Orientador: Domingos da Silva Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T09:38:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Niemann_FernandaSoares_M.pdf: 1512099 bytes, checksum: db41f8402852d861b0bf574aeef40677 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Estudos das propriedades de virulência de Escherichia coli associadas às infecções intestinais são importantes para compreender seus mecanismos diarreiogênicos. Em um trabalho anterior, realizado em nosso laboratório descrevemos um fator de virulência no sobrenadante de E. coli isoladas de água de consumo na cidade de Ouro Preto, MG, com atividades enterotóxica e citotóxica. Este fator foi denominado enterotoxina termo-estável ST-like (ST-L). A ST-L foi purificada a partir dos sobrenadantes de cultura de amostras de E.coli cultivadas em meio CAYE modificado, fracionado com sulfato de amônio e por ultrafiltração e concentrado por liofilização. Este material foi submetido às cromatografias de exclusão molecular e fase reversa, em sistema HPLC. A ST-L purificada mostrou, pela análise eletroforética em 2D, ponto isoelétrico (pI) em 6,19 e massa molecular de aproximadamente 2kDa. A atividade biológica pelos tratamentos com enzimas tripsina, proteinase K, ribonuclease ou pepsina. A citotoxicidade da ST-L manteve-se inalterada sob variações de pH (3 a 9) e tratamento com solventes orgânicos. A toxina resistiu ao aquecimento à 100ºC mostrando ser termoestável. A caracterização biológica da ST-L mostrou que várias linhagens celulares foram sensíveis aos seus efeitos citotóxicos, sofrendo alterações celulares e nucleares, em até 24h, com a formação de vacúolos citoplasmáticos e morte celular, conforme verificado pelos testes de viabilidade celular dos lisossomos, mitocôndrias, membranas celulares e quantificação da população celular das linhagens HEp-2, Vero, CaCo-2 e HT-29. A ST-L não induziu acúmulo de fluídos no teste de alça ligada em intestino de coelhos induzindo, contudo, acúmulo de fluidos intestinais no teste de camundongos recém-nascidos (Dean). Foi possível determinar que a toxina STL encontra-se codificada num plasmídeo e apresenta uma região conservada de alta similaridade com estA2, o que justifica a presença de efeito enterotóxico no teste de Dean. No entanto, não foi possível determinar a região ativa para a atividade citotóxica da ST-L. Em função das características apresentadas sugere-se a toxina ST-L seja uma variante do grupo das enterotoxinas termoestáveis (ST) com atividade citotóxica produzida por E. coli diarreiogênicas. / Abstratc: Studies on the virulence properties of Escherichia coli associated with intestinal infections are important for the understanding of diarrheic diseases mechanisms. In a previous work we have described a factor presenting enterotoxic and cytotoxic activities in the culture supernatants of E. coli isolated from drinking water in the city of Ouro Preto, MG. This factor was called as thermo stable enterotoxin - like (ST-L) and it was purified from cultured supernatants produced with modified CAYE medium, fractionated with ammonium sulfate, being subsequently ultrafiltrated, subjected to molecular exclusion chromatography and then to reversed-phase chromatography in HPLC-system. The ST-L showed to be pure by the electrophoretic analysis in the bidimensionl electrophoresis (2D), being the isoelectric point (pI) of 6.19 and the molecular mass of approximately 2kDa. The toxin can not be inactivated by enzimes like trypsin, proteinase K, ribonuclease or pepsin. The cytotoxic activity of ST-L does not change whith pH variations (3 - 9), does not change after treatment with organic solvents and resists heating treatments of 100°C showing it to be heat-stable. Biological characterization of the toxin showed, through the tests of cell viability with the ST-L, that several cell lines were sensitive to the cytotoxin action, with major cellular and nuclear changes observed within 24 hour assays, presenting cytoplasmic vacuoles and cell death, what was verified by tests of cell viability of lysosomes, mitochondria, cell membranes and quantification of the cell population on cell lines like HEp-2, Vero, CaCo-2 and HT-29. The rabbits ileal intestinal loop tests, performed with the ST-L, did not show positive results, but the toxin acts by inducing intestinal fluid accumulation into the newborn mice test (Dean). Through molecular characterization tests, we found that the gene enconding for the toxin ST-L is in a plasmid and has a conserved region with high similarity to estA2, what justifies the presence of the positive enterotoxic result in the Dean test. However, it was not possible to determine the fragment responsible for cytotoxic activity of ST-L. According to the characteristics presented we suggest that the toxin-ST-L is a variant group of the heat-stable enterotoxin (ST) with cytotoxic activity produced by the diarrheagenic E. coli. / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Stephen Hyslop, Carla Beatriz Collares-Buzato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T23:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_JulianaMinardi_D.pdf: 8097756 bytes, checksum: 5350a8b542e9015bd5486f4418b36285 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As peçonhas de serpentes Bothrops são responsáveis por diversos danos locais (na região da mordida) e sistêmicos durante o envenenamento. Dentre as manifestações sistêmicas, a insuficiência renal aguda e um dos mais importantes efeitos tóxicos causados por acidentes botropicos. Esta tese teve como objetivos: 1) investigar a ação da peçonha bruta de B. alternatus em células epiteliais renais MDCK; 2) proceder a purificação e caracterização de uma DNase acida presente nesta peçonha; e 3) determinar a possível ação apoptotica desta DNase sobre células MDCK em cultura. Com relação as ações in vitro do peçonha bruta de B. alternatus, observamos modificações no citoesqueleto, nas junções intercelulares e sobre a morte celular das células MDCK tratadas com 10 ou 100 µg/mL de peçonha bruta. Dentre as modificações observadas, houve uma diminuição da resistência transpitelial, uma redistribuição de algumas proteínas associadas as junções intercelulares acompanhada por um desarranjo do citoesqueleto envolvendo as fibras de estresse na superfície basal e adesão focal associada a F-actina na região de contato celula-matriz. A analise morfometrica mostrou uma diminuição do numero de células entrando em mitose e um aumento do numero de células com núcleos picnoticos ou morfologicamente alterados apos tratamento com o peçonha. Microscopia eletrônica de varredura revelou uma densidade de microvilosidades diminuída, assim como a alteração da morfologia celular normal, de poliédrico para um formato fusiforme, nas células tratadas. O tipo principal de morte celular induzido pelo tratamento com o peçonha bruta foi a necrose, com uma freqüência pequena de indução de apoptose. O pré-tratamento das células MDCK com catalase, superoxido dismutase e L-NAME inibiu os efeitos sobre morte celular causados pelo peçonha bruta, indicando o envolvimento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nos danos causados pelo envenenamento pela peçonha de B. alternatus. As peçonhas ofídicas possuem uma grande variedade de enzimas que degradam ácidos nucléicos e seus constituintes. As desoxirribonucleases (DNases) são endonucleases presentes em peçonhas de serpentes que hidrolisam acido desoxirribonucleico (DNA). Sua ação no envenenamento ocorre em conjunto com outras enzimas que quebram ligações fosfato (ATPases, 5¿-nucleotidases, fosfodiesterases, ribonucleases). Vários estudos sobre endonucleases em mamiferos sugerem que a DNase II (DNase acida) seria responsável pela fragmentacao do DNA durante a apoptose. E também conhecido que peçonhas são capazes de induzir apoptose em células. Através de uma combinação de cromatografias de troca iônica, gel filtração, afinidade e HPLC, foi purificada uma DNase da peçonha de B. alternatus, com atividade especifica de 3.489 unidades/mg (atividade especifica da peçonha: 65 unidades/mg) e fator de purificação de ~54 vezes. As características bioquímicas desta enzima são: uma massa molecular de ~31 kDa, ausência de subunidades, pI de 4,4-5,2, pH otimo de atividade de 4,7, termo estabilidade ate 40oC. O Km e Vmax são 10.1 µg/mL e 352.5 U/mg, respectivamente. A enzima degrada preferencialmente DNA de dupla fita, com atividade menor sobre DNA desnaturado; também degrada