Submitted by Beatrice Ingrid Macente null (beatrice.vetuel@yahoo.com.br) on 2017-12-13T17:24:54Z No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado - FINAL.pdf: 1497835 bytes, checksum: ec09acb806dd08292a1d4ec818d596e7 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2017-12-13T18:29:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 macente_bi_dr_jabo.pdf: 1454157 bytes, checksum: 970c2725b03ed803688cfef9261d801c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-13T18:29:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 macente_bi_dr_jabo.pdf: 1454157 bytes, checksum: 970c2725b03ed803688cfef9261d801c (MD5) Previous issue date: 2017-11-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Esta pesquisa teve por justificativa ampliar os estudos acerca da criopreservação de tecido gonadal e células espermáticas de gatos domésticos, podendo servir de modelo experimental para felinos selvagens. Objetivou-se comparar os efeitos da criopreservação sobre diferentes tamanhos de fragmentos testiculares, empregando dois crioprotetores. Utilizaram-se os testículos de 31 gatos domésticos, submetidos à orquiectomia eletiva. Os testículos foram pesados e apenas os que apresentarem pesos entre 1 e 2 g foram empregados. O tecido testicular foi dissecado e cortado em fragmentos de tamanhos pré-determinados (0,3cm3 e 0,5cm3). Uma amostra foi direcionada para as avaliações a fresco: integridade de membrana e do DNA; histopatologia; incidência de apoptoses por imuno-histoquímica; e índice de peroxidação lipídica - TBARS. A criopreservação foi feita em meio Tris-gema Equex STM suplementado com 3% de crioprotetores (glicerol e propanediol) através da técnica congelação rápida. Após a descongelação, foram realizados os mesmos testes iniciais. Os primeiros resultados obtidos com os 12 gatos iniciais apontaram na avaliação histomorfológica e pelo teste de lipoperoxidação lipídica que o glicerol foi mais eficiente que o propanediol na criopreservação de fragmentos testiculares de gatos domésticos de 0,5cm3 (Capítulo 2). No experimento seguinte, avaliaram-se os fragmentos testiculares de outros 31 gatos domésticos, seccionados nos mesmos tamanhos e criopreservados nas mesmas condições do experimento anterior, empregando-se 3% glicerol ou 3% propanediol no meio diluente Tris-gema Equex STM, utilizando a técnica de congelamento rápido, seguindo das avaliações pelos testes para dano ao DNA dos espermatozoides por meio da acridina laranja; e análise dos fragmentos teciduais semi-quantitativamente por histomorfologia e imuno-histoquímica. A avaliação imuno-histoquímica foi mais eficiente em verificar os danos às células tubulares seminíferas, sendo possível observar a marcação diferenciada da caspase presente no citoplasma e núcleo das células espermáticas, bem como na cabeça dos espermatozoides. Por meio da caspase foram verificado que os fragmentos frescos já apresentavam danos consideráveis as células teciduais e que não diferiram dos achados para os fragmentos criopreservados, demonstrando a eficiência do protocolo de congelação adotado, sem a observação de superioridade entre os dois tamanhos de fragmentos ou entre os crioprotetores. Contudo, a avaliação apenas do espermatozoides tanto pela técnica de acridina laranja, como pela imuno-histoquímica, pode-se verificar a inferioridade do propanediol em relação ao glicerol para fragmentos de 0,5 cm³ (Capítulo 3). Novas pesquisas que possam complementar os testes realizados neste estudo, como o cultivo dos fragmentos, a fertilização in vitro por meio de ICSI, ou ainda, o uso dos fragmentos para xenotrasnplantes poderiam avaliar com maior acurácia os achados das pesquisas reportadas nesta tese. / This research had the justification to broaden the studies about the cryopreservation of gonadal tissue and sperm cells of domestic cats, and could serve as an experimental model for wild cats. The objective of this study was to compare the effects of cryopreservation on different sizes of testicular fragments using two cryoprotectants. The testicles of 31 domestic cats submitted to elective orchiectomy were used. The testes were weighed and only those weighing between 1 and 2 g were used. The testicular tissue was dissected and cut into fragments of predetermined sizes (0.3cm3 and 0.5cm3). A sample was directed to fresh evaluations: membrane integrity and DNA; histopathology; incidence of apoptosis by immunohistochemistry; and lipid peroxidation index - TBARS. Cryopreservation was done on Tris-egg yolk Equex STM medium supplemented with 3% cryoprotectants (glycerol and propanediol) by the rapid freezing technique. After thawing, the same initial tests were performed. The first results obtained with the 12 initial cats showed that glycerol was more efficient than propanediol in the cryopreservation of testicular fragments of domestic cats of 0.5 cm3 (Chapter 2). In the following experiment, the testicular fragments from 31 other domestic cats, sectioned in the same sizes and cryopreserved