Orientador: Tomomassa Yano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas,. Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T11:00:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thome_JacquelineDarcSilva_M.pdf: 1223668 bytes, checksum: 17699f260f82fb8a09136004fcc1e28a (MD5) Previous issue date: 2006 / Mestrado / Microbiologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Química área de Especialización en Química Medicinal y Memoria para optar al Título de Química Farmacéutica / El presente trabajo de investigación informa sobre la preparación de dos familias de compuestos: cationes lipofílicos derivados del ácido cafeico y bromoésteres derivados de ácido cafeico como compuestos citotóxicos mitocondriotrópicos selectivos para células tumorales. Para el diseño de las moléculas, se consideró: (1) Largo de cadena entre los componentes farmacofóricos. (2) Presencia o ausencia de carga que permita o no dirigirlas hacia la mitocondria (3) Incorporación de grupos funcionales con capacidad antioxidante Las moléculas fueron ensayadas en las líneas celulares: HCT-116, H1975, HeLa, MCF-7, HL60 y Vero, con MTT y Rojo Neutro, dando como resultado mayor citotoxicidad para los cationes lipofílicos fosforados, mejores resultados para ésteres bromados y cationes fosforados con cadena de 10 carbonos y mayor selectividad para HeLa con 9-P / This research work provides information on the preparation of families of compounds: lipophilic cations derived from caffeic acid and bromoesters derived from caffeic acid as selective cytotoxic mitochondrotropic compounds for tumor cells. For the design of the molecules, it was considered: (1) Chain length between the pharmacophoric moieties. (2) Presence or absence of charge that allows or does not direct them towards the mitochondria (3) Presence of antioxidant groups The molecules were tested in the cell lines: HCT-116, H1975, HeLa, MCF-7, HL60 and Vero, with MTT and Neutral Red, resulting in greater cytotoxicity for the phosphorus lipophilic cations, better results for brominated esters and phosphorus cations with chain of 10 carbons and greater selectivity for HeLa with 9-P / Conicyt; Fondecyt

Infecções causadas por STEC constituem problema de saúde pública, pois estão associadas à síndrome hemolítica urêmica e colite hemorrágica. A detecção de isolados STEC depende de um ensaio diagnóstico sensível, específico e de baixo custo. Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de um ELISA de captura utilizando anticorpos policlonais e monoclonais. Primeiramente definiu-se um meio de cultivo para maior expressão de Stx e produziu-se anticorpos monoclonais anti-Stx1 e anti-Stx2. Os resultados mostraram que o cultivo de isolados por 4h em caldo EC com ciprofloxacina induziu maior produção de Stx no sobrenadante bacteriano, e o anticorpo monoclonal anti-Stx1 produzido reconheceu a subunidade A de ambas as toxinas, além de apresentar maior constante de afinidade que o anti-Stx2. Desta forma, o ELISA de captura foi padronizado com 250 mg/ml da fração IgG do soro policlonal anti-Stx1 e anti-Stx2 na sensibilização e 2,5 mg/ml de anticorpo monoclonal anti-Stx1 na captura da toxina, apresentando 80,7% de sensibilidade e 100% de especificidade. / STEC infection is a public health problem, causing hemolytic-uremic syndrome and haemorrhagic colitis. The detection of STEC isolates depends on a sensitive, specific and low cost diagnostic method. Thus, the aim of this study was to develop a capture ELISA using polyclonal and monoclonal antibodies. For this purpose, first of all a growth media that induce better expression and production of Stx was defined and monoclonals anti-Stx1 e anti-Stx2 antibodies were produced. The results show that the growth of the isolates for 4hs in EC broth with ciprofloxacin increased the production of Stx in the bacterial supernantant, and the monoclonal anti-Stx1antibody produced was able to recognize the A subunit of both toxins, besides showing higher affinity constant than anti-Stx2. Thus, the capture ELISA was standardized using 250 mg/ml of the IgG enriched fraction of rabbit anti-Stx1 sera and anti-Stx2 for coating and 2,5 mg/ml of monoclonal anti-Stx1 antibody for the capture of the toxin, showing 80,7% of sensibility and e 100% de specificity.