DNA circular (dos plasmideos pGEM e pBR322) mas não degrada RNA ou poly A. E inibida por altas concentrações (100 mM) de cations (Ca2+, Mg2+ e Zn2+), e também por N-etilmaleimida, iodoacetamida, acido aurintricarboxilico e DTT, mas não por EDTA. A enzima e reconhecida por IgG antibotropica em Western blot e no ELISA e por anti-DNase II humana no Western blot. Em celulas MDCK, a DNase produz alterações morfologicas como vacuolacão do citoplasma, retração e destacamento das celulas em monocamada, presença de núcleos condensados e/ou fragmentados. Através de ensaios de viabilidade e citotoxicidade, verificamos que a DNase e citotoxica as células MDCK em doses a partir de 400 U/mL (~20 µg/mL). Alem disso, causa fragmentação de DNA e um aumento no numero de células apoptoticas, em menor proporção, de células em necrose. A via de apoptose estimulada pela enzima envolve a ativação das caspases 3, 8 e 9, e uma diminuição na expressão da proteína anti-apoptotica Bcl-2. Estes resultados mostram que a peçonha de B. alternatus e citotoxica as células MDCK, com parte desta toxicidade mediada pela DNase II. Esta enzima induz apoptose que poderia contribuir para a toxicidade geral da peçonha / Abstract: Bothrops snake venoms are cytotoxic to a variety of cells (endothelial, smooth muscle, renal and inflammatory cells), and may cause cell death by apoptosis. The venom components implicated in apoptosis include metalloproteinases and L-amino acid oxidase. In contrast, although acidic deoxyribonucleases (DNase II) have been implicated in DNA fragmentation during apoptosis in mammals, nothing is known of the involvement of venom deoxyribonucleases in this phenomenon. In this thesis, we 1) investigated the cytotoxicity of Bothrops alternatus venom in Madin-Darby canine kidney (MDCK) epithelial cells, 2) purified and characterized an acidic DNase from this venom, and 3) assessed the apoptotic activity of this DNase in MDCK cells. Treatment with B. alternatus venom (10 and 100 µg/mL) markedly decreased the transepithelial electrical resistance of cultured cells, and caused redistribution of some junctional proteins followed by cytoskeletal rearrangement involving stress fibers at the basal cell surface and focal adhesion-associated F-actin in the cell-matrix contact region. There was a decrease in the number of mitotic cells and an increase in the number of cells with pycnotic or morphologically altered nuclei. Scanning electron microscopy revealed a decrease in microvillar density and alteration in the normal cell morphology from polyhedric to fusiform. Staining with annexin V-FITC and electrophorese of cellular DNA suggested that cell death was predominantly by necrosis. Pretreating the cells with catalase, superoxide dismutase or L-NAME significantly attenuated the venom-induced cell death, indicating the possible involvement of reactive oxygen and nitrogen species in this phenomenon. DNase II was purified from B. alternatus venom by a combination of ion exchange and gel filtration chromatographies (specific activity = 1.9x103 units/mg vs. 36.1 units/mg for venom, purification factor = 51.2, with a protein yield of 1.75%). The molecular mass of 26.4 kDa (SDS-PAGE) was unaffected by dithiothreitol or i-mercaptoethanol, indicating a single-chain protein. Immunoblotting with affinity-purified IgG from commercial bothropic antivenom also yielded a single protein band with the same molecular mass. The enzyme was also recognized by antibothropic IgG in ELISA and crossreacted with anti-human DNase II in western blots. The isoelectric point determined by 2Dgel electrophoresis was ~5.0. DNase II cleaved double-stranded DNA, denatured DNA and circular DNA (from the plasmids pGEM and pBR 322), but there was no degradation of RNA. The enzyme was active in the pH range of 4.5-5.5, with an optimum at 4.7; activity was lost at >50oC. The Km and Vmax were 10.1 µg/mL and 352.5 U/mg, respectively. Enzymatic activity was inhibited by aurintricarboxylic acid (25 µM), iodoacetamide (1 mM), DTT (1 mM) and Ca2+, Mg2+ and Zn2+ (100 mM), but not by EDTA (5 mM). In MDCK cells, DNase II produced cytoplasmic vacuolization, cell shrinkage and cell detachment from the substrate, as well as condensed and/or fragmented nuclei. DNase was cytotoxic to MDCK cells at > 400 U/mL (~20 µg/mL), caused DNA fragmentation, and increased the proportion of apoptotic cells. The apoptotic pathway stimulated by this enzyme involved the activation of caspases 3, 8 and 9, and a decrease in the expression of the anti-apoptotic protein Bcl2. These results show that B. alternatus venom is cytotoxic to MDCK cells, with part of this toxicity probably being mediated by DNase II. This enzyme induces apoptosis that could contribute to the general cytotoxicity of the venom / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

A capsaicina é um componente pungente das pimentas do gênero capsicum que possui atividade antitumoral. Na busca por compostos antineoplásicos mais eficazes e seletivos em relação aos disponíveis atualmente, foi desenvolvido um análogo sulfonamídico sintético da capsaicina, o RPF101, que apresentou atividade citotóxica superior em linhagens de adenocarcinoma de mama. Face ao exposto, o objetivo deste trabalho foi otimizar a atividade do RPF101 a partir da síntese de análogos sulfonil-hidrazônicos planejados por bioisosterismo. Treze análogos foram sintetizados em três etapas, baseando-se na reação entre cloreto de sulfonila e hidrato de hidrazina para obtenção do intermediário sulfonil-hidrazida; oxidação do álcool piperonílico para obtenção do piperonal; e reação de adição nucleofílica entre sulfonil-hidrazida e piperonal ou vanilina, que apresentaram rendimentos entre 23 e 85%. Os compostos foram caracterizados por metodologias de RMN 1H/13C, faixa de fusão e análise elementar e avaliados quanto sua capacidade citotóxica em células de adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231 e MCF-7) pelo método do MTT. Dois análogos mostraram-se ativos nas duas linhagens, dos quais o mais promissor, RPF906 (IC50 em MDA-MB-231 = 104,6 µM) foi submetido a estudos de elucidação mecanística, onde observou-se indução de apoptose, causando interrupção do ciclo celular na fase G0/G1. Os resultados obtidos mostraram que o grupo benzodioxol favorece a atividade biológica quando comparado ao grupo metilcatecol. Estudos de modelagem molecular sugerem que uma maior hidrofilicidade esteja relacionada com uma atividade superior. Embora menos ativas que seu protótipo, as sulfonil-hidrazonas apresentaram efeito biológico e mostram-se promissoras no desenvolvimento de compostos com potencial antitumoral. Novas modificações moleculares devem ser planejadas com o intuito de otimizar a atividade e seletividade destes compostos. / Capsaicin is a primary pungent compound in red peppers, which has antitumor activity. In view of demand for more selective and less toxic anticancer agents, our group reported a synthetic sulfonamide capsaicin-like analogue, RPF101, which presents higher cytotoxicity in adenocarcinoma cell line than its prototype. Thus, the aim of this work is to optimize RPF101 activity by the synthesis of sulfonylhydrazone analogues, using the bioisosterism as molecular modification strategy. Thirteen analogues were synthesized in three reaction steps: oxidation of piperonyl alcohol to the piperonyl aldehyde; nucleophilic substitution reaction between sulfonyl chloride and hydrazine hydrate to obtain the intermediate sulfonylhydrazide; nucleophilic addition reaction between sulfonylhydrazide and piperonal of vanilin to obtain sulfonylhydrazones, which showed yields between 23 and 85%. All compounds were characterized by NMR 1H/13C, melting point and elemental analisys and evaluated for their cytotoxic activity in breast tumor cell lines (MDA-MB-231 and MCF-7). Two analogues showed cytotoxic effect although RPF906 (IC50 in MDA-MB-231= 104.6 µM) had been the most promising and was further evaluated about its mechanistic properties. This compound induced apoptosis and cell cycle arrest at the G0/G1 phase. Results showed that the introduction of benzodioxol group increases cytotoxicity. Molecular modeling studies suggests that superior hydrophilicity is related to superior activity. Sulfonyl-hydrazone analogues were less cytotoxic than their prototype, but they are still promising compounds. Molecular modifications strategies should be done to optimize the activity and selectivity of these compounds.

