitro . Os resultados foram obtidos através da microscopia de luz e Citometria de fluxo. Com os caracteres encontrados na analise macroscópica foi possível identificar as nadadeiras obtidas como sendo do Tubarão-azul (Prionace glauca). A histologia da cartilagem da nadadeira do Tubarãoazul, demonstrou que é formada de cartilagem hialina, apresentando três regiões distintas, sendo no seu interior formado por condrócitos, na periferia de cartilagem calcificada e nas bordas formada por pericôndrio com a presença de colágeno tipo I,II e III. Os resultados obtidos das amostras do Elemento Radial não evidenciam alterações funcionais, quanto ao armazenamento, transporte e obtenção do suprimento celular, estes são viáveis e satisfatórios. O composto da cartilagem de tubarão para o tratamento de tumor \"in vitro\" neste estudo sugeriu que o mesmo apresenta uma atividade anti-tumoral significativa. Mostrou efeito tóxico sobre os tumores de mama murina (TAE) e tumor de mama canino (TMC) em baixas concentrações, não apresentando efeito tóxico nas células de fibroblasto nas mesmas concentrações. / Sharks and rays belong to the Chondrichthyes Class, once they have cartilaginous skeleton. The blue shark (Prionaceglauca), popularly known as \"blue-cation\", among all shark species is the most abundant in the marine environment and can be found everywhere in the world. This study aimed to study the fin morphology in the blue shark (Prionaceglauca) and its effects on \"in vitro\" tumor cells. The results were obtained using light microscopy and flow cytometry. Using the gross morphology we confirm that the fins belonged to the blue shark (Prionaceglauca). The fin cartilage of the blue shark was formed of hyaline cartilage. It showed three distinct regions with chondrocytes inside, calcified cartilage in the periphery, and perichondrium with collagen type I, II and III in the margins. The results obtained from the Radial Element not showed functional changes as storage, transport and cellular supplies obtaining, they were feasible and satisfactory. The use of shark cartilage compound for the treatment of \"in vitro\" tumor cells suggested that it showed a significant anti-tumor activity. It showed a toxic effect on murine breast tumors (MBT) and canine breast tumor (CBT) at low concentrations, with no significant toxic effect on fibroblast cells using the same concentrations.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 438061.pdf: 2839596 bytes, checksum: 6a94dcd2e48c0f8aa666231a6a1d1a83 (MD5) Previous issue date: 2012-01-27 / This study aimed to evaluate the antiproliferative effect of catechin, as if it has the capacity to reverse the phenotype of GRX cells, and the mechanisms involved in these outcomes. We evaluated the growth and cell proliferation in hepatic stellate cell line activated, the GRX, which were treated with catechin, and cocoa extract, and between the possible mechanisms involved in cell growth was assessed by cell necrosis release of lactate dehydrogenase, apoptosis, by expression of caspase 3 and PARP, as well as the expression of autogagia LC3. The cell cycle was measured by the expression of p53 and p27, as well as inflammatory pathways of IL-6 and COX-2 were assessed by RTPCR Real-time quantification and fibrogenic factor TGF-β. The phenotypic reversion was determined by the presence of fat in the cells with Oil-Red, as well as the expression of PPAR γ, an important regulator of adipogenesis. We evaluated the total collagen and collagen type 1 cells after treatment. It can be seen that both catechin as the cocoa extract decreased the cell growth and proliferation and that this decrease was not due to necrosis and even the activation of apoptosis and autophagy. Catechin induced cell cycle arrest by the reduction of p53 and p27, as well as decreasing the expression of inflammatory proteins such as IL-6 and COX-2 and TGF-β factor fibrogenic. The phenotypic reversion, can observe the presence of fat droplets in the cells after treatment with catechin and cocoa extract, as well as a reduction in collagen type I and an increase in expression following treatment with PPAR γ catechin. In conclusion, catechin decreases cell growth GRX, probably anti-inflammatory activity and for stopping the cell cycle. Catechin decreases the synthesis of TGF-β by cells demonstrating the potential antifibrotic effect. It also presents the property to revert the activated phenotype of GRX cells to a