京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(工学) / 甲第19006号 / 工博第4048号 / 新制||工||1623(附属図書館) / 31957 / 京都大学大学院工学研究科高分子化学専攻 / (主査)教授 中條 善樹, 教授 赤木 和夫, 教授 秋吉 一成 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy (Engineering) / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第19524号 / 理博第4184号 / 新制||理||1601(附属図書館) / 32560 / 京都大学大学院理学研究科化学専攻 / (主査)教授 大須賀 篤弘, 教授 依光 英樹, 教授 丸岡 啓二 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

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京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(エネルギー科学) / 甲第24252号 / エネ博第450号 / 新制||エネ||84(附属図書館) / 京都大学大学院エネルギー科学研究科エネルギー基礎科学専攻 / (主査)教授 森井 孝, 教授 片平 正人, 教授 佐川 尚 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Energy Science / Kyoto University / DFAM

Evolution in bacteria occurs through the combined effects of spontaneous mutations and horizontal gene transfer (HGT). Several mechanisms can lead to HGT: (i) transformation, the uptake of DNA from the environment; (ii) transduction, the transfer of DNA carried by a bacteriophage into another bacterium during infection; and (iii) conjugation, bacterial mating mediated by a conjugative plasmid like the F-factor. HGT through conjugation can lead to the transfer of resistance and virulence genes, which often reside on conjugative plasmids. Conjugation can occur both within a species or between different species. The F-factor plasmid may sometimes integrate into the chromosome by recombination if there is homology between IS elements on the plasmid and the chromosome. Cells with an integrated F-factor can transfer chromosomal DNA with high efficiency and are called Hfr-cells. There are two clinical pathogens (Klebsiella pneumoniae ST258 and Escherichia coli ST1193) that are highly successful (pathogenicity-wise) and thought to originate through the transfer of chromosomal DNA via conjugation creating unique strains with hybrid chromosomes.  Our question was how frequently the transfer of chromosomal DNA occurs when we use clinical isolates of E. coli with a plasmid and mate them with an E. coli recipient. We hypothesized that any conjugative plasmid might integrate into the chromosome, thus creatingHfr-cells with the potential for transfer of chromosomal DNA to create hybrid strains. Our prediction was that some clinical isolates should be able to transfer chromosomal DNA to another bacterial strain. By plating conjugation mixtures on selective medium where neither donor nor recipient could grow, we were able to isolate 15 possible transconjugants with hybridgenotypes occurring at a frequency of ~10-10.

The antimicrobial resistance (AMR) crisis, where new antibiotic discovery is not keeping pace with the emergence of resistant pathogens, is driven by mobile genetic elements (MGEs). MGEs can autonomously transfer between bacteria, along with AMR genes. The widespread use of antibiotics in the clinic, in agriculture, and animal husbandry, has accelerated the MGE-mediated transfer of AMR genes in the environment. However, despite playing such an important role in the AMR crisis, the dynamics and mechanisms behind the transmission of genes are poorly understood. Furthermore, which natural and man-made compounds inhibit or promote their movement in these environments is unknown. One method to combat the rise in AMR is to identify small molecules as probes to understand the molecular basis of transmission and apply this information to prevent MGE-mediated resistance dissemination. Since conjugation is the main mechanism for AMR gene transfer, targeting MGEs that use conjugation, such as conjugative plasmids (e.g. Tn1549) and conjugative transposons (e.g. F plasmid), has the potential to prevent the emergence of multi-drug resistant pathogens. In this work, a high throughput assay modeled after Tn1549 excision was screened against a library of known bioactive compounds to find modulators of the integrase and excisionase activity. Several fluoroquinolone antibiotics including ciprofloxacin were identified as dose-dependent inhibitors of excision, which acted by changing supercoiling levels in the cell. Ciprofloxacin enhanced conjugation frequency of Tn1549 at sub-MIC concentrations relative to an untreated control and inhibited conjugation frequency at higher concentrations. A second project was focused on a high throughput conjugation assay based on the separation of the lux operon between a donor and recipient cell, such that only transconjugants produce luminescence to reflect active gene transfer. This work furthers our understanding of the development of assays to target MGEs and screening for inhibitors of their movement. / Thesis / Master of Science (MSc) / Antibiotics are small molecules that cure bacterial infections. However, their efficacy is fading as a result of the ability of mobile genetic elements (MGEs) to spread antimicrobial resistance genes between bacteria. Conjugative plasmids (CPs) and conjugative transposons (CTns) are two of the major types of MGEs that contribute to the dissemination of antimicrobial resistance in pathogens. The goal of this research is to search for inhibitors of CTns and CPs in order to prevent the emergence of multi-drug resistant bacteria. High throughput assays were designed to model both a CTn (Tn1549) and a CP (F plasmid) to find small molecules targeting their movement. A screen of the Tn1549 excision assay identified fluoroquinolone antibiotics that inhibit excision in a dose-dependent manner and indirectly inhibit the integrase used to excise the CTn. Ciprofloxacin, a fluoroquinolone, inhibited the conjugation frequency of Tn1549. Future work will focus on identifying new inhibitors of these MGEs and their characterization.

