Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-11-23T10:18:26Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7633540 bytes, checksum: 3c399a3be8e26ba7fd0b6e20c37ad4bc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-23T10:18:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 7633540 bytes, checksum: 3c399a3be8e26ba7fd0b6e20c37ad4bc (MD5) Previous issue date: 2017-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Leishmania infantum chagasi é o agente etiológico da Leishmaniose Visceral, doença que afeta milhares de pessoas no mundo. O tratamento habitual é baseado em um repertório restrito de fármacos com toxicidade e custos elevados. O desenvolvimento de novas drogas é essencial para o controle e tratamento dessa enfermidade. No cenário atual, uma possibilidade para a descoberta de novos fármacos é o emprego de compostos químicos sintéticos. Neste contexto, nos propomos a avaliar a atividade leishmanicida dos compostos Triazólicos derivados de 6-hidroxiisobenzofuran-1(3H) -ona e de indan- 1,3-diona e de compostos derivados de Benzofenonas. Neste trabalho, realizamos o estudo in vitro da citotoxicidade destes compostos em macrófagos RAW 264.7, em formas promastigotas e em formas amastigotas de L. infantum chagasi internalizadas em macrófagos, utilizando metodologias convencionais, como a microscopia óptica, bem como implantação de uma nova metodologia utilizando citometria de fluxo. Após vários ensaios, os compostos derivados de Benzofenonas (AL-13, AL-16, AL-19 e B-5), cujas ações leishmanicidas se sobressaíram as demais, foram combinados em 11 diferentes associações. Estas foram testadas quanto à citotoxicidade em macrófagos e a ação leishmanicida em formas amastigotas internalizadas por macrófagos. Os resultados obtidos tanto pela microscopia óptica quanto pela citometria de fluxo apresentaram similaridades quanto à inibição da taxa de infecção em macrófagos infectados por L. infantum chagasi. Partindo deste pressuposto, nossos estudos sugerem que: 1) 3 (das 11 associações propostas) apresentam ação leishmanicida e merecem ser consideradas para estudos in vivo; 2) a grande similaridade dos resultados obtidos tanto pela técnica de avaliação do grau de infecção de Leishmania em macrófagos utilizando microscopia óptica quanto pela citometria de fluxo é um indicativo de que esta nova metodologia pode ser utilizada em um futuro próximo no estudo de triagens de drogas com potencial leishmanicida in vitro. / Leishmania infantum chagasi is the etiologic agent of Visceral Leishmaniasis, a disease that affects thousands of people worldwide. The usual treatment is based on a restricted repertoire of drugs with high toxicity and costs. The development of new drugs is essential for the control and treatment of this disease. In the current scenario, one possibility for the discovery of new drugs is the use of synthetic chemical compounds. In this context, we propose to evaluate the leishmanicidal activity of Triazole compounds derived from 6-hydroxyisobenzofuran-1 (3H) -one and indan-1,3-dione and compounds derived from Benzophenones. In this work, we performed the in vitro study of the cytotoxicity of these compounds in RAW 264.7macrophages, in promastigote and amastigotes forms of L. infantum chagasi internalized in macrophages, using conventional methodologies, such as optical microscopy, as well as implantation of a new methodology using flow cytometry. After several trials, the compounds derived from Benzophenones (AL-13, AL- 16, AL-19 and B-5), whose leishmanicidal actions stood out the others, were combined in 11 different associations. These were tested for macrophage cytotoxicity and leishmanicidal action in amastigote forms internalized by macrophages. The results obtained by both optical microscopy and flow cytometry showed similarities regarding inhibition of infection rate in L. infantum chagasi infected macrophages. Based on this assumption, our studies suggest that: 1) 3 (of the 11 proposed associations) present leishmanicidal action and deserve to be considered for in vivo studies; 2) the great similarity of the results obtained both by the technique of evaluation of the degree of Leishmania infection in macrophages using optical microscopy and by the flow cytometry is an indicative that this new methodology can be used in the near future in the study of drug screenings with leishmanicidal potential in vitro.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-08-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:52Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10949.pdf: 1710290 bytes, checksum: 4f0e0bd77ebdd477f06366315fe3b8f9 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As características da resposta imunológica em pacientes infectados pelo Mycobacterium leprae e pelo virus da imunodeficiência humana (HIV) não estão bem elucidadas. O objetivo geral desta tese foi avaliar diferentes parâmetros imunológicos na interação destas doenças. Inicialmente avaliamos a imunidade celular em quatro grupos de pacientes dividos em: indivíduos saudáveis, monoinfectados pelo Mycobacterium leprae, monoinfectados pelo virus da imunodeficiência humana e coinfectados pelo M. leprae e HIV. Observamos que o grupo coinfectado apresentou diminuição da razão de células CD4:CD8, aumento de níveis de ativação em células T CD8+, aumento da razão de células T V1:V2 e diminuição da porcentagem de células dendríticas plasmocitóides, comparadas com o grupo de indivíduos monoinfectados pelo HIV-1. A produção de IL-4 por linfócitos T CD4+ foi correlacionado positivamente com a porcentagem de subpopulações de memória efetora de células T CD4+, sugerindo diferenciação antigênica da população de células T em ambas as infecções de HIV-1 e M. leprae. A coinfecção por M. leprae pode exacerbar a imunopatologia da doença induzida pelo HIV-1. Houve uma tendência na expressão de citocinas Th2 na resposta de células T CD4+ em ambas infecções de M. leprae e HIV-1, mas não obtivemos efeitos aparentes nos pacientes coinfectados. No trabalho subsequente, avaliamos de forma quantitativa e qualitativa as células NKT da imunidade inata nos indivíduos saudáveis e infectados pelo HIV. A frequência de células NKT que secretam IFN- e TNF- estava significantemente diminuída em pacientes HIV-1 quando comparados com os indivíduos saudáveis. A magnitude da resposta de IFN- teve correlação inversa com o número de anos da infecção, sugerindo que a função das células NKT está diminuída progressivamente ao longo do tempo. Não houve alteração na resposta das células NKT dos indivíduos infectados pelo HIV após tratamento com Forbol12-Miristato13-Acetato (PMA) e ionomicina, sugerindo um defeito no sinal do TCR prejudicando a produção de citocina. Foi observado uma diminuição na magnitude da resposta com produção de citocinas Th1 pelas células NKT quando correlacionado com a expressão de CD161, sugerindo um mecanismo inibitório deste receptor na regulação da resposta de células NKT. Por último, nós demonstramos que pacientes coinfectados tem redução da frequência de células NKT no sangue periférico, quando comparados com indivíduos saudáveis e pacientes monoinfectados pelo M. lepare. Por outro lado, as células NKT de pacientes coinfectados secretam mais IFN- quando comparadas com pacientes monoinfectados pelo M. lepare. Estes resultados sugerem que as células NKT têm atividade aumentada em pacientes coinfectados, contudo em frequência diminuída no sangue periférico. / The immune response characteristics in patients infected with Mycobacterium leprae and human immunodeficiency virus (HIV) is not elucidated. The aim of this study was to evaluate different immune parameters in the overlapping