Os modelos de reconstrução do microambiente são úteis para investigar as propriedades biológicas dos melanócitos humanos com a matriz e como plataforma para testes de novos fármacos. Existe uma demanda crescente para a utilização de pele e derme reconstruídas em laboratório, em ensaios in vitro de citotoxicidade, viabilidade celular, crescimento celular, irritabilidade e avaliação dos constituintes da matriz extracelular. Caracterizamos, em equivalente dérmico, alguns mecanismos de viabilidade e invasão de melanoma metastático humano quando na presença da matriz, a fim de ampliar o conhecimento a respeito de novas terapias contra o melanoma e entender os mecanismos que favorecem seu potencial invasivo, mimetizando com mais fidelidade o que ocorre in vivo. Através da validação deste modelo, constatamos que ele é essencial para resgatar a fisiopatologia do tumor, pois o melanoma, na presença de equivalente dérmico, torna-se capaz de evadir mecanismos de morte e aumentar a secreção de metaproteinases e citocinas que favorecerão a evolução tumoral. Avaliamos também as propriedades antineoplásicas do ácido clorogênico, que já foram relatadas em um grande número de tumores, porém os mecanismos que levam à sua ação antitumoral ainda não foram bem elucidados. Diante dos trabalhos enfatizando o efeito quimioprotetor dos polifenóis, referentes à sua ação antioxidante em células neoplásicas e com potencial metastático, não há na literatura estudos que comprovem a eficácia do ácido clorogênico sobre células de melanoma metastático humano. Portanto, este estudo visou recriar a estrutura dérmica in vitro e, a partir disso, comparar a resposta de fármacos em células de melanoma cultivada em equivalente dérmico, a fim de avaliar se há modulação diferencial nesse substrato, sugerindo, portanto, um protocolo mais eficaz para a prospecção de fármacos antimelanoma. / The microenvironment reconstruction models are useful for investigating the biological properties of human melanocytes onto the matrix and as platform for testing new drugs. There is a growing demand for the use of reconstructed skin and dermis in the laboratory for in vitro assays of cytotoxicity, viability, cell growth, irritability, and evaluation of the extracellular matrix. We characterize in dermal equivalent some mechanisms for cell viability and invasion of human metastatic melanoma in the presence of matrix, the order to increase knowledge about new therapies against melanoma and to understand the mechanisms that favor its invasive potential, to more closely mimic what occurs in vivo. By means of this model, we find that it is essential to rescue the tumor physiopathology as melanoma, in the presence of dermal equivalent, it is able to evade death mechanisms and increase the expression of metalloproteinases and cytokines which favor the tumor evolution. We also evaluated the antineoplastic properties of chlorogenic acid, that have been reported in a large number of tumors, but the mechanisms that lead to its antitumor action has not been well elucidated. Before the work emphasizing the chemoprotective effect of polyphenols related to its antioxidant action in neoplastic cells and with metastatic potential, there is no literature studies confirming the effectiveness of chlorogenic acid on human metastatic melanoma cells. Therefore, this study aims to rebuild the dermal structure in vitro, and from this, to compare the response to drugs in melanoma cells dermal equivalent cultured in order to evaluate whether modulation differential on the substrate, thus suggesting a protocol more effective for prospecting antimelanoma drugs.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-07T14:51:50Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Valéria M. Moura.pdf: 5547073 bytes, checksum: 6401a44660de65ea0a0bf12e74b2b049 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-07T14:59:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Valéria M. Moura.pdf: 5547073 bytes, checksum: 6401a44660de65ea0a0bf12e74b2b049 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2017-03-07T15:00:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Valéria M. Moura.pdf: 5547073 bytes, checksum: 6401a44660de65ea0a0bf12e74b2b049 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-07T15:00:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese - Valéria M. Moura.pdf: 5547073 bytes, checksum: 6401a44660de65ea0a0bf12e74b2b049 (MD5) Previous issue date: 2016-08-25 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bothrops atrox is responsible for the majority of snakebites in northern Brazil and its poisoning is characterized by intense local and hemostatic disorders injuries. In some regions of the country where the care of accident victims by snakes is precarious, medicinal plants have been presented as an alternative treatment or as a complement in the absence of resources soroterápicos. The main goal of this study was to evaluate the anti-snakebite potential of aqueous extract of the bark of Bellucia dichotoma Cogn. (Melastomataceae) prepared in accordance with the traditional method. Initially, we investigated the potential of the extract (AEBd) to inhibit the major local (hemorrhagic, phospholipase A2 and edemainducing) activities of Bothrops atrox venom (BaV) and compared the pre-incubation method with the traditional method used in folk medicine. The concentrations of the phenolic components (tannins and flavonoids) in the extract were determined by colorimetric assays. To assess the action of AEBd on BaV, SDS-PAGE electrophoresis, zymography and Western-blot were carried out. As geographic distribution, soil type and climate can directly influence the biological potential of a species, we compared the potential of B. dichotoma collected in two different locations (Manaus, AM, and Santarém, PA) to inhibit the edemainducing, phospholipase A2, defibrinating and coagulant activities of BaV. We also investigated the antioxidant potential and cytotoxicity of the extracts using human fibroblasts (MRC-5 cell line). In an attempt to correlate the anti-snakebite potential of B. dichotoma with its chemical components, a preliminary HPLC-DAD method was developed to isolate the major components of the extract. The efficacy of the isolated components in inhibiting the hemorrhagic and phospholipase A2 activities of the venom was evaluated initially using a preincubation protocol and a venom:component ratio of 1:1 (w/w). Our results show that AEBd has a higher concentration of (condensed and hydrolysable) tannins than of flavonoids. The complete inhibition observed in this study when pre-incubation was used may be due to the presence of tannins in the extract. However, when AEBd was administered orally according to the traditional method, it was effective in inhibiting edema induced by BaV and enhanced the ability of the antivenom to inhibit edema formation. While the content of total phenolics, total tannins and hydrolysable tannins was greater in B. dichotoma extract collected in Manaus, this difference was not reflected in the anti-snakebite potential of the extracts collected in the two locations. Our results indicate that the two extracts have a high antioxidant potential and are not toxic in MRC-5 cells. It is noteworthy that a component in the FBd1 fraction of the aqueous extract blocked 100% of the hemorrhagic activity of BaV when pre-incubated with the venom. Studies to elucidate the chemical structure of this component are currently being carried out by our group. / Bothrops atrox é responsável pela maioria dos acidentes ofídicos na região Norte do Brasil e seu envenenamento se caracteriza por lesões locais intensas e distúrbios hemostáticos. Em algumas regiões do país onde o atendimento dos acidentados por serpentes é precário, as plantas medicinais têm se apresentado como alternativa de tratamento ou como um complemento na falta de recursos soroterápicos. Este trabalho teve por objetivo principal avaliar o potencial antiofídico dos extratos aquosos das cascas de Bellucia dichotoma Cogn. (Melastomataceae) elaborados de acordo com uso tradicional. Inicialmente, foi investigada a ação bloqueadora do extrato aquoso das cascas de B. dichotoma (EABd) frente às principais atividades locais (Hemorrágica, fosfolipásica, edematogênica) induzidas pelo veneno de Bothrops atrox (VBa), comparando os métodos de pré-incubação e de uso tradicional. As concentrações dos compostos fenólicos (taninos e flavonoides), no extrato, foram determinadas por ensaios colorimétricos. Para verificar a ação de EABd sobre o VBa foram realizadas eletroforese em SDS-PAGE, Zimografia e Western-blot. Como a distribuição geográfica, tipo de solo e condições climáticas, podem influenciar diretamente no potencial biológico de uma espécie, avaliamos a eficácia do bloqueio de B. dichotoma coletada em dois locais distintos (Manaus-AM e Santarém- PA), frente as atividades edematogênica, fosfolipásica, desfibrinante e coagulante do veneno de B. atrox. Além de verificar o potencial antioxidante e a citotoxicidade dos extratos frente a fibroblastos humanos da linhagem MRC- 5. Na tentativa de correlacionar o potencial antiofídico de B. dichotoma com seus constituintes químicos, foi realizado um desenvolvimento preliminar de um método por HPLC-DAD para isolamento dos constituintes majoritários do extrato aquoso das cascas de B. dichotoma. A eficácia dos compostos isolados no bloqueio da atividade hemorrágica e fosfolipásica A2 foi avaliada, inicialmente pelo protocolo de pré-incubação na proporção de 1:1 (veneno: compostos, m:m). Apartir dos resultados obtidos, foi possível concluir que o conteúdo fenólico de EABd apresentou maiores concentrações de taninos (condensados e hidrolisáveis) em relação aos flavonoides. Os bloqueios totais observados neste trabalho, após a pré-incubação, podem ser devido à presença desses taninos no extrato. No entanto, o EABd, quando administrado tradicionalmente (via oral), foi eficaz em bloquear a atividade edematogênica induzida pelo VBa e teve um efeito adicional a ação do Soro antibotrópico na inibição dessa atividade. Os contéudos de compostos fenólicos (fenóis totais, taninos totais e taninos hidrolisáveis), foram superiores no extrato de B. dichotoma coletado em Manaus, porém, essa diferença não influenciou o potencial antiofídico apresentado pelos extratos aquosos coletados em Manaus-AM e Santarém-PA. Os extratos apresentaram um alto potencial antioxidante e não foram considerados tóxicos frente às células MRC-5. Um composto da fração FBd1 oriunda do extrato aquoso de B. dichotoma bloqueou 100% a atividade hemorrágica do veneno de B. atrox (pré-incubação), no entanto, o composto isolado encontra-se em fase de elucidação estrutural.

