Orientador: Joyce Maria Annichinno-Bizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T02:29:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mello_TayanaBezerraTeixeira_D.pdf: 2343820 bytes, checksum: be3d8e4b057cd84ec6771c67b8b1407d (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Nos últimos anos tem sido demonstrada uma associação entre níveis elevados de certos fatores da coagulação e risco de tromboembolismo venoso (TEV). Entretanto, o número de estudos é pequeno e a maioria estão restritos a populações caucasóides. Neste estudo caso-controle emparelhado por idade, sexo e etnia investigamos os níveis plasmáticos do fibrinogênio, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FvW e grupo sanguíneo (GS) ABO no risco trombótico. Foram analisados 175 pacientes com TEV (122 mulheres e 53 homens), com idade mediana de 36 anos (13-63), acompanhados no Ambulatório de Hemostasia da Unicamp no período de julho de 2002 a julho de 2005. Na análise univariada, níveis elevados de FVIII (OR: 5,3 IC95% 2,9-9,6), FvW (OR: 4,9 IC95% 2,7-8,9), FIX (OR: 2,4 IC95% 1,3-4,4), FXI (OR: 2,1 IC95% 1,1-4,0) e GS não O (OR: 3,0 IC95% 1,9-4,6) foram fatores de risco para TEV. O FVIII, FvW e GS não O foram associados ao risco tanto em membro inferior como em sítio incomum da doença. A análise de todas estas variáveis, segundo critério de seleção ¿stepwise¿, mostrou o FVIII (OR: 3,1 IC95% 1,6-6,0), FvW (OR:2,8 IC95% 1,4-5,4) e o GS não-O (OR:2,2 IC95% 1,3-3,5) como fatores de risco independentes para TEV e que o FIX e FXI agiram sinergicamente a estas variáveis no acréscimo do risco trombótico. Risco de recorrência foi conferido por elevações do FIX (OR: 4,7 IC95% 1,8-11,9) e FXI (OR: 3,4 IC95% 1,8-8,7). Os determinantes dos níveis plasmáticos do FVIII não estão totalmente esclarecidos. Como a LRP (Low density lipoprotein receptor related protein) tem um papel no catabolismo do FVIII, foram pesquisados os polimorfimos C200T, o A775P e o D2080N no gene codificador dessa proteína, como fator de risco para TEV e a influência dos mesmos sobre os níveis do FVIII e FvW. Não houve diferença nas prevalências destes polimorfismos entre pacientes e controles. No entanto, no grupo-controle, o genótipo DN, do polimorfismo D2080N, foi associado a menores concentrações do FVIII (77,4 UI/dl) e FvW (70,2 UI/dl), quando comparado ao genótipo DD (127 UI/dl e 108,4 UI/dl, respectivamente p<0,05). Em conclusão, nesta população brasileira miscigenada, o FVIII, FvW , FIX, FXI e GS não O foram associados ao risco de TEV e o polimorfismo D2080N, no gene da LRP, interferiu com os níveis plasmáticos de FVIII e FvW / Abstract: During the last years an association between high levels of certain coagulation factors and the risk for venous thromboembolism (VTE) has been demonstrated. The number of studies, however, is small, and most of them are restricted to Caucasian populations. In this case control study, matched for age, sex and ethnicity, we investigated the plasma levels of fibrinogen, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, vWF and the ABO blood group (BG) in the thrombotic risk. It was analyzed 175 patients with VTE (122 women and 53 men), median age 36 years (13-63), followed at the hemostasis outpatient clinic at the State University of Campinas ¿ UNICAMP, between July 2002 and July 2005. In univariate analysis, elevated levels of FVIII (OR: 5.3 95%CI 2.9-9.6), FvW (OR: 4.9 95%CI 2.7-8.9), FIX (OR: 2.4 95%CI 1.3-4.4), FXI (OR: 2.1 95%CI 1.1-4.0) and non O BG (OR: 3.0 95%CI 1.9-4.6) were risk factors for VTE. FVIII, FvW and non O BG were associated with the risk both in lower limbs and unusual sites of disease. Analysis of all these variables by stepwise selection criteria showed FVIII (OR:3.1 95%CI 1.6-6.0), FvW (OR:2.8 95%CI 1.4-5.4) and non O BG (OR:2.2 95%CI 1.3-3.5) as independent risk factors for VTE, and FIX and FXI increased synergistically the risk of thrombosis of these variables. Risk of recurrence was conferred by FIX (OR:4.7 IC95% 1.8-11.9) and FXI (OR:3.4 IC95% 1.8-8.7). The FVIII plasma levels determinants are not well established. Since LRP (Low density lipoprotein receptor related protein) has a role in the catabolism of FVIII, we evaluated the C200T, A775P and, D2080N polymorphisms in the gene coding of this protein, as risk factor for VTE and their influence upon the levels of FVIII and vWF. There was no difference regarding the prevalence of these polymorphisms between patients and controls. However, in the control group, the DN genotype, of the D2080N polymorphism, was associated with lower concentrations of FVIII (77.4 UI/dl) and vWF (70.2 UI/dl), when compared to DD genotype (127 UI/dl e 108.4 UI/dl, respectively p<0.05). In conclusion, in these Brazilian miscigenous population, increased levels of FVIII, FvW, FIX, FXI and non O BG were associated with VTE risk and the D2080N polymorphism, in the LRP gene, influenced plasma levels of FVIII and vWF / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Introdução: A derivação gástrica em Y-de-Roux (DGYR) é um dos procedimentos bariátricos mais realizados em todo o mundo. Apesar de sua alta eficácia, significativa proporção de pacientes recupera parte do peso perdido. Várias terapias endoscópicas foram introduzidas como alternativas para tratar o reganho de peso, mas a maioria dos artigos publicados tem amostra relativamente pequena, com dados pouco claros e de curto prazo. Objetivo: Avaliar sistematicamente a eficácia das terapias endoscópicas para reganho de peso pós-DGYR. Métodos: Foram realizadas buscas nas bases MEDLINE, EMBASE, Scopus, Web of Science, Cochrane, OVID, CINAHL/EBSCo, LILACS/Bireme e literatura cinzenta. Os desfechos primários avaliados foram perda absoluta de peso (PAP), perda de excesso de peso (PEP) e perda total de peso corporal (PPTP). Resultados: Trinta e dois estudos foram incluídos na análise qualitativa. Vinte e seis trabalhos envolvendo 1148 pacientes descreveram sutura endoscópica de espessura total (SET) e PAP, PEP e PPTP em 3 meses foram 8,5±2,9kg, 21,6±9,3% e 7,3±2,6%, respectivamente. Aos 6 meses, foram de 8,6±3,5kg, 23,7±12,3% e 8,0±3,9%. Aos 12 meses, 7,63±4,3kg, 16,9±11,1% e 6,6±5,0%. A análise de subgrupos mostrou melhores resultados no subgrupo submetido à coagulação com plasma de argônio (APC) prévio à SET (p < 0,0001). A metanálise incluindo 15 desses estudos mostrou resultados concordantes e confirmou a superioridade estatística da SET+APC em comparação à SET isolada. Três estudos descreveram sutura de espessura superficial (SEP) com PAP média de 3,0±3,8kg, 4,4±0,07kg e 3,7±7,4 kg em 3, 6 e 12 meses, respectivamente. No seguimento de curto, médio e longo prazo, a SET proporcionou resultados superiores em relação à SEP (p < 0,05). Dois artigos descreveram