Made available in DSpace on 2015-05-22T18:39:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 207.pdf: 6020624 bytes, checksum: f6db5979961b8cf83ff182a31ae3f66f (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é considerada um problema de saúde pública. A quimioterapia usada causa efeitos colaterias graves e sua utilização na fase crônica ainda é controversa. Neste sentido, a investigação de novas estratégias terapêuticas continua a ser uma prioridade. Os óleos essenciais (OEs) de plantas aparecem como fonte promissora de compostos bioativos. Neste trabalho investigamos as atividades tripanocida e citotóxica de OEs de Lippia sidoides (LS), Lippia origanoides (LO), Chenopodium ambrosioides (CA), Justicia pectoralis (JP), Ocimum gratissimum e Vitex agnus-castus (VAC). A caracterização química dos Oes, através da espectometria de massa, mostrou que o timol e carvacrol foram os principais componentes do LS e LO, enquanto que, o eugenol e 1,8-cineol foram os principais compostos de OG e VAC. Terpinoleno foi o principal constituinte de JP e CA. Todos os OEs foram ativos apresentando baixa toxicidade em macrófagos e alta seletividade para os parasitas. OEs de LS, LO, CA e OG foram os mais eficazes contra tripomastigota e inibiram eficientemente a sobrevivência de amastigotas no interior dos macrófagos. Nenhum destes OEs foi capaz de induzir alterações na produção de óxido nítrico. O tratamento com os OEs de LS, LO, OG e CA induziu alterações morfológicas compatíveis com a perda de viabilidade e morte celular. LS e LO causaram perda de viabilidade celular e da integridade da membrana, demonstrado pela redução da marcação com calceína e o aumento na proporção de células HE-positivas. Uma diminuição considerável na Rodamina 123 e aumento na intensidade de fluorescência do MitoSox foram indicativos de perda do potencial mitocondrial e geração de espécies reativas de oxigênio, o que em última instância conduzem à morte do parasita. Em conjunto nossos resultados apontam os OEs de LS, LO, CA e OG agentes promissores contra doença de Chagas

Infecções causadas por STEC constituem problema de saúde pública, pois estão associadas à síndrome hemolítica urêmica e colite hemorrágica. A detecção de isolados STEC depende de um ensaio diagnóstico sensível, específico e de baixo custo. Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de um ELISA de captura utilizando anticorpos policlonais e monoclonais. Primeiramente definiu-se um meio de cultivo para maior expressão de Stx e produziu-se anticorpos monoclonais anti-Stx1 e anti-Stx2. Os resultados mostraram que o cultivo de isolados por 4h em caldo EC com ciprofloxacina induziu maior produção de Stx no sobrenadante bacteriano, e o anticorpo monoclonal anti-Stx1 produzido reconheceu a subunidade A de ambas as toxinas, além de apresentar maior constante de afinidade que o anti-Stx2. Desta forma, o ELISA de captura foi padronizado com 250 mg/ml da fração IgG do soro policlonal anti-Stx1 e anti-Stx2 na sensibilização e 2,5 mg/ml de anticorpo monoclonal anti-Stx1 na captura da toxina, apresentando 80,7% de sensibilidade e 100% de especificidade. / STEC infection is a public health problem, causing hemolytic-uremic syndrome and haemorrhagic colitis. The detection of STEC isolates depends on a sensitive, specific and low cost diagnostic method. Thus, the aim of this study was to develop a capture ELISA using polyclonal and monoclonal antibodies. For this purpose, first of all a growth media that induce better expression and production of Stx was defined and monoclonals anti-Stx1 e anti-Stx2 antibodies were produced. The results show that the growth of the isolates for 4hs in EC broth with ciprofloxacin increased the production of Stx in the bacterial supernantant, and the monoclonal anti-Stx1antibody produced was able to recognize the A subunit of both toxins, besides showing higher affinity constant than anti-Stx2. Thus, the capture ELISA was standardized using 250 mg/ml of the IgG enriched fraction of rabbit anti-Stx1 sera and anti-Stx2 for coating and 2,5 mg/ml of monoclonal anti-Stx1 antibody for the capture of the toxin, showing 80,7% of sensibility and e 100% de specificity.