of both diseases. In the first paper we observaded The co-infected group exhibited lower CD4:CD8 ratio, higher levels of CD8 T-cell activation, increased V1: V2 T cell ratio and lower percentage of plasmacytoid dendritic cells, compared to HIV-1 infected subjects. Across infected groups, IL-4 production by CD4 T lymphocytes was positively correlated with the percentage of effector memory CD4 T cells, suggesting antigenically-driven differentiation of such T cell population in both HIV-1 and M. leprae infections. Co-infection with M. leprae may exacerbate the immunopathology of HIV-1 induced disease. A T helper 2 (Th2) bias in the CD4 T-cell response was evident in both HIV-1-infection and leprosy, but no additive effect was apparent in co-infected patients. Subsequently, we evaluated quantitatively and qualitatively the NKT cells from innate immune response in HIV-infected subjects and healthy controls. The frequencies of NKT cells secreting IFN- and TNF- were significantly lower in HIV-1-infected subjects and the magnitude of the IFN- production was negatively correlated with the number of years of infection, suggesting that NKT cell function is progressively lost over time. NKT cell responses in HIV-1 infected subjects were essentially normal after treatment with Phorbol12-Myristate13- Acetato (PMA) and ionomycin, suggesting that defective TCR-signaling was the underlying defect in the cytokine production. The lower levels of the NKT Th1 response correlated with higher CD161 expression, suggesting a role for this inhibitory receptor in regulating NKT cell responsiveness. Finally, we have investigated the NKT cells in the context of HIV and M. leprae coinfection. The volunteers were enrolled into four groups: twenty-seven healthy controls, seventeen HIV seropositive patients, seventeen patients with leprosy, and twenty-three co-infected patients with leprosy and HIV-1 infection. Flow cytometric and ELISPOT assays were performed in stored PBMC. We demonstrated that coinfected patients have reduced NKT cells in the peripheral blood when compared to healthy subjects and leprosy monoinfected patients. On the other hand, NKT cells from coinfected patients secrete more IFN- when compared to leprosy monoinfected patients. These results suggest that NKT cells are highly active in coinfected patients, although occurring in lower frequency in the peripheral blood. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-18. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:15Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12957a.pdf: 1243731 bytes, checksum: 878db06d2872246e99cbd4358ee4a1d0 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:15Z : No. of bitstreams: 2 Publico-12957a.pdf: 1243731 bytes, checksum: 878db06d2872246e99cbd4358ee4a1d0 (MD5) Publico-12957b.pdf: 1376768 bytes, checksum: 4cdb6afbfd0e66e1d0fb5c0615f48744 (MD5) / A sepse apresenta crescente incidência com elevada morbidade e mortalidade, sendo a principal causa de óbito nas unidades de terapia intensiva. O controle da infecção depende do adequado reconhecimento dos microrganismos pelas células do hospedeiro e de resposta efetora competente. Os linfócitos, monócitos e neutrófilos são as principais populações celulares do sangue periférico envolvidas nesse processo. A apoptose representa um importante mecanismo de controle da resposta imune, mas em condições críticas, a apoptose desregulada dessas células pode levar o hospedeiro a imunossupressão, dificultando o controle da sepse. Este trabalho avaliou-se a porcentagem de apoptose em linfócitos monócitos e neutrófilos do sangue periférico de pacientes sépticos pela exposição de fosfatidilserina na superfície celular e pela detecção intracelular de caspase-3, também foi avaliado o número absoluto e percentual de linfócitos e suas subpopulações por citometria de fluxo. Foram incluídos 40 pacientes, sendo 4 em sepse, 9 em sepse grave e 27 em choque séptico, classificados de acordo com as definições do consenso de 1992. Quinze voluntários sadios foram incluídos para comparação. Nos ensaios de detecção de apoptose foi feita a separação dos leucócitos totais seguida de lise hipotônica das hemácias e marcação com anticorpos de superfície para identificação das populações leucocitarias. Para verificação da apoptose as amostras foram marcadas com anexina-V e coradas com Iodeto de Propídeo (PI) em tampão apropriado ou incubadas com anticorpo anti-caspase-3 após fixação e permeabilização. A contagem de linfócitos foi realizada em tubos TruCOUNT após a marcação com anticorpos anti-CD45, CD3, CD4, CD8, CD16/56 e CD19. Não houve diferença no percentual de linfócitos totais em apoptose, porém observou-se menor apoptose tardia em linfócitos T nos pacientes sépticos quando comparados aos sadios ( P<0,05). Foi observada menor contagem absoluta de linfócitos totais, linfócitos T, TCD4+, TCD8+ e NK de pacientes sépticos (p<0,01), embora o percentual destas populações celulares tenha se mantido inalterado. Os resultados mostram que o menor número de linfócitos circulantes observados durante o quadro de sepse não pôde ser explicado pela presença de apoptose. A diminuição da contagem destas células na periferia pode significar uma migração para os tecidos ou órgãos linfóides desencadeada pela infecção. Nos neutrófilos não foi observada diferença no percentual de células em apoptose precoce entre pacientes e indivíduos sadios. Houve queda no percentual de apoptose tardia e conseqüente aumento no percentual de células viáveis dos pacientes em comparação aos sadios (p<0,05). Não se observou diferença significativa na mensuração intracelular de caspase 3 em neutrófilos de pacientes comparado a indivíduos sadios. A análise da apoptose durante a evolução da sepse não mostrou diferença entre os grupos D0, D7 e D14. Não houve diferença na proporção de células em apoptose entre pacientes com sepse que sobreviveram e pacientes que evoluíram a óbito até o vigésimo oitavo dia após o diagnóstico de sepse. A apoptose tardia em neutrófilos parece estar diminuída. O possível efeito biológico da redução de apoptose tardia seria uma resposta adaptada à lesão, talvez prolongando a meia vida e atividade dos neutrófilos, entretanto, essa apoptose diminuída pode contribuir para a lesão inflamatória sistêmica e predispor o desenvolvimento da síndrome de disfunção de múltiplos órgãos. Os monócitos foram avaliados unicamente pela detecção intracelular de caspase-3, todavia, não foi encontrado diferença entre pacientes sépticos e indivíduos sadios. O mesmo ocorreu em amostras obtidas na admissão, 7º e 14º dia de seguimento. O percentual de monócitos com positividade para caspase-3 nos dias 0, 7 e 14 de sepse foi relacionado com a evolução dos pacientes em sobreviventes e óbitos, após 28 dias do diagnóstico. A análise realizada com amostras do D0 não indicou diferença na porcentagem de células apoptóticas entre os pacientes sobreviventes e que evoluíram a óbito. Entretanto, o percentual de apoptose observado no D7 mostrou que pacientes que evoluíram a óbito apresentaram menor porcentagem de células positivas para caspase-3 após 28 dias, e essa associação persistiu no seguimento de 60 e 180 dias. O papel da apoptose em monócitos parece ser muito importante na sepse, todavia são necessários novos estudos para elucidar a correlação entre apoptose de monócitos e sobrevida. / Sepsis incidence continues to rise with significant morbidity and mortality and is the leading cause of death in intensive care units. Infection control depends on proper recognition of the microorganisms by immune cells and an adequade effector immune response. Lymphocytes, monocytes and neutrophils are the major peripheral blood