APC isolada com PAP média de 15,4±2,0 kg e 15,4±9,1kg em 3 e 6 meses. Nenhum estudo relatando escleroterapia satisfez os critérios de elegibilidade. Conclusões: A sutura de espessura total é efetiva no tratamento do reganho de peso pós-DGYR. A realização de APC antes da sutura parece resultar em maior perda de peso. Estudos comparativos são necessários para confirmar nossos resultados. A sutura de espessura total relaciona-se com melhores resultados em comparação à sutura de espessura superficial. Poucos estudos avaliam adequadamente a eficácia de outras técnicas endoscópicas / Introduction: Roux-en-Y Gastric Bypass (RYGB) is the most commonly performed bariatric procedure. Despite its high efficacy, some patients regain part of their lost weight. Several endoscopic therapies have been introduced as alternatives to treat weight regain but most of the articles are relatively small with unclear long-term data. Aim: To systematically assess the efficacy of endoscopic therapies for weight regain after RYGB. Methods: We searched MEDLINE, EMBASE, Scopus, Web of Science, Cochrane, OVID, CINAHL/EBSCo, LILACS/Bireme and gray literature. Primary outcomes were absolute weight loss (AWL), excess weight loss (EWL) and total body weight loss (TBWL). Results: Thirty-two studies were included in qualitative analysis. Twenty-six articles enrolling 1148 patients described fullthickness (FT) endoscopic suturing and pooled AWL, EWL and TBWL at 3 months were 8.5±2.9kgs, 21.6±9.3% and 7.3±2.6%, respectively. At 6 months, they were 8.6±3.5kg, 23.7±12.3% and 8.0±3.9%. At 12 months, they were 7.63±4.3kg, 16.9±11.1% and 6.6±5.0%. Subgroup analysis showed that all outcomes were significantly higher in the group with FT suturing combined with argon plasma coagulation (APC) (p < 0.0001). Meta-analysis including 15 FT studies showed greater results and confirmed the significant superiority of FT-APC compared to FT alone. Three studies described superficial-thickness suturing with pooled AWL of 3.0±3.8kg, 4.4±0.07kg and 3.7±7.4kg at 3, 6 and 12 months, respectively. At short, mid and long-term follow-up, FT suturing provided better outcomes compared to ST (p < 0.05). Two articles described APC alone with mean AWL of 15.4±2.0kg and 15.4±9.1kg at 3 and 6 months. No study describing sclerotherapy fulfilled eligibility criteria. Conclusions: Full-thickness suturing is effective at treating weight regain after RYGB. Performing APC prior to suturing seems to result in greater weight loss. Head-to-head studies are needed to confirm our results. Full-thickness suturing lead to greater outcomes compared to superficial thickness suturing. Few studies adequately assess effectiveness of other endoscopic techniques

Neste trabalho foram estudados diversos métodos cromatográficos para a purificação de fatores recombinantes de coagulação VII (FVIIr) e VIII (FVIIIr) derivados de linhagens celulares humanas SK-Hep. O FVIIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia A, enquanto o FVIIr é utilizado para o tratamento da Hemofilia B e também a Hemofilia A. Produzir estes fatores em linhagens celulares humanas faz com os padrões de glicosilação, sulfatação e enovelamento destas proteínas sejam extremamente parecidos com os fatores endógenos produzidos no organismo humano. A purificação do FVIIIr através de técnicas de cromatografia multimodais usando a resina CaptoMMC, afinidade usando a resina FVIIISelect e troca iônica (SP-Sepharose) permitiu obter um produto bastante homogêneo e com perfil de banda (por SDS-PAGE) bem definido que demonstrou a presença esperada das cadeias leve e pesada (o Westen-Blott indicou que os anticorpos comerciais reconheceram a cadeia pesada da molécula estudada). As técnicas permitiram uma alta reprodutibilidade do processo onde sequencias de purificação indicaram o mesmo comportamento de perfis cromatográficos e o processo eliminou 99.5% ± 0,5% de proteínas inespecíficas, recuperando até 64% de FVIIIr. O FVIIr foi purificado com apenas uma única técnica cromatográfica usando a resina FVIISelect que isolou a proteína de interesse eliminando cerca de 99% de impurezas, recuperando praticamente todo o produto. O eluido da cromatografia de afinidade foi dialisado em membranas de 5 kDa o que resultou no processo de auto ativação da molécula de FVIIr, resultando em um aumento de sinal de até 5x em relação a quantidade inicial. O gel de SDS-PAGE e o Westen-Blott comprovaram o processo de auto-ativação no qual uma migração de banda de 50 kDa para 30kDa foi observada e os anticorpos comerciais contra FVII foram capazes de detecta-la. O método de purificação também foi bastante reproduzível e o perfil de banda muito semelhante se comparado ao produto comercial existente no mercado. Sendo assim, foi possível obter plataformas de purificação para as proteínas FVIIr e FVIIIr. / In this work, several chromatographic methods were studied for the purification of recombinant clotting factors VII (FVIIr) and VIII (FVIIIr) derived from human SK-Hep cell lines. The FVIIIr is used for the treatment of Hemophilia A, while the FVIIr is used for the treatment of Hemophilia B and Hemophilia A. Producing these factors in human cell lines results in glycosylation, sulphation and folding patterns similar to the endogenous factors produced in the human organism. Purification of FVIIIr by multimodal chromatography techniques using CaptoMMC resin, affinity using FVIIISelect resin and ion exchange (SP-Sepharose) yielded a fairly homogeneous and well-defined band profile (by SDS-PAGE) which demonstrated the expected presence of the light and heavy chains, Westen-Blott indicated that commercial antibodies recognized the heavy chain of the studied molecule. The techniques allowed a high reproducibility of the process where purification sequences indicated the same behavior of chromatographic profiles and the process eliminated 99.5% ± 0.5% nonspecific proteins and recovering up to 64% FVIIIr. FVIIr was purified with only a single chromatographic technique using the FVIISelect resin which isolated the protein by removing about 99% impurities and recovering virtually the entire product. The affinity chromatography eluate was dialyzed on 5 kDa membranes which resulted in the autoactivation process of the FVIIr molecule resulting in a signal increase of up to 5 fold over the initial amount. The SDS-PAGE gel and Westen-Blott demonstrated the auto-activation process where a migration of 50 kDa to 30 kDa band was observed and the commercial antibodies against FVII were able to detect the band. The purification method was also quite reproducible and the band profile very similar compared to the commercial products. Thus, it was possible to obtain purification platforms for the FVIIr and FVIIIr proteins.

