Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-24T20:18:24Z No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-24T20:18:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-24T20:19:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-24T20:19:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2014-08-28 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dengue virus (DENV) belongs to the family Flaviviridae and the genus Flavivirus, being recognized as four distinct serotypes termed DENV-1 to DENV-4. Like other RNA viruses, DENV displays variation in their sequences, with an error rate during replication cycle estimated at 10-3 to 10-5 errors / nucleotide. These variations are observed not only when samples from different individuals are analyzed, but also within the same host. Considering the need for a better understanding of related mechanisms of DENV evolutionary process and the emergence of viral subpopulations, this study aimed to evaluate the in vitro microevolution of dengue virus serotype-4, analyzing the existence of genetic variations associated with increased viral fitness. For this purpose, a sample of DENV-4 called BR005AM_2015 was inoculated in C6/36 cells and 25 serial passages were performed. After these passages, viral RNA extraction was performed and the cDNA was produced using a specificDENV-4 primer. The full-length genome of the sample BR005AM_2015 and passages 1, 5, 10, 15, 20 and 25 were obtained by the Sanger method using the ABI 3130 Genetic Analyzer and by Next-Generation Sequencing (NGS) using the Ion Torrent technology. The files generated after the sequencing reactions were analyzed using Geneious software version 7.1.7. The analysis of the data provided by the Sanger sequencing has shown that during the 25 passages, two nucleotide mutations occurred, one in the region which encodes for the envelope protein, resulting in the substitution of an amino acid residue T501P, and other silent mutation at NS1 gene. The results of NGS corroborate those obtained by Sanger sequencing. Moreover, seventeen other mutations not previously observed, being the same in the coding regions for proteins E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5. Of the total observed mutations, six of them led to residue substitution. Considering the observed amino acids substitutions, we conducted a study of viral kinetics by RT-qPCR using the ΔΔCt method which indicated a time-dependent increase in the number of copies of viral RNA present in both the supernatant or inside the infected cells, indicating a possible increase of the viral fitness. Other studies are necessary to confirm if the mutations described here also occurs in mammalian cells or in vivo systems, as well as to verify if the observed increase in viral fitness occurs in other systems. / O vírus Dengue (DENV) pertence à família Flaviviridae e ao gênero Flavivirus, sendo reconhecidos quatro sorotipos distintos denominados DENV-1 a DENV-4. Assim como os demais vírus RNA, o DENV exibe variação em suas sequências, com uma taxa de erro durante o ciclo de replicação estimada em 10-3 a 10-5 erros/nucleotídeo. Essas variações são observadas não só quando analisadas amostras de diferentes indivíduos, mas também dentro de um mesmo hospedeiro. Considerando a necessidade de uma maior compreensão dos mecanismos relacionados ao processo evolutivo do DENV e a emergência de subpopulações virais, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a microevolução in vitro do vírus dengue, sorotipo-4, analisando a existência de variações genéticas associadas ao aumento da competência viral (viral fitness). Para tanto, uma amostra do DENV-4 denominada BR005AM_2015 foi inoculada em células C6/36, sendo realizadas passagens seriadas do vírus nesta linhagem celular até a passagem 25. Finalizadas as passagens, foi realizada extração do RNA viral e o cDNA foi produzido utilizando iniciador específico para DENV-4. O genoma completo da amostra BR005AM_2015 e das passagens 1, 5, 10, 15, 20 e 25 foi obtido pelo método Sanger utilizando sequenciador automático ABI 3130 genetic analyzer e por meio de sequenciamento de nova geração (NGS) utilizando a tecnologia Ion Torrent no equipamento Ion PGM™ System. Os arquivos gerados após as reações de sequenciamento foram analisados utilizando o software Geneious versão 7.1.7. A análise dos dados fornecidos pelo sequenciamento de Sanger mostrou que no decorrer das passagens ocorreram duas substituições de nucleotídeos, sendo uma na região codificante para a proteína do envelope que resultou na substituição de um resíduo de aminoácido e outra na região da proteína NS1, porém esta foi uma mutação silenciosa. Os resultados do NGS corroboraram com os obtidos pelo sequenciamento de Sanger e apresentaram outras dezessete mutações não observadas pelo método anterior, sendo as mesmas nas regiões codificantes para as proteínas E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. Do total de mutações observadas, seis delas resultaram em substituição de resíduo de aminoácido. Considerando as mutações observadas, realizamos o estudo de cinética viral por RT-qPCR utilizando o método de ΔΔCt que indicou um aumento do número de cópias de RNA viral, dependente do tempo pós-infecção, tanto presente no sobrenadante de células infectadas quanto no interior das células, indicando um possível aumento da competência viral. Outros estudos se tornam necessários para confirmar se as mutações aqui encontradas também ocorrem em células de mamíferos e em sistemas in vivo, de maneira a verificar se o aumento do fitness viral observado neste estudo se repete em outros sistemas.