cell populations involved in this process. Apoptosis is an important mechanism for controlling the immune response, however, in critical conditions, deregulated apoptosis can lead to immune suppression, difficulting the control of sepsis. This study evaluated the percentage of apoptosis in peripheral blood derived lymphocytes, monocytes and neutrophils by means of exposure of phosphatidylserine on the cell surface and detection of intracellular caspase-3 and evaluated the absolute number and percentage of lymphocytes and their subpopulations by flow cytometry. Forty septic patients were included, of whom, 4 were septic, 9 presented severe sepsis and 27 were in septic shock, classified according to the definitions of the 1992´s consensus. Fifteen healthy volunteers’ were included for comparison. For apoptosis assays, total leucocytes were isolated from the whole blood by hypotonic lysis of the red blood cells and stained with surface antibodies in order to identify the leukocyte subpopulations. For apoptosis evaluation samples were stained with annexin-V and propidium iodide (PI) in an appropriate buffer or labeled with anti-caspase-3 after fixation and permeabilization. Lymphocyte counts were performed in TruCOUNT tubes after labeling the cells with anti-CD45, CD3, CD4, CD8, CD16/56 and CD19. There were no statistical differences in the percentage of apoptosis in total leukocytes, however, lower late apoptosis was observed in T lymphocytes of septic patients when compared to healthy subjects (P<0.05). Septic patients showed a smaller absolute count of total lymphocytes, T lymphocytes, CD4+, CD8+ and NK cells when compared to the healthy individuals (P<0.01), although the percentage of these cell populations has remained unchanged. These results demonstrate that the smallest number of circulating lymphocytes observed during sepsis could not be explained by the presence of apoptosis. The decrease of peripheral blood cell counts could be a result of the cell migration to the lymphoid tissues or organs triggered by infection. There were no differences in the percentage of early apoptosis in neutrophils of patients and healthy individuals. There was a decrease in the percentage of late apoptosis and a consequent increase in the percentage of viable cells in the patients when compared to the healthy subjects (P<0.05). There was no significant differences in the measurement of intracellular caspase-3 in neutrophils of patients compared to the healthy individuals. Analysis of apoptosis during the development os sepsis did not differ among the D0, D7 an D14 groups. There was no difference in the proportion of cells undergoing apoptosis between patients with sepsis who survived and those who died by the twenty-eight (D28) after the diagnosis of sepsis. Late apoptosis in neutrophils appears to be diminished. The possible biological effect of the reduction of apoptosis would be an adapted response to the injury, perhaps extending the half life and activity of neutrophils, however, this decreased apoptosis may contibute to inflammatory injury and predispose to the development of the multiple organ dysfunction syndrome. Only intracellular caspase-3 was evaluated in monocyte population, and no differences were found between this marker on septic patients and healthy individuals. The same results were observed in samples from adminssion, 7 and 14 days of follow-up. The percentage of monocytes with caspase-3 activity on days 0, 7 and 14 of sepsis was related to patient outcome as regards of survival and non-survival, after 28 days of diagnosis. The analysis performed on samples from D0 did not indicate differences in the percentage of apoptotic cells among the survivors and non-survivors. To counterpoint, when this analysis was performed on D7, the percentage of cells positive for caspase-3 were lower in those who died when compared with the survivors after 28 days; besides, this association persisted on 60 and 180 days follow-up. The role of apoptosis in monocytes seems to be important in sepsis, however, further research is needed to elucidate the correlation between monocyte apoptosis and survival. / TEDE

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-23T21:20:51Z No. of bitstreams: 1 Lorena Pinto. Avaliação ex vivo da proliferação espontanea em PBMC de individuos infectados pelo HTLV-1 por citometria de fluxo.pdf: 1267124 bytes, checksum: 830b004821bb96ca261aed15410bcb82 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-23T21:20:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorena Pinto. Avaliação ex vivo da proliferação espontanea em PBMC de individuos infectados pelo HTLV-1 por citometria de fluxo.pdf: 1267124 bytes, checksum: 830b004821bb96ca261aed15410bcb82 (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) infecta cerca de 2% da população de Salvador-Bahia. O HTLV-1 é o agente etiológico da ATLL, HAM/TSP e uveíte. Este vírus também está relacionado a outras doenças inflamatórias como artrites, dermatites infectivas, polimiosites, alveolites e Síndrome de Sjögren. Uma das características imunológicas mais marcantes da infecção pelo HTLV-1 é a proliferação espontânea dos linfócitos T induzida por proteínas transativadoras virais, como Tax e HBZ. O papel da proliferação na patogênese da infecção não é conhecido, porém alguns trabalhos indicam que sua intensidade é maior nos pacientes com HAM/TSP, além disso pode ser responsável pela manutenção da carga proviral do HTLV-1, uma vez que o vírus se replica por divisão da célula infectada. A dinâmica da proliferação ex vivo não é muito conhecida, sendo normalmente avaliada por adição de 3[H]-Timidina às culturas, que possui várias desvantagens, entre as quais a toxicidade. Este é um estudo piloto que objetivou padronizar um método para avaliação da dinâmica da proliferação espontânea de linfócitos T utilizando o marcador CarboxyFluorescein diacetate Succinimidyl Ester (CFSE), por citometria de fluxo. Além de quantificar os índices de proliferação celular de linfócitos T totais e das subpopulações linfocitárias T CD4+ e T CD8+, correlacionar proliferação celular com a carga proviral do HTLV-1 e a expressão da proteína viral TAX. Para tal, PBMC de 30 pacientes infectados pelo HTLV-1 (16 assintomáticos e 14 HAM/TSP) foram cultivados por 24, 48, 72, 96 e 120 horas, em presença de CFSE. As células foram adquiridas em citometro de fluxo e os resultados analisados pelo programa FlowJo, através da porcentagem de células divididas e do índice de divisão celular. Observou-se proliferação em 66,7% dos indivíduos infectados pelo HTLV-1. A proliferação espontânea de PBMC foi superior no grupo de pacientes com HAM/TSP (porcentagem de células divididas: 79%, índice de divisão celular: 79%), comparada aos assintomáticos (porcentagem de células divididas: 50%, índice de divisão celular: 56,3%), porém essa diferença não foi significante A proliferação espontânea pode ser detectada nas primeiras 24 horas de cultura. A intensidade de proliferação é semelhante para as subpopulações de linfócitos T CD4 e T CD8, tanto em indivíduos assintomáticos como naqueles com HAM/TSP. Não houve correlação entre a carga proviral e a porcentagem de células divididas (r= -0,009; p= 0,9) e índice de divisão celular (r=0,1; p=0,5). A média de expressão de TAX em linfócitos TCD4+ foi de 2,4±2,4 %. Houve correlação entre a expressão da proteína Tax e a porcentagem de células divididas (r=0,59; p =0,05) e o índice de divisão celular (r=0,60; p=0,05), porém sem significância estatística. No entanto, encontrou-se uma correlação positiva entre a porcentagem de células T CD4+ divididas e a expressão da proteína Tax (r=0,79; p<0,003), bem como entre o índice de