Submitted by Alisson Mota (alisson.davidbeckam@gmail.com) on 2015-07-17T19:42:06Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Lidiam Maia Leandro.pdf: 7558907 bytes, checksum: 4dd15817ba882dd32549da94c60308e6 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-20T13:22:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Lidiam Maia Leandro.pdf: 7558907 bytes, checksum: 4dd15817ba882dd32549da94c60308e6 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-20T13:26:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Lidiam Maia Leandro.pdf: 7558907 bytes, checksum: 4dd15817ba882dd32549da94c60308e6 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-20T13:26:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Lidiam Maia Leandro.pdf: 7558907 bytes, checksum: 4dd15817ba882dd32549da94c60308e6 (MD5) Previous issue date: 2011-04-18 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Eperua is a genus of the Fabaceae-Caesalpinioideae, endemic to the Central Amazon. The oilresin of E. oleifera, E. purpurea e E. falcata is used in folk medicine in order analogous to “copaiba”, as a healing agent antifungal and bactericide. In general, two class substances have been isolated from this species: terpenes and flavonoids. Despite the species E. glabriflora and E. duckeana are common in the Amazon, have never been studied chemically and pharmacologically. This study aimed to evaluate the chemical composition of extracts of bark of trunk and leaves and to determine the antioxidant, antibacterial, antifungal, antiprotozoal and cytotoxic activity against tumor cells, and analyzing the chemical composition of essential oils from leaves and stems of these species. The plant material was collected in Ducke Reserve near Manaus and the bark and leaves were dried at room temperature and later crushed. The extracts were prepared by maceration with solvent in order of increasing polarity (hexane, ethyl acetate and methanol) were obtained twelve crude extracts. The non-polar extracts of bark of trunk were analyzed by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) and flame ionization detector (GC-FID). It was identified fourteen substances among them: six fatty acids (hexadecanoic acid, 9,12-octadecadienoic acid, 9- octadecenoic acid, octadecanoic acid, tetracosanoic acid and hexacosanoic acid); four diterpene acids (cativic acid, 3-hydroxylabd-7,13-dien-15-oic acid, 3-cleroden-15-oic acid and one isomer); one hydrocarbon (squalene); one vitamin (α-tocopherol); and two sterols (stigmasterol and β-sitosterol). The latter two substances were isolated in mixture and identified by spectrometric methods. From ethyl acetate extract of bark of trunk E.glabriflora was isolated from 3-O-glycoside-flavanonol, engeletin also present in the extract of E. duckeana, but in lower concentration. Other flavonoid was isolated from M+ 476 u.ma. Essential oils were obtained by hydrodistillation in Clevenger apparatus changed during 4h, then dried with sodium sulfate and analyzed by GC-FID and GC-MS. We identified 35 constituents in essential oils, and the β-caryophyllene and germacrene D the major constituents. Essential oils from leaves and stems showed cytotoxic activity against tumor cell lines of breast cancer (MDA/MB-435), colon (HCT8) and central nervous system (SKF-295) with inhibitions of growth of approximately 100%. The extracts tested showed weak or no trypanosoma cruzi or leishmania activity and antibacterial and antifungal activity, except the hexane extract of the bark of E. glabriflora that showed significant activity against grampositive bacterium Bacillus subtilis (MIC = 62.5 μg /mL). With respect to antioxidant potential, the highest activity of free radical sequestration was presented by the extracts in ethyl acetate and methanol of bark of trunk (IC50 10.5 -17.8 mg / mL) in both species. The results of this study contribute to the knowledge of chemical and biological of two species from Amazonian biodiversity. / Eperua é um gênero da família Fabaceae, endêmico da Amazônia Central. O óleo exsudado das espécies Eperua oleifera, Eperua purpurea e Eperua falcata é utilizado na medicina popular de modo análogo ao da copaíba, como cicatrizante, antifúngico e bactericida. De modo geral, duas classes de substâncias têm sido isoladas de espécies desse gênero: terpenos e flavonóides. Apesar das espécies Eperua glabriflora e Eperua duckeana serem comuns na Amazônia, nunca foram estudadas química ou farmacologicamente. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a composição química dos extratos obtidos das cascas do tronco e folhas e determinar as atividades antioxidantes, antibacteriana, antifúngica, antiprotozoária e citotoxicidade em células tumorais, além de analisar a composição química dos óleos essenciais das folhas e talos dessas espécies. O material vegetal foi coletado na Reserva Ducke em Manaus e as cascas e folhas foram secas à temperatura ambiente e posteriormente trituradas. Os extratos foram preparados por maceração com solvente em ordem crescente de polaridade (hexano, acetato de etila e metanol). Foram obtidos doze extratos brutos. Os extratos apolares das cascas foram analisados por Cromatografia à Gás acoplada ao Espectrômetro de Massas (CG-EM) e ao Detector de Ionização de Chama (CG-DIC). Foram identificadas quatorze substâncias, sendo essas: seis ácidos graxos (ácido hexadecanóico, ácido 9,12-octadecadienóico, ácido 9-octadecenóico, ácido octadecanóico, ácido tetracosanóico e ácido hexacosanóico); quatro ácidos diterpênicos (ácido catívico, ácido 3- hidroxi-labda-7,13-dieno-15-óico, ácido 3-clerodeno-15-óico e um isômero dele); um hidrocarboneto (esqualeno); uma vitamina (α-tocoferol); e dois esteróis (estigmasterol e β- sitosterol). As duas últimas substâncias foram isoladas em mistura e identificadas por métodos espectrométricos. Do extrato obtido em acetato de etila das cascas de E. glabriflora foi isolado um 3-O-glicosil-flavanonol conhecido como engeletina, presente também no extrato da E. duckeana, porém, em menor concentração; e um flavonóide de M+ 476. Os óleos essenciais foram obtidos por hidrodestilação, em aparelho clevenger modificado durante 4h, e seco com sulfato de sódio e analisados por CG-DIC e CG-EM. Foram identificados nos óleos essenciais 35 constituintes, sendo o β-cariofileno e o germacreno D os constituintes majoritários. Os óleos essenciais das folhas e talos apresentaram atividade citotóxica em linhagens de células tumorais de câncer de mama (MDA/MB-435), cólon (HCT8) e sistema nervoso central (SKF-295) com inibições de crescimento de aproximadamente 90%. Os extratos testados apresentaram fraca ou nenhuma atividade antileishmania, trypanosoma cruzi, antifúngica e antibacteriana, exceto para o extrato obtido em hexano das cascas de E. glabriflora que apresentou significativa atividade contra a bactéria gram-positiva Bacillus subtilis (CIM= 62,5 μg/mL). Com relação ao potencial antioxidante, a maior atividade de seqüestro de radical livre DPPH• foi apresentada pelos extratos obtidos em acetato de etila e metanol das cascas (CI50 10,5 -17,8 μg/mL) e ambas espécies. Os resultados obtidos neste trabalho contribuem para o conhecimento químico e biológico de duas espécies da biodiversidade amazônica.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-11-10T15:39:39Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Elizabeth Gomes Paulino Menezes - 2009.pdf: 1425255 bytes, checksum: 6aa32c741dbfa1d3e72e004f919b5326 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-11-10T15:39:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Elizabeth Gomes Paulino Menezes - 2009.pdf: 1425255 bytes, checksum: 6aa32c741dbfa1d3e72e004f919b5326 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-10T15:39:56Z (GMT). 