Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont des cellules dendritiques spécialisées, aussi connues sous le nom de cellules productrices d’interféron-α (IFN-α). Les pDC jouent un rôle essentiel dans l’induction de la réponse immunitaire antivirale, en reconnaissant les antigènes viraux via les Toll-like receptors (TLR) 7 et 9. Toutefois, les pDC du sang de cordon sont incapables de produire de l’IFN-α en réponse à une stimulation du TLR9, mais leur maturation en cellules présentatrices d’antigènes est normale. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés aux effets des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous avons analysé l’effet, seules ou en combinaison, de la progestérone (PG), de l'interleukine (IL)-10 et du tumor growth factor (TGF)-β sur la différenciation et la fonction des pDC. Nous démontrons qu’à des niveaux supra-physiologiques ces trois facteurs modulent la différenciation et la production d’IFN-α des pDC. À des niveaux observés dans le sang de cordon, ces facteurs ont peu d’impact sur les pDC lorsque utilisés individuellement. Toutefois lorsque utilisés en combinaison, ils diminuent la production d’IFN-α. Nous avons aussi démontré que la PG, l’IL-10 et le TGF-β n’induisent pas l’expression des micro-ARN 146a et 155 par les pDC. Finalement nous démontrons que les niveaux de ces molécules sont plus élevés dans le sang de cordon que dans le sang d’adulte. Nos résultats révèlent le rôle important des facteurs immuno-régulateurs sécrétés par le placenta sur la fonction des pDC et en conséquence, sur la réponse immunitaire fœtale et néonatale. / Plasmacytoid dendritic cells (pDC) are specialized dendritic cells, also known as IFN-α producing cells. pDC are key inducers of immune responses following viral infections, by detecting viral antigens through the Toll-like-receptors (TLR) 7 and 9. Although cord blood pDC are unable to produce IFN-α after stimulation, they retain their capacity to mature into antigen presenting cells. To gain insights into the mechanisms of pDC regulation in cord blood, we investigated the effects of immune regulators secreted by the placenta on the differentiation and function of pDC. Using in vitro differentiated pDC, we analyzed the effect of progesterone (PG), IL-10 and TGF-β, separately or in combination, on pDC differentiation and activation. The data revealed that supra-physiological concentrations of these three factors could individually impair pDC differentiation and IFN-α production. Physiological concentrations of PG, IL-10 or TGF-β, individually, had low impact on pDC while in combination they were able to modulate IFN-α production. We also showed that PG, IL-10 or TGF-β failed to induce the expression of micro-RNA 146a and 155 in pDC. Lastly, our results indicated that PG, IL-10 and TGF-β were present at high levels in cord blood as compared to adult blood. These results, therefore, shed new light on the synergy of immune regulators secreted by the placenta and their impact on foetal and neonatal immune responses.

Le système immunitaire néonatal est caractérisé par une susceptibilité accrue aux infections par des pathogènes intracellulaires et des réponses vaccinales altérées. Ces caractéristiques soulignent la capacité limitée du nouveau-né à développer des réponses immunes à médiation cellulaire.<p>Les LTγδ représentent le prototype des lymphocytes T non-conventionnels :ils sont capables de réagir très rapidement après activation et sont caractérisés par une activité qui n’est pas restreinte aux molécules du CMH. Les LTγδ qui expriment le TCR Vγ9Vδ2 constituent la population majoritaire (60-90%) de LTγδ dans le sang périphérique humain adulte. Ces cellules reconnaissent spécifiquement les phosphoantigènes, des molécules non-peptidiques de faible poids moléculaire tel que l’HMB-PP. Cet activateur naturel est un intermédiaire de la voie non-mévalonate de biosynthèse des isoprénoïdes, essentielle à de nombreux agents pathogènes. Ces cellules sont également capables de réagir aux aminobisphosphonates, drogues couramment utilisées en thérapie du cancer. Le zolédronate (Zometa) est le plus puissant des aminobisphosphonates. Grâce à leur capacité à sécréter rapidement des cytokines comme l’IFN-γ et le TNF-α ainsi qu’à leur puissante activité cytotoxique, les LT Vγ9Vδ2 jouent un rôle important dans le contrôle des infections et des cancers.