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-03-01T19:10:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Marcelo D. Martins Raizer.pdf: 17337152 bytes, checksum: 03a07ccf85e6940e6a48ca54cfc503a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-03-01T19:10:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Marcelo D. Martins Raizer.pdf: 17337152 bytes, checksum: 03a07ccf85e6940e6a48ca54cfc503a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-03-01T19:11:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Marcelo D. Martins Raizer.pdf: 17337152 bytes, checksum: 03a07ccf85e6940e6a48ca54cfc503a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-01T19:11:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Marcelo D. Martins Raizer.pdf: 17337152 bytes, checksum: 03a07ccf85e6940e6a48ca54cfc503a1 (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / One of the sectors that have the highest growth rate in the national and international market is floriculture. Ornamental plants are distinguished by their beauty, which enchant both through their exotic forms and by the variation of colors, among which stands out the Heliconia chartacea var. Sexy Pink. The search for consumers for news has forced producers to launch, more and more quickly, new varieties to maintain competition in this productive segment. In this sense, biotechnological research was carried out by Embrapa Amazônia Occidental to induce polyploidy in vitro by somatic doubling using colchicine in three concentrations (0.01%, 0.05% and 0.1%) in order to obtain a Higher rate of genetic variability causing larger and better plants, and as a bridge for gene transfer between different levels of ploidy. In this context, the objective of this work was to evaluate the plants established in the field, from in vitro polyploidy induction assays to determine the morphological, physiological, molecular and productive characteristics of 42 clones of H. chartacea var. Sexy Pink. The characterization analyzes were performed by means of 49 morphological and agronomic descriptors, determination of the number of polymorphic loci by AFLP, characterization of leaf blade structure and stomatal density evaluation by means of microscopy, besides identification of the ploidy level by citometry of flow. As the genotypes 13, 20, 36, 37 and 40 did not present inflorescences during the two years of evaluation and did not present any other characteristic of commercial interest, they were considered unfit for selection for future selection and breeding work. The genotype 35 showed the highest morphological variations with changes in the position and color of the inflorescence, besides having the edges of the whole leaf blade. Clone 18 showed plant height and inflorescence size reduced. Clone 26 presented total defoliation during flowering, which makes this genotype more interesting for landscaping. Combinations of the primers used for AFLP analysis revealed a total of 519 bands, ranging from 100 to 800 base pairs. The total number of loci per primer varied from 157 to 188, while the amount of genetic variation obtained by analysis of molecular variance showed that 99.67% of the genetic variability is within the treatments with colchicine analyzed, and only 0.33 % Among treatments of H. chartacea clones. The stomata of all clones showed tetracytic morphology and guard cells without significant alterations. The highest ED were observed in clones 1 and 14 for the adaxial part of the leaves, whereas for the abaxial part, clones 10, 12 and 14 were the ones with the highest values. The lowest values were verified in clones 7 and 35 for the adaxial part and 7 and 13 for the abaxial part of the leaves. The work allowed the identification of 4 tetraploid and 11 mixoploid genotypes by the flow cytometry technique. Helping in the identification of potential genotypes for genetic improvement program and future in obtaining new varieties. / Um dos setores que possuem maior taxa de crescimento no mercado nacional e internacional é o de floricultura. As plantas ornamentais se diferenciam pela sua beleza, que encantam tanto através das suas formas exóticas, como pela variação de cores, e dentre elas destaca-se a Heliconia chartacea var. Sexy Pink. A busca dos consumidores por novidades tem obrigado os produtores a lançarem, cada vez mais rapidamente, novas variedades para manter a competição nesse segmento produtivo. Neste sentido, pesquisas biotecnológicas foram realizadas pela Embrapa Amazônia Ocidental com a finalidade de induzir a poliploidia in vitro por duplicação somática pela utilização da colchicina em três concentrações (0,01%, 0,05% e 0,1%), visando obter uma maior taxa de variabilidade genética ocasionando plantas maiores e melhores, e como uma ponte para a transferência gênica entre diferentes níveis de ploidia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar as plantas estabelecidas em campo, provenientes dos ensaios de indução de poliploidia in vitro para determinar as características morfológicas, fisiológicas, molecular e produtivas de 42 clones de H. chartacea var. Sexy Pink. As análises de caracterização foram realizadas por meio de 49 descritores morfológicos e agronômicos, determinação do número de locos