Xylella fastidiosa é uma bactéria com alta diversidade genética, sendo responsável por várias doenças, com destaque para a clorose variegada dos citros (CVC) e Pierce\'s disease (PD) em videira. O sucesso da transmissão dessa bactéria depende da colonização em biofilme no xilema da planta e no estomodeu de vetores, que são cigarrinhas (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). O conhecimento sobre o mecanismo de transmissão desta bactéria vem de estudos com a subespécie fastidiosa de videira. Com relação à CVC, que tem a subespécie pauca como agente causal, observa-se eficiência de transmissão mais baixa que em videira, indicando que os mecanismos envolvidos no processo de transmissão podem variar entre subespécies da bactéria. Neste sentido, os objetivos desse trabalho foram: i) adaptar e validar um sistema de alimentação em dieta artificial para a aquisição e transmissão de estirpes de X. fastidiosa subsp. pauca por cigarrinhas; ii) aplicar a técnica estabelecida para investigar a eficiência de transmissão variando-se os sequence types (STs) de X. fastidiosa subsp. pauca e as espécies de cigarrinhas e iii) avaliar a importância da adesina XadA2 para a formação de biofilme por X. fastidiosa em superfície de polissacarídeos, bem como na aquisição e transmissão dessa bactéria pelos insetos. Verificou-se que o protocolo de aquisição usado para a entrega de células bacterianas da estirpe Temecula (subsp. fastidiosa) é transferível para estirpes da subsp. pauca. No entanto, diferentemente de fastidiosa, as estirpes de pauca testadas não necessitam interagir com o monômero de pectina (ácido galacturônico) para serem transmitidas para plantas. Com o sistema de aquisição in vitro, observou-se que todas as combinações STs de pauca e espécies de cigarrinhas resultaram na transmissão para plantas, indicando a ausência de especificidade de vetores. Todavia observaram-se diferenças nas taxas de aquisição e transmissão, que podem estar relacionadas com a interação inseto-ST. Em ensaios utilizando X. fastidiosa modificada com green fluorescent protein, incubada em meio de cultivo sem fonte de carbono e contendo asas como única fonte de carboidratos, verificou-se que a bactéria utiliza a quitina das asas para garantir a sobrevivência da colônia. Por meio de ensaios de bloqueio em asas, utilizando a adesina XadA2 e seu anticorpo específico como moléculas competidoras, foi possível observar que quando a adesina é bloqueada, há a redução significativa da formação de biofilme nas asas. Utilizando-se o sistema in vitro para a entrega de células de X. fastidiosa e do anticorpo para as cigarrinhas, observou-se diminuição da taxa de insetos infectivos, porém não houve diferença estatística nas taxas de transmissão. Esses resultados mostram que a adesina XadA2 é importante no início da colonização bacteriana no inseto e, juntamente com o método de aquisição in vitro adaptado nesse trabalho, estabelecem bases para estudos com outras estirpes ou subespécies de X. fastidiosa, e avaliação de outras proteínas-alvo visando o bloqueio da interação bactéria-vetor e, possivelmente, o controle das doenças. / Xylella fastidiosa is a bacterium with high genetic diversity, being responsible for several diseases, with emphasis on citrus variegated chlorosis (CVC) and Pierce\'s disease (PD) on grapevines. The success of the transmission of this bacterium depends on the biofilm colonization in the plant xylem and in the foregut of vectors, the sharpshooters (Hemiptera: Cicadellidae: Cicadellinae). The knowledge about the transmission mechanism of this bacterium comes from studies with the fastidiosa subspecies of grapevine. With regard to CVC, which has the subspecies pauca as causal agent, transmission efficiency is lower than in vine, indicating that the mechanisms involved in the transmission process may vary between subspecies of the bacterium. In this sense, the objectives of this work were: i) to adapt and validate an artificial diet feeding system for the acquisition and transmission of strains of X. fastidiosa subsp. pauca by sharpshooters; ii) apply the established technique to investigate the efficiency of transmission by varying the sequence types (STs) of X. fastidiosa subsp. pauca and sharpshooters and iii) to evaluate the importance of XadA2 adhesin for X. fastidiosa biofilm formation on the surface of polysaccharides, as well as on the acquisition and transmission of this bacterium by the insects. The acquisition protocol used for the delivery of Temecula strain bacterial cells (subspecies fastidiosa) was transferable to strains of the subspecies pauca. However, unlike fastidiosa, the tested pauca strains do not need to interact with the pectin monomer (galacturonic acid) to be transmitted to plants. With the in vitro acquisition system, it was observed that all STs pauca and sharpshooter species combinations resulted in the transmission to plants, indicating the absence of vector specificity. However, there were differences in acquisition and transmission rates, which may be related to the insect-ST interaction. In tests using X. fastidiosa modified with green fluorescent protein, incubated in culture medium without carbon source and containing wings as only source of carbohydrates, it was verified that the bacterium uses the chitin of the wings to guarantee the survival of the colony. With wing-blocking assays, using XadA2 adhesin and its specific antibody as competing molecules, it was possible to observe that when adhesin is blocked, there is a significant reduction of biofilm formation in the wings. Using the in vitro system for the delivery of X. fastidiosa cells and the antibody to the sharpshooters, a decrease in the rate of infective insects was observed, but there was no statistical difference in the rates of transmission. These results show that XadA2 adhesin is important at the beginning of bacterial colonization in the insect and, together with the in vitro acquisition method adapted in this work, establishes bases for studies with other strains or subspecies of X. fastidiosa, and evaluation of other target proteins to block bacterial-vector interaction and, possibly, to control of the diseases.