under the same conditions as in the previous experiment, were evaluated using 3% glycerol or 3% propanediol in the Tris- egg yolk Equex STM medium, using rapid freezing technique, followed by evaluations for DNA damage of the spermatozoa by acridine orange; and analysis of the tissue fragments semi-quantitatively by histomorphology and immunohistochemistry. The immunohistochemical evaluation was more efficient in verifying the damage to the seminiferous tubular cells, being possible to observe the differentiated marking of the caspase present in the cytoplasm and nucleus of the sperm cells, as well as in the spermatozoa head. By caspase, it was verified that the fresh fragments already presented considerable damage to the tissue cells and did not differ from the findings for the cryopreserved fragments, demonstrating the efficiency of the adopted freezing protocol, without the observation of superiority between the two sizes of fragments or between the cryoprotectants. However, the evaluation of spermatozoa by both acridine orange and immunohistochemistry, the inferiority of propanediol to glycerol can be verified for fragments of 0.5 cm³ (Chapter 3). New research that could complement the tests performed in this study, such as the culture of fragments, in vitro fertilization using ICSI, or the use of fragments for xenotransplantation could more accurately assess the findings of the research reported in this thesis.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-04Bitstream added on 2015-04-09T12:48:24Z : No. of bitstreams: 1 000815821.pdf: 448230 bytes, checksum: 8f936d0e61061d2550cda966429cdf86 (MD5) / O emprego de técnicas de criopreservação de gametas em felinos domésticos são consideradas importantes no aprimoramento de procedimentos na reprodução assistida. A vitrificação se baseia no uso de altas concentrações de crioprotetores com o intuito de inibir a formação de cristais de gelo. É possível que a criopreservação induza a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) ou altere o potencial antioxidante enzimático do oócito, sendo assim, aventa-se que a adição de antioxidantes aos meios de vitrificação poderia reduzir o estresse oxidativo causado pelos crioprotetores. No experimento I comparam-se quatro protocolos de vitrificação utilizando-se como meio base (MB) o TCM199 (Meio de cultura de tecidos 199) com glicose mais antibiótico, acrescido de crioprotetores: G1 (3M etilenoglicol–EG + 2M de dimetilsulfóxido-DMSO), G2 (3M EG + 3M 1,2 propanediol-PrOH), G3 (1,5M EG + 1M DMSO) e G4 (1,5M EG + 1,5M PrOH). Após descongelamento, este material foi avaliado quanto à alteração morfológica e viabilidade (coloração cFDA/trypan blue). Neste, não houve diferença estatística (p=0,2857) entre os oócitos descongelados dos quatro grupos estudados em relação à morfologia, mas em relação a viabilidade oocitária os grupos G1 e G2 obtiveram maior porcentagem de oócitos viáveis, porém não diferiram entre si (35,71% e 36,84%, respectivamente; p=0,018). No experimento II três concentrações de vitamina E (0,4, 0,6 e 0,8mM) foram acrescidas ao protocolo de MB com 3M EG + 3M PrOH, formando os grupos G 0,4mM, G 0,6mM, G 0,8mM e o G 0 (sem adição de vitamina E). A escolha do protocolo base foi de acordo com os resultados obtidos no experimento I. Observamos que houve melhora da porcentagem (p=0,0032) de oócitos que apresentavam morfologia normal, nos grupos G 0,6mM (88,6%) e G 0,8mM (62,5%). Oócitos do experimento II que mantiveram sua morfologia após a descongelamento foram submetidos à ... / The use of techniques of cryopreservation of gametes in domestic cats are considered important in enhancing procedures in assisted reproduction. Vitrification is based on the use of high concentrations of cryoprotectants in order to inhibit the formation of ice crystals. It is possible that cryopreservation induces the production of reactive oxygen species (ROS) or change the enzymatic antioxidant potential of the oocyte, so one might speculate that the addition of antioxidants to the means of vitrification could reduce the oxidative stress caused by cryoprotectants. In the first experiment are compared four protocols vitrification using as base medium (MB) the TCM199 (tissue culture medium 199) more antibiotic glucose plus cryoprotectants: G1 (EG + 3M ethylene glycol + 2M dimethyl-DMSO), G2 (3M EG + 3M 1,2 propanediol - PrOH) , G3 (1.5 M EG + 1M DMSO) and G4 (1.5 M EG + 1.5 M PrOH) . After thawing, the material was assessed for viability and morphological changes (staining cFDA / trypan blue). In this , there was no statistical difference (p = 0.2857) among the four groups thawed oocytes studied with respect to morphology, but in relation to oocyte viability G1 and G2 groups had a higher percentage of viable oocytes , but did not differ ( 35.71% and 36.84 %, respectively , p = 0.018). In the second experiment three concentrations of vitamin E (0.4 , 0.6 and 0.8 mM) were added to the protocol MB with 3M EG + 3M PrOH , L forming the groups G 0.4 mM, G 0.6 mM, G 0.8 mM and G 0 (no added vitamin E). The choice of the base protocol was in accordance with the results obtained in experiment I. We observed improvement in percentage (p = 0.0032) of oocytes with normal morphology in groups G 0.6 mM (88.6 %) and G 0.8 mM (62.5 %). Experiment II oocytes that maintained their morphology after thawing were subjected to in vitro maturation for a period of 36 hours. When evaluating the resumption of meiosis, we observed no statistical difference ...