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After 48 hours, the cytotoxicity in normal cells remained themselves and we noticed there was an increase in IC50 leukemic cells of 0.198 μMol and 0.200 μMol in K-562 and lymphocytes, respectively. For the MTT test, results were similar to those found during the previous experiment (IC50K-562 11,98 μMol IC50lymphocytes 0,425 μMol for a period of 24 hours and IC50K-562 0,685 IC50lymphocytes 0,851 μMol for a period of 48 hours). The research about cell death mechanisms showed the treatment in K-562 cells joined to 0.036 μMol of grandisin during 24 hours, induces to an increase of cells population in G1 stage of cell cycle and it also induces to a decline of cells population in G2 stage and S, respectively. These factors also indicate that the grandisin was induced to a cell cycle standstill in G1 stage, which is proportionated to the most antileukemic agents existing. Cell death with apoptosis signs was showed by the research about these cells morphology. Moreover, the treatment of leukemic cells with 0.072, 0.036, 0.018 μMol of grandisin during 24 hours has promoted exposure of annexin V, wich is a first indicator of apoptosis. In these cells, the activity research of 3, 6 and 9 caspases and cell death mediators Bcl2 and Bax showed that cell death happens in dependent-caspase way and with balance induction between Bcl2 and Bax. Collectively, these results introduce a new model able to induce apoptosis in a leukemic cell genealogy with important features of resistance to the process of programmed cell death. / Neste estudo, o potencial antileucêmico da grandisina, uma neolignana extraída de Piper solmsianum, foi investigado contra a linhagem leucêmica K-562, a qual apresenta fenótipo de resistência a fármacos. A citotoxicidade da grandisina (0,018 – 2,365 μMol) foi avaliada em K-562 e em linfócitos do sangue periférico normal utilizando os métodos de Azul de Tripano e MTT({brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio]}). Na investigação da atividade citotóxica da grandisina sobre células K-562 e linfócitos por 24 horas pelo método azul de tripano, a grandisina apresentou IC50 (concentração inibitória para cinqüenta porcento) de 1,075 μMol e 0,375 μMol para linfócitos e K-562, respectivamente. Após 48 horas a citotoxicidade para as células normais se manteve e observamos aumento para as células leucêmicas IC50 0,198 μMol e 0,200 μMol para K-562 e linfócitos, respectivamente. Para o teste de MTT os resultados foram semelhantes aos encontrados no ensaio anterior (IC50K-562 11,98 μMol IC50linfócitos 0,425 μMol para 24 horas e IC50K-562 0,685 μMol IC50linfócitos 0,851 μMol para 48 horas ). A investigação dos mecanismos de morte celular demonstrou que o tratamento das células K-562 com 0,036 μMol de grandisina por 24 horas induz ao aumento da população de células em fase G1 do ciclo celular e uma diminuição da população de células em fase G2 e S, respectivamente, indicando que a grandisina induziu parada do ciclo celular em fase G1, o que condiz com a maioria dos antileucêmicos existentes. A investigação da morfologia destas células indicou morte celular com sinais de apoptose. Além disto, o tratamento das células leucêmicas com 0,072, 0,036, 0, 018 μMol de grandisina por 24 horas promoveu a externalização da anexina V, um indicador primário de apoptose. Nestas células, a investigação da atividade das caspases 6, 8 e 9 e dos mediadores do processo de morte celular Bcl2 e Bax demonstrou que a morte celular ocorre via caspase-dependente e com indução de modulação entre Bcl2 e Bax. Coletivamente estes resultados introduzem um novo modelo capaz de induzir apoptose em uma linhagem celular leucêmica com importantes características de resistência ao processo de morte celular programada.

Submitted by Kamila Costa (kamilavasconceloscosta@gmail.com) on 2015-07-23T20:59:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ellen Suzany Pereira Aranha.pdf: 5525688 bytes, checksum: 2e52510a8984ee46894c1f0f78cdff51 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-24T19:10:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ellen Suzany Pereira Aranha.pdf: 5525688 bytes, checksum: 2e52510a8984ee46894c1f0f78cdff51 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-24T19:22:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ellen Suzany Pereira Aranha.pdf: 5525688 bytes, checksum: 2e52510a8984ee46894c1f0f78cdff51 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-24T19:22:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ellen Suzany Pereira Aranha.pdf: 5525688 bytes, checksum: 2e52510a8984ee46894c1f0f78cdff51 (MD5) Previous issue date: 2014-04-15 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cancer is one of the most causes of death in the world. The research of natural products is strategy to develop anticancer agents. The aim this research was to identify chemical components, to investigate the anticancer potential in vitro and genotoxicity of Eugenia genus´s essential oil. For this, were used the cytotoxicity assay of Alamar blue and the hemolytic potential in erythrocytes of mice, as initial screening for selection of samples with cytotoxic potential, from the determination of the samples IC50. After the samples selection, we attemped to evaluate anticancer effect of the essential oil and its genotoxicity. Nine essential oils were tested, in a single concentration (50 μg/mL) which only two- Eugenia cuspidifolia (1) e Eugenia tapacumensis (3)- were selected for later tests. The IC50, in 72 hours, obtained to these samples varied between 4,69 to 24,35 μg/mL and 6,22 to 26,17 μg/mL, respectively, among tumor cell lines. For non-tumor cell line, in 72 hours, the values for the IC50 were 25,51 μg/mL to E. cuspidifolia and 36,12 μg/mL to E. tapacumensis besides they didn´t cause hemolysis to mice erythrocytes. The species E. cuspidifolia and E. tapacumensis were more active to colorectal line (HCT 116) and ovary (ES-2), and the HCT 116 line was chosen to be used for later tests, because it´s one of the most frequent kind of cancer in diagnostics and in deaths worldwide at a world level . The chemical constitution of E. cuspidifolia and E. tapacumensis essential oils was investigated through gas chromatography. A total 26 constituents were identified for both samples. The majority components were caryophyllene oxide, α-copaene, hepoxid of humulene II and cis-nerolidol. The essential oils in concentrations 7,5, 15 and 30 μg/mL, were tested in the clonogenic assay and they significantly reduced the number of colonies (p<0,05), in the 7,5 and 15 μg/mL concentrations, when compared with DMSO (0,2%). In the wound-healing assay, 24 and 48 hours, the essential oils reduced the migration in vitro (p<0,05) only on the concentration 30 μg/mL, at 48h. The inhibitor potential of metalloproteinase MMP-2 and MMP-9 was evaluated through of zymography method. In the results, the better inhibition effect was from the E. tapacumensis essential oil, that reduced the enzymatic activity (p<0,05) in the concentrations 15 and 30 μg/mL, in both treatments times (24 and 48h). Genotoxicity was evaluated by comet assay, using two versions, alkaline pH, which detects any damage caused to DNA, and neutral pH, specific to double-stranded breaks in DNA. Through damage index analisis, the results in alkaline pH assay were similar to the neutral pH. Only E. tapacumensis (30 μg/mL) caused damage DNA (p<0,05) in the alkaline version. At the neutral pH version, all concentrations tested (p<0,05) caused DNA damage. Thus, is concluded that E. cuspidifolia and E. tapacumensis essential oils are cytotoxic in tumor cell lines, and they have anticancer potencial in HCT 116 cell line acting as cytotoxic and cytostatic depending on the time and the tested concentration. Only E. tapacumensis is genotoxic, in non-tumor cell line, however more specific studies are needed to determine whether this genotoxicity is reversible or if the mechanism of cytotoxic action of essential oil is related to the cell DNA damage. / O câncer é uma das maiores causas de morte no mundo. A pesquisa de produtos naturais constitui uma estratégia para o desenvolvimento de agentes anticancerígenos. Objetivou-se nessa pesquisa identificar os componentes químicos, investigar o potencial anticâncer in vitro e a genotoxicidade de óleos essenciais do gênero Eugenia. Para isso, foram utilizados os ensaios de citotoxicidade do alamar blue e o potencial hemolítico em eritrócitos de camundongos, como triagem inicial para a seleção das amostras com potencial citotóxico, a partir da determinação da CI50 das amostras. Posteriormente a seleção das amostras, buscouse avaliar o efeito anticâncer dos óleos essenciais e a sua genotoxicidade. Foram testados nove óleos essenciais, em concentração única (50 μg/mL) dos quais apenas dois - Eugenia cuspidifolia (1) e Eugenia tapacumensis (3)- foram selecionados para os testes posteriores. A CI50, em 72 