O complexo salivar da sanguessuga H. depressa é composto pelas glândulas salivares e probóscide. Análises bidimensionais (2D) mostraram que a maioria das proteínas apresentam pI entre 3.5 à 9.5 e MM entre 10 à 105 kDa. O mapa 2D do complexo salivar apresentou 352 spots totais, sendo 249 exclusivos da saliva (corado por nitrato de prata) e 219 spots totais (corado por Coomassie Blue). As proteínas foram identificadas após sequenciamento tandem MS (proteoma) pela complementariedade às sequências traduzidas do cDNA (transcriptoma). As proteínas mais abundantes foram: antiagregante plaquetário; miohemeritrina e anidrase carbônica. Estas proteínas devem exercer um papel na digestão ou anticoagulação do sangue durante a alimentação. A zimografia também identificou uma protease gelatinolítica (45 kDa). Porém, lefaxin (inibidor de FXa) e hementerina (fibrinogenolítico e inibidor de agregação plaquetária) não foram identificados por estas técnicas biotecnológicas, o que mostra a necessidade de técnicas adicionais para a completa elucidação da constituição desta amostra. / The salivary complex from H. depressa leech is composed of salivary gland and proboscis. Two-dimensional (2D) analysis showed that majority of proteins have pI from 3.5 to 9.5 and MW from 10 to 105 kDa. The 2D gel of salivary complex showed 352 total spots, 249 of them were from saliva (silver stained) and 219 total spots (Coomassie Blue stained). Proteins were identified after tandem MS sequencing (proteome) and complementar analysis of translated sequences from cDNA (transcriptome). The most abundant proteins were: antiplatelet protein; myohemerytrin; carbonic anhydrase. These proteins may have a role in digestion or antihemostatic system during blood feeding. The zymographic assay identified a gelatinolytic protein (45 kDa). But, lefaxin (inhibitor of Fxa) and hementerin (fibrinogenolytic and antiplatelet function) were not identified by these biotechonolgical techniques, showing that additional techniques are necessary for complete knowledge about the composition of this sample.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rivaldo.pdf: 292230 bytes, checksum: a2cbda0e4eeea6a416fde16f3f375530 (MD5) Previous issue date: 2011-09-26 / This study aimed to evaluate the heart and liver biomarkers, hematology and hemostasis in healthy dogs, submitted to therapy with nonsteroidal anti-inflammatory non-selective (NSAID), COX-2 preferential and COX-2 selective drugs. Were used 30 mongrel dogs, adults, males and females, clinically healthy, randomly divided into 5 groups (G) of 6 animals, that received the follow therapies: ketoprofen, nimesulide, meloxican, etodolac and celecoxib. The blood count, hemostatic profile (clotting time (CT), prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), platelets and fibrinogen), cardiac biomarkers (CK, CKMB) and liver function (ALT, AST and albumin) were evaluate before, at 5 and 10 days (T0, T5, T10) of treatment in all treatment groups, and at 20 days (T20) treatment in celecoxib. The CT scan showed significant increase in the ketoprofen group at T5, while in the nimesulide group significantly increased at T10, in both groups when compared to T0. In TP, the etodolac group showed significant reduction in the T5 compared to T0, while the platelet count increased at T10 compared to T0 and T5 in the ketoprofen group. The red blood cells and Ht decreased in T10 compared to T0 in the ketoprofen group, while the reduction in the celecoxib group T20 compared to T0. The celecoxib group revealed decreased values of total leukocytes, neutrophils and lymphocytes in the T20. Significant increase in CKMB, LDH, and ALT were observed in the celecoxib group. Reduction of serum albumin occurred in the nimesulide and ketoprofen groups in T5 and T10 and T10, respectively. In conclusion, meloxican was the safest drug to NSAID therapy in dogs. The NSAIDs ketoprofen, nimesulide and etodolac should be used judiciously in patients with dysfunction of coagulation profile, once that promote increase in coagulation parameters. Celecoxib appears to be safe in relation to the coagulation, even under prolonged therapy. Celecoxib and ketoprofen therapy requires attention for use in anemic dogs because they are able to reduce the red series. Ketoprofen is contraindicated in patients with hypoalbuminemia. Long term celecoxib therapy should be used cautiously in dogs with immunosuppressive processes, since it was able to reduce the white blood cell counts. / O presente estudo teve como objetivo avaliar as alterações bioquímicas cardíacas e hepáticas, hematologia e hemostasia de cães saudáveis, submetidos à terapia com anti-inflamatórios não-esteroidais não seletivos (AINEs), COX-2 preferenciais e COX-2 seletivos. Foram utilizados 30 cães, sem raça definida, adultos, machos e fêmeas, clinicamente sadios, divididos aleatoriamente em 5 grupos (G) de 6 animais, que receberam as seguintes terapias: cetoprofeno, nimesulida, meloxican, etodolaco e celecoxibe. O hemograma, perfil hemostático (tempo de coagulação (TC), tempo de protrombina (TP), tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), plaquetas e fibrinogênio), biomarcadores cardíacos (creatinofosfoquinase (CK) e sua fração MB- CKMB) e função hepática (alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e albumina) foram avaliados antes, aos 5, 10 dias (T0, T5 e T10) de tratamento em todos os grupos, e também aos 20 dias (T20) de tratamento no celecoxibe. O TC revelou aumento significativo no T5 no grupo cetoprofeno, enquanto no grupo nimesulida houve aumento significativo no T10, em ambos os grupos em relação ao T0. No TP, o grupo etodolaco revelou redução significativa no T5 em relação ao T0, enquanto a contagem de plaquetas aumentou no T10 em relação ao T0 e T5 no cetoprofeno. As hemáceas e o Ht diminuiram no T10 em relação ao T0 no cetoprofeno, enquanto no grupo celecoxibe houve