Orientador: Eunice Oba / Resumo: Os meios diluidores de sêmen exercem importante papel na manutenção da qualidade e da viabilidade espermática, assim como da sua capacidade de fertilização após o processo de criopreservação. O estudo objetivou avaliar a eficácia do caseinato de sódio (2%) adicionado a diluente comercial com 15% de gema de ovo (grupo GC), na manutenção da fertilidade do sêmen bovino criopreservado e, como controle, empregou-se o mesmo diluente comercial com 20% de gema de ovo sem caseinato de sódio (grupo G). No experimento 1, em sêmen descongelado dos dois grupos foram avaliados padrões de cinética espermática, população de espermatozoides sem as alterações das membranas plasmática e acrossomal (IMPA), sem desestabilização da membrana (SDM) e sem translocação de fosfatidilserina da membrana (STF), alto potencial mitocondrial (APM) e geração de superóxido (O2-). Nos experimentos 2 e 3 realizaram-se respectivamente, teste de fertilidade in vitro (taxa de clivagem no dia 3 e taxa de formação de embriões no dia 8 após a fecundação) e in vivo (porcentagem de prenhez) por meio da IATF. De acordo com os resultados, verificou-se diferença na cinética espermática entre os dois grupos, a favor do grupo GC (P<0,05) principalmente após estresse térmico (T90). Com relação às avaliações da IMPA, SDM, STF, observaram-se diferenças também no T90 em favor do grupo GC (P<0,05) para as três avaliações. Contudo, o alto potencial mitocondrial (APM) e as espécies reativas ao oxigênio (EROS) foram menores no T0 e ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

A criopreservação de sêmen é um processo de grande estresse celular, que impõe aos espermatozóides condições extremamente desfavoráveis à manutenção de sua viabilidade. Diversos estudos propõem que a produção excessiva de espécies reativas de oxigênio e a perda da capacidade antioxidante do sêmen potencializam os efeitos prejudiciais dessa biotécnica. O objetivo do presente estudo foi avaliar as atividades antioxidantes enzimáticas e não enzimáticas e a concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), como indicador de lipoperoxidação do sêmen eqüino, durante a criopreservação. Quinze ejaculados de seis garanhões comprovadamente férteis da raça Crioula, foram submetidos a criopreservação, utilizando-se diluente comercial à base de citrato-Hepes, gema de ovo e leite. Foram avaliadas as atividades das enzimas catalase, glutationa peroxidase e superóxido dismutase; o potencial antioxidante total e a concentração de TBARS no sêmen fresco, diluído e congelado. Uma maior atividade das três enzimas estudadas foi observada no sêmen fresco em relação ao sêmen diluído e congelado (p<0,0001), não havendo diferença entre os dois últimos (p>0,05). Não houve diferença na atividade antioxidante não enzimática nas três fases estudadas (p>0,05). Não foi observada nenhuma associação tanto das defesas antioxidantes enzimáticas como das não enzimáticas com a qualidade do sêmen congelado. A queda na motilidade do sêmen congelado pode ser parcialmente explicada pelo aumento da peroxidação dos lipídios do sêmen. / Semen cryopreservation is a stressful procedure which exposes spermatozoa to harmful conditions leading to reduced cell viability. Several studies propose that reactive oxygen species overproduction and decreased antioxidant capacity of semen may increase the damaging effects of the technique. The aim of this work was to evaluate the enzymatic and nonenzymatic antioxidant activity, as well as the concentration of thiobarbituric acid reactive substances (TBA-RS) as and indicator of lipid peroxidation on equine semen during cryopreservation. Fifteen ejaculates from six fertile Criollo stallions were cryopreserved using a commercial extender (citrate-Hepes, egg yolk and skim milk). Activity of catalase, glutathione peroxidase and superoxide dismutase; the total radical-trapping antioxidant potential and TBA-RS content was assessed in native semen, semen diluted in semen extender and thawed semen. All three enzymes showed higher activities in native semen than in diluted and thawed semen (p<0,0001). No difference was observed between diluted and thawed semen (p>0,05). The non-enzymatic defenses did not differ along cryopreservation process (p>0,05). There was not any association between semen quality and both enzymatics and non-enzymatics antioxidant defenses. The decreasing of spermatozoa motility might be partially explained by the increase in semen lipoperoxidation.