polimórficos por AFLP, caracterização da estrutura do limbo foliar e avaliação da densidade estomática por meio de microscopia, além de identificação do nível de ploidia por citometria de fluxo. Como os genótipos 13, 20, 36, 37 e 40 não apresentaram inflorescências durante os dois anos de avaliação, e não apresentaram nenhuma outra característica de interesse comercial, foram considerados inaptos para seleção para futuros trabalhos de seleção e melhoramento. O genótipo 35 foi o que apresentou maiores variações morfológicas com alterações na posição e coloração da inflorescência, além de possuir as bordas do limbo foliar inteiras. O clone 18 apresentou altura da planta e tamanho das inflorescências reduzidos. O clone 26 apresentou necrose e desfolhamento durante a floração, o que torna este genótipo mais interessante para o paisagismo. As combinações dos primers utilizados para a análise de AFLP revelaram um total de 519 bandas, variando entre 100 e 800 pares de bases. O número total de locos por primer variou de 157 a 188, enquanto que a quantidade de variação genética obtida pela análise de variância molecular mostrou que 99,67% da variabilidade genética encontra-se dentro dos tratamentos com colchicina analisados, e apenas 0,33% entre os tratamentos dos clones de H. chartacea. Os estômatos de todos os clones apresentaram morfologia tetracítica e células-guarda sem alterações significativas; porém, houve uma menor densidade estomática, além de um tamanho maior que os estômatos apresentados pelo tratamento controle O trabalho permitiu a identificação de 4 genótipos tetraploides e 11 mixoploides, pela técnica de citometria de fluxo. Auxiliando na identificação de genótipos potenciais para programa de melhoramento genético e futuramente na obtenção de novas variedades.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:16:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8642_1.pdf: 943630 bytes, checksum: 0ef6a23c109d1b1904490d5d9a625d24 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alterações na atividade da glicoproteína-P (gp-P) resultantes da exposição individual à radiação ionizante podem ser cruciais para a eficácia de tratamentos que empregam radioterapia antes da quimioterapia. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo para avaliar o efeito da radiação ionizante na atividade da gp-P. Amostras de sangue periférico de cinco indivíduos sadios foram irradiadas in vitro, separadamente, a partir de uma fonte de cobalto-60, de sorte a receber doses de 0,5 e 2,0 Gy, sendo mantida uma amostra não-irradiada como controle. A atividade da gp-P foi analisada nos linfócitos T CD4 e CD8 através do ensaio de efluxo da rodamina 123 utilizando citometria de fluxo (total 60 leituras), com resultados em porcentagem e índice médio de fluorescência. A comparação da atividade média da gp-P entre os grupos de amostras controle e irradiadas indicou não haver influência da irradiação na atividade da gp-P nos linfócitos T. Entretanto, numa avaliação indivíduo por indivíduo, observou-se mudanças na funcionalidade da gp-P em amostras irradiadas, para alguns casos e doses absorvidas. A análise simultânea dos parâmetros de porcentagem e índice médio de fluorescência mostrou-se fundamental na intercomparação das amostras irradiadas e controle de cada doador. Como base nos resultados obtidos, o protocolo proposto foi considerado adequado para análise da atividade da gp-P após estresse radioativo, configurando-se num importante fator prognóstico à adequação de tratamento pacienteespecífico, em particular para indivíduos suspeitos de apresentarem resistência radioinduzida a múltiplas drogas

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: José Antônio Dell'Aqua Júnio / Banca: Rubens Paes de Arruda / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar se a adição do plasma seminal autólogo ao sêmen criopreservado de jumentos, aliado a lavagem uterina pós-inseminação artificial influencia nos índices de fertilidade em jumentas. Para isso, dois experimentos foram realizados: No experimento I foram analisados os parâmetros de cinética espermática pelo método computer assisted sperm analysis (CASA), análise da integridade de membrana plasmática e acrossomal (MPAI), peroxidação lipídica (PERO) e teor de espécie reativa de oxigênio intracelular (EROS) pela técnica de citometria de fluxo, de 15 ejaculados de 3 jumentos, diluídos em INRA-96®(IC - INRA, IMV Technologies, France) - Rota et al., (2012) ou em BotuCrio® (BC - Botupharma, Botucatu, Brasil), com e sem adição de plasma seminal (PS) após a descongelação. Os resultados do CASA foram semelhantes para os 2 diluentes (P>0,05), no entanto o BC proporcionou uma maior integridade de MPAI além da PERO menor que o IC, resultando em menor EROS (P<0,05). A adição do PS reduziu os parâmetros do CASA (p<0,05), porém sem ação na MPAI e PERO (p>0,05). No experimento II, avaliou-se a influência da adição do PS autólogo na pós-descongelação e sua associação à lavagem uterina (L) pós-inseminação artificial (IA), na fertilidade de jumentas. Foram utilizados 86 ciclos de 33 jumentas, divididas em 8 grupos: G1) BC + PS + L e G2) IC + PS + L foram testados mediante inseminações em 14 ciclos cada; G3) BC + L e G4) IC + L foram testadas em 11 ciclos cada, todas as L foram feitas 10 horas após a IA; G5) BC + PS e G6) IC + PS foram empregados em 8 ciclos cada, e o G7) BC e G8) IC foram avaliados em 10 ciclos cada. Verificou-se