<p><p>Au contraire des LTγδ de l’adulte, la fonction des LTγδ du nouveau-né est peu connue. Cependant, des évidences suggèrent que ces lymphocytes pourraient jouer un rôle particulièrement important en début de vie. Dans ce contexte, nous avons caractérisé en détail la réponse des LTγδ du sang de cordon ombilical humain après stimulation avec l’HMB-PP et le zolédronate. Contrairement à l’HMB-PP, le zolédronate induit la prolifération et la production d’IFN-γ par les LT Vγ9 du nouveau-né. L’IL-23 étant une cytokine produite de façon optimale par les DCs en début de vie, nous avons choisi d’étudier son influence sur le profil d’activation de ces cellules. L’ajout d’IL-23 au zolédronate augmente l’expression d’IFN-γ et génère une population distincte de LT Vγ9 négatifs pour l’IFN-γ et produisant de l’IL-17. De plus, l’IL-23 favorise la synthèse de plusieurs médiateurs cytotoxiques (perforine, granzymes A et B, granulysine) induits par le zolédronate. Alors que l’effet co-stimulateur de l’IL-23 sur la production d’IFN-γ et de molécules cytotoxiques est également observé au sein des LT Vγ9 de l’adulte, l’induction d’une sous-population IL-17+ IFN-γ- est unique aux LT Vγ9 du nouveau-né.<p>Afin de mieux définir les conditions requises pour induire la polarisation des LT Vγ9 du nouveau-né en cellules productrices d’IL-17, nous avons évalué l’effet de diverses cytokines ainsi que celui de dérivés microbiens sur l’activation de ces cellules au zolédronate. Le zolédronate en présence d’IL-1β ou de LPS génère une population distincte de LT Vγ9 IL-17+ IFN-γ-. De plus, l’ajout d’IL-1β au zolédronate n’augmente pas le pourcentage de LT Vγ9 producteurs d’IFN-γ. Nous avons ensuite comparé le phénotype des LT Vγ9 IL-17+ à celui des LT Vγ9 IFN-γ+. Nos résultats indiquent qu’une fraction des LT Vγ9 sécrétant l’IL-17 exprime sélectivement CCR6 contrairement aux LT Vγ9 producteurs d’IFN-γ.<p><p>En conclusion, ce travail a permis de révéler la capacité des LT Vγ9 du nouveau-né humain à se différencier en cellules productrices d’IFN-γ, d’IL-17 et de molécules cytotoxiques. Ces cellules pourraient donc constituer une première ligne de défense capable d’orchestrer une réponse immune efficace à l’encontre de dérivés microbiens ou de signaux endogènes de danger. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La surveillance du bien-être fœtal pendant le travail repose essentiellement sur l’enregistrement du rythme cardiaque fœtal (RCF). Celui-ci, même continu pendant le travail, ne permet pas d’évaluer parfaitement l’oxygénation du fœtus ni le risque d’asphyxie néonatale. En effet, cet outil est imparfait et son évaluation subjective avec une importante variabilité d’interprétation inter et intra opérateur. Des examens dits de seconde ligne sont utilisés en pratique courante pour caractériser l’état fœtal : le prélèvement de sang fœtal au scalp pour l’étude de l’équilibre acido-basique du fœtus (pH ou lactates) ou la pose d’électrode au scalp pour étudier l’ECG fœtal (analyse du segment ST). Ces techniques sont néanmoins invasives et sont soumises à des contraintes techniques. Il y a donc un intérêt à développer des moyens d’évaluation du bien être fœtal à la fois objectifs et non invasifs afin de diminuer la survenue d’une asphyxie périnatale. En effet, celle-ci touche 3 à 8 nouveaux nés pour 1000 naissances. La mortalité en période post-natale est de 25 à 50% des cas et ceux qui survivent développeront des troubles sévères (épilepsie, retard neuro-cognitif et comportemental, paralysie cérébrale…). Au cours de l’accouchement, l’asphyxie périnatale se caractérise par une diminution du pH artériel ombilical. Cette mesure du pH sanguin est donc la mesure de référence pour déterminer la sévérité de l’asphyxie.Une des voies étudiées pour améliorer le dépistage des fœtus à risque d’acidose est l’analyse des modifications du système nerveux autonome (SNA) par analyse de la variabilité du rythme cardiaque fœtal. En effet, la fréquence cardiaque fœtale est en permanence sous l’influence du système nerveux autonome et sa variabilité (VFC) est un reflet de la balance sympathique / parasympathique. Le CHU de Lille a développé une nouvelle méthode d’analyse continue de la VFC ayant montré son efficacité chez l’adulte et chez le nouveau né pour l’évaluation du SNA. L’objectif de ce travail de Thèse est d’adapter cette technologie à l’analyse du SNA fœtal pour obtenir un nouvel indice appelé Fetal Stress Index (FSI) et d’évaluer sa pertinence en situation d’acidose.Cette preuve de concept a été effectuée de manière expérimentale chez le fœtus de brebis. Elle s’est réalisée en 2 temps. Nous avons tout d’abord évalué la performance du FSI par rapport aux méthodes classiques d’analyse de la VFC en termes d’aptitude à