redução no T20 em relação ao T0. O celecoxibe revelou diminuição dos valores de Leucócitos totais, neutrófilos e linfócitos no T20. No grupo celecoxibe houve aumento significativo de CKMB, CK, e ALT. Redução da albumina sérica ocorreu nos grupos cetoprofeno e nimesulida no T10 e T5 e T10, respectivamente. Em conclusão, o meloxican foi o fármaco que se revelou mais seguro para uso em cães, em relação aos aspectos avaliados. Os AINEs cetoprofeno, nimesulida e etodolaco devem ser usados criteriosamente em pacientes portadores de disfunções do perfil de coagulação, uma vez que promovem prolongamento do mesmo, enquanto o celecoxibe revela-se seguro neste aspecto, mesmo sob terapia prolongada. Celecoxibe e cetoprofeno exigem atenção para uso em cães anêmicos, pois são capazes de reduzir a série vermelha. O uso de cetoprofeno em pacientes com hipoalbuminemia é contra-indicado Celecoxibe em terapia prolongada deve ser usado cautelosamente em portadores de processos imunossupressores, uma vez que foi capaz de reduzir a leucometria.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rivaldo.pdf: 292230 bytes, checksum: a2cbda0e4eeea6a416fde16f3f375530 (MD5) Previous issue date: 2011-09-26 / This study aimed to evaluate the heart and liver biomarkers, hematology and hemostasis in healthy dogs, submitted to therapy with nonsteroidal anti-inflammatory non-selective (NSAID), COX-2 preferential and COX-2 selective drugs. Were used 30 mongrel dogs, adults, males and females, clinically healthy, randomly divided into 5 groups (G) of 6 animals, that received the follow therapies: ketoprofen, nimesulide, meloxican, etodolac and celecoxib. The blood count, hemostatic profile (clotting time (CT), prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), platelets and fibrinogen), cardiac biomarkers (CK, CKMB) and liver function (ALT, AST and albumin) were evaluate before, at 5 and 10 days (T0, T5, T10) of treatment in all treatment groups, and at 20 days (T20) treatment in celecoxib. The CT scan showed significant increase in the ketoprofen group at T5, while in the nimesulide group significantly increased at T10, in both groups when compared to T0. In TP, the etodolac group showed significant reduction in the T5 compared to T0, while the platelet count increased at T10 compared to T0 and T5 in the ketoprofen group. The red blood cells and Ht decreased in T10 compared to T0 in the ketoprofen group, while the reduction in the celecoxib group T20 compared to T0. The celecoxib group revealed decreased values of total leukocytes, neutrophils and lymphocytes in the T20. Significant increase in CKMB, LDH, and ALT were observed in the celecoxib group. Reduction of serum albumin occurred in the nimesulide and ketoprofen groups in T5 and T10 and T10, respectively. In conclusion, meloxican was the safest drug to NSAID therapy in dogs. The NSAIDs ketoprofen, nimesulide and etodolac should be used judiciously in patients with dysfunction of coagulation profile, once that promote increase in coagulation parameters. Celecoxib appears to be safe in relation to the coagulation, even under prolonged therapy. Celecoxib and ketoprofen therapy requires attention for use in anemic dogs because they are able to reduce the red series. Ketoprofen is contraindicated in patients with hypoalbuminemia. Long term celecoxib therapy should be used cautiously in dogs with immunosuppressive processes, since it was able to reduce the white blood cell counts. / O presente estudo teve como objetivo avaliar as alterações bioquímicas cardíacas e hepáticas, hematologia e hemostasia de cães saudáveis, submetidos à terapia com anti-inflamatórios não-esteroidais não seletivos (AINEs), COX-2 preferenciais e COX-2 seletivos. Foram utilizados 30 cães, sem raça definida, adultos, machos e fêmeas, clinicamente sadios, divididos aleatoriamente em 5 grupos (G) de 6 animais, que receberam as seguintes terapias: cetoprofeno, nimesulida, meloxican, etodolaco e celecoxibe. O hemograma, perfil hemostático (tempo de coagulação (TC), tempo de protrombina (TP), tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), plaquetas e fibrinogênio), biomarcadores cardíacos (creatinofosfoquinase (CK) e sua fração MB- CKMB) e função hepática (alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e albumina) foram avaliados antes, aos 5, 10 dias (T0, T5 e T10) de tratamento em todos os grupos, e também aos 20 dias (T20) de tratamento no celecoxibe. O TC revelou aumento significativo no T5 no grupo cetoprofeno, enquanto no grupo nimesulida houve aumento significativo no T10, em ambos os grupos em relação ao T0. No TP, o grupo etodolaco revelou redução significativa no T5 em relação ao T0, enquanto a contagem de plaquetas aumentou no T10 em relação ao T0 e T5 no cetoprofeno. As hemáceas e o Ht diminuiram no T10 em relação ao T0 no cetoprofeno, enquanto no grupo celecoxibe houve redução no T20 em relação ao T0. O celecoxibe revelou diminuição dos valores de Leucócitos totais, neutrófilos e linfócitos no T20. No grupo celecoxibe houve aumento significativo de CKMB, CK, e ALT. Redução da albumina sérica ocorreu nos grupos cetoprofeno e nimesulida no T10 e T5 e T10, respectivamente. Em conclusão, o meloxican foi o fármaco que se revelou mais seguro para uso em cães, em relação aos aspectos avaliados. Os AINEs cetoprofeno, nimesulida e etodolaco devem ser usados criteriosamente em pacientes portadores de disfunções do perfil de coagulação, uma vez que promovem prolongamento do mesmo, enquanto o celecoxibe revela-se seguro neste aspecto, mesmo sob terapia prolongada. Celecoxibe e cetoprofeno exigem atenção para uso em cães anêmicos, pois são capazes de reduzir a série vermelha. O uso de cetoprofeno em pacientes com hipoalbuminemia é contra-indicado Celecoxibe em terapia prolongada deve ser usado cautelosamente em portadores de processos imunossupressores, uma vez que foi capaz de reduzir a leucometria.

