Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-01T12:01:10Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) ZILMA ANJOS.pdf: 965838 bytes, checksum: 562afc25b2650739b531bde86e398a7b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-01T12:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) ZILMA ANJOS.pdf: 965838 bytes, checksum: 562afc25b2650739b531bde86e398a7b (MD5) Previous issue date: 2014-12-04 / Ficolinas são moléculas de reconhecimento do sistema complemento capazes de promover opsonização, fagocitose e destruição de patógenos mediado pela ativação da via das lectinas. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes FCN1 e FCN2, que codificam as ficolinas 1 e 2, têm sido relacionadas com a susceptibilidade a doenças infecciosas e autoimunes. Nosso estudo teve como objetivo investigar a associação funcional dos polimorfismos de base única (SNPs) ou tagSNPs entre FCN1 e FCN2 e o desenvolvimento de diabetes mellitus tipo 1 (DM1). Dois SNPs no gene FCN1, rs2989727 e rs1071583 e três no FCN2, rs17514136, rs3124954 e rs7851696 foram estudados em 204 crianças e adolescentes com diagnóstico de DM1 e 193 indivíduos saudáveis do Nordeste do Brasil. Não encontramos associações diretas com o desenvolvimento do DM1 ou com a insurgência de doenças relacionadas com DM1, como doença celíaca (DC) e tireoidite autoimune (AIDT). No entanto, o genótipo T / T (rs1071583) da FCN1 foi associado com uma idade precoce quando do diagnóstico DM1 em comparação com C / C ou genótipos C / T (p = 0,02), em torno de dois anos de diferença. Assim, se a hipótese de que o genótipo T / T (rs1071583) não está diretamente envolvido nas etapas iniciais de DM1 início, mas, após o gatilho induzir DM1, os indivíduos com este genótipo podem aumentar / acelerar a resposta autoimune contra células – do pâncreas. Apesar dos nossos resultados indicarem importância de FCN1 no contexto do DM1, estudos adicionais de réplicas devem ser realizados para esclarecer o papel da ficolina no DM1. / Ficolins are innate immune proteins able to activate the complement system by the lectin pathway. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) of FCN1 and FCN2 genes, encoding for ficolin 1 and 2, have been related with susceptibility to infectious and autoimmune diseases. Our study aims at investigating the association between FCN1 and FCN2 functional of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or tagSNPs and the development of type 1 diabetes mellitus (T1D). Two SNPs at FCN1, rs2989727 and rs1071583 and three at FCN2, rs17514136, rs3124954 and rs7851696 were studied in 204 children diagnosed with T1D and 193 healthy individuals all from the Brazilian Northeast. No direct associations were found with the T1D onset or with the insurgence of T1D related celiac disease (CD) and autoimmune thyroiditis (AIDT). However, the genotype T/T (rs1071583) of FCN1 was associated with an early age at T1D diagnosis compared with C/C or C/T genotypes (p = 0.02), around two years of difference Thus, we hypothesize that the T/T genotype (rs1071583) is not directly involved in the initial steps of T1D onset, but, after the trigger inducing T1D, individuals carrying this genotype could increase/accelerate the pancreatic autoimmune response. Despite our results indicate some importance of FCN1 in the context of T1D, additional replica studies should be performed to clarify the role of ficolins in T1D.