horas, obtida para essas duas amostras variou entre 4,69 a 24,35 μg/mL e 6,22 a 26,17 μg/mL, respectivamente, entre as linhagens tumorais. Para a linhagem não tumoral, em 72 horas, os valores de CI50 foram de 25,51μg/mL para E. cuspidifolia (1) e 36,12 μg/mL para E. tapacumensis (3), além de não causarem hemólise a eritrócitos de camundongos. As espécies E. cuspidifolia (1) e E. tapacumensis (3) foram mais ativas para as linhagens de colorretal (HCT 116) e ovário (ES-2), e escolheu-se para os testes posteriores utilizar a linhagem HCT 116, por ser um dos tipos de câncer mais frequentes em diagnósticos e também em mortes a nível mundial. A constituição química dos óleos essenciais de E. cuspidifolia (1) e E. tapacumensis (3) foi investigada através de cromatografia gasosa. Foram identificados um total de 26 constituintes para as duas amostras. Os componentes majoritários foram óxido de cariofileno, α-copaeno, hepóxido de humuleno II e cis-nerolidol. Os óleos nas concentrações de 7,5, 15 e 30 μg/mL, foram testados no ensaio clonogênico e reduziram significativamente o número de colônias (p<0,05) na concentração de 7,5 e 15 μg/mL, quando comparado ao controle DMSO (0,2%). No ensaio de motilidade celular, nos tempos de 24 e 48 horas, os óleos essencias reduziram a migração (p<0,05) somente na concentração de 30 μg/mL, no tempo de 48h. O potencial inibidor de metaloproteinases MMP-9 e MMP-2 foi avaliado através de método zimográfico. Nos resultados obtidos, o melhor efeito inibitório foi do óleo essencial de E. tapacumensis (3), o qual reduziu a atividade enzimática (p<0,05) nas concentrações de 15 e 30 μg/mL, nos dois tempos de tratamento (24 e 48h). A genotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do cometa, usando duas versões, a de pH alcalino, o qual detecta qualquer dano causado ao DNA, e a de pH neutro, específico para quebras da fita dupla de DNA. Através da análise do Índice de dano, os resultados no ensaio em pH alcalino foram semelhantes ao do pH neutro. Somente E. tapacumensis (3) (30 μg/mL) causou dano ao DNA (p<0,05) na versão alcalina. Na versão em pH neutro todas as concentrações causaram dano (p<0,05). Assim, conclui-se que os óleos essenciais de E. cuspidifolia (1) e E. tapacumensis (3) são citotóxicos nas linhagens tumorais, tem potencial anticâncer na linhagem HCT116 agindo como citotóxico e citostático dependendo do tempo e da concentração testada e somente a E. tapacumensis (3) é genotóxica, em células não neoplásicas, , entretanto estudos mais específicos precisam determinar se essa genotoxicidade é reversível ou se o mecanismo de ação citotóxica do óleo está relacionada a lesão do DNA das células.

Submitted by Lúcia Brandão (lucia.elaine@live.com) on 2015-12-09T17:59:34Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ana Carolina Lima Ralph.pdf: 3508510 bytes, checksum: b16bff00de46cca4fb42ff6771b3f824 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-01-19T19:19:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ana Carolina Lima Ralph.pdf: 3508510 bytes, checksum: b16bff00de46cca4fb42ff6771b3f824 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-01-19T19:21:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ana Carolina Lima Ralph.pdf: 3508510 bytes, checksum: b16bff00de46cca4fb42ff6771b3f824 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-19T19:21:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Ana Carolina Lima Ralph.pdf: 3508510 bytes, checksum: b16bff00de46cca4fb42ff6771b3f824 (MD5) Previous issue date: 2014-03-28 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cancer is a public health problem and thesecond cause of death worldwide. Among many types of cancer, cutaneous melanoma has a notable increasing incidence, high aggressiveness and poor survival. Alternative therapy has been investigated like signaling pathways and molecular mechanisms of target specific genes and proteins of melanoma. Taking into account the antitumor activity of biflorin, substance isolated from Capraria bifloraroots, which is cytotoxic in vitro in many tumor cell lines and antitumor activity in vivolike Erlich and Sarcoma 180. This study aimed to show the activity of biflorin in three different strains of human melanoma - SK -Mel 19, 28 and 103. The study model with three cell lines provided a comparison of the effect of biflorin in different common mutations of human melanomas cell lines.Were evaluated the cytotoxic capacity, cell death mechanism, genotoxic capacity and changes in the expression of BRAF, MELK, TYMS, RAD, MGMT, DNMT1, DNMT3B, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MeCP2. The biflorin, as well as the agents doxorubicin and dacarbazine (positive control), inhibited proliferation of the three human melanoma cell lines studied and was more cytotoxic against SK-Mel 103, followed by SK-Mel 19 and SK-Mel 28.The IC50mean of biflorin at all times and tested strains were 3.23 ± 0.83 μM, ranging from 1.54 to 9.2 μM. Through crystal violet staining of cells treated with biflorin revealed morphological changes like cytolysis with increased of scattered cellular debris, cytoplasm vacuolization, disruption of chromatin with empty nuclear space. Additionally, in the differential staining LA /BE , we observed an increase in the number of apoptotic cells as there was an increase in the concentration of biflorin, however, the number of necrotic cells did not change. Comet assay revealed a production of single and double strand breaks after treatment with biflorin at concentrations of 2.5 and 5.0 μM. At modified comet assay was observed inhibition of methylationat all concentrations tested at SK-Mel 19 and 28. Biflorin also have shown to decrease the expression of methylation genes DNMT1, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4 andMeCP2,genes of cell cycle progressionMELK, gene of DNA replication TYMS,and DNA repair genesRAD and MGMT. The results presented here may indicate the biflorin as animportant cytotoxic agent. / O câncer é um problema de saúde pública e a segunda causa de morte no mundo. Dentre os variados tipos de neoplasias, o melanoma cutâneo destaca-se por sua crescente incidência, alta agressividade e baixa sobrevida. Como alternativa terapêutica tem se investigado as vias de sinalização e mecanismos moleculares de genes e proteínas alvo-específicas do melanoma. Levando-se em consideração a atividade antitumoral da biflorina, substância isolada das raízes da Capraria biflora, que já possui comprovada atividade citotóxica in vitro em diversas linhagens tumorais e in vivoem modelo de carcinoma de Erlich e sarcoma 180. O presente trabalho objetivou mostrar a atividade da biflorinafrente três diferentes linhagens de melanoma humano - SK-Mel 19, 28 e 103. O modelo de estudo com as três linhagens celulares proporcionou a comparação do efeito da biflorina em diferentes mutações comuns em melanomas humanos quanto à sua capacidade citotóxica, mecanismo de morte celular, capacidade genotóxica e alteração na expressão dos genes BRAF, MELK, TYMS, RAD, MGMT,DNMT1, DNMT3B, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MeCP2. A biflorina, assim como os agentes quimioterápicos doxorrubicina e dacarbazina (controles positivos), inibiu a proliferação celular das três linhagens de melanoma humano estudados, sendo mais citotóxica contra SK-Mel 103, seguida pela SK-Mel 19, e menos citotóxica à SK-Mel 28.A média da CI50 da biflorina em todos os tempos e linhagens testados foi de 3,23 ± 0,83μM, variando de 1,54 μMa 9,2 μM pelo método alamar blue. Avaliando a citotoxicidade pelo teste de exclusão por azul de tripan, a biflorina causou diminuição de células viáveis com consequente aumento de células não-viáveis de forma concentração e tempo dependentes. Através da coloração cristal violeta das células tratadas com biflorina, observaram-se alterações morfológicas de citólise com aumento de restos celulares dispersos, vacuolização do citoplasma, desarranjo da cromatina com áreas claras ou espaço nuclear vazio. Adicionalmente, na coloração diferencial LA/BE, foi observado um aumento no número de células apoptóticas de forma concentração dependente, entretanto, o número de células em necrose não variou. No teste do cometa evidenciou-se a produção de quebras de fita simples e dupla de DNA pela biflorina nas concentrações de 2,5 e 5,0 μM. Já no teste do cometa modificado observou-se inibição da metilação em todas as concentrações testadas nas SK-Mel 19 e 28, o mesmo não ocorreu na SK-Mel 103. A biflorina também se mostrou capaz de diminuir a expressão de genes da metilação DNMT1, DNMT3A, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MeCP2, de progressão do ciclo celular MELK, replicação do DNA TYMS e reparo do DNA RAD e MGMT. Os resultados aqui apresentados apontam a biflorina como um importante agente citotóxico em linhagem de melanoma humano.