détecter les variations du SNA. Après injection d’Atropine, parasympatholytique, ou de Propranolol, sympatholytique, nous avons montré que le FSI était une méthode efficace et spécifique d’évaluation des variations du tonus parasympathique du SNA. Cette étude a également montrée la supériorité du FSI par rapport aux méthodes classiques d’analyse de la VFC en termes de sensibilité et de spécificité. Dans un second temps, nous avons évalué ce nouvel indice comme facteur prédictif de l’état acido basique du fœtus dans 2 modèles expérimentaux d’occlusion cordonale. Dans le premier modèle, l’acidose était obtenue par une occlusion continue du cordon avec une réduction de partielle du débit ombilical. Dans le second, nous réalisions des occlusions totales répétées à intervalles réguliers afin de mimer les contractions utérines lors du travail. Dans les 2 études, nous avons observé une hausse du FSI en cas d’acidose avec une corrélation significative entre le FSI et le pH, mais aussi entre le FSI et les lactates dans le second modèle.En conclusion, le FSI constitue un bon reflet de l’activité parasympathique fœtale. Cet indice permet d’étudier les variations du SNA fœtal avec une meilleure sensibilité et une meilleure spécificité que les méthodes usuelles d’analyse de la VFC et semble bien corrélé à l’état acido basique fœtal. Il s’agit donc d’un indice prometteur qu’il sera intéressant d’incorporer dans une analyse multi paramétrique du rythme cardiaque fœtal. / The monitoring of fetal well being during labor is essentially based on fetal heart rate (FHR) analysis. The recording of FHR, even continuously during labor, does not fully assess fetal oxygenation or neonatal risk of asphyxia. Indeed, this tool is imperfect and subjective with an important inter and intra-operator variability. Second-line examinations to characterize the fetal state are currently used in routine practice, i.e. scalp fetal blood sampling to study the fetal acid-base balance (pH or lactates) or scalp electrode placement to study the fetal ECG (ST segment analysis). These techniques are nevertheless invasive and subject to technical constraints. There is therefore an interest in developing both objective and non-invasive means of evaluating fetal wellbeing to reduce neonatal encephalopathy. Indeed, its prevalence is about 3 to 8 per 1000 births. Post natal mortality is about 25 to 50% and survivors will hav severe diseases (epilepsy, neurologic impairment, cerebral palsy…).One of the possibilities studied to better identify fetuses at risk for acidosis is the analysis of changes in the autonomic nervous system (ANS) in response to hypoxia.Indeed, the regulation of heart rate is dependent on the ANS and thus, its variability is a reflection of the sympathetic / parasympathetic balance. Analysis of heart rate variability (HRV) is a recognized non-invasive tool that is used to assess ANS regulation. The CHU Lille has developed a new continuous tool for the analysis of HRV, which demonstrated its efficacity in adults and neonates to evaluate the ANS. The objective of this thesis was to develop its index, called Fetal Stress Index (FSI), in the fetus and to evaluate it in conditions of acidosis.The study was experimental in a sheep model chronically instrumented and was in 2 steps. First, we evaluate the performance of our method compared to commonly used HRV analysis, regarding the ability to detect the variation of variations of the ANS. After injection of atropine, to inhibit parasympathetic tone, or propranolol to block sympathetic activity, we shown that our method appeared to be effective in detecting parasympathetic inhibition and, moreover, was superior to classical analysis of HRV in terms of sensibility and specificity.In a second time, we evaluated this new index as a predictive factor of the fetal acid-base state in 2 experimental models of fetal hypoxia by occlusion of the cord. In the first one, acidosis was obtained through a partial occlusion of the umbilical cord and in the second one, though repetitive complete occlusion as uterine contractions during labor. In those two studies, we observed a raise of our index in case of acidosis with a correlation beetween FSI and pH and also FSI and lactates in the second model.In conclusion, the FSI reflects fetal parasympathetic activity, has a better detection than others usual methods, and seems well correlated to fetal acid-base status. It is a promising index and it will be interesting to incorporate it in a multi parametric analysis of fetal heart rate to predict acidosis.