Envenenamentos por serpentes do gênero Bothrops provocam reações sistêmicas e locais como coagulopatias, hemorragias, reação inflamatória, dor e mionecrose. Proteínas secretadas ricas em cisteínas (CRISPs) estão presentes nas peçonhas de serpentes e estão amplamente distribuídas entre mamíferos, répteis e anfíbios. Estão envolvidas em algumas reações biológicas, porém muitas funções ainda são desconhecidas. O presente trabalho objetivou o isolamento, a caracterização bioquímica/estrutural, enzimática e funcional, a avaliação do potencial inflamatório e avaliação da atividade sobre o sistema complemento de uma CRISP isolada da peçonha de Bothrops jararaca. A CRISP denominada BJ-CRP, foi isolada da peçonha de Bothrops jararaca através da combinação de três etapas cromatográficas: exclusão molecular em Sephacryl S-200, cromatografia de troca aniônica em coluna Source 15Q e cromatografia de fase reversa em coluna C18. O grau de homogeneidade foi determinado e confirmado por eletroforese SDS-PAGE, que mostrou uma banda única de 25,19 kDa, e por MALDI-TOF/TOF que apresentou a massa molecular de 24,6 kDa. A sequência N-terminal e a análise dos peptídeos trípticos por MALDI TOF/TOF demonstrou a presença de 100 resíduos de aminoácidos, os quais apresentaram até 96% de similaridade com sequências de outras CRISPs já descritas, porém de outros gêneros e espécies de serpentes, pois ainda não há CRISPs isoladas do gênero Bothrops. A BJ-CRP não possui atividade proteolítica sobre a azocaseína, o fibrinogênio e a fibrina. Também não apresentou atividade coagulante e hemorrágica, e não demonstrou atividade quando testada na concentração de 1?M em 13 diferentes canais para potássio dependentes de voltagem. Por outro lado, esta toxina foi capaz de induzir um processo inflamatório agudo (tempos de 1 e 4 horas), observado pelo recrutamento de neutrófilos e aumento da citocina pró-inflamatória IL-6 na cavidade peritoneal de camundongos. Ensaios realizados com a BJ-CRP e a peçonha de Bothrops jararaca mostraram modulação na atividade hemolítica promovida pela via clássica do sistema complemento. A BJ-CRP também promoveu ação direta sobre alguns componentes isolados do sistema complemento, como C3 e C4, conforme avaliado por SDS-PAGE e Western blot. O presente trabalho descreve a purificação da BJ-CRP, a primeira CRISP isolada da peçonha da serpente do gênero Bothrops. Os resultados obtidos são promissores e abrem perspectivas para o melhor entendimento desta classe de proteínas, e para a compreensão do mecanismo de ação desta classe de toxinas na resposta inflamatória induzida pelo envenenamento botrópico. / Envenomation by snakes from Bothrops genus is characterized by systemic and local effects such as coagulopathies, bleeding disorders, inflammation, pain and myonecrosis.The cysteine rich secretory proteins (CRISPs) are present in snake venoms and are widely distributed mammals, reptiles and amphibians. They are involved in certain biological activities, however many of their functions are still unknown. The aim of the present study was to isolate a CRISP from Bothrops jararaca and to biochemically/functionally characterize it by evaluating its involvement on inflammatory responses and on the complement system. The CRISP named BJ-CRP was isolated from Bothrops jararaca crude venom through the combination of three chromatographic steps: molecular exclusion on Sephacryl S-200 column, anion exchange chromatography on Source 15Q and reverse phase chromatography using C18 column. A high purity degree was obtained as confirmed by SDSPAGE, showing a single band of 25.19 kDa, and by MALDI-TOF/MS showing a molecular mass of 24.6 kDa. The N-terminal sequence and analysis of tryptic peptides by MALDI TOF/ MS resulted in the determination of 100 amino acid residues, which had up to 96% similarity to sequences from other snake venom CRISPs that were previously described, but from other genus and snake species. The BJ-CRP did not have proteolytic activity on azocasein, fibrinogen or fibrin. It did not show coagulant or hemorrhagic activity, and also did not show activity on 13 different voltage dependent potassium channels when tested at a concentration of 1?M. Moreover, this toxin was able to induce an acute inflammatory response (1 and 4 hours after injection), observed by the recruitment of neutrophils and increase of interleukin-6 into the peritoneal cavity of mice. BJ-CRP and B. jararaca crude venom were capable of modulating the hemolytic activity promoted by the classical pathway of the complement system, and BJ-CRP also showed direct action on some complement system components, such as C3 and C4 as evaluated by SDS-PAGE and Western blot. The present work describes the purification of BJ-CRP, the first CRISP isolated from a Bothrops snake venom. The results obtained showed to be promising and open up prospects in order to better understand the involvement of this class of toxins in the inflammatory response induced by Bothrops envenomation.