divisão das células TCD4+ e a expressão da proteína Tax (r=0,75; p=0,008). Em conclusão, a avaliação da proliferação espontânea por citometria de fluxo, em culturas com CFSE avaliadas pelo programa FlowJo permite identificar a proliferação celular nas 24 horas inicias da cultura e quantificar a proporção de linfócitos T CD4 e TCD8 que proliferam. Este método pode ser útil na avaliação de drogas que modulam a proliferação espontânea em PBMC de indivíduos infectados pelo HTLV-1. / Around 2% of the population of Salvador-Bahia are infected by the Human-T Lymphocyte virus type I (HTLV-1). This virus is the etiologic agent of ATLL, HAM/TSP and uveitis. It is also related to inflammatory illness like arthritis, infective dermatitis, polymyositis, alveolitis and Sjorgen syndrom. The spontaneous proliferation of T-lymphocytes induced by viral transactivating proteins like Tax and HBZ is one of the most outstanding immunological characteristics of the infection. The role of the proliferation in the pathogenesis is still unknown though some studies have shown that it is higher among HAM/TSP patients. Moreover, it could be responsible for the HTLV-1 remaining proviral load since the virus replicate through division of infected cell. The dynamics of the proliferation ex-vivo is not well known and is usually assessed by incorporating 3[H]-Thymidine to the cultures. This method has several disadvantages one of them being the 3[H]-Thymidine toxicity. This pilot study was aimed at the standardization of a method that assesses the dynamics of the spontaneous T-lymphocytes proliferation using flow cytometry and CarboxyFluorescein diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) as a marker. Other objectives were to assess the rates of celular proliferation of both total T lymphocytes and CD4+ and T CD8+ subpopulations; to correlate the celular proliferation with the HTLV-1 viral load and the expression of the viral TAX protein. PBMCs of 30 HTLV-1 infected patients (16 assymptomatic and 14 HAM/TSP) were cultivated for 24, 48, 72, 96 and 120 hours in the presence of CFSE. Cells were obtained by flow cytometry and the results were analysed with the software Flowjo through the percentage of divided cells and the rate of celular division. Cell proliferation was observed in 66.7% of the HTLV-1 infected people. The PBMC spontaneous proliferation was higher in the group of HAM/TSP patients (percentage of divided cells:79%, rate of cellular division79%) compared to the assymptomatic individuals (percentage of divided cells: 50%, rate of cellular division: 56,3%) though this difference was not significant. Spontaneous proliferation can be detected in the first 24 hours of cell cultivation. The intensity of proliferation is similar in T CD4 e T CD8 subpopulations of assympomatic individuals and HAM/TSP patients. There was no correlation between proviral load and percentage of divided cells (r= -0,009; p= 0,9) and the rate of cellular division (r=0,1; p=0,5). The average of the TAX expression in T CD4+ was 2,4±2,4 %. There was a correlation between the expression of TAX protein and the percentage of divided cells (r=0,59; p =0,05) and the rate of cellular division (r=0,60; p=0,05), although not statistically significant. Nevertheless, a positive correlation was found between the percentage of divided T CD4+ cells and the expression of TAX protein (r=0,79; p<0,003), as well as between the rate of cellular division of TCD4+ cells and the expression of TAX protein (r=0,75; p=0,008). As a conclusion, the assessment of spontaneous proliferation by flow cytometry in cultures with CFSE analysed with the FlowJo software allows to identify the cellular proliferation in the first 24 hours of cultivation and to quantify the proportion of T CD4 and TCD8 lymphocytes that proliferated. This method could be usefull to assess drugs that modulate the spontaneous proliferation in PBMCs from HTLV-1 infected individuals.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-01-08T10:40:45Z No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-01-08T10:40:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Maria Luiza Silva.pdf: 18437840 bytes, checksum: 99e60f1ec0d4d9df9e50bbec11e91cd0 (MD5) / Neste trabalho, o perfil fenotípico e de síntese de citocinas pró-inflamatórias (IFN-, TNF- e IL-12) e reguladoras (IL-4, IL-5 e IL-10) em células da imunidade inata (neutrófilos, monócitos e células NK) e adaptativa (linfócitos CD4+, linfócitos CD8+ e linfócitos CD19+) do sangue periférico de indivíduos primo e/ou revacinados com a vacina antiamarílica 17DD, bem como um caso de reação adversa à vacinação foram investigados por citometria de fluxo após cultura rápida in vitro na ausência e presença da estimulação antígeno-específica. Foram avaliados 10 adultos saudáveis, com idade entre 21 e 51 anos, em 4 tempos distintos: antes da vacinação, 7, 15 e 30 dias após primovacinação. Após cultura in vitro foi observado um perfil global de citocinas pró-inflamatórias, transiente no 7° dia, principalmente devido às células da imunidade inata, seguido por perfil misto de citocinas inflamatórias e reguladoras nos 15° e 30° dias após a vacinação antiamarílica 17DD. Em um 2º estudo, foi observada uma resposta imune adaptativa robusta, acompanhada por anormalidades na resposta do sistema imune inato em um caso de evento adverso grave, seguido à vacinação 17D. Em adição, em um 3º estudo, foram incluídas 60 crianças com idade entre 9 e 47 meses, um ano após a primo e/ou revacinação antiamarílica 17DD, classificadas de acordo com os níveis de anticorpos neutralizantes antiamarílicos apresentados após a vacinação em: respondedoras (médios ou altos títulos de anticorpos neutralizantes), não respondedoras, respondedoras após revacinação e um grupo de crianças não vacinadas. Os dados da avaliação do impacto dos antígenos vacinais 17DD no perfil das citocinas dos leucócitos periféricos destas crianças demonstraram que, na presença de títulos médios de anticorpos neutralizantes após a primovacinação, o estímulo por antígenos vacinais 17DD in vitro foi capaz de induzir um perfil balanceado de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo células da imunidade inata e adaptativa, enquanto que uma assinatura polarizada reguladora foi observada no grupo de crianças primovacinadas não respondedoras e uma assinatura proeminente pró-inflamatória no grupo de crianças que apresentaram títulos altos de anticorpos neutralizantes após a primovacinação. Em conjunto os dados sugerem que uma resposta imune predominantemente do tipo balanceada, com síntese de citocinas pró-inflamatórias e reguladoras, envolvendo tanto células da imunidade inata quanto da imunidade adaptativa parece ser essencial para a indução de uma resposta imune efetiva e segura após a vacinação antiamarílica. / In this study, phenotypic analysis and intracytoplasmic pro-inflammatory (IFN-, TNF- and IL-12) and regulatory (IL-4, IL-5 and IL-10) cytokines synthesis by innate (neutrophils, monocytes and NK cells) and adaptive (CD4+ and CD8+ T subsets, and CD19+) immunity cells of peripheral leucocytes of 17DD yellow fever (YF) prime or revaccinated volunteers, as well as a case of serious adverse events (YF-SAE) temporally associated with 17D YF vaccination were performed using short-term cultures, in absence or presence of YF-17DD-antigens, and single-cell flow cytometry. Ten healthy non-vaccinated volunteers, aged 21 to 51 years were evaluated at four consecutive periods including: before vaccination, 7, 15 and 30 days after vaccination. After whole blood cells culture, the overall cytokine signature showed a transient pro-inflammatory profile at day 7, mainly due to the innate