que o PS não influiu na fertilidade de jumentas (p = 0,6582) contudo a L,10 h pós-IA, interferiu positivamente na taxa de prenhez (p = 0,0097) elevando de 0% (G7 e G8) para 42,9% (G1 e G2) / Abstract: The aim of this study was to evaluate whether the addition of autologous seminal plasma to frozen donkey semen, coupled uterine flushing after artificial insemination influence on fertility rates in jennies. Two experiments were conducted: experiment I, the parameters of sperm kinetics were analyzed by using computer assisted sperm analysis (CASA), analysis of plasma membrane integrity and acrosome (MPAI), lipid peroxidation (PERO) and reactive species content intracellular oxygen (ROS) by the technique of flow cytometry, 15 ejaculated 3 donkeys, diluted in INRA-96® (IC - INRA, IMV Technologies, France) -. Rota et al, (2012) or BotuCrio® (BC - Botupharma, Botucatu, Brazil), with and without addition of seminal plasma (SP) after thawing. The results were similar for CASA to 2 extenders (P> 0.05), however BC provided greater MPAI integrity beyond smaller PERO than the IC, resulting in lower EROS (P <0.05). The addition of PS reduced the parameters of CASA (P <0.05), but no action on the MPAI and Pero (P> 0.05). Experiment II, evaluated the influence of the addition of autologous SP in post-thaw and its association with uterine lavage (L) pos-IA, in the fertility jennies. 86 cycles of 33 jennies were used, divided into 8 groups: G1) BC + SP + Land G2) IC + SP + L, were tested by 14 cycles each; G3) BC+L and G4) IC+ L, were tested on each 11 cycles, all L were made 10 hours after AI; G5) BC + SP and G6) IC + SP were used in 8 cycles each, and the G7) BC and G8) IC were evaluated in 10 cycles each. It was found that the SP, had no effect on fertility jennies (p = 0.6582) however L 10 h post-IA, increased pregnancy rate (p = 0.0097) increasing from 0% (G7 and G8) to 42.9% (G1 and G2) / Mestre

Resumo não disponível.

Orientador: Nereu Carlos Prestes / Resumo: Estudos das células-tronco mesenquimais (CTMs) comprovaram a influência do sexo do doador nas suas capacidades proliferativa e imunomoduladora. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho é investigar se há disparidades entre as células da placenta derivada de fetos de sexos diferentes, fato que ainda não foi descrito na medicina veterinária. Foram coletadas 11 pares de membrana alantoamniótica de cães (ALAM), isoladas por digestão enzimática e cultivadas. Utilizamos amostras de tecido para avaliação histológica e imunohistoquímica. Avaliamos os cultivos celulares para padrões morfológico, proliferativo e de capacidade de diferenciação. A justaposição íntima das membranas alantoideana e amniótica observada nos cortes histológicos justifica estudá-las juntas. Observamos que as células obtidas da ALAM de ambos os sexos apresentaram características semelhantes. As alterações morfológicas foram consistentes entre as amostras, e a viabilidade e a curva de crescimento apresentaram p>0,05. As células demonstraram capacidade de diferenciação nas linhagens adipogênica e osteogênica. Na imunocitquímica, as amostras expressaram a vimentina e os marcadores de pluripotência (Oct-4 e Nanog). Na citometria de fluxo, elas expressaram valores significativos de CD44 e CD90, além da baixa expressão de CD34 e MHCII. Esses resultados indicam não haver diferença entre as células quando comparamos as células da ALAM derivadas de fetos de sexos diferentes, mas sugerem seu uso futuramente na medicina re... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mesenchymal stem cells (MSCs) studies have proven the influence of the donor's gender in its proliferative and immunomodulatory abilities. Therefore this study aims to investigate the presence of discrepancies among the MSCs of the placenta derived from different sex fetus, which haven't been described in the veterinary medicine. Eleven pairs of canine allantoamniotic membranes (ALAM) were collected,isolated through enzymatic digestion and cultivated. Tissue samples were used for histological and immunohistochemistry assessment. The cell cultures were evaluated for morphological, proliferative, and differentiation potential standards. The intimate juxtaposition of the allantoic and amniotic membranes detected in the histological slides justifies studying them together. Similar characteristics were observed for the cells derived from ALAM in both genders. The morphological alterations were consistent among samples, and viability and growth curve exhibited p>0.05. The cells displayed capability to: differentia... / Mestre

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-29T17:53:07Z No. of bitstreams: 1 ana-rodrigues-de-andrade.pdf: 2209967 bytes, checksum: daf5f7b7ad34996e5a40131114f4b681 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-29T17:53:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana-rodrigues-de-andrade.pdf: 2209967 bytes, checksum: daf5f7b7ad34996e5a40131114f4b681 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / A eritropoetina é o hormônio responsável pela regulação da produção de células vermelhas. A eritropoetina humana recombinante (rhEPO) produzida em laboratório e usada como medicamento pode apresentar as isoformas alfa e beta, chamadas de alfaepoetina e betaepoetina humana recombinante. O tratamento com rhEPO melhora bastante a vida de pacientes anêmicos e/ou em diálise, reduzindo a necessidade de transfusão de sangue. A grande