Tendo em vista a ocorrência de alterações no sistema imune relacionadas ao hipertireoidismo e à participação do sistema complemento (SC) em processos imunológicos, torna-se importante investigar se os hormônios tireoidianos teriam algum efeito sobre o SC. O SC é composto de uma série de proteínas séricas e de membrana que estão envolvidas em processos da resposta imune. Considerando que os hormônios tireoidianos estão envolvidos em uma série de processos biológicos, e que tanto o hipo- quanto hipertireoidismo podem acarretar alterações importantes nestes processos, os objetivos deste trabalho foram estudar o impacto de níveis séricos elevados de hormônios tireoidianos sobre a atividade do sistema complemento e produção de anticorpos. Foram utilizados ratos machos wistar para o modelo experimental de hipertireoidismo, investigando-se a atividade lítica das vias clássica/lectina e alternativa através de ensaios hemolíticos; os níveis séricos de fator B da via alternativa através do emprego de reagente deficiente de fator B; e a produção de anticorpos anti-hemácia de carneiro (SRBC) empregando ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) e ensaios de plaque forming cell (PFC). O hipertireoidismo induzido não resultou em alterações da atividade lítica das vias clássica/lectina. Entretanto, a elevação dos níveis séricos de hormônios tireoidianos provocou uma redução da atividade lítica de via alternativa, de forma significante em doses de 1, 5, 50 e 100g de levotiroxina/200g de peso animal após 14 dias de tratamento, e com dose a partir de 0,15g de triiodotironina/200g de peso animal, após 7 e 12 dias de tratamento. Os níveis séricos funcionais de fator B foram reduzidos nestas condições. Além disso, ocorre redução da resposta de produção de anticorpos em ratos tratados com T3 e imunizados com SRBC. Estes resultados mostram que níveis elevados de hormônio tireoideano reduzem a capacidade funcional da via alternativa do SC , avaliada pelo desencadeamento da lise em decorrência da interação com hemácias de coelho. Esta redução poderia levar a uma menor geração de fragmentos com atividade nos processos de seqüestro e apresentação do antígeno e interação com as células envolvidas na resposta imune, resultando em títulos menores de anticorpos produzidos. Estudos adicionais são necessários para avaliar estas possibilidades. As observações deste estudo podem auxiliar para o melhor entendimento do impacto biológico das disfunções hormonais sobre a atividade do sistema complemento. / Considering the alterations of the immune system that occur in the hyperthyroidism, and the involvement of the complement system (CS) in immune processes, this work aimed to investigate the effect of high levels of thyroid hormones on the CS and on the antibody production. The CS comprehends a group of serum and membrane proteins which activation leads to the generation of protein fragments or complexes with important biologic functions, such as participation in events of the immune response. Wistar adult male rats treated with thyroid hormones were used as experimental model of hyperthyroidism, to evaluate the lytic activity of classical/lectin and alternative pathways of the CS through hemolytic assays; the serum levels of factor B employing serum deficient of this component (RB); and the production of anti-sheep red blood cells (SRBC) antibodies through enzyme linked immunosorbent (ELISA) and plaque forming cell (PFC) assays. Classic and lectin pathways activity was not affected in the hyperthyroidism. However in this condition the alternative pathway activity was significantly reduced at doses of 1; 5; 50 and 100 g of thyroxine (T4) /200g of animal weight/day after 14 days of treatment, or crescent doses starting from 0,15 g of triiodothyronine (T3) for periods of 7 and 12 days of treatment. The serum levels of factor B were also reduced in these conditions. In addition, there was a reduction of the antibody response in rats treated with T3 and immunized with SRBC. These results show that the functional capacity of alternative pathway is decreased in consequence of high levels of thyroid hormones as evaluated by its lytic potency triggered by the rabbit erythrocytes. This could them lead to a reduced generation of complement fragments active in antigen sequestering and presentation, and on the interaction of cells in the immune response decreasing the antibody production. Additional studies are required to evaluate these possibilities.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-09-22T19:23:19Z No. of bitstreams: 1 thiagodealmeidaoliveira.pdf: 1376099 bytes, checksum: 1223858331fe263a8bdcce2a114266c5 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-09-27T13:42:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 thiagodealmeidaoliveira.pdf: 1376099 bytes, checksum: 1223858331fe263a8bdcce2a114266c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-27T13:42:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 thiagodealmeidaoliveira.pdf: 1376099 bytes, checksum: 1223858331fe263a8bdcce2a114266c5 (MD5) Previous issue date: 2017-06-28 / A modulação da resposta imune inata seria uma ferramenta capaz de elhorar a capacidade do sistema imune de combater a infecção por patógenos e outros estímulos externos. A utilização de vias sinalizadoras com a participação de alguns receptores específicos, como o peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα) surgiria como importante hipótese para modular a produção de proteínas de fase aguda e do complemento em hepatócitos bovinos, órgão principal envolvido nessa síntese. Nesse sentido, o presente trabalho se utilizou de técnicas de cultivo primário de hepatócitos bovinos, provenientes de 5 animais diferentes, que