immunity cells, which draws back toward a mixed or modulated pattern at day 15 and day 30 in most vaccines. In another study a robust adaptive response and abnormalities in the innate immune system were observed in one severe adverse event following primary YF-17D vaccination. In addition it was evaluated sixty healthy children with age raging from 9 to 47 months, one year after 17DD yellow fever prime or revaccination, classified according to anti-YF neutralizing antibodies results after vaccination as seroconverters (medium or high neutralizing antibodies levels), non-seroconverters, seroconverters after revaccination, and a unvaccinated group. The impact of YF-17DD-antigens recall on cytokine profiles of YF-17DD primo-vaccinated children characterized by single-cell flow cytometry after short-term cultures of whole blood samples demonstrate that the overall signature of high cytokine producers triggered by YF-Ag recall is associated with the levels of anti-YF neutralizing antibodies, with a balanced pro-inflammatory and regulatory profile of innate and adaptive immunity being the hallmark of seroconverters who presented medium neutralizing antibodies levels, whereas a polarized regulatory signature is observed in non-seroconverters and a prominent pro-inflammatory signature is characteristic of seroconverters who presented high neutralizing antibodies levels. Taken together, the results suggest that mixed type immune response, pro and anti-inflammatory, involving both innate immunity cells and adaptive immunity cells, it may play a pivotal role in the establishment of effective and safe immunization by yellow fever vaccine

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T18:17:38Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T18:17:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-09T18:17:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T18:17:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_LauraCottaRepoles.pdf: 2325297 bytes, checksum: be8a47328cb27845c949da8c4cdb022f (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A triagem sorológica para doença de Chagas em bancos de sangue, obrigatória no Brasil desde 1969, aliada ao desenvolvimento de métodos para detecção de anticorpos anti-T.cruzi cada vez mais sensíveis, permitiram a diminuição da transmissão transfusional desta doença. No entanto, os resultados não negativos (positivos ou indeterminados/inconclusivos) e a discordância entre testes aumentaram consideravelmente, passando a representar um grande desafio para os hemocentros. Outro desafio está relacionado à reinclusão de indivíduos não negativos em triagens prévias como potenciais doadores. Resultados falso-positivos e inconclusivos promovem o descarte desnecessário de bolsas de sangue, além de rotular pessoas saudáveis como portadoras de uma doença grave. Assim, verifica-se a necessidade de desenvolver métodos capazes de distinguir com segurança resultados positivos verdadeiros dos falsos, além de resolver os resultados indeterminados. Neste contexto, o FC-TRIPLEX-IgG1 se apresenta como um método confirmatório inovador para o diagnóstico diferencial da doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar em plataforma única, utilizando citometria de fluxo. O objetivo deste estudo foi verificar o desempenho desta nova metodologia para o esclarecimento diagnóstico de amostras não negativas (n=91) e para o monitoramento sorológico de indivíduos com antecedente de não negatividade (n=100) na triagem para doença de Chagas realizada em três grandes hemocentros brasileiros. Para isto, as amostras foram triadas com os métodos ELISA (I e II) e RIFI e, em seguida, foram realizados os métodos confirmatórios recELISA e FC-TRIPLEX-IgG1. Os resultados mostraram alta discordância entre os testes de triagem (78,0%), além de grande número de reações indeterminadas. Nas amostras positivas em todos os testes de triagem, o FC-TRIPLEX-IgG1 e o recELISA apresentaram desempenho semelhante na confirmação dos resultados. Porém, o desempenho dos métodos no esclarecimento diagnóstico das amostras discordantes foi diferente (p=0,001). O FC-TRIPLEX-IgG1 foi positivo em muitas amostras positivas no ELISA-I e indeterminadas na RIFI, sugerindo sua aplicabilidade na confirmação de resultados e no esclarecimento diagnóstico de amostras não negativas. Já o recELISA foi positivo em muitas amostras negativas nos outros testes, o que mostrou sua baixa especificidade neste estudo. O teste de maior concordância com o FC-TRIPLEX-IgG1 foi a RIFI (k=0,5), seguida do ELISA-I (k=0,5), recELISA (k=0,2) e ELISA-II (k=0,2). O FC-TRIPLEX-IgG1 foi capaz de realizar o diagnóstico diferencial e também se mostrou útil na monitoração sorológica de indivíduos com antecedente de não negatividade na triagem para doença de Chagas, com 98,0% de concordância em amostras ELISA-RIFI- e 94,0% de concordância em amostras ELISA+RIFI+. Os resultados deste estudo sugerem que o FC- TRIPLEX-IgG1 é uma ferramenta promissora, de alta especificidade e desempenho, que pode ser aplicada em hemocentros para auxiliar no esclarecimento diagnóstico de resultados indeterminados/inconclusivos na triagem sorológica para doença de Chagas e na monitoração sorológica periódica de indivíduos com precedente de não negatividade, visando sua exclusão ou reinclusão como possível doador / The serological screening for Chagas' disease in blood banks, mandatory in Brazil since 1969, together with the development of methods for detection of anti-Trypanosoma cruzi antibodies increasingly sensitive, allowed the reduction of transfusion transmission of this disease. However, non-negative results (positive or indeterminate) and the discrepancy between tests increased considerably, and now represent a big challenge for blood banks. Another challenge is related to the re-inclusion of non-negative individuals in previous trials as potential donors. False-positive and inconclusive results further unnecessary disposal of blood bags, and label healthy people as having a serious illness. Thus, there is a need to develop methods capable of reliably distinguish true and false positive results, solving indeterminate results too. In this context, the FC-TRIPLEX-IgG1 presents itself as an innovative confirmatory method for the differential diagnosis of Chagas disease, visceral leishmaniasis and cutaneous leishmaniasis in a single platform, using flow cytometry. The aim of this study was to verify the performance of this new method to clarify the diagnosis of non-negative (n = 91) samples and to serological monitoring of individuals with a history of non-negativity (n = 100) in screening for disease testing Chagas performed in three major Brazilian blood centers. The samples were screened by the methods ELISA (I and II) and IFI and then the confirmatory methods recELISA and FC-TRIPLEX-IgG1 were performed. The results showed high discordance between screening tests (78.0%) and large number of indeterminate reactions. In positive samples in all screening tests, the FC-TRIPLEX-IgG1 and recELISA showed similar performance in confirmation of the results. However, the performance of the methods in diagnostic clarification of discordant samples was different (p=0.001). The FC-TRIPLEX-IgG1 was positive in many samples positive in ELISA-I and indeterminate in IFI, suggesting its applicability in confirmation of results and in clarifying the diagnosis of non-negative samples. Already recELISA was positive in many negative samples in all other tests, which showed a low specificity in this study. The test for a greater agreement with the FC-TRIPLEX-IgG1 was IFI (k=0.5), then the I-ELISA (k=0.5), recELISA (k=0.2) and ELISA-II (k=0.2). The FC-TRIPLEX-IgG1 was able to perform the differential diagnosis and also proved useful in the serological monitoring of individuals with a history of non-negativity in screening for Chagas disease, with 98.0% agreement in RIFI-ELISA- samples and 94.0% of agreement in ELISA+IFI+ samples. The results of this study suggest that FC-TRIPLEX-IgG1 is a promising tool, that has high specificity and performance, which can be applied to blood banks to assist in diagnosis clarifying indeterminate results in serological screening for Chagas disease and in periodic serological monitoring individuals with precedent of non-negativity, for their re-inclusion or exclusion as a possible donor