demanda por este biofármaco justifica o esforço de pesquisa não só para conhecimento de seus mecanismos de ação e desenvolvimento de processos de produção, como também para controle da qualidade do produto. É de grande importância o desenvolvimento de métodos de análise que diminuam a margem de erro e aumentem a precisão e a confiabilidade dos resultados, além de reduzir o tempo de liberação para o mercado. O ensaio de determinação da potência da alfaepoetina humana recombinante produzida por Bio-Manguinhos é realizado pelo método de camundongos normocitêmicos, com contagem de reticulócitos por microscopia. Estemétodo de contagem é demorado, pouco preciso e desgastante para o analista. O objetivo deste trabalho é estudar o uso do método de citometria de fluxo na contagem de reticulócitos para o ensaio de potência da alfaepoetina humana recombinante. Visando a implantação do método no Departamento de Controle de Qualidade (DEQUA) de Bio-Manguinhos, o desenvolvimento deste trabalho teve também como objetivo comparar a sua eficácia em relação aoprocesso atualmente utilizado, e a realizar os testes necessários à sua validação. Os camundongos foram inoculados com três doses diferentes de amostra ou material de referência e os reticulócitos presentes no sangue coletado foram marcados com o corante fluorescente laranja de tiazol (Retic-COUNT). Os reticulócitos foram contados em citômetro de fluxo FACSCalibur e seu percentual foi utilizadopara a determinação da potência de acordo com os cálculos da Farmacopéia Européia 6ª edição. Para a comparação entre os métodos, vinte lotes de alfaepoetina humana recombinante produzidos por Bio-Manguinhos tiveram sua potência determinada pela contagem de reticulócitos por citometria e microscopia. Para a determinação da repetitividade e da precisão intermediária, foi utilizado um único lote de alfaepoetina humana recombinante. Para avaliar a concordância entre os métodos de citometria de fluxo e microscopia, foi utilizado o teste estatístico de Bland-Altman, com comparação dos vinte resultados obtidoscom os mesmo lotes, analisados a partir das mesmas amostras de sangue. Os resultados apresentaram boa repetitividade e precisão intermediária e mostraram que os métodos são equivalentes no que diz respeitoà determinação da potencia da rhEPO produzida por Bio-Manguinhos. No entanto, em funçãoda alta probabilidade de erros associados ao método de microscopia, a introdução da citometria de fluxo mostra-se uma alternativa bastante promissora para suprir a demanda de testes com precisão, reprodutibilidade e maior velocidade de liberação de lotes. / Erythropoietin is the hormone responsible for the regulation of the red cells’ production. The recombinant human erythropoietin (rhEPO) produced in laboratory and used as a drug exists in the alpha and beta isoforms, called alpha epoietin and beta epoietin. The treatment with rhEPO improves the life of anemic patients and/or on dialysis, reducing the need for blood transfusion. The high demand for this biopharmaceutical product justifies the research effort not only for the knowledge of its mechanisms of action and development of production processes, but also for the product quality control. The development of quality control methods able to reduce errors and increase the accuracy and the reliability of the results, along with a reduction in the release timeto the market, is of great importance. The assay to determine the biological activity of the recombinant human alpha epoietin produced in Bio-Manguinhos is performed bythe normocythaemic mice method and reticulocyte counting by microscopy. This counting method is time consuming, imprecise and stressful to the analyst. The present study aimed to study the use of the flow cytometric method for reticulocyte counting in the biological activity assay for the human alpha epoietin. Intending to implement this new method in the Quality Control Department of Bio-Manguinhos, this work also compared its effectiveness with the currently used method, and the tests required to its validation were performed. The mice were inoculated with three different dosesof sample and reference material, and the reticulocytes on the collected blood were stained with the fluorescent dye thiazole orange (Retic-COUNT). The reticulocytes were counted in a FACSCalibur flow cytometer and their percentage was used for the biological activity determination in accordance with the European Pharmacopoeia 6 th edition. To compare the methods, the biological activity of twenty batches of recombinant human alpha epoetin produced by Bio-Manguinhos was determined trough both cytometry and microscopy. Tothe determination of repeatability and intermediate precision, only a single batch of recombinant human alpha epoetin was used. For the evaluation of agreement between both methods, the Bland-Altman test was used to the compare the twenty results obtained from the same batches, analyzed from the same blood samples. The results showed good repeatability and intermediate precision and indicated that the two methods are equivalent when it concerns thedetermination of the rhEPO biological activity. However, due to the high probability of errors associated with the microscopy method, the introduction of the flow cytometry method seems to be a promising alternative to meet the demand for analyses with precise and reproducible results, along with a good speed in releasing batches for the market.