Acredita-se que o Brasil é o centro de diversidade de vírus transmitidos por ácaros do gênero Brevipalpus (VTB). Alguns desses VTB infectam culturas fundamentais para o agronegócio brasileiro como citros e café, além de maracujá e de várias plantas ornamentais. Na última década os genomas de dois deles, Citrus leprosis virus C (CiLV-C) e Coffee ringspot virus (CoRSV) foram sequenciados, mas ainda é escasso o conhecimento sobre a diversidade genética e processos evolutivos envolvidos na população dessas espécies. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar molecularmente novas estirpes de CiLV-C e CoRSV que infectam citros e café, respectivamente. E revelar as relações filogenéticas com espécies de VTB conhecidas, assim como avaliar a variabilidade genética da população de CiLVC no Brasil. Para o estudo de CiLV-C, 47 amostras de Citrus sinensis apresentando sintomas típicos da leprose dos citros foram coletadas em diferentes regiões do Brasil no período de 2011-2015. A presença de CiLV-C foi detectada por RT-PCR em todas as amostras coletadas e, posteriormente, foi realizado o sequenciamento de quatro regiões do genoma viral (p29, p15, RI e MP) de cada isolado. As sequências obtidas foram utilizadas no estudo de filogenia e variabilidade da população de CiLV-C no Brasil. Foi demonstrado que a população de CiLV-C apresenta uma variabilidade relativamente baixa; entretanto, foi identificada a existência de duas linhagens dentro da espécie, nomeadas Cor e SJRP. Os genomas completos de CiLV-C SJRP e também do dicorhavirus tentativo CoRSV identificado em Limeira, SP, foram obtidos mediante o sequenciamento de RNA de pequeno tamanho (siRNA). Cada sequência foi validada mediante o sequenciamento de fragmentos gerados por RT-PCR ao longo do genoma. CiLV-C SJRP apresenta cerca de 85% de identidade de nucleotídeo com o membro-tipo do gênero Cilevirus e exibe evidências de recombinação com isolados da linhagem Cor, a prevalente no território brasileiro. Globalmente, o genoma de CoRSV Limeira apresenta mais de 90% de identidade de nucleotídeo com isolado CoRSV Lavras, o que indica que ambos os isolados são membros da mesma espécie tentativa de dichorhavirus. / South America is most likely the center of diversity of Brevipalpus transmitted viruses (BTV). Some of these BTV infect major crops of the Brazilian agribusiness such as citrus and coffee. Passion fruit and several other ornamental plants are affected as well. The genome of two of these viruses, Citrus leprosis virus C (CiLV-C) and Coffee ringspot virus (CoRSV) were sequenced, but the knowledge about several molecular characteristics and processes involved in the evolution of their populations are still scarce. Thus, the objective of this study was to molecularly characterize new isolates of BTV infecting citrus and coffee, reveal the phylogenetic relationships with known species of BTV, and assess the genetic variability of the population of CiLV-C in Brazil. For CiLV-C studies, 47 samples of Citrus sinensis showing typical symptoms of leprosis were collected in different Brazilian regions during 2011-2015. The presence of CiLV-C was detected by RT-PCR in all the collected samples and four regions of the viral genome (p29, p15, IR and MP) of each isample were sequenced. It has been shown that the CiLV-C population has relatively low variability; although the existence of two lineages named Cor and SJRP were identified in this work. The complete genomes of one isolate of the lineage SJRP (CiLV-C SJRP) and that of the tentative dicorhavirus CoRSV found in Limeira, SP, were obtained by small RNA (siRNA) Sequencing. Validation was performed by sequencing fragments generated by RT-PCR using specific primers throughout the genome. CiLV-C SJRP has about 85% nucleotide identity with the genome of the type-member of the Cilevirus genus and shows evidence of recombination with isolates of the lineage Cor, which are prevalent in Brazil. CoRSV isolate Limeira has more than 90% of nucleotide identity with CoRSV Lavras, indicating that both isolates are members of the same tentative species of dichorhavirus.

A doença Huanglongbing (HLB) associada a bactéria Candidatus Liberibacter spp., que coloniza os vasos do floema, é considerada uma das mais graves doenças de citros. Uma importante estratégia para o controle desta doença consiste na produção de plantas transgênicas, expressando genes que codificam peptídeos antibacterianos especificamente no local de colonização do patógeno. O objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de laranja doce, expressando o gene que codifica o peptídeo antibacteriano atacina A (attA) dirigido por promotores específicos para a expressão gênica no floema. O trabalho foi iniciado com a elaboração de construções gênicas contendo o gene attA (associado ou não ao peptídeo sinal), sob o controle dos promotores AtSuc2 (transportador de sacarose), AtPP2 (proteína de floema 2), clonados de Arabidopsis thaliana, ou CsPP2 (proteína de floema 2), clonado de Citrus sinensis. Os experimentos de transformação genética foram realizados com C. sinensis cv. \'Hamlin\', \'Valência\', \'Pêra\' e \'Natal\', via Agrobacterium tumefaciens, utilizando-se segmento de epicótilo como explante. A identificação de plantas transgênicas foi realizada por meio da análise de PCR. Plantas PCR+ foram aclimatizadas e transferidas para casa-de-vegetação específica para o cultivo de plantas transgênicas. Análises de Southern e Northern blot foram realizadas em plantas aclimatizadas, confirmando-se a integração e transcrição do gene attA, respectivamente. A expressão do gene attA também foi confirmada pela análise de RT-qPCR. Plantas de laranja \'Hamlin\' contendo o gene attA (associado ou não ao peptídeo sinal), sob o controle dos promotores AtSuc2 ou AtPP2 foram propagadas por enxertia, para futura avaliação da resistência a Candidatus Liberibacter asiaticus / Huanglongbing (HLB) associated to Candidatus Liberibacter spp., which colonizes the phloem, is considered one of the most serious diseases of citrus. One important strategy to control this disease consists of producing transgenic plants expressing, in the bacteria colonization tissue, genes encoding antibacterial peptides. The objective of this work was to produce transgenic sweet orange plants expressing genes encoding the antibacterial peptide attacin A (attA) driven by phoem-specific promoters. The work started with the development of the gene constructs, containing the attacin A gene (with or without signal peptide) controlled by either sucrose transporter gene (AtSuc2) or phloem protein 2 gene promoters (AtPP2) from Arabidopsis thaliana, or phloem protein 2 gene promotor (CsPP2) from Citrus sinensis. The genetic transformation of C. sinensis \'Hamlin\', \'Valencia\', \'Pera\' and \'Natal\' cultivars was done via Agrobacterium tumefaciens. Epicotyls segments collected from in vitro germinated seedlings were used as explants. Transgenic plants were identified by PCR analyses. PCR positive plants were acclimatized and transferred to specific greenhouse. Integration and transcription of the attA gene was confirmed in acclimatized transgenic plants by Southern and Northern blot analysis, respectively. The attA gene expression was validated by RT-qPCR analysis. \'Hamlin\' transgenic cultivars containing the AtSuc2 or AtPP2 promoters controlling the expression of attA (with or without signal peptide) were propagated by grafting, for future evaluation of Candidatus Liberibacter asiaticus resistance