Resumo não disponível

Objetivo: Comparar a eficácia do transplante de membrana amniótica (MA) criopreservada e liofilizada quanto à velocidade de reepitelização em defeitos epiteliais corneanos em coelhos. Desenho do estudo: Estudo experimental intervencional. Métodos: Foram utilizados vinte e seis olhos de vinte e seis coelhos divididos em dois grupos cujas córneas foram submetidas a uma desepitelização de 7 mm de diâmetro e, posteriormente, recobertas com MAs fixadas com cola de fibrina. O Grupo 1 recebeu MAs criopreservada, enquanto o Grupo 2 recebeu MAs liofilizadas. Foram avaliados os seguintes critérios: velocidade de reepitelização corneana por fotografias seriadas das córneas no primeiro, quarto e sétimos dia pós-operatório, estudo anatomopatológico e imunohistoquímico das córneas e análise por microscopia eletrônica de varredura de uma amostra de cada MA. Resultados: Em cada grupo, o percentual de reepitelização corneana foi significativamente maior entre o primeiro e sétimo dia pós-operatório (p<0,001). Entre os grupos, não houve diferença estatisticamente significativa (p=0,867). Em relação à análise anatomopatológica, não houve diferença significativa entre autólise e vacuolização epitelial entre os grupos (p=0,064 e p=0,204, respectivamente). Em relação à integridade da membrana basal, quando vista ao PAS, todas as amostras receberam classificação 2 (membrana basal íntegra). A imunohistoquímica mostrou marcação positiva para citoqueratina e vimentina em todos os olhos de ambos os grupos. A microscopia eletrônica revelou que a MA criopreservada possui uma espessura maior do que a liofilizada. Conclusão: A MA liofilizada mostrou-se tão eficaz quanto a criopreservada no tratamento de defeitos epiteliais corneanos em coelhos. Não houve diferença nas características anatomopatológicas e imunohistoquímicas entre os dois tipos de MA. A MA liofilizada deve ser considerada no arsenal terapêutico dos oftalmologistas, com a vantagem de ser mais facilmente armazenada, ter um prazo de validade maior, além da segurança biológica de se ter um material esterilizado.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-14T17:53:06Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 729222 bytes, checksum: 9e0fad759a68ba07f6ac8df51dd3195f (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-14T17:53:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 729222 bytes, checksum: 9e0fad759a68ba07f6ac8df51dd3195f (MD5) Previous issue date: 2016-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O aumento do uso da inseminação artificial (IA) em equinos com sêmen congelado necessita de estudos que possibilitem a melhora da qualidade dos espermatozoides criopreservados e diminua a variabilidade individual entre os garanhões quanto à congelabilidade dos ejaculados. Isto porque as taxas de fertilidade obtidas com o sêmen equino criopreservado são inferiores àquelas obtidas com o sêmen fresco e refrigerado dessa espécie e ao sêmen bovino criopreservado. Este estudo visou verificar a ação de diferentes crioprotetores adicionados ao diluente além da eficácia da solução coloidal Equicoll-SmallTM na filtragem do sêmen equino pós-descongelamento no intuito de se obter uma população espermática com menor concentração de patologias e com maior número de características favoráveis à fecundação. Foram utilizados quatro garanhões da raça Mangalarga Marchador, hígidos e com históricos reprodutivos normais. Após o descongelamento, as amostras de sêmen foram submetidas ou não à centrifugação com o Equicoll-SmallTM, e avaliadas por meio de sondas fluorescentes através da citometria de fluxo. A maioria dos parâmetros espermáticos mostrou melhora após a centrifugação em camada única (SLC) com o Equicoll-SmallTM (P<0,05). No pós-descongelamento as amostras de sêmen criopreservadas em diluentes com o crioprotetor glicerol mostraram piores resultados comparadas às amostras de sêmen criopreservadas em diluentes com outros crioprotetores (DMFA e DG) em relação à integridade de membrana plasmática e organização da bicamada lipídica (P<0,05). O uso do coloide propiciou a recuperação de uma população espermática com melhor integridade de membrana, maior organização da bicamada lipídica, menor potencial mitocondrial e menor integridade acrossomal (P<0,05). O rendimento espermático médio foi de 6,95 % (±0,91 %). Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que o uso de diluentes com os crioprotetores DMFA e DG mostraram ser mais eficazes em manter a viabilidade espermática in vitro em comparação ao diluente com o crioprotetor glicerol no pós-descongelamento. Além disso, o uso do Equicoll-SmallTM se mostrou eficaz na obtenção de uma população espermática viável, principalmente nas amostras de sêmen com maior porcentagem de crioinjúrias, porém seu rendimento espermático (concentração espermática final inseminante) pode ser um fator limitante para o uso desta técnica como rotina. / The use of artificial insemination (AI) in horses with frozen semen requires efforts to increase the quality of cryopreserved spermatozoa and decrease individual variability among stallions as theirs ejaculates freezeability. This is because of fertility rates obtained from cryopreserved stallion semen are lower than those obtained with fresh and cooled semen of this species and of cryopreserved bovine semen. This study aimed to verify the action of different cryoprotectants added to the diluent in addition to the effectiveness of the colloidal solution Equicoll-SmallTM, in filtering the stallion semen post-thawing in order to obtain a sperm population with lower concentrations of pathologies and with more favorable fertilization characteristics. Four healthy stallions of Mangalarga Marchador breed with normal reproductive historic were used. After thawing the semen samples were subjected or not to centrifugation with Equicoll-SmallTM and evaluated by fluorescent dyies via flow cytometry. Most sperm parameters showed improvement after Single Layer Centrifugation (SLC) with Equicoll-SmallTM (p<0.05). After thawing the treatment with glycerol showed worse results compared to others cryoprotectants (dimethylformamide and dimethylformamide+glycerol) in relation to the integrity of the plasma membraneand organization of the lipid bilayer (P<0.05). SLC recovered a sperm population with better membrane integrity, better organization of the lipid bilayer, lower mitochondrial potential and lower acrosomal integrity (P<0.05). The average of the sperm yield was 6.95% (±0.91%). Based on these results, it is concluded that the treatments with dimethylformamide and dimethylformamide + glycerol are shown to be more effective in maintaining the sperm viability in vitro when compared to the glycerol after thawing. In addition, it was concluded that the SLC with Equicoll-SmallTM is effective in obtaining a viable sperm population, especially in those samples that show more cryoinjuries, but its sperm yield can be a limiting factor for the technique.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-28T17:29:52Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1101547 bytes, checksum: 22262285235154782cb907f89229e0d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T17:29:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1101547 bytes, checksum: 22262285235154782cb907f89229e0d2 (MD5) Previous issue date: 2017-02-17 / Com este estudo objetivou-se avaliar o perfil proteômico total e diferencial do plasma seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador, que apresentam variações na motilidade espermática do sêmen após descongelamento, visando identificar proteínas candidatas a marcadores de congelabilidade. Foram utilizados quatro garanhões de fertilidade comprovada, divididos em dois grupos, com dois animais em cada grupo: T1: alta congelabilidade (n= 4 ejaculados) e T2: baixa congelabilidade (n= 4 ejaculados), sendo cada tratamento composto por dois ejaculados de cada garanhão. As análises físicas do sêmen foram realizadas antes e após a criopreservação espermática. Os grupos estudados foram divididos pós-descongelamento pela avaliação da motilidade espermática total. O perfil protéico do plasma seminal foi obtido por eletroforese bidimensional, as análises de imagem dos géis foram realizadas pelo programa ImageMaster 2D Platinum 6.0 (GE Healtcare ® ) e a identificação das proteínas foi por espectrometria de massas usando MALDI-TOF/TOF, com o software Mascot Daemon para a busca em banco de dados. A validação das proteínas identificadas entre os tratamentos foi realizada pelo programa SCAFFOLD (95%). Os dados foram analisados pela ANOVA com 5 % de probabilidade de erro, correlações