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Aline Costa de Lucio Prado / Banca: Lúcia Galvão de Albuquerque / Banca: Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Resumo: Doses de sêmen enriquecidas com espermatozoides portadores do cromossomo X são utilizadas na inseminação artificial (IA) e na produção in vitro de embriões (PIVE). Todavia ensaios de campo, utilizando este tipo de sêmen, demonstraram redução na taxa de prenhez, que pode ser justificada pelas injúrias espermáticas durante o processo de sexagem, além de alterações no DNA, interferindo na expressão de genes paternos, afetando o desenvolvimento embrionário e acarretando perda gestacional após 90 dias. Assim, os objetivos desse trabalho foram: comparar a taxa de clivagem e de blastocistos produzidos in vitro utilizando sêmen convencional e sêmen com espermatozoides sexados por citometria de fluxo e verificar a existência de diferenças na expressão de genes relacionados ao reconhecimento da gestação (AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-1, mPGES-2, TNF-α) em embriões produzidos in vitro utilizando os dois tipos de sêmen. Os embriões bovinos foram produzidos por fecundação in vitro, quarenta e oito horas após a fecundação foi avaliada a taxa de clivagem, e no sétimo dia após a fecundação foi avaliada a taxa de blastocisto. Posteriormente esses blastocistos foram submetidos à extração de RNA para a avaliação da expressão gênica. Não foi observada diferença significativa (P>0,05) para as taxas de clivagem e blastocisto entre os grupos experimentais. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo não alterou os níveis de transcritos dos genes AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-2 e TNF-α sugerindo que embriões produzidos com espermatozoides sexados por citometria de fluxo não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação. Porém o gene mPGES-1 foi 4,54 vezes menos expresso nos embriões produzidos com espermatozoides sexados por citometria de fluxo, sugerindo a possibilidade de ocorrência de perda gestacional, pois estudos ... / Abstract: Doses of semen enriched with carriers of X chromosome sperm are used in artificial insemination (AI) and in embryos produced in vitro (PIVE). However, field studies using this type of semen demonstrated a reduction in pregnancy rate, which can be justified by injuries during sperm sexing and alterations in DNA, interfering with the expression of paternal genes affecting embryonic development and resulting in pregnancy loss after 90 days. The aims of this study were to compare the cleavage and blastocyst rates produced in vitro using conventional semen and sexed semen by flow cytometry, and check differences in the expression of genes related to pregnancy recognition (AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-1, mPGES-2, TNF-α ) in embryos produced in vitro using the two types of semen. Bovine embryos were produced by in vitro fertilization, forty eight hours after fertilization the cleavage rate was evaluated, and on the seventh day after fertilization the blastocyst rate was performed. Subsequently, these blastocysts were subjected to RNA extraction for evaluation of gene expression. No significant differences (P>0.05) for cleavage and blastocyst rates between the experimental groups were observed. Related to the expression pattern, the flow cytometry did not alter the transcript levels of AKR1B1, PTGS1, PTGS2, mPGES-2 e TNF-α genes, suggesting that embryos produced with sexed semen by flow cytometry do not have detrimental changes in genes involved in pregnancy recognition. However the mPGES-1 gene was expressed 4,54 times less in embryo produced with sexed semen by flow cytometry, suggesting the possibility of pregnancy loss, since studies suggest that are required levels of expression of mPGES for maintenance and recognition of pregnancy / Mestre

A mudança anual de penas é um componente crítico do ciclo biológico de todas as espécies de aves e pode modificar as respostas imunológicas individuais, sendo que suas consequências são pouco estudadas. Neste contexto, uma vez que são escassos os estudos acerca do perfil clínico e parâmetros imunológicos de pinguins-de-Magalhães em diferentes fases da muda, este estudo propôs avaliar determinados aspectos relacionados a esses perfis, em animais mantidos em ambiente controlado. Foram estudados 21 indivíduos adultos (dez machos e 11 fêmeas) e os parâmetros avaliados foram: teste de hipersensibilidade cutânea tardia à fitohemaglutinina (FHA) com a avaliação histopatológica de biópsias que incluíram a análise qualitativa e quantitativa dos tipos celulares presentes na reação e no controle às 6, 24 e 48 horas; parâmetros clínicos (massa corpórea