O efeito ansiolítico dos benzodiazepínicos (BZDs) é reduzido depois da primeira exposição ao labirinto em cruz elevado (LCE). Várias hipóteses tem sido formuladas para explicar este fenômeno chamado one-trial tolerance (OTT), entretanto, nenhuma delas é conclusiva. No presente estudo, examinamos este fenômeno através da análise etofarmacológica de ratos submetidos ao LCE em duas sessões (T1 e T2), e do conteúdo de monoaminas presentes no córtex pré-frontal, amígdala, hipocampo e núcleo accumbens através da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Pressão. Ratos machos Wistar foram tratados com salina ou midazolam (0,5 mg/Kg, i.p.) antes de T1 e T2 e imediatamente depois, seus encéfalos foram dissecados e as estruturas analisadas. Como controle à análise neuroquímica foram incluídos animais tratados com salina e não expostos ao LCE. A administração de midazolam antes de T1 promoveu efeito ansiolítico, aumentando a exploração dos braços abertos, porcentagem de entradas e tempo de permanência nos mesmos. Em T2 foi observado redução da exploração dos braços abertos em relação a T1. Esses resultados sugerem que há uma mudança no estado emocional do animal em T2, que é resistente a ação ansiolítica dos BZDs. Com relação aos resultados dos estudos neuroquímicos, foi observado redução dos conteúdos de serotonina (5- HT) e noradrenalina (NA) no córtex pré-frontal, na amígdala, no hipocampo e no núcleo accumbens depois de T1 e T2. Houve também, redução do conteúdo de dopamina (DA) na amígdala depois de ambas sessões. Não ocorreram mudanças nas taxas de renovação dessas monoaminas em nenhuma das estruturas analisadas. Através desses resultados, pode-se inferir que a estimulação aversiva do LCE causa alterações na neurotransmissão monoaminérgica da amígdala, como também das outras estruturas límbicas estudadas neste trabalho. Essas alterações neuroquímicas depois da primeira exposição ao LCE, devem representar alterações adaptativas na neurotransmissão do sistema límbico que podem estar associadas ao fenômeno da OTT. / Numerous reports have demonstrated that a single exposure to a variety of stressful experiences enhances fearful reactions when behavior is subsequently tested in current animal models of anxiety. Until now, no study has examined the neurochemical changes during the test and retest sessions of freely-behaving rats in the elevated plus-maze (EPM), one of the most traditional tests of anxiety. This work is a new approach looking at the changes in dopamine (DA), serotonin (5-HT) and noradrenaline (NA) levels in the prefrontal cortex, amygdala, hippocampus and nucleus accumbens during one-trial learning development. We used high pressure liquid chromatography to assess the concentrations of these neurotransmitters and their metabolites in animals injected with saline or midazolam upon single or double exposure to the EPM. For the biochemical analysis an extra control group treated with saline and not exposed to EPM was added. The data showed that stressful stimuli present in the maze were able to elicit one-trial learning to midazolam on re-exposure. Significant decreases in 5-HT and NA contents in the prefrontal cortex, amygdala, hippocampus and nucleus accumbens occurred in saline and midazolam injected animals submitted to the first and second trials. Significant decreases in DA content were also observed in the amygdala after both trials. There was no change in the turnover of these monoamines in any structure studied. It is suggested that aversive stimuli inherent to the EPM cause primary changes in the neurochemical mechanisms of the amygdala and also influence the activity of monoaminergic neurotransmission in the prefrontal cortex, hippocampus and nucleus accumbens. The observed reduction in monoaminergic transmission in limbic structures after the first stressful experience in the EPM seems to represent adaptive changes and may be associated to the phenomenon of ?one-trial tolerance?.

Foram desenvolvidas metodologias de cromatografia a líquido de fase reversa baseadas em injeção sequencial (SIC) e em cromatografia a líquido de alta eficiência (HPLC) para determinação de triclosan em amostras de produtos de higiene pessoal e em estudos de adsorção em argilominerais naturais e modificados, visando determinar parâmetros de adsorção de triclosan frente a alguns de seus metabólitos. A determinação de triclosan em enxaguadores bucais foi realizada por SIC com eluição isocrática usando fase móvel constituída por acetonitrila: tampão fosfato de trietilamina 70 mM pH 3,5 na proporção 70:30 (v v-1), obtendo-se limites de detecção e de quantificação de 0,22 e 0,72 mg L-1, respectivamente. Taxas de recuperação entre 96 e 98% foram obtidas da aplicação a amostras reais, sendo que os resultados obtidos pelo método proposto não apresentaram evidências de diferenças estatisticamente significativas em comparação a uma metodologia de referência baseada em HPLC com coluna empacotada. A separação de triclosan (TCS), 2-clorofenol (2-CP), 2,4-diclorofenol (2,4-DCP), 2,4,6-triclorofenol (2,4,6-TCP), 2,3,4-triclorofenol (2,3,4-TCP) e metiltriclosan (MTCS) foi estudada por SIC, obtendo-se a separação de TCS, 2-CP, 2,4-DCP e 2,4,6-TCP com duas etapas de eluição isocrática, a primeira delas com fase móvel 60:40 (v v-1) metanol: tampão acetato de amônio 20 mM (pH 5,5) seguida de eluição com fase móvel 70:30 (v v-1) metanol : tampão acetato de amônio 20 mM (pH 5,5). Nesse caso, os isômeros 2,4,6-TCP e 2,3,4-TCP coeluem. Metiltriclosan, o menos polar desses compostos, pode ser separado de TCS com etapas subseqüentes de eluição. Os métodos foram aplicados para estudar a adsorção de triclosan e seus metabólitos 2,4-DCP, 2,4,6-TCP e metiltriclosan em montmorilonita homoiônica (K+) e modificada com sal de hexadeciltrimetilamônio (HDTMA), observando-se forte adsorção