foram isolados, cultivados e estimulados com um ligante desse receptor nuclear, o fenofibrato. Após 48 horas de cultivo as células tiveram seu ácido ribonucleico (RNA) extraído e quantificado, seguindo-se à síntese de ácido desoxirribonucleico complementar (cDNA) e execução das reações em cadeia da polimerase quantitativo (qPCR), a fim de se verificar a expressão e produção de proteínas de fase aguda e do sistema complemento por meio de de reações de qPCR. Os sobrenadantes de cultura também foram avaliados após esse período de tempo, onde foram dosadas as mesmas proteínas, por meio da técnica de Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Os resultados demonstraram que o cultivo se provou ineficiente no que diz respeito à viabilidade celular e à quantificação de RNA extraído, indicando que mais estudos devem ser feitos para padronização dessa técnica. Além disso, os resultados demonstraram que o PPARα, ativado frente ao seu ligante específico, o fenofibrato, não foi capaz de modular a expressão e tampouco a produção dos fatores de complemento e das proteínas de fase aguda analisadas, podendo indicar que em hepatócitos bovinos a modulação por esse receptor não ocorre da mesma maneira como em humanos e em murinos. No entanto, devido à grande variabilidade racial dos animais cujos fígados foram coletados e ao pequeno número amostral utilizado, análises mais refinadas são necessárias. Dessa maneira, estudos devem ser realizados visando novas moléculas capazes de modular proteínas relacionadas ao sistema imune em bovinos. / The innate immune modulation is a tool capable of improve the immune system capacity to fight infections by pathogens and other external stimuli. The use of signaling paths with participation of some specific receptors, such as peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα) arises as an important hypothesis to modulate the acute phase proteins (APP) and complement proteins in bovine liver cells, where most of these molecules are produced in a systemic level. In this way, this work aimed to establish a protocol of primary culture of bovine hepatocytes suitable to analyze intracellular signaling paths and genetic expression and synthesis of proteins related to innate immune system. For that, bovine hepatocytes from five different animals were isolated, cultivated and activated by a receptor ligand - fenofibrate, both alone and associated with proinflammatory stimuli, in different concentrations. After 48 hours of culture, ribonucleic acid (RNA) was extracted and quantified, complementary deoxyribonucleic acid was synthetized and real-time polymerase chain reactions were setup to verify the acute phase and complement proteins expression and synthesis. The culture supernatant was used to analyze the protein dosage by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). The results showed that the hepatocytes isolation and culture were not very effective, since the extracted RNA showed low concentration and bad integrity, indicating that more studies must be performed to standardize this technique. Considering the low quantification and bad quality of RNA, it was not possible to access the role of the receptor PPARα in complement factors and acute phase proteins genetic expression and production, when activated by its specific ligand (fenofibrate). Thus, the development of isolation and culture techniques for bovine hepatocytes must continue to be developed in order to better evaluate the intracellular signaling pathways and the search for new molecules capable to modulate proteins related to the immune system in bovines.

Em trabalhos anteriores o nosso grupo mostrou que a vacina celular pertussis (wP) apresenta atividade adjuvante quando combinada a proteína A da superfície de Streptococcus pneumoniae (pneumococo), PspA, A formulação PspA5-wP induz altos níveis de anticorpos e proteção em camundongos após desafio com pneumococo. Neste trabalho foram avaliados os mecanismos da ação adjuvante e os componentes de B. pertussis responsáveis por este efeito. A imunização de camundongos com PspA em combinação a mutantes de B. pertussis ou componentes desta bactéria purificados mostrou que a presença da toxina pertussis (PT) capaz é essencial para induzir altos níveis de anticorpos anti-PspA e proteção significativa contra o desafio letal com pneumococo. Este efeito não foi dependente da atividade enzimática. Anticorpos anti-PspA e as proteínas do sistema complemento foram essenciais para a proteção conferida por PspA-wP. As vacinas celulares BCG e DTP combinadas a PspA, também apresentaram atividade adjuvante, induzindo anticorpos anti-PspA e proteção contra o desafio invasivo por pneumococo. / Previously our group showed that the pneumococcal surface protein A from Streptococcus pneumoniae (pneumococcus), PspA, when combined with cellular pertussis vaccine (wP) as adjuvant, induce high levels of antibodies and mice protection on pneumococcal challenge. In this work were used mutants and purified components derived from B. pertussis for investigate the components responsible for this adjuvant effect, through of mice immunizations in combination with the PspA5 (Clade 5 PspA) antigen. Pertussis toxin (PT) was able to inducing the higher levels of PspA5 specific antibodies and significative protection against the pneumococcal lethal challenge, independently of its enzymatic effect. Was observed that in the protection conferred by the PspA5-wP formulation thus as the anti-PspA5 antibodies, the complements proteins are essentials. Lastly, prime-boost experiments showed that the cellular vaccines BCG and DTP when combined to PspA5, induced high levels of anti-PspA5 antibodies and protection against invasive challenge with pneumococcus.