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-12-15T16:02:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Erika Crispim Resende - 2013.pdf: 9225841 bytes, checksum: 704ac58eda3cb376fd2c234dcc302a24 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2014-12-15T16:31:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Erika Crispim Resende - 2013.pdf: 9225841 bytes, checksum: 704ac58eda3cb376fd2c234dcc302a24 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-15T16:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Tese - Erika Crispim Resende - 2013.pdf: 9225841 bytes, checksum: 704ac58eda3cb376fd2c234dcc302a24 (MD5) Previous issue date: 2013-06-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / O ácido ursólico (AU) é um composto triterpenoide pentacíclico que ocorre em grande variedade de plantas do Cerrado. Apresenta atividades anti-inflamatória, antioxidante, antitumoral e ação inibidora de enzimas responsáveis pelo envelhecimento cutâneo. Devido à sua reduzida hidrossolubilidade, a incorporação do AU em produtos de uso tópico representa um desafio farmacotécnico. Neste sentido, a produção de nanossistemas pode ser considerada uma alternativa promissora. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados contendo AU, investigar a atividade citotóxica, antioxidante, antidegradação da matriz celular, toxicidade, avaliar o efeito de permeação cutânea ex vivo e in vivo do AU e verificar a eficácia no tratamento de manchas cutâneas e prevenção de rugas. Inicialmente o AU foi submetido aos ensaios de citotoxicidade em células B16-F10 e Balb/c 3T3 por MTT e em Balb/c 3T3 pela captação do corante vermelho neutro. A morfologia das células B16-F10 tratadas com AU foi avaliada através de coloração de Giemsa. A atividade antioxidante celular (AAC) do AU foi realizada em células NIH-3T3 pelo método de diclorofluoresceína. A capacidade do AU em inibir enzimas (elastase, colagenase e tirosinase) foi avaliada por métodos espectrofotométricos. Os Lipossomas (LPs, obtidos pelo método de hidratação do filme lipídico), nanopartículas poliméricas (NPs, preparadas através da técnica de precipitação do polímero pré-formado) e as microemulsões (MEs, obtidas por emulsificação espontânea) foram caracterizados quanto à distribuição do tamanho, índice de polidispersão (PdI), pH, potencial zeta e teor do AU incorporado. Com a finalidade de veicular as MEs, uma emulsão (EM) foi formulada. O índice de refração (IR) foi determinado para os componentes das MEs e das EMs. A estabilidade física foi por observação visual e testes de centrifugação. Métodos cromatográficos com detector ultravioleta e de massas (CLAE-UV e CLAE-EM/EM) foram desenvolvidos e validados para quantificar o AU nas formulações e nos ensaios de permeação. Os testes pré-clínicos da EM com ME (AU 0,02%) e da ME (AU 0,2%) envolveram ensaios de contagem de micro-organismos totais, toxicidade oral aguda em ratos, irritação ocular e cutânea primária em coelhos, sensibilização cutânea em cobaias, toxicidade dermal aguda em ratos, mutagenicidade in vitro e micronúcleo em camundongos. Foram realizadas permeações cutâneas ex-vivo (utilizando células de Franz e pele de orelha de porco) e in vivo (pela técnica de tape stripping em antebraços de voluntários sadios). Nos estudos ex-vivo uma solução receptora de lauril sulfato de sódio a 2,5% (pH 7,4, 37°C a 300rpm) foi utilizada atendendo as condições sink. Após 24 horas, a solução receptora, o estrato córneo e a epiderme viável foram analisados quanto à presença do AU. A permeação in vivo teve a finalidade de obter informações sobre o tempo de exposição na pele de voluntários sadios à dose de AU presente nas formulações. O estudo clínico foi mono-cêntrico, aberto, prospectivo com dois tratamentos em um período utilizando-se quatro voluntários masculinos sadios (18–28 anos). Os parâmetros dermofarmacocinéticos da área sob a curva do perfil de penetração de AU ao longo das fitas (ASC0-t) e do tempo necessário para que o AU atingisse a metade do efeito máximo predito ET50 foram avaliados. A integridade cutânea dos voluntários foi monitorada pela perda de água transepidermal. As formulações (60mg) foram aplicadas em 5 sítios (2,0 cm2) em cada antebraço ficando em contato com a pele por 30 minutos, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h (sítios 1 ao 5, respectivamente). Decorrido o tempo de cada sítio, a técnica de tape stripping foi realizada e o AU quantificado. 32 mulheres (35-63 anos) foram instruídas a utilizar a ME contendo AU por 30 dias em um estudo de eficácia clínica dermatológica de aceitabilidade cutânea e de apreciabilidade cosmética. Após o tratamento, as voluntárias fizeram avaliação clínica final para comparação do aspecto do rosto (D30) com o início do tratamento (D0). A eficácia clínica foi analisada quanto à uniformidade do tom da pele, manchas, linhas de expressão e rugas. Já a apreciabilidade cosmética foi feita por meio de um questionário. Os resultados dos ensaios da concentração inibitória CI50 de AU para B16-F10 foi de 15,70μM e de 22,09 μM para 3T3. A CI50 de AU em células de melanoma confirmou a capacidade antitumoral do AU. Ocorreram alterações na morfologia das células B16-F10 quando tratadas com AU próximo ao valor da CI50 sugerindo apoptose. O AU exibiu atividade antioxidante celular inibindo cerca de 65% a oxidação da quercetina, mas não foi possível observar esta atividade quando o AU foi submetido a ensaios in vitro com reações radicalares (DPPH•). Nos ensaios enzimáticos, o AU inibiu ±25% da colagenase, ±22% da tirosinase e ±11% da elastase. O método CLAE-EM/EM foi validado sendo linear com R>0,99. Apresentou precisão e exatidão com desvio padrão relativo (DPR%) abaixo de 10% e recuperação variando de 93,3 a 103,4%. Os LPs e as NPs apresentaram instabilidade com vazamento de AU e baixa encapsulação. As MEs apresentaram pH dentro da faixa aceitável para aplicação tópica e maior incorporação de AU do que os sistemas de LPs e NPs. A ME incorporada à emulsão apresentou estabilidade a temperatura ambiente. A ME e a emulsão contendo AU demonstraram perfis reológicos semelhantes evidenciando ausência de propriedade tixotrópica. Os IRs variaram de 1,3388 para emulsão sem ME a 1,4700 para os tensoativos. As MEs apresentaram valores intermediários de IR concluindo eram do tipo água em óleo (A/O). Não foi observada degradação do AU analisado por CLAE-EM/EM mesmo após um ano de preparação da ME e na emulsão contendo ME. Ensaios pré-clínicos de toxicidade demonstraram que a EM contendo 10% de ME (0,02% de AU) e a microemulsão (0,2% de AU) não apresentaram toxicidade oral, não foram irritantes para os olhos nem para a pele e não foram mutagênicas. Nos estudos de permeação ex-vivo, cerca de 1,5 vezes mais AU permeou a pele quando incorporado na ME, já na emulsão contendo AU disperso (não microencapsulado), o AU ficou mais retido no estrato córneo, cerca de 5,3 vezes mais que ao valor encontrado na epiderme. Na ME, a concentração do AU na epiderme viável foi aproximadamente 7 vezes maior quando comparado ao AU livre (emulsão). Na ME veiculada na emulsão cerca de 7% de AU foi quantificado no estrato córneo e cerca de 32% foi encontrado na epiderme viável. Nos estudos de permeação in vivo, não foi verificada nenhuma ocorrência de reação adversa. A metade do efeito máximo predito (ET50) para a formulação de emulsão contendo AU disperso foi alcançada em aproximadamente 49 minutos após a aplicação do produto na pele, já a formulação de emulsão contendo microemulsão demonstrou um perfil de duração da dose do AU independentemente do tempo de exposição sendo que o efeito máximo predito para a absorção permaneceu constante ao longo do tempo. A avaliação clínica após tratamento com a ME mostrou eficácia de 3% em relação à uniformidade do tom da pele, 16% de eficácia em relação às manchas, 66% em relação às linhas de expressão e 59% de eficácia contra as rugas. Já a avaliação da opinião das voluntárias, 44% perceberam melhora na sensação de pele mais jovem, 41% perceberam melhora na sensação de pele mais bela e 61% referiram gostar do produto. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a microemulsão contendo AU é uma forte candidata a agente terapêutico tópico podendo veicular o AU para camadas mais profundas da pele. Além disto, foi verificado que o AU é capaz de prevenir o aparecimento de rugas, inibir a ação de enzimas que degradam as proteínas estruturais da pele, agir contra células de melanoma e como antioxidante. / O ácido ursólico (AU) é um composto triterpenoide pentacíclico que ocorre em grande variedade de plantas do Cerrado. Apresenta atividades anti-inflamatória, antioxidante, antitumoral e ação inibidora de enzimas responsáveis pelo envelhecimento cutâneo. Devido à sua reduzida hidrossolubilidade, a incorporação do AU em produtos de uso tópico representa um desafio farmacotécnico. Neste sentido, a produção de nanossistemas pode ser considerada uma alternativa promissora. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados contendo AU, investigar a atividade citotóxica, antioxidante, antidegradação da matriz celular, toxicidade, avaliar o efeito de permeação cutânea ex vivo e in vivo do AU e verificar a eficácia no tratamento de manchas cutâneas e prevenção de rugas. Inicialmente o AU foi submetido aos ensaios de citotoxicidade em células B16-F10 e Balb/c 3T3 por MTT e em Balb/c 3T3 pela captação do corante vermelho neutro. A morfologia das células B16-F10 tratadas com AU foi avaliada através de coloração de Giemsa. A atividade antioxidante celular (AAC) do AU foi realizada em células NIH-3T3 pelo método de diclorofluoresceína. A capacidade do AU em inibir enzimas (elastase, colagenase e tirosinase) foi avaliada por métodos espectrofotométricos. Os Lipossomas (LPs, obtidos pelo método de hidratação do filme lipídico), nanopartículas poliméricas (NPs, preparadas através da técnica de precipitação do polímero pré-formado) e as microemulsões (MEs, obtidas por emulsificação espontânea) foram caracterizados quanto à distribuição do tamanho, índice de polidispersão (PdI), pH, potencial zeta e teor do AU incorporado. Com a finalidade de veicular as MEs, uma emulsão (EM) foi formulada. O índice de refração (IR) foi determinado para os componentes das MEs e das EMs. A estabilidade física foi por observação visual e testes de centrifugação. Métodos cromatográficos com detector ultravioleta e de massas (CLAE-UV e CLAE-EM/EM) foram desenvolvidos e validados para quantificar o AU nas formulações e nos ensaios de permeação. Os testes pré-clínicos da EM com ME (AU 0,02%) e da ME (AU 0,2%) envolveram ensaios de contagem de micro-organismos totais, toxicidade oral aguda em ratos, irritação ocular e cutânea primária em coelhos, sensibilização cutânea em cobaias, toxicidade dermal aguda em ratos, mutagenicidade in vitro e micronúcleo em camundongos. Foram realizadas permeações cutâneas ex-vivo (utilizando células de Franz e pele de orelha de porco) e in vivo (pela técnica de tape stripping em antebraços de voluntários sadios). Nos estudos ex-vivo uma solução receptora de lauril sulfato de sódio a 2,5% (pH 7,4, 37°C a 300rpm) foi utilizada atendendo as condições sink. Após 24 horas, a solução receptora, o estrato córneo e a epiderme viável foram analisados quanto à presença do AU. A permeação in vivo teve a finalidade de obter informações sobre o tempo de exposição na pele de voluntários sadios à dose de AU presente nas formulações. O estudo clínico foi mono-cêntrico, aberto, prospectivo com dois tratamentos em um período utilizando-se quatro voluntários masculinos sadios (18–28 anos). Os parâmetros dermofarmacocinéticos da área sob a curva do perfil de penetração de AU ao longo das fitas (ASC0-t) e do tempo necessário para que o AU atingisse a metade do efeito máximo predito ET50 foram avaliados. A integridade cutânea dos voluntários foi monitorada pela perda de água transepidermal. As formulações (60mg) foram aplicadas em 5 sítios (2,0 cm2) em cada antebraço ficando em contato com a pele por 30 minutos, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h (sítios 1 ao 5, respectivamente). Decorrido o tempo de cada sítio, a técnica de tape stripping foi realizada e o AU quantificado. 32 mulheres (35-63 anos) foram instruídas a utilizar a ME contendo AU por 30 dias em um estudo de eficácia clínica dermatológica de aceitabilidade cutânea e de apreciabilidade cosmética. Após o tratamento, as voluntárias fizeram avaliação clínica final para comparação do aspecto do rosto (D30) com o início do tratamento (D0). A eficácia clínica foi analisada quanto à uniformidade do tom da pele, manchas, linhas de expressão e rugas. Já a apreciabilidade cosmética foi feita por meio de um questionário. Os resultados dos ensaios da concentração inibitória CI50 de AU para B16-F10 foi de 15,70μM e de 22,09 μM para 3T3. A CI50 de AU em células de melanoma confirmou a capacidade antitumoral do AU. Ocorreram alterações na morfologia das células B16-F10 quando tratadas com AU próximo ao valor da CI50 sugerindo apoptose. O AU exibiu atividade antioxidante celular inibindo cerca de 65% a oxidação da quercetina, mas não foi possível observar esta atividade quando o AU foi submetido a ensaios in vitro com reações radicalares (DPPH•). Nos ensaios enzimáticos, o AU inibiu ±25% da colagenase, ±22% da tirosinase e ±11% da elastase. O método CLAE-EM/EM foi validado sendo linear com R>0,99. Apresentou precisão e exatidão com desvio padrão relativo (DPR%) abaixo de 10% e recuperação variando de 93,3 a 103,4%. Os LPs e as NPs apresentaram instabilidade com vazamento de AU e baixa encapsulação. As MEs apresentaram pH dentro da faixa aceitável para aplicação tópica e maior incorporação de AU do que os sistemas de LPs e NPs. A ME incorporada à emulsão apresentou estabilidade a temperatura ambiente. A ME e a emulsão contendo AU demonstraram perfis reológicos semelhantes evidenciando ausência de propriedade tixotrópica. Os IRs variaram de 1,3388 para emulsão sem ME a 1,4700 para os tensoativos. As MEs apresentaram valores intermediários de IR concluindo eram do tipo água em óleo (A/O). Não foi observada degradação do AU analisado por CLAE-EM/EM mesmo após um ano de preparação da ME e na emulsão contendo ME. Ensaios pré-clínicos de toxicidade demonstraram que a EM contendo 10% de ME (0,02% de AU) e a microemulsão (0,2% de AU) não apresentaram toxicidade oral, não foram irritantes para os olhos nem para a pele e não foram mutagênicas. Nos estudos de permeação ex-vivo, cerca de 1,5 vezes mais AU permeou a pele quando incorporado na ME, já na emulsão contendo AU disperso (não microencapsulado), o AU ficou mais retido no estrato córneo, cerca de 5,3 vezes mais que ao valor encontrado na epiderme. Na ME, a concentração do AU na epiderme viável foi aproximadamente 7 vezes maior quando comparado ao AU livre (emulsão). Na ME veiculada na emulsão cerca de 7% de AU foi quantificado no estrato córneo e cerca de 32% foi encontrado na epiderme viável. Nos estudos de permeação in vivo, não foi verificada nenhuma ocorrência de reação adversa. A metade do efeito máximo predito (ET50) para a formulação de emulsão contendo AU disperso foi alcançada em aproximadamente 49 minutos após a aplicação do produto na pele, já a formulação de emulsão contendo microemulsão demonstrou um perfil de duração da dose do AU independentemente do tempo de exposição sendo que o efeito máximo predito para a absorção permaneceu constante ao longo do tempo. A avaliação clínica após tratamento com a ME mostrou eficácia de 3% em relação à uniformidade do tom da pele, 16% de eficácia em relação às manchas, 66% em relação às linhas de expressão e 59% de eficácia contra as rugas. Já a avaliação da opinião das voluntárias, 44% perceberam melhora na sensação de pele mais jovem, 41% perceberam melhora na sensação de pele mais bela e 61% referiram gostar do produto. Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que a microemulsão contendo AU é uma forte candidata a agente terapêutico tópico podendo veicular o AU para camadas mais profundas da pele. Além disto, foi verificado que o AU é capaz de prevenir o aparecimento de rugas, inibir a ação de enzimas que degradam as proteínas estruturais da pele, agir contra células de melanoma e como antioxidante.