Xylella fastidiosa (Xf) é o agente causal de doenças em várias culturas economicamente importantes. Recentemente foi identificada como sendo o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), doença que representa um grande problema para os citricultores paulistas, pois vem causando perdas econômicas significativas. Trata-se de uma bactéria gram-negativa, fastidiosa e restrita ao xilema das plantas hospedeiras. Um fato observado na interação Xf - citros, é que plantas infectadas por Xf podem demonstrar sintomas da doença um longo tempo após a infecção. Isto faz supor que a expressão de fatores de patogenicidade e/ou virulência ocorre somente após a população de Xf na planta atingir altas densidades celulares. Como fatores de patogenicidade/virulência de algumas bactérias são regulados por sensores de quorum, seria interessante determinar se esse mecanismo de regulação gênica ocorre em Xf, e quais genes bacterianos são regulados por densidade celular. O objetivo deste trabalho foi verificar se genes de patogenicidade putativos de Xf são modulados pela densidade celular em meio de cultura. Para tal, Xf foi cultivada em PW líquido, células no início da fase exponencial (baixa densidade celular) e na fase estacionária (alta densidade celular) foram coletadas, e RNA total foi extraído. Fragmentos de 20 genes de Xf relacionados à patogenicidade putativos foram transferidos em arranjos ordenados para membranas de náilon, e hibridizados, sob condições de alta estringência, com sondas complexas de primeiras fitas de cDNA marcadas com fosfatase alcalina. A detecção foi feita por quimioluminescência. Sob as condições experimentais utilizadas, os genes fur (XF-2344), gumC (XF-2369), protease-serina (XF-1851) e rsmA (XF-0125) tiveram sua expressão significativamente suprimida sob condições de alta densidade celular (p < 0,05). Já a expressão de rpfF (XF-1115) foi induzida significativamente (p < 0,06) sob condições de alta densidade celular. Os genes gumD (XF-2367), gumJ (XF-2362) e rpfA (XF-0290) tiveram a expressão detectada somente sob condições de alta densidade celular, enquanto a expressão de rpfB (XF-0287) foi detectada somente sob condições de baixa densidade celular. A expressão de celulase (XF0818), mdoH (XF-1623), pluxR (XF-0972), protease-RE (XF-1823), rpoN (XF-1408), xpsK (XF-1523) e xpsL (XF-1524) não foi afetada significativamente pela densidade populacional em meio PW, enquanto a expressão dos genes luxR/UHPA (XF-2608), poligalacturonase (XF-2466), rpfC (XF-1114) e rsmB (XF-0928) não foi detectada em ambas as condições. Usando RT-PCR, os transcritos de todos os genes, exceto gumC, foram detectados sob condições de baixa e alta densidade celular, indicando que a expressão de alguns genes relacionados à patogenicidade putativos em meio de cultura é muito baixa. Os resultados obtidos sugerem que os EPS são sintetizados por Xf predominantemente em condições de alta densidade celular em meio PW. Adicionalmente, os dados sugerem que Xf sintetiza uma molécula sinal similar à de Xcc em meio PW sob condições de alta densidade celular, e que a disponibilidade de ferro pode ser importante para a regulação gênica em condições de alta densidade celular. É possível que o padrão de expressão gênica observado possa ser alterado em função do meio de cultivo ou in planta. / Xylella fastidiosa (Xf) is the causal agent of several economically important plant diseases. Recently, Xf has been identified as the causal agent of citrus variegated chlorosis (CVC), a disease that represents a major economic problem for citrus growers in the São Paulo State. Xf is a gram-negative, fastidious and xylem-limited bacterium. Based on the fact that plants may show disease symptoms a long time after infection in Xf-citrus interaction, we hypothesize that the expression of pathogenicity/virulence factors in Xf occurs after the bacterial population reach high cell densities. Since pathogenicity/virulence factors of some bacteria are quorum-sensing regulated, it would be interesting to determine whether this mechanism of genetic regulation occurs in Xf, and which genes are regulated by cell-density. In order to determine whether Xf putative pathogenesis-related genes are modulated by cell-density in culture media, Xf was grown in liquid PW and cells were sampled at early log (low cell density) and stationary phase (high cell density) and total RNA was extracted. Fragmentos of 20 putative pathogenicity-related genes from Xf were hybridized on ordered arrays nylon membranes to alkaline phosphatase-labeled first strand cDNA from low and high celldensity conditions as probes, at high stringency conditions. Detection was performed using chemiluminescence. Our results indicate that the following putative pathogenicity-related genes are significantly suppressed (p < 0.05) at high cell-density conditions: fur (XF-2344), gumC (XF-2369), serine-protease (XF-1851) and rsmA (XF-0125). The expression of rpfF (XF-1115) was significantly induced (p < 0.06) at high cell-density conditions. Expression of gumD (XF-2367), gumJ (XF-2362) and rpfA (XF-0290) was detected only at high cell-density conditions, whereas expression of rpfB (XF-0287) was detected only at low cell-density conditions. The expression of cellulase (XF0818), mdoH (XF-1623), pluxR (XF-0972), protease-RE (XF-1823), rpoN (XF-1408), xpsK (XF-1523) and xpsL (XF-1524) was not affected by the Xf population density in PW medium, whereas expression of luxR/UHPA (XF-2608), polygalacturonase (XF-2466), rpfC (XF-1114) and rsmB (XF-0928) was not detected under our experimental conditions. Using RT-PCR, transcripts for all genes, except gumC, were detected under low or high cell densities, indicating that the expression of some putative pathogenesis-related genes in culture medium is very low. Our results suggest that EPS may be synthesized by Xf mainly at high cell density conditions in PW medium. Additionally, our data suggest that Xf may synthesize a signal molecule similar to the Xcc in PW medium at high cell density conditions, and that iron availability may be important for gene regulation at high cell density conditions. It is possible that gene expression patterns observed under our experimental conditions may be altered with the culture medium used or when Xf grows in planta.

Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema de plantas, sendo transmitida principalmente por cigarrinhas da subfamília Cicadellinae (Hemiptera: Cicadellidae). No Brasil, é o agente causal da Clorose variegada dos citros (CVC), doença que afeta laranja-doce [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o comportamento alimentar da cicadelíneo vetor Bucephalogonia xanthophis (Berg) em citros e correlacionar suas atividades estiletares com a transmissão de X. fastidiosa. Inicialmente, testes de escolha e análises de excreção de honeydew foram realizadas para determinar os locais e períodos preferidos para alimentação em mudas de citros. B. xanthophis preferiu a haste dos ramos novos, na parte superior da muda. Esta cigarrinha ingeriu seiva do xilema e apresentou maior volume médio de excreção e maior percentual de indivíduos que excretaram durante a fotofase. Assim, estudou-se a penetração estiletar do vetor na haste de brotações cítricas, durante a fotofase, pela técnica de \"Electrical Penetration Graph\" (EPG, sistema DC). Os principais padrões de EPG foram correlacionados com análises histológicas e de \"honeydew\" para determinação da posição exata dos estiletes no tecido vegetal e atividades envolvidas. Seis padrões foram descritos: (S) secreção de bainha salivar e caminhamento dos estiletes através de células da epiderme ou parênquima; (R) estiletes inseridos na planta, porém sem nenhuma atividade aparente; (X) contato dos estiletes com os vasos do xilema; (Xi) ingestão ativa no xilema; (I) breve interrupção durante X ou Xi; (W) retirada dos estiletes da planta. Durante uma prova, a seqüência de eventos com maior probabilidade de ocorrência foi penetração estiletar através da epiderme e parênquima (S) (100% dos insetos), seguida de contato com o xilema (X) (67,6%). Entre os indivíduos que exibem o padrão X, 88,3% passam para Xi. Os vasos do xilema foram localizados pelo inseto após uma média de 2,2 provas. O tempo médio para atingir o xilema (X) e iniciar ingestão (Xi) após o início da primeira prova foi 27.8 min e 34,2 min, respectivamente. Entretanto, verificou-se ingestão prolongada no xilema (Xi > 5 min) somente após 39,8 min, em média. Em um outro estudo, investigou-se a relação dos padrões S, X e Xi com os processos de aquisição e inoculação de X. fastidiosa em citros. B. xanthophis adquiriu X. fastidiosa somente no padrão Xi. Após 1 h de ingestão no xilema, esta cigarrinha transmitiu a bactéria para plantas-teste com uma eficiência de 7,7%. A inoculação ocorreu durante os padrões S, S+X e S+X+Xi, com eficiência de 3,5; 7,1 e 7,4%, respectivamente. Um fato intrigante foi a ocorrência de inoculação de X. fastidiosa pelo inseto antes de atingir os vasos do xilema, durante o padrão S. Contudo, as maiores taxas de transmissão ocorreram após o contato com o xilema (S+X ou S+X+Xi). Por fim, estudou-se o efeito da infecção sintomática e assintomática por X. fastidiosa em plantas cítricas sobre a penetração estiletar de B. xanthophis. O comportamento alimentar foi semelhante em plantas sadias e infectadas sem sintomas. A infecção sintomática não afetou a capacidade de B. xanthophis localizar os vasos do xilema, mas reduziu o tempo gasto por este inseto ingerindo seiva dos mesmos. Estes resultados sugerem que a aquisição de X. fastidiosa pode ser mais eficiente em plantas infectadas assintomáticas do que em plantas com sintomas severos de CVC. As informações sobre penetração estiletar do vetor B. xanthophis em citros são importantes para estudos mais avançados de mecanismos de transmissão de X. fastidiosa, bem como para estabelecer estratégias que visem interferir neste processo. / Xylella fastidiosa is a xylem-limited bacterium transmitted mainly by leafhoppers (Hemiptera: Cicadellidae) in the subfamily Cicadellinae. In Brazil, it is the causal agent of Citrus variegated chlorosis, a disease that affects sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck]. The goal of this research was to characterize the feeding behavior of the cicadeline vector Bucephalogonia xanthophis (Berg) in citrus and correlate its feeding activities with transmission of X. fastidiosa. Initially, choice tests and honeydew excretion analyses were carried out to determine preferred feeding sites and periods on citrus nursery trees. B. xanthophis preferred the stems of young shoots, in the upper part of the plant. This species ingested sap from the xylem vessels and showed larger excretion volume and higher proportion of excreting individuals during the day. Thus, vector stylet penetration was studied on the stem of citrus shoots in the photophase, by using the Electrical Penetration Graph (EPG, DC system) technique. The main EPG waveforms were correlated with histological and honeydew excretion analyses to determine the precise stylet position in the plant tissue and feeding activities. Six waveforms and proposed activities are described: (S) secretion of salivary sheath and intracellular pathway; (R) stylets inserted into the plant, without any apparent activity; (X) contact of stylets with xylem vessels; (Xi) active xylem ingestion; (I) interruption between X and Xi; and (W) stylet withdrawal from the plant. During a probe, the most likely sequence of events is stylet pathway (S) through epidermal and parenchymal cells (all individuals), followed by contact with xylem (X) (67.6% of all individuals) and then active ingestion (Xi) (88.3% of those that exhibit waveform X). The xylem was reached after an average of 2.2 probes. The mean time to contact the xylem (X) and initiate ingestion (Xi) after onset of the first probe was 27.8 and 34.2 min, respectively. However, sustained xylem ingestion (Xi > 5 min) was established only after 39.8 min, on average. In a second study, the waveforms S, X and Xi were correlated with X. fastidiosa acquisition and inoculation in citrus. Acquisition of X. fastidiosa from infected plants occurred only after onset of the pathogen to 7.7% of test plants. In healthy plants, inoculation took place during waveform Xi (xylem ingestion); but with just 1 h in Xi, B. xanthophis subsequently transmitted waveforms S (salivary sheath formation and stylet pathway), S+X (X= first xylem contact by stylets) and S+X+X1, with efficiencies of 3.5, 7.1 and 7.4%, respectively. Although higher transmission rates were recorded after the first contact with xylem (S+X and S+X+Xi), it is intriguing the fact that inoculation of this xylem-limited bacterium also occurred before that (during S). Finally, the effect of X. fastidiosa infection on the feeding behavior of B. xanthophis was studied by comparing stylet penetration on: a) healthy citrus; b) symptomless infected citrus; c) infected citrus with CVC symptoms. Based on the analysis of 26 EPG parameters, no significant differences were found in stylet penetration on healthy versus asymptomatic infected citrus. Symptomatic infection did not affect the ability of B. xanthophis to locate xylem vessels, but reduced the time spend by this vector ingesting xylem sap. These results suggest that X. fastidiosa acquisition may be more efficient on symptomless infected plants than on citrus with severe CVC symptoms. Information on vector feeding behavior is basic for future studies on transmission mechanisms of X. fastidiosa and to establish control strategies aimed to interfere with this process.