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:20:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bernardina_morales_ipec_dout_2013.pdf: 4097768 bytes, checksum: a3e4244f0c2be9b0d8d257c5f8921c52 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A criptococose é uma micose sistêmica adquirida pela inalação de basidiosporos ou leveduras desidratadas de Cryptococus neoformans e Cryptococus gattii, estas duas espécies podem causar criptococose oportunista e primária respectivamente. C. neoformans está constituído de tipos moleculares VNI-VNIV e C. gattii de VGI-VGIV que apresentam distribuição geográfica diferenciada, como por exemplo, o tipo VNI é cosmopolita e está associado a AIDS e VGI predominando na Austrália e EUA, o tipo VGII predominando no Brasil e America Latina. Este trabalho tem por objetivo realizar estudo comparado dos tipos moleculares VNI de C. neoformans, VGI e VGII de C. gattii analisando diferentes aspectos tais como: 1- Determinar o perfil da suscetibilidade in vitro da concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol (FLZ), itraconazol (ITZ), 5-fluorocitosina (5FC) e anfotericina B (AMB), isoladamente e de forma combinada de AMB com 5FC e AMB com Voriconazol (VRZ); 2- Determinar CIM pela citometria de fluxo (CMF) frente a FLZ, ITZ e AMB; 3- Definir a concentração mínima letal (CML) de AMB e 5FC, isoladamente e em combinação; 4- Avaliar a ação da melanina frente a 5FC e AMB na forma combinada e isolada de 5FC; 5- Induzir a resistência in vitro para FLZ e padronizar os fluorocromos: acetoximetil - calceína (calceina-AM), acetoximetil - 2\2019, 7\2019 -bis-(2-carboxietil)-5-(e -6)- carboxifluoresceína (BCECF-AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3\2019 \2013dipentiloxacarbocianina (DiOC5) na CMF para verificar a expressão de bombas de efluxo; 6- Comparar a expressão de bombas de efluxo Os resultados permitiram identificar diferentes fenótipos de suscetibilidade que foram analisados e comparados entre as duas espécies e os tipos moleculares, permitindo a produção de quatro artigos; sendo assim, concluímos que: 1- Na análise das CIMs o tipo molecular VGII apresentou-se menos suscetível em relação a VGI e VNI; já na combinação in vitro de AMB e VRZ foi observado 100% de indiferença, e na combinação de AMB e 5FC observou-se necessidade de padronização da concentração da glicose para obter testes que possam ser futuramente relacionados a casos clínicos; 2- O método de CMF demonstrou ser alternativa de leitura automatizada, reprodutível, para os testes de suscetibilidade antifúngica com uso de Laranja de Acridina e FUN-1; 3- Foi verificada a importância da realização do teste da CML para verificar a ação protetora da melanina frente a combinação de AMB e 5FC. 4- A expressão da melanina, na combinação de AMB e 5FC reduz a detecção do sinergismo e o efeito aditivo in vitro. 5. Os isolados induzidos à resistência ao FLZ permitiram obter resultados estatisticamente significativos na verificação de Bombas de efluxo in vitro na CMF com uso de fluorocromo Dioc5 e bloqueador de protonóforos CCCP; 6- Foi verificado que 65% de isolados não induzidos a resistência e 90% de isolados induzidos a resistência do tipo molecular VGII expulsam o FLZ com certa vantagem em relação aos tipos moleculares VGI e VNI. Os resultados deste trabalho contribuem para compreensão do comportamento in vitro de C. neoformans e C. gattii frente a drogas antifúngicas cujos resultados poderão ser aplicados em estudos clínicos de correlação in vitro e in vivo para melhor compreensão da terapêutica antifúngica da criptococose e validação dos testes de suscetibilidade para estas duas espécies / Cryptococcosis is a system ic mycosis acquired by inhalation of dried yeasts or basidiospores of Cryptococus neoformans and Cryptococus gattii , these species can cause cryptococcosis opportunistic and primary respectively. C. neoformans is composed of molecular types VNI - VNIV and C. gattii VGI - VGIV they have different geographical distribution, the VNI type is cosmopolitan and is associated with AIDS, VGI type is predominant in Australia and the USA; while VGII type occurs in Brazil and Latin America. This paper aims to conduct a comparative study of the molecular types VNI C. neoformans and VGI, VGII C. gattii analyzing different aspects such as : 1 – The susceptibility profile in vitro of fluconazole ( FLZ ), itraconazole ( ITZ ), 5 - fluorocytosine ( 5FC ) and amphotericin B ( A MB ) alone and in combination with 5FC and AMB with voriconazole ( VRZ ) 2 – The minimum inhibitory concentration ( MIC ) by flow cytometry ( FCM ) comparing MIC of FLZ , ITZ and AMB with CLSI; 3 - The minimum lethal concentration ( MLC ) of AMB and 5FC, a lone and in combination; 4 - The action of melanin against 5FC and AMB alone and combined 5FC, 5 – The induced resistance in vitro to FLZ and standardize the fluorochromes: acetoximetil - calceína (calceina - AM), acetoximetil - 2’, 7’ - bis - (2 - carboxietil) - 5 - (e - 6) - carboxifluoresceína (BCECF - AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3’ – dipentiloxacarbocianina (DiOC5) in FCM to verify expression of efflux pumps; 6 - The compare the expression of efflux pumps. These results permitted the identification of dif ferent susceptibility phenotypes which were analyzed and compared between the two species and molecular types, allowing the production of four articles . T hus, we concluded that: 1 - The analysis of the molecular type VGII MICs presented less susceptibility against VGI and VNI, whereas in the combination of AMB and VRZ in vitro 100% indifference was observed, in the combination of AMB and 5FC we observed the need for standardization of the concentration of glucose for future tests which can be related to cli nical cases; 2 - the FCM method proved to be an alternative automated reproducible reading for antifungal susceptibility testing with use of Acridine Orange and FUN - 1, 3 - The importance of carrying out the MLC test to verify the protective action of mela nin when exposed to the combination of AMB and 5FC. 4 - Was also verified that expression of melanin, in combination AMB and 5FC reduces the detection of synergism and additive effect in vitro . 5 - The strains induced to resistance to fluconazole made it p ossible to obtain statistically significant results in the verification of acriviry of efflux pumps in vitro using FCM with fluorochrome Dioc5 and protonophores blocker CCCP, 6 - It was found that 65% isolates no inducted to resistance and 90% isolates ind ucted to resistance of the molecular ty pe VGII expels the FLZ with a certain advantage in relation to the molecular types VNI and VGI. The results of these studies contribute to the understanding of the behavior in vitro of C. neoformans and C. gattii agai nst antifungal drugs and can be applied in clinical correlation studies in vitro and in vivo to better understand the antifungal therapy of cryptococcosis and validation of susceptibility testing for these two species.