quiescent state and this mechanism may be via activation of PPAR gamma metabolic pathway. / O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito antiproliferativo da catequina, assim como, se esta apresenta capacidade de reverter o fen?tipo das c?lulas GRX, e quais os mecanismos envolvidos nestes desfechos. Foi avaliado o crescimento e prolifera??o celular em linhagem de c?lulas estreladas hep?ticas ativadas, as GRX, as quais foram tratadas com catequina e extrato de cacau, e entre os poss?veis mecanismos envolvidos no crescimento celular foi avaliada necrose celular pela libera??o da lactato desidrogenase, apoptose, pela express?o de Caspase 3 e PARP, assim como, autogagia pela express?o de LC3. O ciclo celular foi avaliado pela express?o de p53 e p27, assim como, as rotas inflamat?rias da IL-6 e COX-2 foram avaliadas por RT-PCR em tempo real e a quantifica??o do fator fibrog?nico TGF-β. A revers?o fenot?pica foi avaliada pela presen?a de gordura nas c?lulas, por Oil-Red, assim como, pela express?o de PPARγ, um importante fator regulador da adipog?nese. Foi avaliado o col?geno total e o col?geno do tipo 1 nas c?lulas ap?s os tratamentos. Pode-se observar que tanto a catequina como o extrato de cacau diminuiu o crescimento e prolifera??o celular e que esta diminui??o n?o foi por necrose e nem mesmo pela ativa??o da apoptose e autofagia. A catequina induziu uma parada no ciclo celular, pela redu??o da p53 e p27, assim como, diminuiu a express?o de prote?nas inflamat?rias como a IL-6 e COX-2 e o fator fibrog?nico TGF-β. Quanto a revers?o fenot?pica, pode-se observar a presen?a de got?culas de gordura nas c?lulas ap?s tratamento com catequina e extrato de cacau, assim como, uma diminui??o do col?geno tipo I e um aumento na express?o de PPARγ ap?s tratamento com catequina. Em conclus?o, a catequina diminui o crescimento das c?lulas GRX, provavelmente por atividade anti-inflamat?ria e por parar o ciclo celular. A catequina diminui o s?ntese de TGF-β pelas c?lulas demostrando um potencial efeito antifibr?tico. Apresenta ainda, a propriedade de reverter o fen?tipo ativado das c?lulas GRX para um estado quiescente e este mecanismo pode ser via ativa??o da rota metab?lica PPARγ.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2015-05-28T12:30:06Z No. of bitstreams: 1 469532 - Texto Completo.pdf: 772339 bytes, checksum: b1ca6d60639abd0248f0ea693f8f7d1f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-28T12:30:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 469532 - Texto Completo.pdf: 772339 bytes, checksum: b1ca6d60639abd0248f0ea693f8f7d1f (MD5) Previous issue date: 2015-03-04 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Introduction: There has been a continuous search for safe tests that can predict antibody-mediated rejection in organ transplants, and the positive complement dependent cytotoxic crossmatch, developed in the 1960?s, was until recently considered the gold standard and the main test for prediction of rejection. The new methods for assessing humoral immunity, notably flow cytometric crossmatching and the Luminex? technology significantly increased the sensitivity of these assessments, but also the complexity in the interpretation of these results, as well as in the correlation of different methodologies. Despite the sensitivity of these methods, not any donor-specific antibody detected by solid phase assay results in positive or negative crossmatch. Information obtained with the specificities (such as fluorescence intensity) of anti-HLA antibodies may define the immunological risk for the patient, assisting in the selection of the ideal donor, as well as in the immunosuppressive regimen, for prophylactic and therapeutic uses. Objectives: The present study aimed to establish a cut-off point at the fluorescence intensity of antibodies detected by the panel Single Antigen Beads of class I and II that correlates to positive flow cytometric crossmatching (FCXM). It also aimed to assess whether there are differences between the use of DSAs with higher MFI alone and the sum of all the DSAs of a given patient. Methodology: A cross-sectional study of two databases of results of panels (Luminex?) and flow cytometric crossmatching of patients on a waiting list for kidney transplantation registered at the Laborat?rio de Imunologia de Transplantes da Santa Casa de Miseric?rdia, in Porto Alegre. Database 1 was composed of 1,316 crossmatches against deceased donors and