simples de Pearson e análise de regressão linear. Observou-se diferença (p<0,05) em relação à motilidade espermática total do sêmen fresco e pós-descongelamento. No perfil protéico identificou-se 5 famílias de proteínas (HSP-1, HSP-2, CRISP-3, Calecreína e Albumina sérica). Destas famílias, algumas proteínas se apresentaram com diferenças em abundância (p<0,05) entre os grupos estudados, em que quatro destas podem ser consideradas possíveis candidatas a marcadores de congelabilidade (HSP-1: spot 175; HSP-2: spot 39; CRISP-3: spot 66 e 166). Conclui-se então que os garanhões da raça Mangalarga Marchador apresentam variação individual ao processo de criopreservação do sêmen e possuem possíveis proteínas candidatas a marcador de congelabilidade para raça. / This study aimed to evaluate the total and differential proteomic profile of the seminal plasma of stallions of Mangalarga Marchador breed that presented variations in sperm motility after thawing, intending to identify candidate proteins as freezability markers. Four proven fertility stallions were used and splited in two groups with two animals in each group: T1: high freezability (n= 4 ejaculates) and T2: low freezability (n= 4 ejaculates) with two ejaculates of each stallion in each treatment. Semen analysis were made before and after criopreservation. The studied groups were divided after thawing by the evaluation of total sperm motility. The protein profile of the seminal plasma was obtained by bidimensional electrophoresis. The analyses of the images of the gels were performed by the ImageMaster 2D Platinum 6.0 (GE Healtcare ® ) program and the proteins identification were made by the mass spectrometry using MALDI-TOF/TOF with the software Mascot Daemon for database search. The validation of identified proteins between treatments was performed by SCAFFOLD (95%) program. The data were analyzed by ANOVA, Pearson's simple correlations and linear regression analysis with 5 % of error probability. Differences were observed (p<0.05) in relation to total sperm motility of fresh and after thawing semen. At protein profile, 5 protein families (HSP-1, HSP-2, CRISP-3, Kallikrein and Serum albumin) were identified. Of these families some proteins presented differences in abundance (p<0.05) between studied groups in which four of them can be considered as possible markers candidates of semen freezability (HSP-1: spot 175; HSP-2: spot 39; CRISP-3: spot 66 and 166). It can be concluded that stallions of Mangalarga Marchador breed present individual variation to semen cryopreservation process and have possible proteins as markers candidates of semen freezability.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-27Bitstream added on 2014-06-13T20:26:10Z : No. of bitstreams: 1 lopes_bv_dr_botfmvz.pdf: 1496519 bytes, checksum: 66727a17c8bb9d049c65239284863d62 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo desse projeto foi determinar a eficiência do uso de antioxidantes na prevenção de efeitos deletérios da congelação de sêmen em cães férteis e subférteis. Para isso foram executados dois experimentos: O primeiro teve como objetivo comparar os resultados da congelação do sêmen de cães férteis e subférteis, utilizando meio diluente a base de TRIS/gema de ovo/glicerol, com a adição ou não de antioxidantes (Catalase, Superóxido Dismutase e suas associações, ácido ascórbico, tocoferol e suas associações). O segundo experimento teve como objetivo comparar os resultados da congelação do sêmen de cães férteis e subférteis, suplementados com 500mg de vitamina C e E, por via oral, durante 60 dias. Foram utilizados 13 cães, sendo 7 considerados férteis e 6 classificados com subférteis. Os cães férteis apresentavam exame andrológico dentro dos padrões recomendados pelo CBRA; os subférteis apresentavam baixa concentração espermática (< 20x10 6 sptz/mL) e/ ou alto índice de patologias espermáticas (> 30%). O sêmen foi congelado em três momentos, antes do início da suplementação (M1), 30 (M2) e 60 dias (M3) após o início da suplementação oral. O sêmen foi coletado por manipulação digital do pênis e analisado para: motilidade, vigor, concentração e morfologia espermática. A congelação do sêmen foi realizada pelo método descrito por Chirinéa et al. (2006). A descongelação foi realizada a 70ºC por 8 segundos. Logo após as amostras foram