Embora a citricultura seja uma importante atividade econômica no Brasil, nos últimos anos houve uma redução significativa da produção nacional. A baixa rentabilidade que o setor citrícola vem enfrentando, devido ao alto custo de produção, é decorrente principalmente dos problemas fitossanitários, com destaque para as doenças, que afetam diretamente a produtividade dos pomares. Atualmente, o huanglongbing (HLB) é a doença mais grave que afeta a citricultura mundial, sendo que os danos são severos em todas as variedades de citros. Diante desse fato, a transformação genética de plantas é uma alternativa para a obtenção de plantas transgênicas, com genes que estimulem o sistema de defesa das plantas, tornando-as resistentes a doenças. Apesar da eficácia dos protocolos existentes para a transformação genética de citros, uma desvantagem característica de plantas perenes é o ciclo reprodutivo lento, tornando difícil e demorado a validação de novos genes de interesse. Por isso, uma importante estratégia é o uso de plantas modelos, como o tomateiro, que possui ciclo curto e boa eficiência de transformação genética. Assim, o objetivo deste trabalho foi obter plantas transgênicas de Solanum lycopersicum cv. \'Micro-Tom\' e Citrus sinensis, contendo a construção gênica com o gene Csd1 (superóxido dismutase do cobre e do zinco), isolado de Poncirus trifoliata. A proteína codificada pelo gene Csd1, também conhecido como Sod1 (superoxide dismutase 1), é o mais potente antioxidante na natureza e é um importante constituinte de defesa celular contra o estresse oxidativo causado pela infecção bacteriana. O tomateiro Micro-tom foi utilizado como modelo de patogenicidade para validação do gene. Porém, devido a sua baixa eficiência de transformação genética, os experimentos de inoculação com o patógeno não foram realizados. Posteriormente, a caracterização da função do gene Csd1 em relação ao HLB será realizada com as plantas transgênicas de citros. A identificação de plantas transgênicas, de tomate e de laranja doce, foi realizada por meio da análise de PCR, utilizando primers para a detecção do gene Csd1. As plantas PCR+ foram aclimatizadas e transferidas para casa-de-vegetação. A eficiência de transformação genética do tomateiro \'Micro-Tom\' e das cultivares de laranja doce, \'Hamlin\' e \'Pineapple\', foram respectivamente: 0,34%, 4,74% e 3,65%. A caracterização molecular pelas análises de Southern blot e RT-qPCR foi realizada apenas em plantas de citros. Foi possível confirmar a integração do transgene em 32 eventos obtidos. O número de eventos de inserção variou de 1 - 5, sendo a presença do gene endógeno Csd1, localizada em 3 locais distintos no genoma das plantas. O nível de mRNA do transgene foi verificada em 21 plantas que tiveram apenas uma única inserção do transgene no genoma. Os resultados obtidos mostram que houve transcrição do gene Csd1 nas plantas transgênicas, assim como, na testemunha não transgênica. A relação do nível de transcrição do transgene com a resistência das plantas ao patógeno será definida após a inoculação com Candidadus Liberibacter. / Although the citrus industry is an important economic activity in Brazil, in recent years there has been a significant reduction in the national citrus production. The low profitability of the citrus sector has faced due to the high production cost is mainly attributed to phytosanitary problems, particularly diseases that directly affect productivity of orchards. Currently, huanglongbing (HLB) is the most serious disease that affects the global citrus industry and the damage is severe in all citrus varieties. Genetic transformation of plants is an alternative to obtain transgenic plants with genes that stimulate the plant defense system, making it resistant to diseases. Despite the effectiveness of protocols for genetic transformation of citrus, a characteristic disadvantage of perennial plants is the slow reproductive cycle, hindering validation of new genes of interest. Therefore, an important strategy is the use of model plants, such as the tomato, which has a short cycle and good genetic transformation efficiency. The objective of this study was to obtain transgenic plants of Solanum lycopersicum cv. \"Micro-Tom \'and Citrus sinensis, containing the gene construct with Csd1 gene (copper/zinc superoxide dismutase), isolated of Poncirus trifoliata. The protein encoded by the gene Csd1, also known as SOD1 (superoxide dismutase 1), is the most powerful antioxidant in nature and is important constituent of cellular defense against oxidative stress caused by bacterial infection. \'Micro-tom\' tomato was used as a model for pathogenic gene validation. However, due to its low efficiency of genetic transformation, the inoculation experiments with the pathogen were not realized. Posteriorly, the characterization of gene function Csd1 in relation to the HLB disease will be realize with citrus transgenic plants. The objective of this study was to obtain transgenic plants of Solanum lycopersicum cv. \'Micro-Tom\' and of Citrus sinensis, containing the gene construction with Csd1 gene (copper/zinc superoxide dismutase), isolated of Poncirus trifoliata, for validation and for future study of this gene for resistance to HLB. Proteins encoded by the Csd1 gene, also known as SOD1 (superoxide dismutase 1), are the most powerful antioxidants in nature and are important constituents of cellular defense against oxidative stress caused by bacterial infection. The identification of transgenic plants of tomato and sweet orange was performed by the PCR analysis using primers for the detection of Csd1 gene. The PCR+ plants were acclimatized and transferred to a greenhouse. The genetic transformation efficiency of tomato \'Micro-Tom\' and sweet orange cultivars, \'Hamlin\' and \'Pineapple\', were 0.34%, 4.74% and 3.65%, respectively. The molecular characterization with the Southern blot and RT-qPCR analyses was performed only in citrus plants. The transgene integration was confirmed in 32 plants. The number of insertion events ranged from 1-5 and the presence of Csd1 endogenous gene is found in three distinct locations in the plants genome. The mRNA level of the transgene was verified in 21 plants that had only a single transgene insertion into the plant genome. The results show that there was transcription of Csd1 gene in transgenic plants as well as in non-transgenic plants. The relation between the transgene transcript level with the resistance of plants to pathogens is set after inoculation with Candidadus Liberibacter.