panels of anti-HLA antibodies for loci A, B and DRB1 performed in 2010. Database 2 was composed of 2,288 crossmatches against deceased donors and panels of anti-HLA antibodies for loci C and DQB1 performed between July 2013 and July 2014. As an inclusion criterion for both databases, only samples with results available in the Panel on the same date of the serum tested in flow cytometry crossmatches were used resulting in 834 samples in database 1. Besides, for database 2 only samples with donor-specific antibody (DSA) for loci C and or DQB1, resulting in 348 crossmatches. Results and Conclusions: we demonstrated that 97.6% of the patients with DSAs anti-HLA- ABDRB1 with MFI ? 5000 resulted in positive FCXM. These were the optimal MFI cut-off values for donor selection when we assessed sensitivity and specificity for correlation with positive flow cytometric crossmatching. For DSAs HLA-DQB1, fluorescence intensities above 15,000 MFI offer high specificity (97.8%). Anti-HLA-C sensitization is less frequent (n=40). Only 5 patients showed MFI?5000. Of these, the crossmatch was positive in only one patient (20%). Virtual crossmatch is a resource that can assist in making pre-kidney transplantation decisions. / Introdu??o: A busca por testes seguros que possam prever a rejei??o mediada por anticorpo em transplantes de ?rg?os tem sido cont?nua e a prova cruzada por citotoxicidade dependente de complemento, desenvolvida na d?cada de 60, at? pouco tempo era considerada padr?o ouro e principal teste preditor de rejei??o. Os novos m?todos de aferi??o da imunidade humoral, notadamente a prova cruzada por citometria de fluxo e a tecnologia Luminex?, aumentaram significativamente a sensibilidade destas avalia??es, mas tamb?m a complexidade na interpreta??o destes resultados, assim como na correla??o das diferentes metodologias Embora bastante sens?vel, nem todo anticorpo doador espec?fico detectado pelo teste de fase s?lida resulta em uma prova cruzada positiva ou com rejei??o. As informa??es obtidas com as especificidades (assim como a intensidade de fluoresc?ncia) dos anticorpos anti-HLA podem definir o risco imunol?gico do paciente, auxiliando a escolha do doador ideal, bem como do esquema imunossupressor, tanto profil?tico quanto terap?utico. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi estabelecer um ponto de corte no n?vel de fluoresc?ncia de anticorpos detectados pelo painel Single Antigen Beads de classe I e II que se correlacione com a prova cruzada positiva por citometria de fluxo (XMCF). Tamb?m objetivou-se avaliar se existem diferen?as entre o emprego de apenas DSAs com maior MFI e a soma de todos os DSAs de um determinado paciente. Metodologia: Foi realizado estudo transversal de dois bancos de dados de resultados de Paineis (Luminex?) e prova cruzada por citometria de fluxo de pacientes em lista de espera para transplante renal cadastrados no Laborat?rio de Imunologia de Transplantes da Santa Casa de Miseric?rdia de Porto Alegre. O banco n?mero 1 era composto de 1316 provas cruzadas contra doadores falecidos e pain?is de anticorpos anti-HLA dos loci A, B e DRB1, realizados no ano de 2010. O banco n?mero dois era composto de 2288 provas cruzadas contra doadores falecidos e pain?is de anticorpos anti-HLA dos loci C e DQB1 realizadas entre julho de 2013 e julho de 2014. Como crit?rio de inclus?o para ambos os bancos de dados foram utilizadas somente amostras que possu?am resultados de Painel na mesma data do soro testado nas provas cruzadas por citometria de fluxo, resultando em 834 amostras no banco de n?mero 1. Al?m disso, para o banco de dados n?mero 2 foram utilizados apenas amostras que possu?am anticorpo espec?fico contra o doador (DSA) dos loci C e ou DQB1, resultando em 348 provas cruzadas. Resultados e Conclus?es: demonstramos que 97,6% dos pacientes com DSAs anti-HLA- ABDRB1 com MFI?5000 resultaram em XMCF positiva. Os n?veis de MFI nesta faixa corresponderam aos melhores pontos de corte de escolha quando avaliamos a sensibilidade e especificidade para a correla??o com a prova cruzada positiva por citometria de fluxo. Para os DSAs HLA-DQB1, n?veis de fluoresc?ncia acima de 15.000 MFI ofereceram elevada especificidade (97,8%). A sensibiliza??o anti-HLA-C ? menos frequente (n=40). Apenas 5 pacientes apresentaram MFI?5000. Destes, apenas em um (20%) a prova cruzada foi positiva. A prova cruzada virtual ? um recurso que pode auxiliar na tomada de decis?es pr?-transplante renal.