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) sont considérées comme quantitativement et qualitativement supérieures aux autres types cellulaires pour la synthèse des interférons (IFNs) de type I lors d’une infection virale. Plusieurs observations viennent supporter cette désignation. Tout d’abord, elles expriment un éventail très large des sous-types d’IFN-alpha en comparaison aux autres types cellulaires. Par ailleurs, elles possèdent la capacité de détecter la présence des virus via leurs TLR7 et TLR9, reconnaissant respectivement l’ARN ou l’ADN d’origine virale. Enfin, elles expriment de manière constitutive dans leur cytoplasme le facteur de transcription IRF-7 qui permet une synthèse rapide et robuste des IFNs de type I en réponse à l’infection. <p>Dans un précédent travail, il a été montré que les pDCs néonatales présentent un défaut majeur de synthèse d’IFN-alpha en réponse aux CpG ODNs, ligands du TLR9. Nous avons ensuite étendu notre étude des pDCs néonatales en les stimulant avec le R-848, ligand du TLR7, mais également en présence de virus tels que HCMV et HSV. Dans ces conditions également, la synthèse de l’IFN-alpha est déficiente dans les pDCs du nouveau-né. Nous avons également observé une déficience de production de l’IFN-beta suite à une stimulation via les ligands TLR7 et TLR9, tant au niveau protéique que de l’expression de l’ARN messager. Par ailleurs, la synthèse des cytokines/chimiokines inflammatoires par les pDCs du sang de cordon ainsi que leur maturation, fonctions dépendantes du facteur NF-kappaB, sont également diminuées en comparaison aux pDCs adultes, suite à une stimulation en présence du CpG ODN ou du R-848.<p>L’ensemble de ces données nous a amené à étudier de manière plus précise les voies de signalisation des pDCs néonatales suite à leur activation. Tout d’abord, nous avons observé que les taux d’expression des TLR7 et 9 tout comme le taux basal d’IRF-7 sont équivalents dans les pDCs néonatales et les pDCs adultes. Ensuite, grâce à la technique d’ImageStream (Amnis corporation), nous avons pu quantifier la translocation nucléaire des facteurs de transcription IRF-7 et de NF-kappaB dans les pDCs activées. Nous avons ainsi pu observer que la translocation de NF-kappaB est comparable dans les pDCs adultes et néonatales en réponse aux ligands TLR7 ou TLR9. Par contre, elle est déficiente lors d’une stimulation par HSV. La translocation du facteur IRF-7, quant à elle, est significativement déficiente en réponse au CpG ODN et au virus HSV dans les pDCs néonatales. <p>Nous proposons que le défaut de translocation d’IRF-7 mis en évidence dans les pDCs néonatales pourrait en partie expliquer la déficience de synthèse des IFNs de type I de ces cellules et fournir une base moléculaire à la plus grande susceptibilité du nouveau-né vis-à-vis des infections virales.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le sang de cordon ombilical et placentaire constitue aujourd’hui une ressource biologique prisée puisqu’il contient des cellules souches et un haut taux d’hémoglobine utilisées lors de traitements thérapeutiques. Considérant les applications actuelles et celles envisagées dans le futur, le sang de cordon peut être mis en banque privée pour un usage autologue ou familiale. Il peut également être donné à une banque publique pour des greffes allogéniques ou pour la recherche. Bien qu’inévitablement séparé du corps humain au moment de la naissance de chaque enfant, ce sang n’est pas considéré comme un déchet d’aucune valeur et un consentement doit être obtenu avant tout prélèvement et toute utilisation. Ce mémoire présente une revue empirique de la pratique de mise en banque canadienne. Cette analyse révèle que les banques s’assurent d’obtenir un consentement préalable à la collecte, à l’entreposage et à l’utilisation du sang de cordon, sans toutefois que l’origine de ce consentement soit uniforme. Elle permet également de constater que les acteurs impliqués dans la mise en banque semblent considérer le sang de cordon comme un bien susceptible d’appropriation. Ce mémoire aborde ainsi la question de savoir qui, de la mère ou de l’enfant, doit consentir à ce que le sang de cordon soit d’abord prélevé pour ensuite être mis en banque. Il traite également de la propriété de ce sang une fois séparé du corps humain et des contraintes juridiques encadrant son aliénation. Il suggère au final certains aménagements pour l’utilisation du sang de cordon en recherche de même qu’une uniformisation des règles d’entreposage privé. / The umbilical and placental cord blood is now a prized biological resource as it contains stem cells and high hemoglobin level used in therapeutic treatments. Considering the current applications and those envisaged in the future, cord blood can be secured in private banking for autologous or family use. It can also be given to a public bank for allogeneic transplants or research. Cord blood should not be considered as a human waste without value, even if it is inevitably produced at the time of birth of each child. Consent must be obtained before any withdrawal and use. This study presents an empirical review of Canadian cord blood banking practice. This analysis reveals that banks do obtain prior consent to the collection, storage and use of cord blood. However, the source of this consent differs. It also shows that the actors involved in the banking process consider cord blood as a movable property that can be transferred to one another. This study addresses the question of who, between the mother and the child, should consent to cord blood collection and storage. It deals with blood’s ownership once separated from the human body and the legal constraints applicable to its alienation and use. It also suggests modifications to the legal framework for cord blood research as well as a standardization of private storage rules.