O Huanglongbing (HLB) é a doença dos citros mais importante em todo mundo, por afetar todas as variedades cítricas cultivadas e ser de difícil controle. No Brasil, onde afeta as principais regiões produtoras de citros, a doença vem se espalhando e causando enormes prejuízos à atividade. O manejo do HLB depende da utilização de ações integradas, dentre elas o controle do inseto vetor, o psilídeo-asiátco-dos-citros, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae). Para controlar de forma eficiente esse inseto vetor é necessário que se conheça, por meio de amostragens eficazes, suas características de dinâmica tanto temporal quanto espacial, identificando regiões mais propensas à infestações e épocas do ano em que o inseto se desenvolve melhor. Por isso, o presente estudo teve como objetivos: a) avaliar a dinâmica temporal do psilídeo D. citri em pomares do Estado de São Paulo, examinando o efeito de diferentes regiões, épocas do ano e idade dos plantios; b) verificar a existência de diferenças no número de insetos amostrados em diferentes alturas da planta cítrica, comparando diferentes métodos de amostragem; e c) investigar o padrão de distribuição espacial do inseto em pomares de diferentes idades. Para isso foram realizados levantamentos ao longo de dois anos em seis localidades, representativas de três regiões do parque citrícola paulista, com pomares de diferentes idades, sendo amostradas todas as fases de vida de D. citri e brotações cítricas. Para a avaliação da amostragem de psilídeos em diferentes alturas, foram estudados dois pomares com plantas de diferentes idades, com avaliação da densidade de psilídeos e brotos cítricos em vários estratos da planta, comparando-se dois tipos de amostragem de insetos adultos. Para o estudo da distribuição espacial de D. citri foram feitos levantamentos em pomares de dois municípios da região citrícola central, analisando-se os dados com geoestatística. Foram constatados efeitos de região, idade dos plantios e épocas do ano sobre a população de D. citri. As maiores populações do inseto estão presentes na região central, onde o inseto ocorre com maior frequência ao longo do ano, seguida da região noroeste e sul. Mais ninfas ocorreram em pomares mais jovens, mas a população de adultos não necessariamente ocorre em maiores números nestes locais. A primavera foi a estação do ano na qual ocorreram as maiores populações de insetos, mas elevações populacionais podem ocorrer em qualquer época desde que haja brotações presentes e que o clima seja favorável. A altura de amostragem influenciou o número de adultos de D. citri detectados no pomar mais velho e de todas as fases de vida do inseto no pomar mais novo, bem como o número de brotações cítricas. Amostras mais precisas foram geradas pela amostragem com armadilhas adesivas do que visualmente, sendo recomendada a amostragem de D. citri com armadilhas em pontos mais elevados da planta para melhor precisão. D. citri apresentou distribuição agregada e forte dependência espacial na maioria das datas de amostragem e em pomares de diferentes idades. Focos foram identificados nos pomares, com área de 1.257 m², em média. / Huanglongbing (HLB) is the most important citrus disease in the world, affecting all cultivated citrus varieties, and it is very difficult to control. In Brazil, HLB is spreading in the major citrus producing areas and causing huge losses to the citriculture. Disease management depends on integration of different methods, including control of the insect vector, the Asian citrus psyllid, Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae). In order to effectively monitor and control this vector, it is necessary to understand his population dynamics in citrus orchards, identifying regions and seasons where the insect develops higher populations. This study was designed to investigate the temporal and spatial dynamics of D. citri in citrus orchards of Sao Paulo State, examining the effect of different regions, seasons and plant age. Surveys of psyllid populations and citrus shoots were carried out over two years in six locations, representing three growing regions of São Paulo State, in citrus orchards of different ages, where all life stages of D. citri and citrus shoots were sampled. The spatial distribution of D. citri was analyzed by geostatistics in orchards of two municipalities of the central region of São Paulo State. The efficacy of sampling methods (yellow sticky cards vs. visual inspections) and sampling height on the tree canopy for estimating psyllid populations and number of citrus shoots was investigated as well; this particular study was conducted in two orchards of different ages, in the central region. Significant effects of region, orchard age and seasons of the year on the population of D. citri were observed. The highest insect populations are present in the central region, where the insect occurs more frequently throughout the year, followed by the northwestern and southern regions of São Paulo State. More nymphs occurred in younger orchards, but the adult population does not necessarily occur in higher numbers in the younger orchards. Spring was the season of highest populations of D. citri, but population increases can occur at any time if there are shoots present and the weather is favorable. The sampling height influenced the number of D. citri adults trapped by yellow sticky cards in the older orchard, and the numbers of psyllid eggs, nymphs and adults, as well as of citrus shoots, visualized on the younger orchard. More accurate sampling data were generated by using yellow sticky traps compared with visual inspections. Yellow sticky traps should be placed closer to the top of the citrus tree for better accuracy. D. citri showed aggregated pattern and strong spatial dependence in most sampling dates and in orchards of different ages. Foci were identified in the orchards, with a mean area of aggregation of 1,257 m².