O projeto tem como objetivo a detecção e caracterização das células epiteliais circulantes de pacientes com carcinoma de mama no estádio III. Analisou-se a presença ou ausência destas células antes da realização de quimioterapia neoadjuvante. Para tanto, utilizou-se o sistema de enriquecimento de amostras de sangue periférico por meio da marcação intracelular imunomagnética direta, empregando-se microbeads conjugados com citoqueratina e posterior separação imunomagnética. A amostra final, com as células alvo detectadas, foi então quantificada por imunocitoquímica ou citometria de fluxo. Resultados: A reação de imunocitoquímica no sangue periférico foi negativa em todos os casos enquanto que na citometria de fluxo foi positiva em 22/23 casos analisados. Conclusão: A detecção e caracterização de células tumorais circulantes em pacientes com câncer de mama podem vir a se constituir em um novo fator prognóstico, porém, são ainda necessárias novas estratégias para melhor detectá-las. / The aim of this study was to detect and characterize carcinoma cells of patients with breast cancer with clinical stage III analyzing the presence or absence before chemotherapy by enrichment of peripheral blood with super paramagnetic microbeads, using direct Immunomagnetic labeling of intracellular 7/8 cytokeratin. For enrichment, magnetically labeled tumor cells are passed over a high-gradient magnetic positive selection column. Cytospin preparations are made after immunomagnetic enrichment and are examined immunocytochemically (ICC) using an anti-cytokeratin and quantified by flow cytometry (CMF). Results: No cytokeratin positive cells were detected in the 32 peripheral blood of patients of breast carcinoma by ICC and cytokeratin positive cells were detected in the 22 of 23 patients by CMF. Conclusion: These methods of detection and characterization breast carcinoma cells will become useful in the diagnosis and prognosis but is necessary optimization of existing methods.

Introdução: as doenças linfoproliferativas de células B maduras correspondem a cerca de 80% das neoplasias linfoides, são caracterizadas pela proliferação clonal de uma célula B precursora em diferentes estágios de diferenciação. A semelhança imunofenotípica a um dado estágio maturativo é relevante para o diagnóstico diferencial através da imunofenotipagem por citometria de fluxo, embora a sobreposição de expressões possa dificultar a identificação correta de cada linfoproliferação. Alguns marcadores são pouco conhecidos nas diferentes linfoproliferações B e há pouca literatura analisando os dados quantitativamente, sendo grande parte qualitativa. Objetivos: este trabalho avalia a expressão quantitativa em intensidade de fluorescência média (IFM) dos anticorpos CD200, CD43, CD52 e CD123 no diagnóstico diferencial das doenças linfoproliferativas B crônicas. Métodos: estudo transversal, com 124 amostras de pacientes em investigação diagnóstica de doenças linfoproliferativas que realizaram imunofenotipagem em um centro de referência em neoplasias hematológicas no período de outubro de 2014 a junho de 2015. Foram analisadas as IFMs de cada marcador nas onze diferentes doenças diagnosticadas. Resultados: as neoplasias dos 124 pacientes analisados foram: 81 leucemias linfocíticas crônicas (LLC), 17 linfomas de zona marginal (LZM), 9 linfomas linfoplasmocíticos (LLPL), 6 linfomas do manto (LM), 2 tricoleucemias (TRL), 2 tricoleucemias variantes (TRLv), 5 linfomas foliculares (LF), 1 linfoma de Burkitt e 1 linfoma difuso de grandes células B (LDGCB). A expressão mediana do CD200 foi de 46,8 (intervalo: 1,5-334). A expressão mediana de CD200 foi maior na TRL (incluindo a TRLv) e na LLC (85 e 61,2, respectivamente). A expressão de IFM do CD200 na TRLv diferiu quando comparado à TRL na sua forma clássica (mediana: 36,1 versus 220,3). A mesma diferença foi observada na expressão do CD123 quando comparada a TRL à TRLv. Verificamos, que casos de LZM demonstraram IFM medianas de CD43 de 7,1 (intervalo: 1,1-106), em comparação a casos de LM e LLC, nos quais as medianas de IFM do CD43 foram 90 e 176, respectivamente. A comparação da intensidade de CD52 entre amostras demostrou diferença estatisticamente significativa entre LLC e LZM com medianas de IFM de 775,5 versus 1297,0 (P=0,04). Conclusões: nossos resultados sugerem que a citometria de fluxo quantitativa desses marcadores pode ser uma ferramenta adicional útil na identificação de alguns tipos de DLPCBs. / Background: lymphoproliferative disorders of mature B cells account for about 80% of the lymphoid malignancies. They are characterized by the clonal proliferation of a B cell precursor at different stages of differentiation. The similarity of a given phenotypical maturation stage is relevant for the differential diagnosis by immunophenotyping, however overlap in cell morphology and immunologic features may difficult the correct identification of each pathology. Some markers are not well known in different B lymphoproliferative neoplasms and there is little literature analyzing the data quantitatively. Objectives: this study evaluated the expression of CD200, CD43, CD52 and CD123 by flow cytometry on B-cell chronic lymphoproliferative disorders (BCLDs) differential diagnosis. Methods: cross-sectional study, of 124 samples from patients for diagnostic investigation of lymphoproliferative disorders who underwent immunophenotyping in a referral center for hematologic malignancies from October 2014 to June 2015. MFIs were analyzed for each marker in eleven different diagnosed pathologies. Results: the diseases of the 124 patients investigated comprised: 81 chronic lymphocytic leukemia (CLL), 17 marginal zone lymphoma (MZL), 9 lymphoplasmacytic lymphoma (LPL), 6 mantle cell lymphoma (MCL), 2 hairy cell leukemia (HCL), 2 hairy cell leukemia variant (HCLv), 5 folicular lymphoma (FL), 1 Burkitt lymphoma (BL) e 1 diffuse large B cell lymphoma (DLBCL). The CD200 median MFI expression was 46,8 (range: 1,5-334). CD200 was higher in HCL (including HCLv) and CLL cells (85 and 61,2 respectively). HCLv difference in CD200 MFI, when compared to classical HCL (median 36,1 versus 220,3). The same difference in CD123 expression was observed when comparing HCL versus HCLv. We found that cases of MZL exhibited CD43 median MFI of 7,1 (range: 1,1-106), in contrast to cases of MCL and CLL, which had median MFIs for CD43 of 90 and 176, respectively. The comparison of CD52 intensity between CLL and MZL samples showed statistically significant difference with a median MFI of 777,5 versus 1297,0 (P=0,04). Conclusion: our results suggest that quantitative flow cytometry of these markers may be a useful additional tool to better identify some types of BCLDs.