Submitted by Adriana Martinez (amartinez@unoeste.br) on 2017-12-18T11:39:51Z No. of bitstreams: 1 Rivaldo Marini Filho.pdf: 197818 bytes, checksum: ae8b3afee2f83011a3937b0b0a8b0124 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-18T11:39:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rivaldo Marini Filho.pdf: 197818 bytes, checksum: ae8b3afee2f83011a3937b0b0a8b0124 (MD5) Previous issue date: 2011-09-26 / This study aimed to evaluate hematological and hemostatic parameters, cardiac and hepatic biomarkers in healthy dogs submitted to therapy with non-selective (NSAID) and COX-2 preferential nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Were used 24 healthy dogs, randomly divided into 4 groups (G) submitted to therapy with ketoprofen, nimesulide, meloxicam and etodolac. The blood count, hemostatic profile (clotting time (CT), prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), platelets and fibrinogen), cardiac biomarkers (CK, CKMB) and liver function (ALT, AST and albumin) were evaluate before, at 5 and 10 days (T0, T5, T10) of treatment. Were observed increase in CT in the ketoprofen and nimesulide groups at T5 and T10, respectivelly, when compared to T0. The etodolac group showed reduction in TP in T5 compared to T0. The platelet count increased at T10 compared to T0 and T5 in the ketoprofen group. The red blood cells and hematocrit decreased in at T10 in the ketoprofen group. Reduction of serum albumin occurred in the ketoprofen (T5 and T10) and nimesulide (T10) groups. In conclusion, meloxican was the safest drug to NSAID therapy in dogs. The NSAIDs ketoprofen, nimesulide and etodolac should be used judiciously in patients with dysfunction of coagulation profile, once that promote increase in coagulation parameters. Ketoprofen therapy requires attention for use in anemic dogs because they are able to reduce the red series, and in patients with hypoalbuminemia is contraindicated. / O presente estudo teve como objetivo avaliar a hemograma, hemostasia, biomarcadores cardíacos e função hepática de cães saudáveis tratados com anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) não seletivos e COX-2 preferenciais. Foram utilizados 24 cães clinicamente sadios, divididos em 4 grupos (G), que receberam as seguintes terapias: cetoprofeno, nimesulida, meloxicam, e etodolaco, durante 10 dias. O hemograma, perfil hemostático (tempo de coagulação (TC), tempo de protrombina (TP), tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), plaquetas e fibrinogênio), biomarcadores cardíacos (creatinofosfoquinase (CK) e sua fração MB- CKMB) e função hepática (alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e albumina foram avaliados antes, aos 5 e 10 dias (T0, T5 e T10) de tratamento. O TC revelou aumento significativo nos grupos cetoprofeno e nimesulida no T5 e T10, respectivamente, em relação ao T0. O grupo etodolaco revelou redução do TP no T5 em relação ao T0. A contagem de plaquetas aumentou no T10 em relação ao T0 e T5 no grupo cetoprofeno. As hemáceas e o Ht diminuiram no T10 no grupo cetoprofeno. Redução da albumina sérica ocorreu nos grupos cetoprofeno (T5 e T10) e nimesulida (T10). Em conclusão, o meloxican foi o fármaco que se revelou mais seguro para uso em cães, em relação aos aspectos avaliados. Os AINEs cetoprofeno, nimesulida e etodolaco devem ser usados criteriosamente em pacientes com disfunções do perfil de coagulação, uma vez que prolongam do mesmo. O cetoprofeno exige atenção para uso em cães anêmicos, pois é capaz de reduzir a série vermelha, e em pacientes com hipoalbuminemia é contra-indicado.