e hematologia); fagocitose e burst oxidativo; fenotipagem e resposta linfoproliferativa. O teste de FHA demonstrou diferença significativa na espessura da membrana interdigital de ambas as patas inoculadas com FHA e com o controle (PBS) quando comparadas antes da inoculação e antes da biópsia às 24 e 48 horas. A análise histomorfométrica revelou não haver diferenças significativas na frequência relativa de granulócitos (heterófilos/ eosinófilos), linfócitos, macrófagos ou trombócitos entre as patas inoculadas com FHA e PBS em nenhum dos momentos analisados. Este resultado sugere que a diferença na espessura da membrana interdigital das patas inoculadas seja em decorrência do edema e não do infiltrado inflamatório. Para analisar os efeitos do ciclo da muda nos parâmetros clínicos e hematológicos, os animais foram divididos em três grupos: pré-muda (-5 a 0 dias da muda), muda (10&ordm; ao 21&ordm; dia da muda) e padrão basal (&gt;120 dias da muda). Os resultados mostraram que em relação ao momento basal: houve aumento significativo na massa corpórea dos animais no momento da pré-muda; diminuição significativa de proteínas totais, hematócrito, eritrócitos totais e leucócitos totais na pré-muda e muda. Não houve diferença no número total de monócitos e heterófilos, contudo, houve eosinofilia e linfopenia na pré-muda e muda, respectivamente. Com relação aos parâmetros imunológicos, houve aumento no burst oxidativo gerado pelo estímulo biológico (Staphylococcus aureus) na pré-muda em relação à muda e ao padrão basal; ocorreu aumento do burst oxidativo gerado pelo estímulo químico (éster de forbol) na pré-muda em relação à muda. Em relação à fagocitose, houve diminuição desta capacidade dos leucócitos dos animais na pré-muda e muda em relação ao padrão basal quando o agente foi bacteriano; entretanto, o mesmo não foi observado para a fagocitose de leveduras (Zymosan A); houve diminuição de linfócitos T CD4+ circulantes na pré-muda e muda em relação ao padrão basal e o índice de proliferação de linfócitos aumentou durante o período de muda em relação ao basal. Esses resultados tomados em conjunto sugerem que as mudanças fisiológicas observadas durante o ciclo da muda interferem na modulação de parâmetros imunológicos e são sugestivas de serem consequência do prejuízo energético sofrido, mesmo em animais mantidos em ambientes controlados / The annual replacement of feathers is a critical component of the biological cycle of all bird species. Molt can modify their individual immune response, and the consequences of this are not well known. Within this context, and the few studies on the clinical profile and immunological parameters of Magellanic penguins at different stages of their molt, this study aimed to evaluate certain aspects related to the clinical profiles of animals kept in a controlled environment. A total of 21 adult individuals (ten males and 11 females) was analyzed and the parameters evaluated in this study were: delayed-type hypersensitivity test to phytohemagglutinin (PHA) based on the histopathological evaluation of foot web biopsies that included qualitative and quantitative analysis of cell types present in the essay and control at 6, 24 and 48 hours; clinical parameters (body mass and hematology); phagocytosis and oxidative burst; phenotyping and lymphoproliferative response. The PHA test showed significant differences in the thickness of the webbing of both feet inoculated with PHA and control (PBS), when compared before inoculation and before biopsy at 24 and 48 hours. Histomorphometric analysis revealed no significant differences in the relative frequencies of granulocytes (heterophils/ eosinophils), lymphocytes, macrophages, thrombocytes, or between the feet inoculated with PHA and with PBS in any of the samples. This result suggests that the difference in thickness of the foot webbing is due to edema and not an inflammatory infiltrate. To analyze the effects of the molting cycle on clinical and hematological parameters, the birds were divided into three groups: pre-molt (from -5 days to the start of the molt, day 0), molt (10th to 21st days of molt) and baseline (&gt;120 days after the completion of the molt). The results showed that in comparison with baseline values: a significant increase in body mass occurred during pre-molt; and a significant decrease in total protein, hematocrit, total erythrocytes and total leukocytes occurred during pre-molt and molt. There was no difference in the total numbers of monocytes and heterophils, however, there were eosinophilia and lymphopenia during pre-molt and molt, respectively. There was an increase in the oxidative burst generated by the biological stimulus (Staphylococcus aureus) in the pre-molt