Introdução: as doenças linfoproliferativas de células B maduras correspondem a cerca de 80% das neoplasias linfoides, são caracterizadas pela proliferação clonal de uma célula B precursora em diferentes estágios de diferenciação. A semelhança imunofenotípica a um dado estágio maturativo é relevante para o diagnóstico diferencial através da imunofenotipagem por citometria de fluxo, embora a sobreposição de expressões possa dificultar a identificação correta de cada linfoproliferação. Alguns marcadores são pouco conhecidos nas diferentes linfoproliferações B e há pouca literatura analisando os dados quantitativamente, sendo grande parte qualitativa. Objetivos: este trabalho avalia a expressão quantitativa em intensidade de fluorescência média (IFM) dos anticorpos CD200, CD43, CD52 e CD123 no diagnóstico diferencial das doenças linfoproliferativas B crônicas. Métodos: estudo transversal, com 124 amostras de pacientes em investigação diagnóstica de doenças linfoproliferativas que realizaram imunofenotipagem em um centro de referência em neoplasias hematológicas no período de outubro de 2014 a junho de 2015. Foram analisadas as IFMs de cada marcador nas onze diferentes doenças diagnosticadas. Resultados: as neoplasias dos 124 pacientes analisados foram: 81 leucemias linfocíticas crônicas (LLC), 17 linfomas de zona marginal (LZM), 9 linfomas linfoplasmocíticos (LLPL), 6 linfomas do manto (LM), 2 tricoleucemias (TRL), 2 tricoleucemias variantes (TRLv), 5 linfomas foliculares (LF), 1 linfoma de Burkitt e 1 linfoma difuso de grandes células B (LDGCB). A expressão mediana do CD200 foi de 46,8 (intervalo: 1,5-334). A expressão mediana de CD200 foi maior na TRL (incluindo a TRLv) e na LLC (85 e 61,2, respectivamente). A expressão de IFM do CD200 na TRLv diferiu quando comparado à TRL na sua forma clássica (mediana: 36,1 versus 220,3). A mesma diferença foi observada na expressão do CD123 quando comparada a TRL à TRLv. Verificamos, que casos de LZM demonstraram IFM medianas de CD43 de 7,1 (intervalo: 1,1-106), em comparação a casos de LM e LLC, nos quais as medianas de IFM do CD43 foram 90 e 176, respectivamente. A comparação da intensidade de CD52 entre amostras demostrou diferença estatisticamente significativa entre LLC e LZM com medianas de IFM de 775,5 versus 1297,0 (P=0,04). Conclusões: nossos resultados sugerem que a citometria de fluxo quantitativa desses marcadores pode ser uma ferramenta adicional útil na identificação de alguns tipos de DLPCBs. / Background: lymphoproliferative disorders of mature B cells account for about 80% of the lymphoid malignancies. They are characterized by the clonal proliferation of a B cell precursor at different stages of differentiation. The similarity of a given phenotypical maturation stage is relevant for the differential diagnosis by immunophenotyping, however overlap in cell morphology and immunologic features may difficult the correct identification of each pathology. Some markers are not well known in different B lymphoproliferative neoplasms and there is little literature analyzing the data quantitatively. Objectives: this study evaluated the expression of CD200, CD43, CD52 and CD123 by flow cytometry on B-cell chronic lymphoproliferative disorders (BCLDs) differential diagnosis. Methods: cross-sectional study, of 124 samples from patients for diagnostic investigation of lymphoproliferative disorders who underwent immunophenotyping in a referral center for hematologic malignancies from October 2014 to June 2015. MFIs were analyzed for each marker in eleven different diagnosed pathologies. Results: the diseases of the 124 patients investigated comprised: 81 chronic lymphocytic leukemia (CLL), 17 marginal zone lymphoma (MZL), 9 lymphoplasmacytic lymphoma (LPL), 6 mantle cell lymphoma (MCL), 2 hairy cell leukemia (HCL), 2 hairy cell leukemia variant (HCLv), 5 folicular lymphoma (FL), 1 Burkitt lymphoma (BL) e 1 diffuse large B cell lymphoma (DLBCL). The CD200 median MFI expression was 46,8 (range: 1,5-334). CD200 was higher in HCL (including HCLv) and CLL cells (85 and 61,2 respectively). HCLv difference in CD200 MFI, when compared to classical HCL (median 36,1 versus 220,3). The same difference in CD123 expression was observed when comparing HCL versus HCLv. We found that cases of MZL exhibited CD43 median MFI of 7,1 (range: 1,1-106), in contrast to cases of MCL and CLL, which had median MFIs for CD43 of 90 and 176, respectively. The comparison of CD52 intensity between CLL and MZL samples showed statistically significant difference with a median MFI of 777,5 versus 1297,0 (P=0,04). Conclusion: our results suggest that quantitative flow cytometry of these markers may be a useful additional tool to better identify some types of BCLDs.

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2015-03-24T20:38:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação Laura Néspoli Nassar.pdf: 1629298 bytes, checksum: 4f06298ca89a21aa7b5c0cf540d13579 (MD5) / Approved for entry into archive by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-04-07T18:39:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação Laura Néspoli Nassar.pdf: 1629298 bytes, checksum: 4f06298ca89a21aa7b5c0cf540d13579 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-07T18:39:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação Laura Néspoli Nassar.pdf: 1629298 bytes, checksum: 4f06298ca89a21aa7b5c0cf540d13579 (MD5) Previous issue date: 2014-03-24 / A retinocoroidite é a manifestação mais comum causada pela infecção congênita por Toxoplasma gondii. Devido a gravidade das lesões oculares que podem até levar à perda completa da visão, a detecção precoce da toxoplasmose congênita e da lesão ocular são essenciais para o tratamento. Este trabalho possuiu o objetivo de avaliar a aplicabilidade da pesquisa de anticorpos IgG e das subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 anti-T. gondii por citometria de fluxo como marcador laboratorial das diferentes formas de lesões retinocoroidais na toxoplasmose congênita. Foram analisadas 88 amostras de soro de recém-nascidos com toxoplasmose congênita, sendo 25 sem lesão ocular (SL), 10 com lesão ocular ativa (RA), 26 com lesão ocular ativa e cicatricial (RAC) e 27 com lesão ocular cicatricial (RC). Foram também utilizadas 19 amostras de soro de recém-nascidos não infectados que apresentaram IgG positivo após o nascimento (NI). Essas amostras foram obtidas a partir de soros de recémnascidos participantes de um programa de triagem neonatal realizado em Minas Gerais realizado nos anos de 2006 e 2007. Os resultados demonstraram que os recém-nascidos com toxoplasmose congênita apresentam maior reatividade de anticorpos IgG total e subclasses IgG1, IgG2 e IgG3 do que indivíduos não infectados. No grupo não infectado, o único anticorpo com mais de 50% de indivíduos com alta reatividade de anticorpos foi IgG4. Ao comparar os grupos de indivíduos com toxoplasmose congênita, foi observado que o grupo RAC, seguido de RC, apresentou maior reatividade principalmente para os anticorpos IgG1 e IgG3 comparado aos recém-nascidos dos grupos RA e SL, enquanto que pacientes do grupo RA apresentaram maior reatividade para IgG4 do que indivíduos dos outros grupos. IgG1 foi a única subclasse capaz de diferenciar os grupos NI, SL dos grupos RAC e RC. Também foi avaliado o índice de avidez de IgG total, que não permitiu estabelecer nenhum critério de diferenciação das formas de lesão ocular causadas pelo T. gondii. Portanto, a citometria de fluxo demonstrou que pode ser um método laboratorial complementar para ser utilizado como indicador das diferentes lesões oculares causadas pela toxoplasmose congênita. / Retinochoroiditis is the most important disorder caused by Toxoplasma gondii infection. Because of severity of ocular lesions that can lead to blindness, early detection of congenital toxoplasmosis and ocular lesion are critical to treatment. The purpose of this study was evaluate the research applicability of IgG and subclasses IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 by flow citometry as a laboratorial biomarker for different forms of ocular lesions in congenital toxoplasmosis. For this purpose, was investigated the presence of antibodies anti-T. gondii IgG and subclasses by flow citometry. 