Linhagens celulares humanas tem despertado interesse como plataformas de produção de proteínas terapêuticas recombinantes por sua capacidade de realizar modificações pós-traducionais complexas e de modo similar à humana, sem gerar epítopos imunogênicos como ocorre com proteínas produzidas em células de mamíferos. Para a produção de uma proteína com correta qualidade terapêutica, as agências regulatórias recomendam processos livres de componentes animais de modo a evitar contaminação com vírus e príons. Deste modo, esse trabalho visa a produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante (FVIIr) utilizada no tratamento de hemofílicos com inibidores em células humanas adaptadas para meios de cultura livres de soro fetal bovino. As linhagens humanas SK-Hep-1, HKB-11 e Huh-7 foram adaptadas para suspensão e meios livres de soro fetal bovino (SFB). Essas células adaptadas foram transfectadas de forma transiente com o vetor lentiviral p1054-GFP e o reagente polietilenimina. No entanto, a baixa eficiência de transfecção nas células SK-Hep-1 e Huh-7 mostraram que essas linhagens são difíceis de transfectar por esse método, e mesmo a transfecção da célula HKB-11 só foi possível após a variação de alguns parâmetros, resultando em uma transfecção de 49,5% de células HKB-11 GFP-positivas. Desta forma, a expressão estável foi avaliada e as células adaptadas foram transduzidas com um ciclo de lentivírus (MOI = 1) contendo o vetor p1054-FVII. Foram observadas porcentagens de células GFP-positivas acima de 35% nas três linhagens celulares humanas modificadas. As células transduzidas foram submetidas a dois processos de sorting por citometria de fluxo, no qual a população obtida apresentava mais de 90% de células GFP-positivas. As três células foram avaliadas com relação à expressão de FVIIr após a adição de vitamina K no cultivo, no entanto, não foi possível detectar níveis de FVIIr no sobrenadante de 48 horas do cultivo dessas células pelo teste ELISA. As células foram transduzidas com um segundo ciclo de lentivírus (MOI = 2). A quantificação por ELISA do sobrenadante de 48 horas de cultivo das três células detectou 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL e 78,46 ng/mL de FVII total, respectivamente, nos cultivos das células HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C e Huh-7-F7-2C. A expressão relativa de RNA mensageiro por RT-PCR também foi observada nos três cultivos. Paralelamente, foi analisado o proteoma das três células adaptadas e não-adaptadas em triplicata sendo identificadas de forma abundante proteínas do citoesqueleto, do metabolismo celular, da síntese, enovelamento e degradação de proteínas, relacionadas à apoptose, ao ciclo celular e ao crescimento, proteínas contra estresse oxidativo e osmótico, com ação antioxidante, entre outras. / Human cell lines have attracted great interest as a plarform for recombinant therapeutic proteins production, due their ability to perform complex posttranslational modification in a similar manner to human proteins. These proteins do not carry immunogenic epitopes as occurs with proteins produced in mammalian cells. These therapeutic proteins should be produced in a animal-free process avoiding virus and prion contamination, as recommended by regulatory agencies for quality control. Thus, this work aims the production of recombinant blood coagulation factor VII (rFVII) used in the treatment of hemophiliacs with inhibitors in human cell lines adapted to serum-free suspension cultures. Human cell lines SK-Hep-1, HKB-11 and Huh-7 were adapted to suspension and serum-free media. These adapted cells were transiently transfected with p1054-GFP lentiviral vector and the polyethyleneimine reagent. However, low transfection efficiency in SK-Hep-1 and Huh-7 cells showed that these cells are difficult to transfect by this method, and even transfection of HKB-11 cell was only possible after varying some parameters, resulting in a 49,5% HKB-11 GFP-positive cells. Stable transfection was assessed and adapted cells were transduced with lentivirus particles containing p1054-FVII vector in one cycle (MOI=1). Percentages of GFP-positive cells above 35% were observed in three modified human cell lines. Transduced cells were sorted by FACS and more than 90% of GFP-positive cells were obtained. The expression of rFVII were evaluated by ELISA test after vitamin K supplementation, however, it was not possible to detect FVII levels in the 48 hour culture supernatant. Cells were transduced again with a second lentivirus cycle (MOI = 2). ELISA quantification of the 48 hour culture supernatant detected 240,96 ng/mL, 217,42 ng/mL and 78,46 ng/mL total FVII, respectively, in the cultures of HKB-11-F7-2C, SK-Hep-1-F7-2C and Huh-7-F7-2C cells. Relative expression of mRNA by RT-PCR was also observed in the three cultures assessed. In parallel, a proteomic analysis of adapted and non-adapted cells was performed in triplicate. Proteins related to cellular metabolism, cytoskeletal structure, apoptosis, cell cycle and cell growth, against oxidative and osmotic stress, antioxidant action were found.

Pacientes envenenados pela serpente Bothrops jararaca manifestam uma tendência hemorrágica em que a plaquetopenia é um achado consistente. Manifestações clínicas sistêmicas, como sangramento de mucosas e microangiopatia trombótica em alguns pacientes, apresentam similaridades com sinais clínicos de doença de von Willebrand e púrpura trombocitopênica trombótica. Algumas proteínas do veneno - como a botrocetina (uma proteína relacionada às lectinas do tipo C) e as metaloproteinases do veneno (SVMP) - interferem direta ou indiretamente na interação entre plaquetas e o fator de von Willebrand (vWF) in vitro e in vivo. E dessa forma, podem contribuir para os sangramentos induzidos pelo envenenamento devido à importância que o vWF tem para a hemostasia primária. Pensando em compreender a participação do vWF do organismo e a botrocetina e as SVMP do veneno bruto de B. jararaca (BjV) na plaquetopenia induzida pelo envenenamento, utilizamos dois modelos experimentais: ratos Wistar heterogênicos e camundongos nocautes do gene Vwf (Vwf-/-). No modelo em ratos, o BjV foi pré-incubado com salina (controle positivo), um inibidor de metaloproteinases (Na2-EDTA), anticorpos policlonais anti-botrocetina, glicerol (veículo dos anticorpos), ou a combinação do Na2-EDTA e anticorpos anti-botrocetina; o grupo controle negativo foi injetado somente com salina. Após a administração subcutânea (s.c.) dos venenos tratados (1,6 mg/kg), amostras de sangue foram coletadas após 3, 6 ou 24 h, e analisaram-se a contagem de plaquetas, quantificação antigênica (vWF:Ag) e da atividade de ligação do vWF ao colágeno (vWF:CB), a atividade de ADAMTS13, a distribuição multimérica de vWF, e a atividade coagulante de fator VIII (FVIII). Para explorar a participação do vWF na plaquetopenia, camundongos nocautes de vWF (Vwf-/-) e camundongos controles (C57BL/6) foram injetados s.c. com BjV incubado com salina (grupo positivo do envenenamento) ou apenas