The effect of a self-selected and semisynthetic diet on urinary conjugates levels was determined in 18 male adults (22-40 y). Urinary conjugates were also quantified to develop an index of detoxification using a multivariate approach. The four major urinary conjugates measured were glucuronides, sulfoconjugates, mercapturates, and amino acid conjugates. Subjects consumed a self-selected diet for three days and a semisynthetic diet for seven days. Mercapturates and amino acid conjugates were most affected by dietary change, excretion levels reduced by about 50% during the semisynthetic diet period (0.27±0.11 vs 0.14±0.02 mmol/24-h; 5.99 vs 3.03 mmol/24-h, respectively). Glucuronides were the least responsive to dietary change with no significant difference between the means of the two diet periods (self-selected diet 2.93±0.77; semisynthetic 3.21±0.29 mmol/24-h). Four methods for developing 'normal' ranges were presented: mean±SD; percentiles; principal component analysis (princomp); Mahalanobis distance (distquan). The four methods were compared. In summary, conjugate excretion levels were found to be sensitive to dietary changes, with some pathways more responsive than others. Also, the princomp and distquan methods were stressed because they are a multivariate approach which combine values for all three pathways and their interaction into a single value that would then be representative of an individual's total, or overall, detoxification level relative to the others in this group. / Ph. D.

Der photorefraktive Effekt in Bariumtitanat-Kristallen ist Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten. Der Grund sind die großen elektrooptischen Koeffizienten dieses Materials, die nur von wenigen, kommerziell noch nicht erhältlichen Kristallen übertroffen werden, z.B. von tetragonalem Kalium-Tantalat-Niobat. Beleuchtet man diese Materialien mit Laserstrahlen, treten einzigartige Effekte auf. So erzeugen z.B. photorefraktive parametrische Verstärkungsprozesse charakteristische kreis- oder linienförmige Streulichtfiguren. Faszinierende Möglichkeiten bieten diese parametrischen Prozesse bei der Verstärkung und Phasenkonjugation von Lichtwellen. In dieser Arbeit werden alle 57 photorefraktiven parametrischen Prozesse, die in den untersuchten Materialien auftreten können, zunächst phänomenologisch analysiert. Das Lösen der gekoppelten Wellengleichungen filtert aus der Vielzahl der Prozesse diejenigen heraus, die eine besonders effiziente Wechselwirkung einfallender Lichtwellen versprechen. Für diese Prozesse werden anschließend explizit Verstärkungsfaktoren berechnet. Durch die Berücksichtigung elastooptischer, piezoelektrischer und raumladungsbegrenzender Effekte können die Einfallswinkel der Lichtstrahlen und die Orientierungen der Kristalle für die Signalstrahlverstärkung und die Phasenkonjugation optimiert werden. Auf der Basis dieser theoretischen Vorarbeiten gelingt im experimentellen Teil dieser Arbeit zum ersten Mal die Verstärkung eines Laserstrahls durch einen photorefraktiven parametrischen Prozeß. Die Verstärkung beträgt in einem 3,2 Millimeter dicken Bariumtitanat-Kristall 9000. Eine Besonderheit der angewandten Verstärkungsprozesse ist die sehr geringe räumliche Bandbreite. Die daraus folgende große Winkelselektivität verspricht viele Anwendungsmöglichkeiten in der optischen Meßtechnik, schränkt den Einsatz zur Bildverstärkung jedoch erheblich ein. Ebenfalls zum ersten Mal wird die Phasenkonjugation durch einen phototrefraktiven parametrischen Prozeß demonstriert. Die Intensitäten der erzeugten phasenkonjugierten Wellen entsprechen denen der verstärkten Signalstrahlen. Es lassen sich also Reflektivitäten bis zu 9000 realisieren. Zudem kann durch eine spezielle Konfiguration mit frequenzverstimmten Signalstrahlen ein prinzipielles Problem der photorefraktiven Wellenmischung gelöst werden: Die Verstärkung sehr schwacher Signalstrahlen. Durch die neu entwickelte Methode der Rauschunterdrückung gelingt es, Lichtwellen mit Leistungen unter einem Nanowatt um mehrere Größenordnungen zu verstärken. Zum Abschluß werden die parametrischen Prozesse noch in Kalium-Tantalat-Niobat untersucht. Bei diesen ersten Untersuchungen gelingt der Nachweis von fünf Prozessen. Die beobachteten ausgeprägten Effekte und die gemessenen riesigen elektrooptischen Koeffizienten zeigen, daß tetragonale Kalium-Tantalat-Niobat-Kristalle ebenfalls sehr interessant für die photorefraktive Wellenmischung sind.

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Bei Thiomersal handelt es sich um ein quecksilberhaltiges Konservierungsmittel in Medizinprodukten, welches auch in Impfstoffen Verwendung findet. In dieser Arbeit wurden die Toxizität von Thiomersal und von Glutathionkonjugaten seiner Dissoziationsprodukte sowie zum Vergleich die Toxizität von zwei strukturell mit Thiomersal bzw. seinen Metaboliten verwandten Referenzsubstanzen, p-Chlormercuribenzoesäure und Ethylquecksilberchlorid, in Zellsystemen mit humanen Zellen vom Typ A-549 und Hep-G2 untersucht. Alle fünf Substanzen führten zu einer dosisabhängigen Vitalitätsreduktion bei beiden Zelllinien. Die stärkste Vitalitätsreduktion wurde durch Ethylquecksilberchlorid erzielt, danach folgten in absteigender Reihenfolge Thiomersal, Ethylquecksilber-L-Glutathion und p-Chlormercuribenzoesäure. Den schwächsten vitalitätsreduzierenden Effekt zeigte Thiosalicyl-L-Glutathion-Disulfid. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die Glutathion-Konjugation von Thiomersal zu einer Abschwächung der Toxizität im menschlichen Organismus führt und untermauern die Annahme einer protektiven Wirkung von Glutathion. Die giftende Rolle von Glutathion in Bioaktivierungsprozessen anderer Noxen wird diskutiert. Es wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Beitrag zum besseren Verständnis der Toxizität von Thiomersal im humanen Organismus geleistet und darüber hinaus Bezüge zum potentiellen allergenen Potential von Thiomersal hergestellt.