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), destaca-se como um importante patógeno emergente causador de diarréia persistente em países em desenvolvimento e de diarréia aguda em países desenvolvidos. A grande heterogeneidade dos fatores de virulência caracteriza esta categoria, porém não foi estabelecido um marcador genético comum a todas as amostras de EAEC. O padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2 e HeLa é a forma de caracterização e diagnóstico mais precisos desta categoria. Uma das toxinas envolvidas na patogênese é Plasmid-encoded toxin (Pet) pertencente à classe das proteínas autotransportadoras com características de uma serino protease denominada SPATEs. Iniciou-se este estudo com a determinação do padrão de adesão de 164 amostras EAEC, previamente caracterizadas como sonda pCVD432 ou onda AA positiva. Assim, 141 (86%) amostras, que apresentaram padrão de adesão agregativo, foram caracterizadas como EAEC. Face aos resultados obtidos, confirmou-se a baixa especificidade da sonda AA. A pesquisa do gene pet, por meio de ensaio de PCR, resultou na positividade de 12 (8,5%) amostras. Prosseguiu-se esse estudo com a padronização da reação de immuno-dot. Utilizando-se 300 µL do sobrenadante bacteriano, soro policlonal anti-Pet e o conjugado nas diluições 1/50 e 1/2.500, respectivamente, resultados bastante reprodutíveis foram obtidos. O método foi mais sensível que a detecção do gene por PCR. Por esse ensaio, detectou-se a toxina Pet em 16 (11,3%) das 141 amostras EAEC. Nenhuma das amostras controle negativo foi reconhecida pelo soro anti-Pet, assim como as amostras de E. coli produtoras das mais diversas toxinas. Apesar da baixa prevalência de amostras de EAEC produtoras da toxina Pet, neste estudo padronizou-se um método rápido, sensível, específico e de baixo custo para pesquisa desta toxina mostrando o potencial diagnóstico deste ensaio para uso em inquéritos epidemiológicos, o que poderá permitir determinar o papel da Pet no desenvolvimento de diarréia aquosa. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC) is an emerging diarrheal pathogen, whose pathogenesis is thought to comprise colonization of the intestinal mucosa with the release of secretogenic toxins. One of the toxin involved is the plasmid-encoded toxin (Pet), which is secreted by the autotransporter mechanism and belongs to a growing class of Enterobacteriaceae autotransporter proteins. Since the characteristic aggregative adherence pattern of EAggEC is associated with the presence of a large plasmid called pCVD432, DNA probes and PCR primers derived from this plasmid have been recommended as a screening method for EAggEC in the clinicai laboratory. In this study 164 E. coli isolates positive for the pCVD432 probe were tested for adherence to HEp-2 cells in which 141 isolates showed aggregative pattern, 12 isolates from them amplify a 1037-bp DNA fragment corresponding to pet gene by PCR. Using this samples we standardized an immuno-dot assay for EAggEC detection through Pet toxin as target antigen. 300 µl of bacterial supernatant were applied in a PVDF membrane, and using a rabbit polyclonal sera anti-Pet the expression of the toxin by immuno-dot was in the same isolates in which the gene was detected. Besides no negative controls reacted with Pet antisera, in which we included 40 isolates with no virulence markers for diarrheagenic E. coli and E. coli expressing toxins other than Pet. This method proves to be rapid, sensitive, specific and low cost, demonstrating this potential as diagnosis for Pet expression and its association with diarrhea.

Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), destaca-se como um importante patógeno emergente causador de diarréia persistente em países em desenvolvimento e de diarréia aguda em países desenvolvidos. A grande heterogeneidade dos fatores de virulência caracteriza esta categoria, porém não foi estabelecido um marcador genético comum a todas as amostras de EAEC. O padrão de adesão agregativa (AA) em células HEp-2 e HeLa é a forma de caracterização e diagnóstico mais precisos desta categoria. Uma das toxinas envolvidas na patogênese é Plasmid-encoded toxin (Pet) pertencente à classe das proteínas autotransportadoras com características de uma serino protease denominada SPATEs. Iniciou-se este estudo com a determinação do padrão de adesão de 164 amostras EAEC, previamente caracterizadas como sonda pCVD432 ou onda AA positiva. Assim, 141 (86%) amostras, que apresentaram padrão de adesão agregativo, foram caracterizadas como EAEC. Face aos resultados obtidos, confirmou-se a baixa especificidade da sonda AA. A pesquisa do gene pet, por meio de ensaio de PCR, resultou na positividade de 12 (8,5%) amostras. Prosseguiu-se esse estudo com a padronização da reação de immuno-dot. Utilizando-se 300 µL do sobrenadante bacteriano, soro policlonal anti-Pet e o conjugado nas diluições 1/50 e 1/2.500, respectivamente, resultados bastante reprodutíveis foram obtidos. O método foi mais sensível que a detecção do gene por PCR. Por esse ensaio, detectou-se a toxina Pet em 16 (11,3%) das 141 amostras EAEC. Nenhuma das amostras controle negativo foi reconhecida pelo soro anti-Pet, assim como as amostras de E. coli produtoras das mais diversas toxinas. Apesar da baixa prevalência de amostras de EAEC produtoras da toxina Pet, neste estudo padronizou-se um método rápido, sensível, específico e de baixo custo para pesquisa desta toxina mostrando o potencial diagnóstico deste ensaio para uso em inquéritos epidemiológicos, o que poderá permitir determinar o papel da Pet no desenvolvimento de diarréia aquosa. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAggEC) is an emerging diarrheal pathogen, whose pathogenesis is thought to comprise colonization of the intestinal mucosa with the release of secretogenic toxins. One of the toxin involved is the plasmid-encoded toxin (Pet), which is secreted by the autotransporter mechanism and belongs to a growing class of Enterobacteriaceae autotransporter proteins. Since the characteristic aggregative adherence pattern of EAggEC is associated with the presence of a large plasmid called pCVD432, DNA probes and PCR primers derived from this plasmid have been recommended as a screening method for EAggEC in the clinicai laboratory. In this study 164 E. coli isolates positive for the pCVD432 probe were tested for adherence to HEp-2 cells in which 141 isolates showed aggregative pattern, 12 isolates from them amplify a 1037-bp DNA fragment corresponding to pet gene by PCR. Using this samples we standardized an immuno-dot assay for EAggEC detection through Pet toxin as target antigen. 300 µl of bacterial supernatant were applied in a PVDF membrane, and using a rabbit polyclonal sera anti-Pet the expression of the toxin by immuno-dot was in the same isolates in which the gene was detected. Besides no negative controls reacted with Pet antisera, in which we included 40 isolates with no virulence markers for diarrheagenic E. coli and E. coli expressing toxins other than Pet. This method proves to be rapid, sensitive, specific and low cost, demonstrating this potential as diagnosis for Pet expression and its association with diarrhea.

HP, uma bactéria gram-negativa envolvida na patogênese do tecido gastroduodenal, foi classificada como carcinogênico classe I em 1994. Seus mecanismos são pouco entendidos, mas a presença da ilha de patogenicidade (PAI) é fator importante de virulência. PAI sugere aumento da proliferação celular, diminuindo a apoptose. A detecção do HP e da PAI (cagA) foi feita por PCR. Casos positivos são associados aos resultados histopatológicos, proliferação celular e apoptose. Detectamos HP em 37,0% (111/300), sendo 40,5% (45/111) dos pacientes cagA+. A relação proliferação celular/apoptose (P/A) mostra aumento em pacientes infectados por HP/cagA até 8,8 vezes maior no surgimento de doença gástrica grave / HP, a gram-negative bacterium involved in pathogenesis of gastroduodenal tissues, was classified as type I carcinogen in 1994. The mechanisms involved in carcinogenesis point to the pathogenicity island (PAI) as an important virulent factor. PAI suggests an increase in cell proliferation, attenuating apoptosis. HP detection and PAI were performed by using PCR. Positive results were associated to the histological findings, cell proliferation and apoptosis. We detected HP in 37,0% (111/300) and 40,5% (45/111) of the patients. A significant increase index appears between proliferation and apoptosis in those infected by HP/cagA+ with higher risk of 8,8 for the development of gastric cancer

HP, uma bactéria gram-negativa envolvida na patogênese do tecido gastroduodenal, foi classificada como carcinogênico classe I em 1994. Seus mecanismos são pouco entendidos, mas a presença da ilha de patogenicidade (PAI) é fator importante de virulência. PAI sugere aumento da proliferação celular, diminuindo a apoptose. A detecção do HP e da PAI (cagA) foi feita por PCR. Casos positivos são associados aos resultados histopatológicos, proliferação celular e apoptose. Detectamos HP em 37,0% (111/300), sendo 40,5% (45/111) dos pacientes cagA+. A relação proliferação celular/apoptose (P/A) mostra aumento em pacientes infectados por HP/cagA até 8,8 vezes maior no surgimento de doença gástrica grave / HP, a gram-negative bacterium involved in pathogenesis of gastroduodenal tissues, was classified as type I carcinogen in 1994. The mechanisms involved in carcinogenesis point to the pathogenicity island (PAI) as an important virulent factor. PAI suggests an increase in cell proliferation, attenuating apoptosis. HP detection and PAI were performed by using PCR. Positive results were associated to the histological findings, cell proliferation and apoptosis. We detected HP in 37,0% (111/300) and 40,5% (45/111) of the patients. A significant increase index appears between proliferation and apoptosis in those infected by HP/cagA+ with higher risk of 8,8 for the development of gastric cancer