salina (grupo controle negativo). As injeções dos tratamentos, bem como os períodos analisados foram idênticos aos dos ratos. Em nossos resultados, todos os ratos injetados com algum tratamento de BjV, inclusive nos animais que receberam veneno pré-tratado com anticorpo anti-botrocetina e/ou Na2-EDTA, apresentaram plaquetopenia, com maior intensidade em 6 h. Na avaliação do vWF foi encontrada uma grande variação individual nos grupos de tratamentos, porém ainda assim houve uma tendência a redução nos níveis de vWF:Ag em 3 e 6 h nos ratos que receberam BjV sem inibidores. A administração de BjV tratado somente com anticorpo anti-botrocetina promoveu uma maior redução nos níveis de vWF:Ag em 3 h, com retorno aos níveis semelhantes aos de controle negativo em 6 h e 24 h. A inibição sozinha das metaloproteinases não promoveu efeito importante, porém em 6 h, potencializou a ação do anticorpo anti-botrocetina na inibição conjunta do decréscimo de vWF:Ag e vWF:CB. A análise dos multímeros do vWF mostrou perfis bastante variáveis individualmente, porém os multímeros de alto peso molecular e intermediário tenderam a diminuir e os de baixo peso a aumentar nos animais que receberam algum tratamento com BjV, especialmente em 24 h. Na dosagem de FVIII, houve redução em 3 e 6 h em todos os ratos que receberam qualquer tratamento de BjV, sem grandes variações entre esses grupos. A atividade de ADAMTS13 apresentou uma redução dos valores em 3 e 6 h, que foi revertida pela inibição das metaloproteinases do veneno. Já nos camundongos, a plaquetopenia esteve presente em todos os animais nocautes e controles que receberam BjV, mostrando ser independente da presença de vWF. Nos camundongos controles (C57BL/6), não houve alterações evidentes em vWF:Ag durante o envenenamento, porém em 3 h houve uma tendência a sua diminuição. Em conjunto, nossos resultados mostram que a presença da botrocetina no veneno bruto não afeta a plaquetopenia desencadeada pelo envenenamento, porém influencia o vWF plasmático quantitativa e funcionalmente. As metaloproteinases do veneno têm forte efeito sobre a enzima fisiológica reguladora da atividade biológica do vWF, a ADAMTS13, que indiretamente pode afetar os níveis de vWF. Ademais, a intensidade da plaquetopenia durante o envenenamento de B. jararaca não depende da presença de vWF, e tendo em conta o caráter multifatorial do consumo plaquetário durante o envenenamento, sugerimos que outros mecanismos possam ser responsáveis pela plaquetopenia induzida pelo BjV. Com isso, concluímos que o consumo de vWF no envenenamento por B. jararaca é um fator contribuinte, porém não determinante, para as alterações da contagem plaquetária / Patients bitten by Bothrops snakes manifest a bleeding tendency in which thrombocytopenia is consistently observed. Systemic clinical manifestations, such as mucous bleeding and thrombotic microangiopathy in some patients, share similarities with symptoms of von Willebrand disease and thrombotic thrombocytopenic purpura. Some venom proteins - e.g. botrocetin (a C-type lectin-related protein) and snake venom metalloproteinases (SVMP) - disturbs, direct or indirectly, the interaction between platelets and von Willebrand factor (vWF) in vitro and in vivo, and may contribute thereby to snakebite-induced bleedings, once vWF is required for primary hemostasis. To better understand the relation between plasma vWF, and botrocetin and SVMPs from B. jararaca crude venom (BjV) in the thrombocytopenia induced by envenomation, we used two experimental models: Wistar heterogenic rats and vWF knockout mice (Vwf-/-). In the rat model, BjV was pre-incubated with saline (positive control), metalloproteinase inhibitor (Na2-EDTA), polyclonal anti-botrocetin antibodies, glycerol (antibody vehicle), or the combination of Na2-EDTA and anti-botrocetin antibodies; the negative control group was injected with saline only. After subcutaneous injection (s.c.) of treated venom (1.6 mg/kg), blood samples were collected after 3, 6 or 24 h, and platelet count, vWF antigen (vWF:Ag) and collagenbinding activity (vWF:CB), ADAMTS13 activity, vWF multimer distribution, and factor VIII (FVIII) coagulant activity were analyzed. To investigate the participation of vWF in thrombocytopenia, vWF knockout mice (Vwf-/-) and control mice (C57BL/6) were injected s.c. with saline only (negative control group) or BjV pre-incubated with saline (positive control group). The same protocols used for rats were accomplished in mice. Our results showed that all rats injected with any BjV treatment, including animals which received anti-botrocetin antibodies and/or Na2-EDTA-treated BjV, showed thrombocytopenia, with the nadir at 6h. vWF analysis exhibited a large individual variation among treatment groups, but there was a tendency to reduce vWF:Ag levels at 3 and 6 h in rats that received BjV pre-incubated with saline (without any inhibitor). Administration of BjV pre-incubated only with anti-botrocetin antibodies evoked a large reduction in vWF:Ag levels at 3 h, which returned to levels similar to those of the negative control group at 6 and 24 h. SVMP inhibition alone did not induce an important effect, but potentialized the activity of anti-botrocetin antibodies to inhibit the fall in both vWF:Ag and vWF:CB levels at 6 h. VWF multimer analysis had a large individual profile variation, although animals that received any BjV treatment tended to decrease the high and intermediate molecular weight multimers and to increase the low ones, especially at 24 h. FVIII showed diminished levels in all rats that received any BjV treatment at 3 and 6 h, without important variations among groups. Decreased levels of ADAMTS13 activity were noticed at 3 and 6 h, which were reverted by SVMP inhibition. In mice, thrombocytopenia was present in all control and knockout mice that received BjV, demonstrating independence of vWF presence. In control mice (C57BL/6), there were no relevant alterations in vWF:Ag during envenomation, although at 3 h there was a tendency to decrease it. Al together, our results showed that botrocetin present in crude venom does not affect thrombocytopenia induced by envenomation, but it changes the levels and function of plasma vWF. SVMP had a marked effect in ADAMTS13, the physiological enzyme that regulates vWF biological activity, which may affect vWF levels indirectly. In addition, thrombocytopenia during B. jararaca envenomation is independent of vWF, and considering the multifactorial features of platelet consumption during envenomation, we suggest that other mechanisms might account for BjV-induced thrombocytopenia. Therefore, we conclude that vWF consumption during B. jararaca envenomation is an ancillary mechanism, but not the main one to decrease platelet counts