Human C-reactive protein (CRP), injected intravenously into mice or produced inside mice by a human transgene, protects mice from death following administration of lethal numbers of Streptococcus pneumoniae. The protective effect of CRP is due to reduction in the concentration of bacteria in the blood. The exact mechanism of CRP-dependent killing of pneumococci and the partners of CRP in this process are yet to be defined. The current efforts to determine the mechanism of action of CRP in mice are directed by four known in vitro functions of CRP: 1. the ability of pneumococcal C-polysaccharide-complexed CRP to activate complement pathways, 2. the ability of CRP to bind to Fcγ receptors on phagocytic cells, 3. the ability of CRP to bind to immobilized complement regulator protein factor H which can also be present on pneumococci, and, 4. the ability of CRP to interact with dendritic cells. CRP-treated dendritic cells may well be as host-defensive as CRP alone. An interesting condition for the protective function of CRP is that CRP must be given to mice within a few hours of the administration of pneumococci. CRP does not protect mice if given later, suggesting that CRP works prophylactically but not as a treatment for infection. However, full knowledge of CRP may lead to the development of CRP-based treatment strategies to control pneumococcal infection. Also, because CRP deficiency in humans has not yet been reported, it becomes important to investigate the deficiency of the mechanism of action of CRP in CRP-positive individuals.

Les nanomédecines injectées par voie intraveineuse interagissent avec les éléments biologiques qui les entourent dans le compartiment sanguin. Parmi ces interactions, celles avec les protéines sanguines se révèlent être très importantes dans le devenir de ces nanovecteurs, leur conférant une identité biologique influençant leur chemin jusqu’au tissu et aux cellules cibles. La compréhension et le contrôle de ces phénomènes reste un enjeu crucial dans le développement des nanomédecines. Des méthodes permettant une étude facilitée de ces interactions sont nécessaires à cet égard. Les travaux de cette thèse ont eu pour but de développer des méthodes, utilisables en routine, permettant une caractérisation fine des nanomédecines et de leurs interactions avec les protéines plasmatiques, applicables dans un contexte clinique. Ils s’inscrivent dans un projet intitulé « Nano Innovation for CancEr » (NICE, BPI France) regroupant un consortium de partenaires industriels en développement clinique de nanomédecines.Dans un premier temps, un travail bibliographique sur les méthodes actuellement mises en œuvre pour une telle caractérisation ont pu mettre en avant deux limitations majeures. (i) D’une part, la complexité des méthodes actuelles disponibles pour lesquelles la spécificité des équipements et l’expertise requise limitent une utilisation à large échelle. (ii) D’autre part, les propriétés aujourd’hui caractérisées en routine (taille, morphologie globale, charge) ne sont que grossières comparées à la finesse des processus biologiques qui interagissent et « analysent » les nanovecteurs une fois introduits dans le milieu biologique. Ces deux aspects limitent aujourd’hui un développement plus sûr des nanomédecines pour une bonne reproductibilité en clinique et garantir des essais de contrôle qualité fiables.Au cours de nos travaux, nous avons développé des méthodes permettant de répondre en partie à la problématique posée par la caractérisation des nanomédecines. Une méthode d’analyse à haut débit de l’activation du système du complément par immunoélectrophorèse en deux dimensions a été développée et validée. Elle permet l’analyse reproductible de l’activation de la protéine C3. Elle est applicable à l’étude de l’effet de la présence de nanoparticules dans le sérum humain et leur degré d’action sur la cascade du complément. Cette méthode a été utilisée pour mener une étude plus fondamentale du mécanisme de l’activation du système du complément en regard de l’architecture de la surface de nanoparticules.Une deuxième méthode d’étude de l’activation du complément produit par des nanomédecine a été proposée sur la base de la résonnance plasmonique de surface (SPR). Une puce permettant un screening automatisé de l’activation du complément a été développée. L’application de cette méthode comparée à d’autres méthodes d’études de l’activation du système du complément (Immunoélectrophorèse 2D, ELISA) a permis d’identifier des biais lors de leur application à l’évaluation des nanomédecines.Enfin, une approche originale de caractérisation de la surface de nanoparticules a été proposée utilisant des protéines pour sonder la capacité de la surface des nanoparticules à adsorber ou repousser ces dernières. Dans cette méthode, l’électrophorèse capillaire est utilisée comme outil analytique permettant une analyse directe de l’échantillon sans séparation préalable des nanomédecines.Les méthodes développées au cours de ces travaux peuvent être appliquées à la caractérisation