avaliadas na análise computadorizada (CASA) e avaliação de integridade de membrana acrossomal e plasmática. Também foi analisada a taxa de peroxidação lipídica e antioxidantes: SOD, catalase, vitaminas C e E no plasma seminal. Pode-se concluir que a suplementação oral, no meio diluente ou a sua associação pode trazer benefícios para o processo de congelação/descongelação de cães... / The aim of this project was to determine the efficiency of antioxidants in preventing the deleterious effects of freezing semen in fertile and subfertile dogs. For this purpose two experiments were performed: The first aim was to compare the results of frozen semen of fertile and subfertile dogs, using the TRIS diluent / egg yolk / glycerol extender, with or without addition of antioxidants (Catalase, Superoxide dismutase and their associations, ascorbic acid, tocopherol and their associations). The second experiment aimed to compare the results of frozen semen of fertile and subfertile dogs supplemented with 500mg of vitamin C and E, orally for 60 days. We used 13 dogs, 7 were considered fertile and 6 classified as subfertile. The dogs had been considered fertile breeding soundness examination within the standards recommended by CBRA; the subfertile had lower sperm concentration (<20x10 6 sptz / mL) and / or high rate of sperm pathologies (> 30%). Semen was frozen in three stages, before the start of supplementation (M1), 30 (M2) and 60 days (M3) after the initiation of supplementation. Semen was collected by digital manipulation of the penis and analyzed for: motility, vigor, concentration and morphology. The frozen semen was performed by the method described by Chirinea et al. (2006). Thawing was performed at 70 ° C for 8 seconds. Soon after the samples were evaluated in the computerized analysis (CASA) and assessment of membrane integrity and acrosomal plasma. We also analyzed the rate of lipid peroxidation and antioxidants: SOD, catalase, vitamins C and E in seminal plasma. It can be conclude that oral supplementation, in the extender or your association can benefit the process of freezing / thawing of dogs. Especially for those with reproductive problems and may even, with oral therapy to reduce or eliminate this feature

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-04-17T15:50:19Z No. of bitstreams: 1 2011_JoseFelipeWarmilingSpricigo.pdf: 776198 bytes, checksum: 7dc5f032a4e8d4be9695b31ffaede77b (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2012-04-20T15:27:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_JoseFelipeWarmilingSpricigo.pdf: 776198 bytes, checksum: 7dc5f032a4e8d4be9695b31ffaede77b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-20T15:27:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_JoseFelipeWarmilingSpricigo.pdf: 776198 bytes, checksum: 7dc5f032a4e8d4be9695b31ffaede77b (MD5) / A vitrificaçào com cryotop surgiu como uma opçào promissora para a criopreservaçào de ovócitos, por minimizar efeitos negativos e melhorar as taxas de sobrevivência. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da vitrificaçào em diferentes momentos da maturação in vitro (MTV), quanto às características morfológieas, funcionais e moleculares, em ovócitos bovinos. Foram utilizados complexos-cumulus-ovócitos (CCOs) obtidos de ovários de abatedouio. Paia os experimentos 1 e 2, os ovócitos foram distribuídos em 4 grupos: controle (GC), não vitrificado; 0 hora vitrificado (VO); S horas vitrificado (VS) e 22 horas vitrificado (V22). Todos os grupos vitrificados foram desvitrifícados e retornaram para a MrV até completar 24 horas. Para a avaliação da cromatina, CCOs foram desnudados, fixados e corados com lacmoide. Para a taxa de fecundação, ovócitos foram submetidos à fecundação in vitro (FIV), e após 18 horas de co-cultivo com os espermatozóides foram fixados e corados com lacmoide. O desenvolvimento embrionário foi avaliado, pelas taxas de clivagem e blastocistos em D2. D7 e D8, após a inseminação (pi). Para análise estatística foi empregado o teste Qui-quadrado (P<0,05). Quanto ao experimento 3. primeiramente foi quantificada a expressão de genes ligados à apoptose (Caspase-3 e P-53) e ao controle epigenético (HDAC 2, Dnmt-1 e SUV39H1) em ovócitos maturados m vitro por : 0 (GCO), 8 (GC E), 22 (GC22) e 24 horas (GC24). Posteriormente, foi avaliado o efeito da