Distúrbios de hemostasia são uma das principais manifestações clínicas observadas nos acidentes por serpentes do gênero Bothrops. Tendo em vista a importância da ativação de fatores da cascata de coagulação no desenvolvimento da patologia no envenenamento, o presente trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease capaz de induzir a ativação de fatores de coagulação, a partir da peçonha de Bothrops moojeni. A metaloprotease foi isolada por três etapas cromatográficas utilizando colunas de exclusão molecular (Sephacryl S-200), interação hidrofóbica (Phenyl Sepharose) e troca aniônica (ES 502N). A protease isolada, denominada moojenactivase, é uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 89 kDa e ponto isoelétrico de 4,92, sendo composta por três cadeias com massas de 66; 17 e 14 kDa, ligadas por pontes dissulfeto. A determinação da sequência de aminoácidos por espectrometria de massas evidenciou grande identidade sequencial com outras metaloproteases, indicando a presença dos domínios metaloprotease, desintegrina-like e lectinas-like e classificando-a como uma protease da classe PIIId. Funcionalmente, a moojenactivase foi capaz de induzir a cogulação de plasma humano pela ativação dos fatores II (protrombina) e X da cascata de coagulação, gerando -trombina e fator X ativado, respectivamente. A protease apresentou atividade fibrinogenolítica, especialmente sobre a cadeia da molécula de fibrinogênio, porém não foi capaz de induzir a formação do coágulo de fibrina pela ativação deste. A moojenactivase foi parcialmente inibida quando incubada em condições de pH entre 3,5 e 5,0 e em pH 9,0, além de temperaturas acima de 60ºC, bem como na presença de ions Cu2+, além dos inibidores EDTA, SDS, DTT e soro anti-ofídico crotalico/botrópico. A protease induziu agregação plaquetária e não apresentou atividades fibrinolítica e hemorrágica. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) tratadas com a protease foram capazes de produzir TNF- assim como expressar fator tecidual (Fator III da coagulação) na forma ativa, fazendo com que essas células apresentassem caráter procoagulante. Com o objetivo avaliar os efeitos nos parâmetros hematológicos in vivo, a moojenactivase foi administrada em ratos (3g/Kg) onde foi observado que a protease foi capaz de prolongar o tempo de sangramento dos animais e induzir a diminuição do número de plaquetas sanguíneas, caracterizando um quadro de trombocitopenia. Ainda, o plasma dos animais administrados com a moojenactivase apresentaram valores elevados do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcialmente ativada, assim como redução na concentração de fibrinogênio. Na análise dos parâmetros da série branca, foi observado aumento leucocitário na circulação, com predominância de neutrófilos até 3h após a administração, indicando a instalação de um quadro inflamatório. Com relação à análise da série vermelha, a moojenactivase não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros estudados. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, o isolamento de uma metaloprotease da classe P-IIId da peçonha de Bothrops moojeni capaz de atuar sobre diferentes ii eventos do processo hemostático, sendo essa ação prócoagulante responsável pelo quadro de incoagulabilidade sanguínea em animais. Os dados gerados podem auxiliar no entendimento dos distúrbios de coagulação em pacientes envolvidos em acidentes por serpentes da espécie Bothrops moojeni, levando ao melhor direcionamento na terapia anti-ofídica. Ainda, a função da moojenactivase sobre componentes biológicos credencia a molécula para uma possível aplicação biotecnológica em processos que envolvem o sistema hemostático. / Haemostasis disorders are a major clinical manifestation induced by Bothrops snake envenomations. Considering the relevance of the activation of coagulation factors during the envenomation pathophysiology, the present work describes, for the first time, the isolation and functional and biochemical characterization of a coagulation factor activator metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom. The protease was purified by three chromatographic procedures using size exclusion (Sephacryl S-200), hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose) and anion exchange (ES 502N) chromatographies. The isolated protease, named moojenactivase, is a glycoprotein with molecular mass of approximately 89 kDa by SDS-PAGE, and composed of 66 kDa, 17 kDa and 14 kDa disulfide linked chains, with pI of 4,92. The amino acid sequence determination of tryptic peptides from moojenactivase by mass spectrometry presented fragments with high identity to snake venom metalloproteases, confirming the presence of the metalloprotease, disintegrin-like and lectin-like domains, which allowed its classification as a PIIId class snake venom metalloprotease. Regarding its functional properties, the protease was capable to induce human plasma coagulation by inducing activation of coagulation factors II and X, forming-thrombin and factor X activated, respectively. Also, moojenactivase presented fibrinogenolitic activity, by cleaving preferentially -chain of fibrinogen, however was not capable to induce the formation of fibrin clot from fibrinogen. The enzyme stability was assessed and showed that moojenactivase presented a reduced functional activity when preincubated in pH values ranging from 3,5 to 5,0 and at pH 9,0, and in temperature conditions over 60ºC. Cu2+ ions and inhibitors such as EDTA, SDS, DTT and crotalic/bothropic antiophidian serum reduced the protease activity. Moojenactivase induced platelet aggregation, but no fibrinolytic and haemorrhage activities. In order to evaluate the stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), cells were treated with the protease and we observed the release of proinflammatory cytokine TNF- and expression of active Tissue Factor (coagulant factor III), inducing a procoagulant state on PBMC. In order to evaluate in vivo haematological effects, the protease (3 g/Kg) was administered in rat (i.v.) and was observed that moojenactivase induced a prolonged bleeding time and reduced platelet counting (indicating a thrombocytopenia state). Moreover, the evaluation of the hemostasis parameters was assessed by the the prothrombin time and activated partial thromboplastin time assays and showed a prolonged clot time on both tests, and also a decrease in fibrinogen plasma levels. The leukogram analysis showed an increase in the circulating leukocyte number up to 3 hours after moojenactivase administration, composed predominantly of neutrophils. However, parameters envolving red cells shows that the protease do not affect. The results obtained in the present work show, for the first time, the isolation of a PIIId class metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom involved on the activation of several hemostatic events, inducing a pro coagulant activity and leading to blood unclottable state in experimental animals. These data can assit in understanding coagulation disturbs in iv patients involved in Bothrops moojeni envenomation and leading to a better anti ophidic therapy guidance. Moreover, moojenactivase functional activities accredits this protease as a possible molecular instrument applied on biotechnological prospect related to the hemostasis.