compared to molt and baseline levels; and there was an increased oxidative burst generated by the chemical stimuli (phorbol esters) in the pre-molt in relation to the molt. There was a decreased capacity of phagocytosis for the leukocytes in animals during pre-molt and molt compared to baseline when the agent was bacterial; however, this was not observed for the phagocytosis of yeast (Zymosan A). There was a decrease of circulating CD4+ T lymphocytes in the pre-molt and molt compared to baseline, and the lymphocyte proliferation index increased during the molt compared to baseline. The results suggest that the physiological changes observed during the molt cycle does interfere with the modulation of immune parameters, and are suggestive of resulting as a consequence of from the high energy demands of molt, even for birds kept in controlled environments

Os resultados obtidos no mestrado mostraram que a samambaia do campo (Pteridium aquilinum) reduz a citotoxicidade das células natural killer (NK) esplênicas e a resposta imune celular do tipo tardia (DTH) de camundongos. Entretanto, até aquele momento não era sabido qual a célula afetada pela planta causava a diminuição da DTH. Assim, o objetivo inicial deste estudo foi verificar qual a célula envolvida na diminuição da DTH. Além disto, buscou-se descobrir o mecanismo de ação imunotóxico da P. aquilinum, o principio tóxico envolvido e se este efeito poderia ser revertido pelo selênio (Se). Para tal, camundongos C57BL/6 foram administrados com extrato de P. aquilinum, por gavage, durante 30 dias e suplementados com Se por mais 30 dias e a análise histológica revelou redução significativa na área de polpa branca esplênica que foi completamente revertida pelo tratamento com Se. Ainda, foi possível verificar que a diminuição da DTH foi causada pela redução da produção de IFN&gamma; pelas células NK durante a indução da resposta imune celular. Além disto, camundongos administrados com ptaquilosídeo, por gavage, durante 14 dias mostraram a mesma redução na atividade das células NK causada pelo extrato de P. aquilinum, assim como a prevenção deste efeito pela co-administração de Se. Por fim, na análise da expressão gênica das células NK esplênicas dos camundongos tratados com ptaquilosídeo e/ou selênio pôde-se observar o aumento da expressão dos genes Mt1 e Mt2, possíveis responsáveis pelo mecanismo imunotóxico da planta, sendo posteriormente confirmado pelo aumento de metalotioneína e consequente redução de Zn2+ livre no espaço intracelular das células NK. Os resultados deste estudo claramente mostram que os efeitos imunossupressores da P. aquilinum são induzidos pelo ptaquilosídeo e são decorrentes do aumento da expressão dos genes da Mt1 e Mt2 e que a suplementação com Se pode prevenir e reverter estes efeitos tóxicos. / The results obtained in the master showed that the bracken fern (Pteridium aquilinum) reduces both the cytotoxicity of splenic natural killer cells (NK) and the delayed-type hypersensitivity (DTH) from mice. However, it was not known until that time, which cell affected by the plant that caused a decrease in DTH. Thus, the initial goal of this study was to determine which cell was involved in the reduction of DTH. Moreover, we sought to discover the mechanism of action of the P. aquilinum, the toxic principle involved and whether this effect could be reversed by selenium (Se). For that, C57BL/6 mice were treated with extract of P. aquilinum, by gavage, for 30 days and supplemented with Se for following 30 days. The histological analysis revealed a significant reduction in the splenic white pulp area that was completely reversed by treatment with Se. Still, it was verified that the decrease in DTH was caused by reduced production of IFN&gamma; by NK cells during the induction of cellular immune response. In addition, the mice administered with ptaquiloside, by gavage, for 14 days showed the same reduction in the NK cell activity caused by the extract of P. aquilinum, as well as the prevention of this effect by co-administration of Se. Finally, we could observe an increase in the expression of Mt1 and Mt2 genes in the gene expression analysis of splenic NK cells from mice treated with ptaquiloside and/or selenium. These genes were probably responsible for immunotoxic mechanism of the plant, which was confirmed later by the augment of metallothionein and consequent reduction of free Zn2+ into the intracellular space of NK cells. The results of this study clearly show that the immunosuppressive effects of P. aquilinum are induced by ptaquiloside and they are a consequence of the augment in the gene expression of Mt1 and Mt2 and that the supplementation with Se can prevent and reverse these toxic effects.