Resumo:hgghj / Abstract:hjkhjkhjk / Orientador: Juliana Regina Peiró / Banca:Flávia de Almeida Lucas / Banca:Márcia Marinho / Doutor

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Coorientador: Bruna De Vita / Banca: Leandro Maia / Banca: Cláudia Barbosa Fernandes / Resumo: As células tronco mesenquimais (CTMs) estão presentes na maioria dos tecidos adultos e possuem grande capacidade de multiplicação, o que as tornam muito atrativas para a terapia celular, tanto na medicina humana como na medicina veterinária . Quando cultivadas in vitro são capazes de se auto renovar e dar origem a novos tipos celulares. Atualmente há uma grande tendência para a utilização de CTMs obtidas de tecidos fetais, como a membrana amniótica (MA), matriz extravascular do cordão umbilical (CU) e sangue do cordão umbilical (SCU), podendo ser obtidas no momento do parto por uma técnica não invasiva. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar, diferenciar e criopreservar CTMs obtidas de MA, CU e SCU de fetos bovinos colhidos no momento do parto e em abatedouro. As células foram recuperadas por meio de digestão enzimática tecidual, realizada com solução de colagenase 0,1%. Foram colhidas amostras de MA e CU no momento do parto (n=6) e de MA e CU no terço inicial de gestação (n=6), bem como de SCU no terço médio de gestação em abatedouro (n=6), as quais foram submetidas às análises morfológica, imunocitoquímica, imunofenotípica por citometria de fluxo e diferenciações in vitro nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica e criopreservação. Além disso, foram criopreservadas e analisadas por citometria de fluxo para observação da viabilidade celular. Todas as amostras dos diferentes períodos gestacionais demonstraram adesão ao plástico e morfologia fibroblastóide. No ensaio imunocitoquímico todas as amostras foram imunomarcadas para CD44, NANOG e Oct-4, com ausência de marcação para MHC II. Na análise imunofenotipica por citometria de fluxo, todas as amostras apresentaram marcação para CD44, ausência de marcação para CD34 e baixa expressão de MHC II. Apresentaram também capacidade de diferenciação in vitro nas três linhagens mesodermais e quando analisadas ... / Abstract: Stem cells are undifferentiated cells with a high proliferation potential. These cells can be characterized by their in vivo ability to self-renew and to differentiate into specialized cell lines. The most used stem cell type, in both human and veterinary field, is the mesenchymal stem cells (MSC). Nowadays, there is a great tendency to use stem cells derived from fetal tissues, such as amniotic membrane (AM), extravascular matrix of umbilical cord (EMUC) and umbilical cord blood (UCB), which can be obtained non-invasively at delivery time. Thus, the aim of this study was to isolate, characterize and differentiate. MSC derived from bovine fetal annexes cow dairy neonates after assisted delivery and of fetus obtained in slaughterhouse. Cells were isolated by enzymatic digestion of the tissue fragments with 0,1% collagenase solution. Six samples of AM and EMUC at delivery time, six samples of AM and EMUC at first third of pregnancy and six samples of UCB at secondary third of pregnancy were subjected to morphology evaluation, immunocytochemistry, flow cytometry and in vitro osteogenic, adipogenic and chondrogenic differentiation. Moreover, sample were cryopresrved and evaluated for viability by flow citometri. All samples showed adherence to plastic and fibroblast-like morphology. Immunocytochemistry revealed expression of CD 44, NANOG and OCT-4 and lack of expression of MHC II in MSC from all samples. Flow cytometry demonstrated that cells from all samples expressed CD 44, lacked CD 34 expression and showed low expression of MHC II. They were also capable of trilineage mesenchymal differentiation and showed 80-90% viability after cryopreservation. According to the results, AM, EMUC and UCB, either obtained at delivery time or from slaughterhouse, are a painless and non-invasive source of MSC and can be used for stem cell bank creation / Mestre