vitrificaçào em diferentes momentos da MIV (0, 8 e 22 horas) na expressão desses mesmos genes. Para isso ovócitos de todos os grupos vitrifícados e do controle foram coletados ás 24 horas de MIV. A avaliação da expressão gênica. foi realizada por qPCR e os dados analisados por ANOVA one-way. (P<0,0S). A capacidade do ovócito de atingir Mil, após a maturação, clival e se desenvolver até blastocisto foi superior no grupo controle (P<0,05) comparado aos grupos vitrifícados. não havendo diferenças significativas entre estes (P>0.05). Já a taxa de fecundação, apesar de ser superior no grupo controle (P<0.05) o grupo VO apresentou a menor porcentagem de ovócitos fecundados e maior de ovócitos degenerados (P<0,05). comparado aos demais grupos. Quanto ao perfil de expressão gêmea em ovócitos durante a MIV. foi observado que os níveis de transcritos do gene Caspase-3 estavam aumentados (P<0,05). nos grupos GC22 e GC24. comparados á GCO e GCS, também foi observado um aumento (P<0.05) da expressão do gene Dnmt-1. nos grupos GC8. GC22 e GC24 comparados ao GCO. Entretanto, não foi observada alteração na abundância dos transcritos em nenhum dos grupos submetidos à vitnficação (P>0,0:j), comparados ao CG24. Conclui-se que. apesar dos baixos resultados, a vitnficação pode ser empregada para a conservação de ovócitos bovinos, independente do momento da MIV. Os níveis de transcritos avaliados nào foram alterados em resposta à vitrificaçào. Entretanto, foi constatado um aumento na expressão da Caspase-3 e Dnmt-1, durante a MIV. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Vitrification by cryorop method has emerged as a promising option for oocytes cryopreservation, by minimizing negative effects and improving survival rates. The aim of this research was to evaluate the effect of vitrification at different tunes point during in vitro maturation (TVM) on functional, morphological and molecular characteristics of bovine oocytes. For all the experiments cumulus-oocytes-complexes (COCs) were obtained from slaughterhouse ovaries. In first and second experiments, oocytes were distributed into 4 groups: control non-vitrified(C&); 0 hour vitrified (VO); 8 hours vitrified (VS) and 22 hours vitrified (V22). In all groups oocytes were vitrified and wanned, and then returned to incubator until 24 hours of IVM. For chromatin evaluation, COCs were denuded, fixed and stained with lacmoid. To evaluate fertilization rates, oocytes, were fixed and stained with lacmoid 18 hours after in vitro insemination (pi). Embryonic development was accessed by cleavage and blastocyst rates at D2. D7 and D8 (pi). Data were analyzed by Chi-square test (P <0.05). A third experiment was designed to evaluated inRNA expression of apoptosis (Caspase-3 and P-53) and epigenetic control related genes (HDAC 2, SUV39H1 and Dnmtl).First gene expression was quantified at different time points during oocyte IVM: 0 (CGO). 8 (CG 8), 22 (CG22) and 24 hours (CG24). Then, the effect of vitrification at different moments of IVM (0, 8 and 22 hours) on genes expression was studies. Gene expression was performed by qPCR and data were analyzed by one-way ANOVA (P <0.05).. The ability of the oocyte to reach Mil after maturation, to cleave and to develop to blastocyst w:as higher in CG (P <0.05), compared to vitrified groups, which did not differ among them (P:: 0.05). For fertilization rates, CG also presented superior results compared to all vitrified groups (P <0 05). However, when vitrified groups were compared. VO had the lowest rate of fertilized oocytes and higher rate degenerated oocytes than the other groups (P <0.05). Gene expression profile in oocytes during IVM, showed that mRNA levels of Caspase-3 were increased (P <0.05) in both CG22 and C&24 compared to CGO and CGE. An increase in Dnnit-1 gene expression was also observed (P <0.05) in CGS, CG22 and CG24 compared to CGO. No difference in mRNA relative abundance was observed in any of the vitnficated group (P> 0.05), compared to CG24. hi conclusion, despite the poor results, vitrification can be used to preserve bovine oocytes , regardless to IVM time. Transcript levels of the studied genes were not affected by vitrification procedure. However, an increase in mRNA levels of Caspase-3 and Dntnt-1 genes was observed during IVM, suggesting transcription processes during this period.