L’importance des modificateurs de la chromatine dans la régulation de l’hématopoïèse et des hémopathies malignes est illustrée par l’histone méthyltransférase Mixed-Lineage Leukemia (MLL) qui est essentielle au maintien des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et dont le gène correspondant, MLL, est réarrangé dans plus de 70% des leucémies du nourrisson. Les histones déméthylases (HDM), récemment découvertes, sont aussi impliquées dans le destin des CSH et des hémopathies malignes. Le but de ce projet est d’étudier l’expression des HDM dans les cellules hématopoïétiques normales et leucémiques afin d’identifier de potentiels régulateurs de leur destin. Nous avons réalisé un profil d'expression génique des HDM par qRT-PCR et par séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans des cellules de sang de cordon (cellules CD34+ enrichies en CSH et cellules différenciées) et des cellules de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec réarrangement MLL. Les deux techniques montrent une expression différentielle des HDM entre les populations cellulaires. KDM5B et KDM1A sont surexprimés dans les cellules CD34+ par rapport aux cellules différenciées. De plus, KDM4A et PADI2 sont surexprimés dans les cellules leucémiques par rapport aux cellules normales. Des études fonctionnelles permettront de déterminer si la modulation de ces candidats peut être utilisée dans des stratégies d’expansion des CSH, ou comme cible thérapeutique anti-leucémique. Nous avons aussi développé et validé un nouveau test diagnostique pour détecter les mutations de GATA2 qui code pour un facteur de transcription clé de l’hématopoïèse impliqué dans les LAM. Ces travaux soulignent l’importance des facteurs nucléaires dans la régulation de l’hématopoïèse normale et leucémique. / The importance of chromatin modifiers in regulation of hematopoiesis and hematologic malignancies is illustrated by the Mixed-Lineage Leukemia (MLL) histone methyltransferase, which is essential to maintain hematopoietic stem cells (HSC) and whose corresponding gene, MLL, is rearranged in over 70% of infant leukemia. The recently discovered histone demethylases (HDM) are also involved in HSC fate and in hematologic malignancies. The purpose of this project is to study the expression of HDM in normal and leukemic hematopoietic cells to identify potential regulators of their fate. We performed a comprehensive gene expression profile of HDM by qRTPCR and transcriptome sequencing (RNA-seq) in cord blood cells (CD34+ cells enriched in HSC and differentiated cells) and in acute myeloid leukemia (AML) cells with MLL rearrangement. Both techniques revealed differential expression of HDM between these cell populations. KDM5B and KDM1A are overexpressed in CD34+ cells compared to differentiated cells. Moreover, KDM4A and PADI2 are overexpressed in leukemic cells compared to normal cells. Functional studies will determine whether modulation of these candidates can be used in HSC expansion strategies or as anti-leukemic drug target. We have also developed and validated a new diagnostic test to detect mutations of GATA2, a gene encoding a key transcription factor involved in hematopoiesis and in AML. This work highlights the importance of nuclear factors in the regulation of normal and leukemic hematopoiesis.