A partir da década de 1950, o limoeiro \'Cravo\' (Citrus limonia Osbeck) passou a ser o principal porta-enxerto para citros no Estado de São Paulo. Devido à sua suscetibilidade ao declínio dos citros, a sua utilização diminuiu na década de 1980. Em 2001, com a constatação da doença morte súbita dos citros (MSC) na região norte e noroeste do Estado de São Paulo e Triângulo Mineiro, o emprego do limoeiro \'Cravo\' como porta-enxerto se tornou praticamente inviável, já que o mesmo se mostrou suscetível à MSC. A utilização de porta-enxertos tolerantes no cultivo de laranjeiras doces (C. sinensis (L.) Osbeck), até o momento, é a medida de manejo mais indicada para a MSC, porém, esses porta-enxertos apresentam baixa tolerância à seca, inviabilizando o cultivo sem irrigação em regiões que apresentam baixa disponibilidade hídrica no solo e altas temperaturas em determinadas épocas do ano. Com base nessas premissas, o objetivo do presente estudo foi determinar o desempenho horticultural de laranjeira \'Valência\' (C. sinensis (L.) Osbeck) sobre onze porta-enxertos na região norte do Estado de São Paulo, baseando-se nas características de produção e qualidade de fruto, desenvolvimento das plantas, tolerância à MSC e à seca. O experimento foi instalado no município de Colômbia, região norte do Estado de São Paulo. As diferentes combinações (copa / porta-enxerto) foram plantadas em março de 2007. Em abril de 2012, foram pré-selecionados combinações sobre onze porta-enxertos dentre os 42 que foram plantados originalmente. Para as diferentes combinações copa/porta-enxerto selecionadas, foram avaliadas as variáveis produção e qualidade dos frutos, desenvolvimento da planta, eficiência produtiva, taxa média de crescimento, tolerância à MSC (avaliação visual, detecção de Citrus sudden death-associated virus (CSDaV) e detecção do Citrus tristeza vírus (CTV)) e tolerância à seca (avaliação visual, potencial de água em folha e estimativa do índice de área foliar). Os resultados encontrados no presente estudo relatam a superioridade na produção de frutos de laranjeira \'Valencia\' quando enxertada em pelos menos um porta-enxerto pré-selecionado em relação ao limoeiro \'Cravo\' \"CNPMF 03\". Em relação às demais variáveis, também foi atribuído a duas combinações de copa/porta-enxerto qualidade superior dos frutos de laranja \'Valência\' e a outras três combinações tolerância satisfatória à seca comparadas aos clones de limoeiro \'Cravo\'. Foi observado aptidão para cultivo adensado de laranjeira \'Valência\' em dois porta-enxertos. Também foram encontradas diferenças em relação à presença do CSDaV nos diferentes porta-enxertos. Tangerina \'Sunki\' x P. trifoliata \'English\' e citrange \'C-13\' \"S\" apresentaram potencial para utilização como porta-enxertos para laranjeira \'Valência\' na região norte do Estado de São Paulo como alternativa ao limoeiro \'Cravo\'. / Since the 1950s, the Rangpur lime (Citrus limonia Osbeck) became the main rootstock for brazilian citrus industry in São Paulo State. Because of its susceptibility to citrus blight, the use of this rootstock decreased in the 1980s. In 2001, with the first report of citrus sudden death disease (CSD) in the north and northwest of São Paulo State and Minas Gerais Triangle, the use of Rangpur lime as a rootstock became practically impossible, because of its susceptibility to CSD. The use of tolerant rootstocks in sweet orange groves (Citrus sinensis (L.) Osbeck) yet is the most adequate management to CSD. However, these rootstocks have low tolerance to drought stress, limiting the citrus industry in areas with high temperatures at certain seasons of year, and with low water availability for irrigation. Based on these assumptions, the aim of this study was to determine the horticultural performance of \'Valencia\' sweet orange (C. sinensis (L.) Osbeck) onto eleven rootstocks in the northern region of São Paulo state, based on the characteristics of production and fruit quality, plant growth, tolerance to CSD and drought tolerance. The experiment was carried out in Colombia, north of the São Paulo State. The different combinations (canopy / rootstock) were planted in March 2007. In April 2012, eleven rootstocks were pre-selected from the 42 that were originally planted. For the different selected canopy / rootstock combinations, the following variables were evaluated: yield and fruit quality, plant development, yield efficiency, growth rate, tolerance to CSD (visual evaluation, detection of Citrus sudden death-associated virus (CSDaV) and detection of Citrus tristeza virus (CTV)) and drought tolerance (visual evaluation, leaf water potential and leaf area index). The results found in this study showed higher production quality of \'Valencia\' sweet orange fruits when grafted onto, at least, one pre-selected rootstock compared to \"CNPMF 03\" Rangpur lime. For the other variables, it was also attributed to two combinations scion / rootstock superior quality of \'Valencia\' sweet orange fruits and in the other three combinations satisfactory tolerance to water stress compared to Rangpur lime. It was observed aptitude for high density planting of \'Valencia\' sweet orange onto two rootstocks. There were also found differences regarding the presence of CSDaV on different rootstocks. The \'Sunki\' mandarin x English\' P. trifoliata and the \'C-13 \'\"S\" citrange showed potential to be used as rootstocks for \'Valencia\' sweet orange in the northern region of São Paulo state as an alternative to Rangpur lime.