de nanomédecines et proposées comme des méthodes de contrôle en routine de façon plus générale. Un développement de la caractérisation dans ce sens constitue l’un des leviers pour une translation plus fructueuse des nanomédecines entrant en phase clinique. / Nanomedicines injected intravenously interact with surrounding biological elements in the bloodstream. Among these interactions, those with blood proteins turn out to be very important regarding the becoming of the nanovectors. They acquire a biological identity upon interaction with proteins which influence their path to target tissue and cells. The understanding and mastering of these phenomena remains a crucial issue in nanomedicine development. Methods allowing an easier study of these interactions are needed. The aim of these PhD thesis was to develop such methods, usable on a routine basis in a clinical context, allowing a fine characterization of nanomedicines and their interactions with plasmatic proteins. This PhD is part of the project “Nano Innovation for CancEr” (NICE, BPI France), gathering a consortium of industrials partners developing clinical nanomedicines.In a first time, a bibliographic study about current methods used for such a characterization could identify two major limitations. (i) On one hand, the complexity of current available methods for which the equipment specificity and required expertise prevent their use at a large scale. (ii) On the other hand, properties today characterized on a daily basis (size, morphology, charge) are too rough compared to the sharpness of biological processes who interact and “analyze” the nanovectors introduced in biological media. These two aspects are limiting a safer development of nanomedicines as well as a good reproducibility of their action in clinics.During this thesis, we developed methods allowing a beginning of answer to the wide problematic of nanomedicine characterization. A method for a high throughput analysis of complement activation by nanomedicines via 2D immunoelectrophoresis was developed and validated. It allows the reproducible analysis of protein C3 fragmentation. This method is applicable to the study of the impact of nanoparticles in human serum and their degree of action on the complement cascade. This method has been used for a more fundamental study on complement activation pathways activated according to the architecture of nanoparticles surface.A second method for the study of complement activation produced by nanoparticles has been proposed using surface plasmon resonance (SPR). A chip allowing an automated screening of complement activation has been developed. This method was compared to other methods for complement activation study (2D immunoelectrophoresis, ELISA) and allowed the identification of bias during nanomedicine evaluation.Finally, an original approach for the characterization of nanomedicine’s surface architecture using proteins as molecular probes has been proposed. In this method, capillary electrophoresis has been used as analytical tool to allow a direct analysis of sample without preliminary nanoparticle removal step.Methods developed during this work can be applied to the characterization of nanomedicines and proposed as routine methods for quality control. A development of nanomedicines characterization in this direction constitute one of the lever for a more fruitful translation of nanomedicines entering in clinical phase.

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A Artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crônica e sistêmica, de etiologia desconhecida, que pode dificultar ou impossibilitar as funções habituais das articulações devido à destruição da cartilagem, edema e dor. A patogênese da AR envolve uma complexa inter-relação de fatores imunológicos, ambientais e genéticos, dificultando assim a descoberta de terapias eficientes. Na AR, o influxo de neutrófilos para a cavidade sinovial é predominante e contínuo de tal forma que, os neutrófilos são as células mais abundantes no sítio inflamatório. Uma vez ativados, os neutrófilos são capazes de produzir espécies reativas de oxigênio que, juntamente com enzimas proteolíticas, podem estar envolvidos na lesão articular observada nos pacientes com AR. A ativação dos neutrófilos pode ser mediada por receptores para IgG (Fc?R) e para o complemento (CR) presentes nas membranas dessas células, através da interação com complexos imunes (ICs). Esses receptores são também importantes moduladores das reações inflamatórias mediadas por ICs. Entretanto, a função do sistema complemento e dos Fc?R, bem como a importância de cada um na manifestação da AR ainda não está clara. Assim, neste estudo avaliou-se o metabolismo oxidativo de neutrófilos estimulados através de receptores Fc?R e Fc?R/CR em ambos os grupos de pacientes com AR, ativa e inativa, e em controles saudáveis. Esta função celular foi avaliada por quimioluminescência (QL) dependente de luminol e de lucigenina. Os resultados mostraram que não houve diferenças na produção de