La greffe de cellules souches hématopoïétiques est parfois le seul traitement efficace contre les cancers hématologiques ainsi que plusieurs autres désordres reliés au système hématopoïétique. La greffe autologue est souvent le traitement de choix pour les patients atteints de lymphome ou de myélome. Dans ce cas, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) du patient sont récoltées et congelées. Le patient subit ensuite des traitements de chimiothérapie et/ou radiothérapie qui éliminent les cellules malignes, mais détruisent aussi son système hématopoïétique. Ce dernier sera ensuite reconstitué par la greffe de CSH. Ces traitements ont pour conséquence de plonger le patient en état d’aplasie pour une période variant de 2 à 4 semaines. La thrombocytopénie (faible taux de plaquettes) est une complication majeure nécessitant des transfusions plaquettaires répétées et associée à une augmentation de la mortalité hémorragique post-transplantation. Il serait particulièrement intéressant de développer une thérapie accélérant la reconstitution des mégacaryocytes (MK), ce qui aurait pour effet de raccourcir la période de thrombopénie et donc de diminuer les besoins transfusionnels en plaquettes et potentiellement augmenter la survie. HOXB4 est un facteur de transcription qui a déjà démontré sa capacité à expandre les CSH et les progéniteurs multipotents (CFU-GEMM) donnant naissance aux MK. Il est donc un bon candidat pour l’expansion des progéniteurs MK. Comme la protéine HoxB4 a par contre une courte demi-vie (~1.1h), des protéines HoxB4 de deuxième génération avec une plus grande stabilité intracellulaire ont été créées (1423 (HoxB4L7A), 1426 (HoxB4Y23A) et 1427 (HoxB4Y28A)). Nous avons donc étudié la capacité d’HoxB4 sauvage et de deuxième génération à expandre les CSH, ainsi que les MK donnant naissance aux plaquettes. La surexpression rétrovirale de ces protéines HoxB4Y23A et HoxB4Y28A conduit à une expansion des progéniteurs MK murins in vitro supérieure à HoxB4-wt, 1423 et au contrôle GFP. La reconstitution plaquettaire in vivo dans un modèle murin a ensuite été évaluée par des transplantations primaires et secondaires. Les résultats révèlent que la surexpression rétrovirale des différents HoxB4 n’apporte pas de bénéfice significatif à la reconstitution plaquettaire des souris. Lorsque cultivées dans un milieu favorisant la différenciation mégacaryocytaire, le traitement de cellules CD34+ dérivées du sang de cordon ombilical avec les protéines recombinantes TATHoxB4WT ou de seconde génération n’a pas augmenté la production plaquettaire. Par contre, de manière intéressante, les cellules CD34+ provenant de sang mobilisé de patients atteints de myélome et mises en culture dans un milieu favorisant l’expansion des CSH ont montré des différences significatives dans la différenciation des progéniteurs MK en présence de la protéine recombinante TATHoxB4. La protéine HOXB4 possède donc un avenir prometteur quant à une amélioration de l’état thrombocytopénique chez les patients. / Haematopoietic stem cell (HSC) transplantation is the most efficient treatment against a number of cancers or other disorders of the hematologic system. Prior to HSC transplantation, patients are exposed to high doses of radiotherapy and/or chemotherapy to eliminate malignant cells. However, these treatments result in a state of aplasia, particularly in thrombocytopenia, which is characterised by very low blood platelet counts. Platelets produced by megakaryocytes (MK) are essential components of the blood system and play a critical role in the prevention of bleeding. Thus a low platelet blood level is a major complication and contributes significantly to transplant related mortality. At present, regular infusion of platelets isolated from healthy donors is the treatment of choice for thrombocytopenia. However, this is cumbersome for patients as well as donors and, in many instances results in platelet refractoriness due to the generation of auto-antibodies against disparate HLA molecules expressed on donor platelets. Therefore, the development of strategies to accelerate MK production and thus platelet reconstitution post HSC transplant would represent a major advance. It has already been shown that HoxB4 expands HSC and multipotent progenitors (CFU-GEMM) that give rise to megakaryocytes (MK). Thus HoxB4 is a great candidate for in vitro MK progenitor expansion. However, the short half-life of HoxB4 protein prompted us to generate a second generation of HoxB4 proteins with greater intracellular stability. We therefore studied the capacity of wild type (WT) and HoxB4 with 3 substitutions (1423 (HoxB4L7A), 1426 (HoxB4Y23A) and 1427 (HoxB4Y28A) resulting in a longer protein half-life to expand HSC as well as MK progenitors. Retroviral-mediated expression of HoxB4Y23A and HoxB4Y28A proteins showed a greater expansion of murine MK progenitors, in comparison with HoxB4WT or HoxB4L7A proteins or GFP control. We also evaluated the ability of HSC expressing second generation HoxB4 to generate platelets in a murine model. Our results show that retroviral-mediated transduction of second generation HoxB4 in murine HSC does not provide a significant advantage over HoxB4WT in platelet reconstitution in mice. Interestingly, treatment of CD34+ cells derived from cord blood showed only marginal effect of HoxB4WT or second generation HoxB4 soluble recombinant proteins when cultured under conditions optimized for megakaryocyte differentiation. Unexpectedly, CD34+ cells derived from mobilized peripheral blood of myeloma patients showed a significant increase in MK progenitor differentiation in the presence of TAT-HoxB4WT when cultured in expansion medium for HSC. Thus, HoxB4 holds promise in autologous HSC transplantation for the treatment of thrombocytopenic patients.