A piometra é uma condição mórbida caracterizada pela inflamação do útero com acúmulo de exsudatos, resultante de ações hormonais e geralmente associada à presença de bactérias no lúmen uterino. A anemia é a alteração hematológica mais frequentemente observada em cadelas com piometra e está associada à cronicidade da doença, diminuição da eritropoiese, devido ao efeito toxêmico na medula óssea, diminuição da disponibilidade de ferro ou perda de sangue para o útero. Adicionalmente, o efeito das toxinas bacterianas e os radicais livres gerados pelo metabolismo oxidativo dos neutrófilos podem resultar na modificação da estrutura antigênica da membrana do eritrócito, permitindo a ligação de imunoglobulinas em sua superfície e acelerando a destruição eritrocitária. Essa hipótese pode ser comprovada pela detecção de imunocomplexos na superfície eritrocitária de cadelas com piometra. O diagnóstico de piometra foi estabelecido em 33 cadelas atendidas no Serviço de Obstetrícia/Ginecologia do Hospital Veterinário da Universidade de São Paulo com base na anamnese, exame físico e exames subsidiários (ultrassonografia, hemograma e concentrações séricas de ureia e creatinina). As amostras sanguíneas foram coletadas em dois momentos. A primeira anterior a ovariosalpingohisterectomia (OSH) e a segunda, sete a dez dias após a OSH. A quantificação de hemácias com deposição de imunocomplexos IgG e IgM foi realizada utilizando-se anticorpos anti-IgG e anti-IgM (Bethyl®Laboratories) conjugadas a fluoresceína de isotiocianato (FITC), e a leitura realizada com citômetro de fluxo (FACS Calibur; Becton, Dickinson and Company© 2007 BD), sendo os resultados expressos em percentual de hemácias marcadas. Foram utilizados o Teste de Shapiro-Wilk para a avaliação da distribuição de dados e a comparação entre os grupos controle, pré e pós-OSH foi realizada valendo-se do Teste t ou Teste t pareado e Correlação de Pearson, e do Teste U de Mann-Whitney e Correlação de Spearman, para as variáveis com distribuição normal e não-normal, respectivamente. O valor de alfa estipulado foi de 0,05. Analisando os valores hematológicos de cada um dos cães incluídos no estudo, observa-se que 19 (57,6%) apresentavam anemia normocítica normocrômica não regenerativa no momento pré-OSH e cinco (15,2%) no momento pós-OSH. Em cães do grupo controle foram observadas 0,14 - 0,77% (0,43±0,18%) de hemácias marcadas com anticorpos anti-IgG FITC e 0,29 - 9,58% (0,68±0,29%) para anticorpos anti-IgM FITC. Já nos cães com piometra, foram encontradas 0,14 - 4,19% (0,96±0,86%) de hemácias marcadas com anticorpos anti-IgG FITC e 0,29 - 9,58% (1,37±1,71%) com anticorpos anti-IgM FITC, antecedendo a OSH. No momento pós-OSH observou-se 0,18 - 16,2% (2,77±3,67%) de hemácias marcadas para anticorpos anti-IgG FITC e 0,15 - 19,8% (4,01±4,46%) para anticorpos anti-IgM FITC. O percentual de hemácias marcadas com anticorpos anti-IgG FITC diferiu entre os grupos controle e piometra, pré-OSH (p<0,001) e pós-OSH (p<0,001). Em relação a anticorpos anti-IgM FITC, não foram observadas diferenças entre os grupos controle e pré-OSH (p=0,09), porém, após a OSH houve aumento na marcação de hemácias, quando comparado ao grupo controle (p<0,001). Apenas alguns animais apresentaram mais de 5% de hemácias marcadas, e isto ocorreu, principalmente, no momento pós-OSH. Entretanto, não resultou no agravamento da anemia, indicando que a piometra em cadelas está associada à deposição de imunoglobulinas G ou M na superfície das hemácias, sem, no entanto, promover hemólise ou agravamento da anemia / The pyometra is a morbid condition characterized by inflammation of the uterus with exudates accumulation resulting from hormonal action and usually associated with the presence of bacteria in the uterine lumen. Anemia is the hematologic changes most frequently observed in bitches with pyometra and is associated with chronic disease, diminished erythropoiesis due to toxemic effect on the bone marrow, decreased iron availability or loss of blood to the uterus. Additionally, the effect of bacterial toxins and free radicals generated by neutrophil oxidative metabolism may result in the modification of antigenic structure of the erythrocyte membrane, allowing the binding of immunoglobulins on their surface and accelerating erythrocyte destruction. This hypothesis can be confirmed