QL, tanto dependente de luminol quanto de lucigenina, quando mediada por Fc?R ou pela cooperação Fc?R/CR, em ambos os grupos de pacientes com AR comparados entre si e comparados com neutrófilos de indivíduos saudáveis. No entanto, a comparação do padrão da resposta de QL dentro de ambos os grupos de pacientes com AR, mostrou que a resposta celular aos IC opsonizados por soro humano de pacientes com AR (IC-IgG/SHAR) não foi significativamente significantemente maior em relação à observada para os IC não opsonizados, refletindo uma ausência da cooperação Fc?R/CR nestas células. Vale ressaltar que a atividade hemolítica do complemento sérico, tanto da via clássica/lectina quanto da alternativa, não foi diferente entre os grupos estudados. Quanto à expressão dos CR, somente no grupo de pacientes com AR ativa observou-se diferenças, sendo que CR1 estava aumentado em relação ao grupo controle (p<0,05) e CR3 aumentado quando comparado ao grupo de pacientes com AR inativa (p<0,05). A expressão dos Fc?R, CD32 e CD16, não foi diferente entre os grupos estudados. Ainda, as análises de correlação da expressão dos diferentes receptores de membrana mostraram: (i) correlação positiva CD16 vs CR1 somente nos grupos com AR, ativa e inativa; (ii) correlação positiva CD16 vs CR3 no grupo com AR ativa; (iii) ausência de correlação entre a expressão de CD32 e o número de neutrófilos CD32+ no grupo com AR ativa; e (iv) correlação positiva entre a expressão de CR3 e o número de neutrófilos CR3+ no grupo com AR ativa. O conjunto de resultados sugere que estas diferenças ocorrem apenas durante a atividade da doença, reforçando a hipótese que estas alterações sejam uma característica adquirida da doença. Desta forma, este estudo pode contribuir para esclarecer mecanismos envolvidos na patogênese da AR, que possam ser alvos em potencial para o desenvolvimento de agentes terapêuticos específicos para esta doença. / Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic and systemic inflammatory disease of unknown etiology that can impair the usual joint functions, due to cartilage damage, edema and pain. The RA pathogenesis involves multiple interacting immunological, environmental and genetic factors, making it difficult to find effective therapies. Neutrophils are the most abundant cells at AR inflammatory sites, since they migrate continuously to the synovial cavity. The activated neutrophils generate reactive oxygen species and release a variety of proteases that seem to be involved in the joint lesions of RA patients. Neutrophil activation can be mediated by membrane receptors for IgG (Fc?R) and for complement (CR) through interaction with immune complexes (IC). These receptors are also very important modulators of IC-mediated inflammatory reactions. However, the role of the complement system and Fc?R and the hierarchy of them in the manifestation of RA are still unclear. In this study, we evaluated the neutrophil oxidative burst induced by Fc?R and Fc?R/CR, from RA patients at active and inactive disease stages, and from healthy controls. This cellular function was assessed by luminol- and lucigenin-enhanced chemiluminescence (CL) systems. When neutrophils were stimulated via Fc?R or Fc?R/CR cooperation, we found that the cellular responses of active and inactive RA patients were not significantly different when compared to each other and to the healthy controls, by using both CL systems. However, the comparison between the active and inactive RA groups revealed that the CL responses triggered by IC opsonized with RA serum were not significantly higher than those observed for neutrophils stimulated only via Fc?R (IC-IgG), reflecting an absence of Fc?R/CR cooperation in these cells. In addition, the hemolytic activities of serum complement, classical/lectin and alternative pathways, were not different among the groups studied. With regard to the CR expression, only neutrophils from the active RA group showed an increased number of CR1 and CR3 on their surfaces when compared with the control (p<0.05) and the inactive RA groups (p<0.05), respectively. The Fc?R expressions, CD32 and CD16, were not different among the groups studied. In addition, correlation analysis of the expression among the different receptors showed: (i) a positive correlation CD16 vs CR1 in both RA groups, active and inactive; (ii) a positive correlation CD16 vs CR3 in the active RA group; (iii) an absence of correlation between the CD32/neutrophil expression and the number of this cell bearing CD32 in the active RA groups; and (iv) a positive correlation between the CR3/neutrophil expression and the number of this cell bearing CR3 in the active RA group. These results suggest that such differences could be occurring just during the activity of the RA, supporting once again an acquired characteristic of the disease. This study can contribute for the understanding of the mechanisms involved in the pathogenesis of the RA, which might become potential targets for the development of specific therapeutic agents for this disease.

Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos no Brasil. Seus venenos provocam efeitos locais em humanos e animais, como hemorragia, edema, dor e necrose, caracterizando uma resposta inflamatória, cujo mecanismo não está bem definido. Esses efeitos estão relacionados com a ação combinada de proteases, substâncias que induzem hemorragia e fosfolipases, bem como a liberação de mediadores endógenos gerados pelos venenos. Considerando que a ativação do sistema complemento (SC) e de funções celulares, como quimiotaxia, ativação, proliferação e citotoxicidade podem desempenhar papel importante nos processos inflamatórios e de lesão tecidual subsequentes ao envenenamento, o estudo propõe: a) investigar a capacidade dos venenos brutos de serpentes Bothrops jararacussu e Bothrops pirajai e das toxinas purificadas, serinoprotease de B. jararacussu (SPBj) e L-aminoácido oxidase de B. pirajai (LAAOBp), em modular a atividade do SC; b) avaliar a contribuição do efeito sobre o SC no recrutamento de leucócitos polimorfonucleares humanos (PMN); c) avaliar o potencial citotóxico direto dos venenos e toxinas sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); d) analisar o efeito dos venenos sobre a modulação da expressão dos marcadores de ativação CD69, CD25 e HLA-DR em células T, B e natural killer (NK). Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostraram que o veneno bruto de B. jararacussu foi citotóxico para PBMC apenas nas concentrações maiores, de 50 e 100g/mL, não apresentando citotoxicidade nas outras concentrações testadas. A serinoprotease apresentou baixa citotoxicidade para essas células, o que sugere a necessidade de maiores investigações quanto aos mecanismos que levam a essa morte celular. O aumento da viabilidade celular encontrado nas amostras incubadas com veneno bruto e LAAO de B. pirajai sugere possível indução de proliferação celular, que necessita de maiores estudos. Os resultados obtidos sugerem que os venenos brutos de B. jararacussu e B. pirajai são capazes de ativar o SC como observado nos ensaios cinéticos da VCVL e VA e de quimiotaxia de neutrófilos, onde ficou evidenciado que a migração celular foi devida a liberação dos fatores quimiotáticos do SC, C3a e C5a. e que suas respectivas toxinas, serinoprotease e LAAO apresentam efeitos moduladores sobre o SC humano, e estimulam investigações mais aprofundadas com a finalidade de se esclarecer os mecanismos de ação e identificar os componentes responsáveis pelos efeitos observados. Houve expressão aumentada de CD69, CD25 e HLA-DR nas células T CD4+ e CD8+, especialmente quando incubadas com veneno bruto de B. jararacussu e LAAO de B. pirajai, o que reflete ativação da resposta imune celular, e pode sugerir que este tipo de resposta desempenhe papel relevante na indução e/ou controle dos processos imunopatológicos decorrentes de envenenamentos por B. jararacussu e B. pirajai. Esta investigação visa fornecer subsídios para a possível utilização das toxinas para fins terapêuticos e como ferramentas para investigação dos mecanismos envolvidos nos processos fisiopatológicos que ocorrem em decorrência de picadas e também em outras doenças de caráter inflamatório. / Snakes of the genus Bothrops are responsible for 90% of snakebites in Brazil. Their venoms cause local effects in humans and animals, such as hemorrhage, edema, pain and necrosis, characteristic of an inflammatory response. The mechanism is not well defined. These effects are related to the combined action of proteases, substances that induce bleeding and phospholipases, as well as release of endogenous mediators generated by the venoms. Considering that activation of the complement system (CS) and cellular functions such as chemotaxis, activation, proliferation and cytotoxicity, may play a role in inflammatory processes and tissue injury following envenomation, the study proposes: a) to investigate the ability of crude venom of B. jararacussu and B. pirajai and the purified toxins, serineprotease of B. jararacussu and L-amino acid oxidase (LAAO) of B pirajai in modulating the activity of the CS, b) to assess the contribution of the effect on CS in the recruitment of human polymorphonuclear leukocytes (PMN), c) to assess the direct cytotoxic potential of venoms and toxins on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), d) to analyse the effect of venoms on the modulation of the expression of activation markers CD69, CD25 and HLA-DR on T, B and natural killer (NK) cells. The results of cytotoxicity assay showed that the crude venom of B. jararacussu was cytotoxic to PBMC only at higher concentrations, 50 and 100g/mL, showing no cytotoxicity in the other concentrations. The serineprotease showed low cytotoxicity to the cells, suggesting the need for further investigations about the mechanisms that lead to this cell death. The increase in cell viability found in samples incubated with crude venom of B. pirajai and LAAO suggests the possibility of induction of cell proliferation, which needs further study. The results suggest that the crude venom of B. jararacussu and B. pirajai are capable of activating the CS as observed in kinetic assays of classical pathwaylectin pathway and alternative pathway and neutrophil chemotaxis assay, where it was shown that cell migration was due to release of CS chemotactic factors, C3a and C5a, and that their respective toxins, serineprotease and LAAO have modulatory effects on human CS, and stimulate further research in order to clarify the mechanisms of action and identify the components responsible for the observed effects. There was increased expression of CD69, CD25 and HLA-DR on CD4+ and CD8+, especially when incubated with crude venom of B. jararacussu and LAAO of B. pirajai. It reflects activation of cellular immune response and may suggest that this type of response play an important role in the induction and/or control of immunopathological processes arising from envenomation by B. jararacussu and B. pirajai. This research aims to provide subsidies to the possible use of the toxin for therapeutic purposes and as tools for investigating mechanisms involved in pathophysiological processes that occur as a result of snakebites and also in other diseases of inflammatory nature.