La greffe de sang de cordon est de plus en plus utilisée et a permis de traiter avec succès chez l’enfant des déficits immunitaires ainsi que des hémopathies malignes comme les leucémies. Malgré d’importants avantages tels que l’absence de risque pour le donneur ou la plus faible incidence de maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), utiliser le sang de cordon comporte certains inconvénients. En effet, une reconstitution immunitaire retardée, des infections opportunistes en plus grand nombre et un risque de rechute sont des complications qui peuvent survenir et engendrer un risque pour le pronostic vital du patient. Par conséquent, de nouvelles stratégies d’immunothérapies doivent être envisagées. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes particulièrement intéressés aux cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) dont les fonctions sont importantes pour l’initiation des réponses immunitaires innée et adaptative et particulièrement pour leur capacité à activer les cellules NK. Afin d’élucider le rôle et l’impact de ces cellules dans les greffes de sang de cordon, le nombre et la fonction des pDC et des NK a été suivi longitudinalement chez des patients ayant subi une greffe de sang de cordon comparativement à des patients transplantés avec de la moelle osseuse. Nous avons ainsi démontré que les pDC et les NK apparaissent précocement suite à une greffe de sang de cordon et que ces cellules sont fonctionnelles. Ces résultats mettent donc en lumière que ces cellules pourraient être de bons outils pour l’établissement d’une immunothérapie après greffe de sang de cordon. De plus, la caractérisation fonctionnelle des pDC du greffon de sang de cordon a permis de révéler une plus faible production d’IFN-α par les pDC, comparativement aux pDC de sang d’adulte. Cette différence pourrait jouer un rôle dans la plus faible incidence de GvHD après les greffes de sang de cordon. Dans le but de préciser les mécanismes moléculaires de régulation négative de la production d’IFN-α par les pDC de sang de cordon, nous avons étudié les protéines de la voie de signalisation TLR9-IRF7. L’expression similaire de l’ARN du TLR9, MyD88, IRAK1 et IRF7 contraste avec la plus faible expression des protéines correspondantes. De plus, l’expression des MicroARNs miR-146a et miR-155 est plus élevé dans les pDC de sang de cordon comparativement aux pDC de sang d’adultes. Ensemble, ces données pointent une régulation négative post-transcriptionnelle de la voie TLR9-IRF7 qui pourrait expliquer la plus faible production d’IFN-α des pDC du sang de cordon. L’ensemble des ces travaux suggère que les pDC pourraient représenter une cible de choix dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans les greffes de sang de cordon. / Umbilical cord blood transplantation has increasingly been used as a source of hematopoietic stem cells to successfully treat immunodeficiencies and malignant diseases such as leukemia in pediatric patients. Despite important advantages, namely lack of risk for the donor and low incidence of GvHD, use of cord blood is associated with several drawbacks. Specifically, delayed immune reconstitution, more opportunistic infections and a relative risk of relapse are complications that may occur and lead to a poor prognosis. Consequently, new immunotherapeutic strategies should be considered. In this study, we were interested in plasmacytoid dendritic cells (pDC), whose functions are important for initiation of innate and adaptive immune responses and, in particular, for their ability to activate natural killer cells (NK). In order to elucidate the role and the impact of these cells in cord blood transplantation, pDC and NK numbers and function have been longitudinally followed in cord blood and bone marrow recipients. We showed that pDC and NK cells appeared early after umbilical cord blood transplantation and that these cells retained functional activity. Thus, these cells may constitute a good tool for immunotherapy in umbilical cord blood transplantation. Moreover, the functional characterization of pDC in cord blood revealed a lower production of IFN-α by cord blood pDC, which may play a role in the lower incidence of GvHD after umbilical cord blood transplantations. In order to determine the molecular mechanism for the negative regulation of IFN-α production by cord blood pDC, we studied the expression of TLR9-IRF7 pathway. The stable expression of TLR9, MyD88, IRAK1 and IRF7 mRNA contrasts with the lower expression of corresponding proteins. Interestingly, expression of microRNA miR-146a and miR-155 is higher in cord blood pDC. Together, these results point to a post-transcriptionnal negative regulation of TLR9-IRF7 pathway which may explain the lower IFN-α production by cord blood pDC. This work reinforces the idea that pDCs constitute a target of choice for developing new therapeutic approaches in cord blood transplantations.