Brazil is the largest citrus producer in the world and has a large global citrus market share. However, several diseases affect the crop, being postbloom fruit drop (PFD) one of them. PFD has gained importance in São Paulo State for the displacement of citrus areas to regions with weather conditions more favorable for this disease. The accurate identification of the causal agent of the PFD has been performed and it was renamed as Colletotrichum abscissum. The origin of the initial inoculum is still an enigma for PFD epidemics and the hypotheses that the initial inoculum could be present in propagation material have been discussed but it has never been demonstrated. The objective of this work was to detect and quantify Colletotrichum abscissum from citrus leaves of budwood increase block and citrus nursery plants by qPCR. Four commercial citrus farms from São Paulo State, Brazil with budwood increase block and citrus nursery plants of Pera and Valencia sweet orange varieties were used for this work. C. abscissum was detected in budwood increase block and in nursery plant in both varieties (Valencia and Pera) at the four farms sampled. Out of 122 budwood increase block samples, 89 (73%) were positive for C. absicissum. From nursery plants, out of 175 samples, 129 (73%) were detected with the pathogen. The majority of the positive samples of budwood increase blocks and nursery plants contained 10 to 200 and 10 to 400 conidia of C. absicissum, respectively. With the methods used was not possible to isolate the fungus from vegetative material. This finding suggests a new long distances dispersion type of C. abscissum in the cycle of postbloom fruit drop by propagation material. Confirmation of C. abscissum in budwood increase block and nursery plants would lead to update regulations for the production of certified citrus nursery trees and searching for new control strategies of the pathogen. / O Brasil é o maior produtor de citros do mundo e possui uma grande participação no mercado global de citros. No entanto, várias doenças afetam a cultura, sendo uma delas a podridão floral dos citros (PFC). PFC ganhou importância no Estado de São Paulo pelo deslocamento de áreas de citros para regiões com condições climáticas mais favoráveis para a doença. A identificação precisa do agente causal do PFC foi realizada, tendo sido renomeado como Colletotrichum abscissum. A origem do inóculo inicial ainda é um enigma para as epidemias de PFC e as hipóteses do que o inóculo inicial poderia estar presente no material de propagação já foram discutidas, mas nunca foram demonstradas. O objetivo deste trabalho foi detectar e quantificar Colletotrichum abscissum em folhas de borbulheiras e mudas de citros por meio de qPCR. Neste trabalho, foram utilizadas quatro fazendas comerciais de citros do Estado de São Paulo, Brasil, com borbulheiras e viveiros de mudas de citros das variedades laranja Pera e Valência. C. abscissum foi detectado em borbulheiras e em mudas em ambas as variedades (Valência e Pêra) nas quatro fazendas amostradas. Das 122 amostras de folhas de borbulheiras, 89 (73%) foram positivas para C. absicissum. Das 175 amostras de folhas de mudas de citros, 129 (73%) foram detectadas com o patógeno. A maioria das amostras positivas de borbulheiras e mudas de citros continham 10 a 200 e 10 a 400 conídios de C. absicissum, respectivamente. Com os métodos utilizados, não foi possível isolar o fungo do material vegetativo. Esta descoberta sugere um novo tipo de dispersão a longas distâncias de C. abscissum no ciclo de podridão floral dos citros por meio do material de propagação. A confirmação de C. abscissum nas borbulheiras e mudas de citros levaria à atualização da regulamentação para a produção de mudas de citros certificadas e à busca de novas estratégias de controle do patógeno.

Xylella fastidiosa é o agente causal de uma série de doenças que ocorrem em plantas economicamente importantes como laranjeiras, videiras e cafeeiros, causando no Estado de São Paulo prejuízos relevantes à indústria citrícola. Esta bactéria Gram-negativa é restrita ao xilema das plantas e à porção anterior do trato digestório dos insetos vetores das famílias Cicadellidae e Cercopidae, conhecidos como cigarrinhas. Tentativas de elucidar os mecanismos de virulência e patogenicidade adotados por esta bactéria apontam a formação do biofilme como etapa fundamental para o estabelecimento da infecção e o consequente desenvolvimento da doença na planta, mas fatores adicionais parecem contribuir, tais como a produção de toxinas. As bacteriocinas são proteínas com atividade antibiótica contra cepas próximas à espécie produtora e que já foram associadas à virulência e patogenicidade de outras bactérias. Uma varredura in silico no genoma de X. fastidiosa 9a5c revelou 13 sequências codificadoras de microcinas putativas no cromossomo. Transcritos de todos esses genes foram detectados por RT-qPCR em culturas de X. fastidiosa 9a5c, e análises comparativas com genomas públicos (cepas Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 e GB514) e recém sequenciados por nosso grupo de pesquisa (cepas U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x e Fb7) revelaram que cada cepa possui seu próprio arsenal de bacteriocinas. Diferenças encontradas in silico entre os loci de bacteriocinas nas cepas foram demonstradas experimentalmente. Nossos resultados comprovam a variabilidade predita nos quatro clusters de bacteriocinas que identificamos, o que é esperado para genes relacionados à adaptação e patogenicidade. Destes loci, três foram detectados por RT-PCR como transcritos policistrônicos. Nossa tentativa de detectar essas proteínas em culturas de X. fastidiosa (através de sequenciamento de polipeptídeos por HPLC-MS/MS) foi capaz de identificar uma das bacteriocinas putativas e, portanto, o conjunto de nossas observações apóia a continuidade dos estudos para elucidar o papel das bacteriocinas na fisiopatologia de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of diseases that affect several economically important crops such as sweet orange trees, grapevines and coffee trees, causing in the State of São Paulo considerable losses mainly to the citrus industry. This Gram-negative bacterium is restricted to the plant xylem and to the upper gastrointestinal tract of its insect vectors, the sharpshooters from the Cicadellidae and Cercopidae families. Attempts to elucidate the virulence and pathogenicity pathways employed by this bacterium point the biofilm formation as a fundamental step for the establishment of the infection and the consequent development of the plant disease, but additional factors seem to contribute to these processes, such as the production of toxins. Bacteriocins are proteinaceous antibiotics that act against closely-related species and have been previously associated with virulence and pathogenicity in other bacteria. An in silico screening of the X. fastidiosa 9a5c genome revealed 13 coding sequences as putative microcins in the chromosome. Transcripts from all those genes were detected through RT-qPCR in X. fastidiosa 9a5c cultures, and comparative analyses on the public genomes (Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 and GB514) plus the ones recently sequenced by our group (U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x and Fb7) revealed that each strain possesses its own arsenal of bacteriocins. Differences found in silico among the loci in all strains were experimentally confirmed. Our results demonstrated the predicted variability in the four bacteriocins clusters as expected for adaptation and pathogenicity-related genes. Three out of the four bacteriocins loci were detected by RT-PCR as polycistronic transcripts. Our attempt to detect these proteins in X. fastidiosa cultures (using HPLC-MS/MS polypeptide sequencing) identified one of the putative bacteriocins, and therefore our observations warrant further efforts to elucidate the role of bacteriocins in the X. fastidiosa physiopathology.