by detection of immune complexes in the erythrocyte surface dogs with pyometra. The diagnosis of pyometra was established in 33 dogs attended by the Obstetrics Service/Gynecology of Veterinary Hospital of the University of São Paulo based on history, physical examination and additional tests (ultrasound, blood count and serum concentrations of urea and creatinine). Blood samples were collected in two stages. The first prior to ovariohysterectomy (OSH) and the second, seven to ten days after OSH. Quantification of erythrocyte with deposition of IgG and IgM immune complexes was performed using antibodies anti-IgG and anti-IgM (Bethyl® Laboratories) conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC), and the reading performed with flow cytometry (FACS Calibur; Becton, Dickinson and Company© 2007 BD), and the results expressed as a percentage of red blood cells marked. The Shapiro-Wilk test was used to assess the distribution of data and the comparison between the control group, pre- and post-OSH was carried out making use of the t test or paired t test and Pearson correlation, and test U Mann-Whitney and Spearman correlation for the variables with normal and non-normal distribution, respectively. The stipulated alpha value was 0.05. The analysis of the hematological values of each of the dogs enrolled in the study, it was observed that 19 (57.6%) with anemia normocytic normochromic non-regenerative in the pre-OSH moment and 5 (15.2%) in the post-OSH moment. In control group of dogs were observed from 0.14 to 0.77% (0.43± 0.18%) of red blood cells marked with antibodies anti-IgG FITC and 0.29 to 9.58% (0.68± 0.29%) for antibodies anti-IgM FITC. Already in dogs with pyometra were found 0.14 to 4.19% (0.96 ± 0.86%) of red blood cells marked with antibodies anti-IgG FITC and 0.29 to 9.58% (1.37 ± 1.71%) with antibodies anti-IgM FITC, prior to OSH. In the post-OSH time it was observed 0.18 to 16.2% (2.77 ± 3.67%) of red blood cells marked for antibodies anti-IgG FITC and 0.15 to 19.8% (4.01 ± 4.46%) for antibodies anti-IgM FITC. The percentage of red blood cells marked with antibodies anti-IgG FITC differ between groups control and pyometra, pre-OSH (p<0.001) and post-OSH (p<0.001). Regarding the antibodies anti-IgM FITC, no differences were observed between the control and pre-OSH (p=0.09), however, after the OSH was no increase in labeling of red blood cells compared to the control group (p<0.001). Only a few animals have more than 5% of marked red blood cells, and this was mainly in the post-OSH time. However, not result in the worsening of anemia, indicating that pyometra in dogs is related to the deposition of immunoglobulin G or M on the surface of erythrocytes, without, however, promote hemolysis or worsening of anemia

A invasão de eritrócitos por merozoítas de Plasmodium é um processo bastante complexo em que várias proteínas do parasita interagem com receptores presentes na célula hospedeira. É nossa hipótese que o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) e a Proteína 1 da Superfície do Merozoíta (MSP1) estejam envolvidas na adesão ao eritrócito, no momento da invasão. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade de ligação de proteínas de merozoítas de P. vivax a eritrócitos humanos utilizando um novo ensaio de citometria de fluxo e o clássico ensaio de citoaderência. Para tanto, a ligação das proteínas recombinantes correspondentes à região C-terminal de 19 kDa da MSP1 (PvMSP119), ao ectodomínio (PvAMA-1E) e aos domínios I-II e II de AMA-1 (PvAMA-1DI-II e PvAMA-1DII) foi avaliada por citometria de fluxo utilizando anticorpo fluorescente contra cauda de histidina. A proteína recombinante baseada na região II da Proteína Ligante de Duffy (PvDBP-RII) foi utilizada como controle positivo e a tioredoxina humana como controle negativo. Os dados foram expressos pela média da intensidade de fluorescência (MIF). Os resultados dos ensaios de citometria de fluxo confirmaram a ligação de PvDBP-RII a eritrocitos Duffy A (MIF=1997±405) e Duffy B (MIF= 5760±303). No entanto, não foi possível detectar a ligação de PvMSP119 (MIF=201±47), de PvAMA-1E (MIF=536±99) e dos domínios PvAMA- 1DI-II (MIF=120±12) e PvAMA-1DII (MIF=179±30). Soro policlonal de camundongos BALB/c imunizados com PvDBP-RII foi capaz de inibir a ligação da proteína aos eritrócitos em até 66%. Tais resultados foram confirmados pelo ensaio clássico de citoaderência. Para tanto, células COS-7 foram transfectadas com plasmídeos recombinantes codificando as proteínas PvDBPRII, PvMSP119, PvAMA-1DI-II e PvAMA-1DIII em fusão com GFP. A eficiência de transfecção e a expressão destas proteínas na superfície das células foram confirmadas por citometria de fluxo, utilizando anticorpos policlonais produzidos em camundongos. A ligação foi avaliada pela formação de rosetas entre as células transfectadas e eritrócitos humanos por microscopia de fluorescência. Observamos que as células transfectadas expressando PvDBP-RII foram capazes de se ligar a eritrócitos humanos Duffy A (274±144 rosetas/25 campos) e Duffy B (356±129 rosetas/25 campos). No entanto, não foram visualizadas rosetas nos ensaios realizados com células expressando PvMSP119, PvAMA-1E, PvAMA-1DI-II e PvAMA-1DIII, indicando a ausência de ligação destas proteínas a eritrócitos humanos. Soro de camundongos imunizados com PvDBP-RII foi capaz de inibir a ligação aos eritrócitos em até 99%. Os resultados obtidos nesse trabalho demonstram que fomos capazes de desenvolver um ensaio baseado em citometria de fluxo para avaliação da ligação de proteínas a eritrócitos humanos, cujos resultados foram confirmados pelo ensaio clássico de citoaderência. No entanto, não foi possível detectar a ligação das proteínas PvMSP119 e PvAMA-1 a eritrócitos humanos. / The invasion of erythrocytes is a complex process in which the Merozoite Surface Proteins (MSPs) are responsible for initial adhesion and the P. vivax Duffy Binding Protein (PvDBP) is involved on junction formation. In addition, there are evidences that the Apical Membrane Antigen (AMA-1) plays a fundamental role on invasion; however, the exact mechanism is still being investigated. The aim of the present study was to evaluate the ability of P. vivax merozoite antigens to bind to human erythrocytes using a new flow cytometry assay and the classical cytoaherence assay. The binding assay was performed by flow cytometry using fluorescent antibody against histidine tag present on recombinant proteins based on 19 kDa C-terminal fragment of MSP1 (PvMSP119), the ectodomain (PvAMA-1E) and domains I-II and II of AMA-1 (PvAMA-1DI-II and PvAMA-1DII). The recombinant protein based on the region II of DBP (PvDBP-RII) was used as positive control and human thioredoxin as negative control. Data were expressed as mean of fluorescent intensity (MFI). The results of flow cytometry assays confirmed the binding of PvDBP-RII to human Duffy A (MFI=1997±405) and Duffy B (MFI= 5760±303) erythrocytes. However, we were not able to detect the binding of PvMSP119 (MFI=201±47), PvAMA-1E (MFI=536±99), PvAMA-1DI-II (MFI=120±12) or PvAMA-1DII (MFI=179±30). Sera from BALB/c mice immunized with PvDBP-RII inhibited binding up to 66%. These results were confirmed by classic cytoadherence assay. COS-7 cells were transfected with plasmids encoding the proteins PvDBP-RII, PvMSP119, PvAMA-1DI-II or PvAMA-1DIII fused to GFP. The transfection efficiency and expression of proteins on cell surface were confirmed by flow cytometry using polyclonal antibodies raised on mice. The binding was evaluated by the number of rosettes formed between transfected cells and human erythrocytes using fluorescent microscope. The cells expressing PvDBP-RII were able to bind Duffy A (274±144 rosettes/25 fields) and Duffy B (356±129 rosettes/25 fields) human erythrocytes. On the other hand, PvMSP119, PvAMA1E, PvAMA-1DI-II and PvAMA-1DIII failed to bind human erythrocytes and specific rosettes were not observed. Sera from immunized mice inhibited binding of PvDBP-RII up to 99%. In conclusion, we developed a binding assay using flow cytometry which can be extremely useful to evaluate the binding of proteins to erythrocytes whose results were confirmed by classic cytoadherence assays, as observed the binding of PvDBP-RII to human erythrocytes. Using both biding assays, we were not able to determine the binding of PvMSP119, nor PvAMA-1 and their domains to human erythrocytes.