La transplantation de sang de cordon ombilical (TSCO) constitue un traitement de choix pour une multitude de pathologies hématologiques malignes et non malignes chez l’enfant et dans certains cas l’adulte. La TSCO est associée à certaines complications, dont une reconstitution immunitaire plus lente et une incidence élevée d’infections opportunistes, notamment celles reliées au cytomégalovirus (CMV) et au virus varicella-zoster (VZV). Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes intéressés dans un premier temps à la caractérisation de la reconstitution immunitaire spécifique au CMV et au VZV. Nos résultats ont démontré que la reconstitution de l’immunité cellulaire ne requiert ni un statut séropositif pré-transplantation ni le développement de la maladie. De plus, des reconstitutions spontanées ont été détectées chez certains patients séronégatifs vis-à-vis du CMV ou du VZV. Outre le fait qu’elle se manifeste surtout à partir de 6 mois post-transplantation, ladite reconstitution mérite le qualificatif de « protectrice » en termes de réactivations virales et du développement de signes cliniques lorsqu’une fréquence de 150 cellules produisant l’IFN-γ/million est dépassée. Toutefois, moins de 5% des patients développent une réponse T anti-VZV et anti-CMV au cours 100 premiers jours suivant la TSCO. Il est donc possible que les lymphocytes CD8+ T provenant du SCO, comparativement à leurs homologues provenant de la moelle osseuse (MO), présentent un défaut de fonctionnalité, communément appelé « épuisement clonal ». La caractérisation du répertoire de récepteurs inhibiteurs exprimés par les cellules T CD8+ suivant la TSCO ou la transplantation de moelle osseuse (TMO) a révélé une augmentation significative de la fréquence des cellules exprimant PD-1 tôt suivant la transplantation. Cette population, caractérisée majoritairement par un phénotype effecteur-mémoire (EM), démontre une perte significative de la capacité proliférative et exprime moins d'IFN-γ, d'IL-2, de TNF-α et de CD107a. Une meilleure caractérisation de la reconstitution immunitaire après TSCO permettrait, d'une part de sélectionner des biomarqueurs en vue d’une meilleure gestion des patients à risques de développer des infections virales et/ou de rechuter, et d'autre part d'améliorer leur pronostic. / Umbilical cord blood transplantation (UCBT) is a treatment of choice for a variety of hematological malignancies and non-malignant diseases in children and, in some cases, in adults. UCBT is associated with a slower immune reconstitution and a high incidence of viral infections, especially related to cytomegalovirus (CMV) and the varicella-zoster virus (VZV). As part of this work, we aimed to assess the reconstitution of CMV and VZV-specific T cell responses. Neither pre-transplant serostatus nor disease development is required for development of T cell mediated immunity. Moreover, spontaneous reconstitution detected in some patients who were seronegative for CMV or VZV. Detected especially after 6 months post-transplant, antiviral responses are protective in terms of viral reactivation and development of clinical signs, when a frequency of 150 cells producing d'IFN-γ / million is achieved. However, less than 5% of patients develop an antiviral response during the first 100 following UCBT. Compared to their bone marrow (BM) counterparts, UCB CD8+ T lymphocytes may be functionally impaired, a state commonly called « clonal exhaustion ». Characterization of the inhibitory receptors repertoire expressed by CD8+ T cells following UCBT and BMT showed a significant increase in the frequency of cells expressing PD-1 early after transplantation. This population, mainly characterized by effector phenotype, showed a significant loss of proliferative capacity and produced less IFN-γ, IL-2, TNF-α and CD107a. An improved understanding of the CD8+ T cell compartment following UCBT, as well as biomarkers related to T cell exhaustion will decrease infection, transplant related mortality and correlate with better prognosis

La thèse concerne l'instabilité des couches minces et en particulier à la délamination des couches sur substrat rigide. La première partie du travail s'intéresse aux contraintes résiduelles dans les couches minces de molybdène déposées par pulvérisation cathodique. Elle a permis d'étudier et développer des couches fortement compressives pour la délamination. Dans la seconde partie du travail ces couches fortement contraintes sont utilisées pour provoquer la délamination par cloquage d'un empilement contenant une interface faible. La propagation ainsi que la morphologie des délaminations ont été étudiés. Les paramètres qui affectent la morphologie des délamination sont identifiés et permettent la construction d'un diagramme de phase. Dans la dernière partie du travail un modèle numérique couplant flambage d'une plaque mince et zone cohésive est développé afin de modéliser le phénomène de délamination par cloquage. Les résultats obtenus par la méthode des éléments finis sont en accord avec les expériences.