88 serum samples from newborns with congenital toxoplasmosis were analyzed, of these, were 25 without ocular lesions (SL), 10 with active ocular disease (RA), 26 with active and cicatricial ocular lesions (RAC) and 27 with cicatricial ocular lesions (RC). Were also used 19 serum samples from uninfected infants with a positive IgG after birth (NI). These samples were obtained from Neonatal Screening Program in Minas Gerais, Brazil performed in the years 2006 and 2007. The results demonstrate that infants with congenital toxoplasmosis showed greater reactivity of antibodies IgG and subclasses IgG1, IgG2 and IgG3 than newborns uninfected. In the non-infected group the only antibody with over 50% of individuals with high antibody reactivity was IgG4. Among infants infected, the group of patients with lesions RAC showed greater reactivity to IgG and subclasses IgG1, IgG2 and IgG3 than infants groups of RC, RA and SL. Patients in group RA showed greater reactivity to IgG4 than other groups. IgG1 was the only subclass capable to differentiate group NI and SL than group RAC and RC. Was also evaluated IgG avidity that not allowed to establish any criteria for differentiating forms of eye lesion caused by Toxoplasma. Therefore, the results demonstrated that flow citometry can be used as an additional biomarker for different forms of retinochoroiditis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2012 / Made available in DSpace on 2013-07-16T04:28:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 314952.pdf: 2334013 bytes, checksum: 58adbde5a28f3979ffd31859887bf181 (MD5) / Além de grande importância ecológica, muitas espécies da família Orchidaceae, a mais numerosa entre as angiospermas, constituem-se em importantes recursos genéticos devido ao seu valor horticultural e apelo ornamental. O desenvolvimento de protocolos de micropropagação para estas espécies é importante, pois uma maneira eficaz de conservar determinado recurso genético se dá pela sua utilização. No entanto, estes protocolos são altamente específicos e muito escassos atualmente. Estudos visando o melhoramento genético de espécies através da fixação de ganho genético bem como estudos de ordem molecular são também altamente desejáveis. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo regenerativo baseado em estruturas semelhantes a protocormos (ESP) e emprego de biorreatores de imersão temporária (BIT) para Cattleya tigrina, espécie nativa com grande potencial ornamental e atualmente pouco encontrada in situ. Também objetivou-se a realização de estudos do genoma nuclear desta e de outras espécies nativas, com o emprego da citometria de fluxo, visando relacionar aspectos citogenéticos com sua implicação na cultura de tecidos destas espécies. A técnica da camada fina de células (TCL) e o uso de explantes foliares e radiculares cultivados em meio de cultura com diferentes concentrações de fitorreguladores foram avaliados na indução de ESP em C. tigrina. Diferentes concentrações de GA3 e sacarose, além de variações físicas e de técnicas de cultivo, foram avaliadas na multiplicação e regeneração de ESP de C. tigrina. Também foi empregada a técnica da citometria de fluxo para a análise da estabilidade citogenética dos regenerantes de C. tigrina obtidos com o protocolo proposto, bem como na quantificação do conteúdo de DNA nuclear (valor C) de outras cinco espécies nativas. A indução de ESP foi nula em explantes radiculares de C. tigrina. Não houve diferença na taxa de indução entre explantes foliares íntegros ou seccionados em TCL. A indução de ESP foi superior nos meios com maiores concentrações de TDZ, apesar desta ter ocorrido mesmo na ausência completa de fitorreguladores. A desidratação das ESP previamente a inoculação resultou em maior taxa de multiplicação, sendo essa até duas vezes maior quando da utilização de BIT. A presença de GA3 no meio de cultura favoreceu o aumento do número e tamanho de brotos obtidos a partir das ESP. As concentrações de sacarose testadas se comportaram de maneira diretamente proporcional ao incremento de massa fresca, não estando esta relacionada com o número, tamanho ou diferenciação de brotos. As análises de núcleos celulares de C. tigrina e de outras 5 espécies de orquídeas permitiu a quantificação do valor C de DNA com boa precisão, além da observação de que o tecido foliar de todas as espécies avaliadas, com exceção de C. purpurata, é polissomático, existindo grupos de células com diferentes níveis de ploidia no mesmo tecido ou órgão. A análise comparativa em citometria de fluxo dos explantes utilizados na indução de ESP e dos regenerantes obtidos com o protocolo proposto mostrou que 100% dos regenerantes avaliados possuíam o dobro da ploidia do tecido dos explantes, podendo este fato estar ligado a natureza polissomática do tecido de C. tigrina, conforme é discutido.<br> / Abstract : Besides the important ecological importance, many species of the Orchidaceae family, the biggest within the Angiosperm, are also important genetic resources due to its horticultural and ornamental value. The development of micropropagation protocols for these species is important, because one efficient way to conserve a genetic resource is by its utilization. However the protocols for micropropagation os species are highly specific and still scarce. Studies focusing the genetic improvement of species through genetic gain fixation as well as molecular studies are also highly demanded. The objective of this study was to develop a regenerative protocol based on protocorm-like bodies (PLB) and the use of temporary immersion bioreactors (TIB) to Cattleya tigrina, which is an endemic species with a high ornamental value, and currently rarely found in situ. Studies of the nuclear genome o C. tigrina as well as five other native orchids were also done to relate cytogenetic aspects with their implication on tissue culture. The thin cell layer technique (TCL) and the use of different hormone concentration media were evaluated on the induction of PLB from C. tigrina leaf and root explants. Different GA3 and sucrose concentrations, as well as physical variations and different cultivation techniques, were evaluated in the multiplication and regeneration of PLB of C. tigrina. Flow cytometry was used to analyze the genetic stability of C. tigrina regenerates obtained through the proposed protocol, as well as in the quantification of the DNA C-value of other five native species. There was no PLB induction on root explants of C. tigrina. No statistical difference on the PLB induction rate between entire and TCL explants was detected. PLB induction was higher on media containing higher TDZ concentrations, although even on fitorregulator-free medium, PLB induction was observed. The previous dehydration of PLBs resulted in higher multiplication rates, and when TIB were used the multiplication rate increased 2-fold. The presence of GA3 in the culture media favored the increase on the size and number of shoots obtained from PLBs. The sucrose concentrations tested were directly related with the fresh weight increment, but not with the shoot number or size. Through flow cytometry nuclei analysis of C. tigrina and other five orchid species, it was possible to estimate the DNA C-value with high precision, and it was also possible to observe polysomaty on the leaf tissue of all analyzed species, except on C. purpurata. The flow cytometry analysis of tissue from the explants used on PLB induction and the regenerants obtained though the proposed protocol, showed that 100% of the analyzed regenerants doubled their ploidy levels in relation with the explants, been this fact possibly linked with the polysomaty observed on C. tigrina leaf tissue, as discussed.