de triclosan e metiltriclosan em comparação a 2-CP, 2,4-DCP e 2,4,6-TCP. A incorporação de HDTMA no argilomineral causou significativo aumento da capacidade de adsorção desses metabólitos, determinada a partir do ajuste dos dados experimentais à equação linearizada de Langmuir, observando-se que a ordem de adsorção é 2,4,6-TCP > 2,4-DCP > 2-CP / Reversed-phase liquid chromatography methodologies based on sequential injection (SIC) and high performance liquid chromatography (HPLC) have been developed for determination of triclosan in samples of personal hygiene products and in studies of adsorption on natural and modified clay minerals aiming to determine kinetic and thermodynamic parameters of adsorption of triclosan in comparison with some of its metabolites. The determination of triclosan in oral rinses with SIC was performed by isocratic elution using a mobile phase of acetonitrile : 70 mM triethylamine phosphate buffer pH 3.5 at the ratio 70:30 (v v-1), obtaining limits of detection and quantification of 0.22 and 0.72 mg L-1, respectively. Recovery rates between 96 and 98 % were obtained from the application to commercial samples, and the results obtained by the proposed method showed no evidence of statistically significant differences compared to the reference methodology based on HPLC with packed column. The separation of triclosan (TCS), 2-chlorophenol (2-CP), 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP), 2,4,6-trichlorophenol (2,4,6-TCP), 2,3,4 trichlorophenol (2,3,4-TCP) and methyltriclosan (MTCS) was studied by SIC, resulting in the separation of TCS, 2-CP, 2,4-DCP and 2,4,6-TCP with two isocratic elution steps, the first of them with a mobile phase 60:40 (v v-1) methanol: 20 mM ammonium acetate buffer (pH 5.5) followed by elution with 70:30 (v v-1) mobile phase of methanol : 20 mM ammonium acetate buffer (pH 5.5). In this case, the isomers 2,4,6-TCP and 2,3,4-TCP coeluted. Methyltriclosan, the less polar of these compounds, can be separated from TCS with subsequent elution steps. The methods were applied to study the adsorption of triclosan and its metabolites 2-CP, 2,4-DCP, 2,4,6-TCP and methyltriclosan on homoionic montmorillonite (K+) as well as in hexadecyltrimethylammonium salt (HDTMA) modified montmorillonite, noticing a stronger adsorption of triclosan and methyltriclosan compared with 2-CP, 2,4-DCP and 2,4,6-TCP. Incorporation of HDTMA in the clay mineral caused significant increase in adsorption capacity of these metabolites. This capacity was determined by fitting the experimental data to the linearized Langmuir equation. The adsorption order was 2,4,6-TCP > 2,4-DCP > 2-CP.

O pró-fármaco olmesartana medoxomila (OLM) é um anti-hipertensivo representante da classe dos bloqueadores seletivos dos receptores da angiotensina II (BRA). No Brasil, encontra-se disponível sob a forma de comprimidos revestidos (Benicar®). Foi aprovado pelo FDA em 2002. Não existe monografia disponível para este fármaco em nenhum código oficial. Desse modo, este trabalho objetivou o desenvolvimento de métodos analíticos para quantificação da OLM na substância química de referência (SQR) e forma farmacêutica, estabelecer a cinética de dissolução in vitro para os comprimidos revestidos deste fármaco e por fim investigar a presença de diferentes estruturas polimórficas da SQR deste anti-hipertensivo. A determinação da faixa de fusão, a espectrofotometria na região do infravermelho (IV), assim como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C permitiram a identificação da SQR. Os métodos por espectrofotometria na região do ultravioleta (UV), cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) e cromatografia capilar eletrocinética micelar (MECC) foram utilizados para análise qualitativa do fármaco no produto acabado. A determinação quantitativa foi realizada através do desenvolvimento e validação de método indicativo da estabilidade por CLAE e MECC, avaliando-se os parâmetros descritos pelas guias de validação como: especificidade, robustez, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão e exatidão. Determinou-se ainda, a intercambialidade dos mesmos, através de análise estatística por ANOVA (p = 0,05), e comprovou-se que ambos podem ser utilizados para análise qualitativa e quantitativa da OLM em matéria-prima e produto acabado. O teste de dissolução foi desenvolvido e validado de acordo com o guia proposto pelo USP Fórum, utilizando como meio de dissolução 900 ml de uma solução a 0,5% (p/V) de lauril sulfato de sódio pH 6,8, a 37 ± 0,5 °C, pás a 50 rpm e quantificação por CLAE e espectrofotometria na região do UV. A análise do teor de OLM dissolvida, realizada por ambos os métodos, não apresentou diferença estatística (p > 0,05). Os perfis de dissolução do Benicar®, medicamento referência, e do Olmetec®, outra formulação disponível no mercado, foram considerados semelhantes, após aplicação do método modelo-independente (f1 e f2) e eficiência de dissolução. Avaliou-se, também, a cinética de dissolução de ambas as formulações através da aplicação de métodos modelo-dependentes. Os perfis de dissolução do Benicar® e Ometec® foram descritos pelos modelos propostos por Hixson-Crowell e de ordem zero, respectivamente. Os valores calculados para t50% e t80%, obtidos através da aplicação da equação de ordem zero, foram semelhantes aos valores experimentais encontrados no perfil de dissolução de ambos os produtos. As técnicas de espectrofotometria por reflexão difusa no IV com transformada de Fourier (ATRFTIR), difração de raios-X de pó (XRPD), calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TGA) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) permitiram a identificação de uma forma amorfa e outra polimórfica da SQR da OLM, diferentes daquela descrita na literatura. Logo, de acordo com os resultados obtidos, todos os métodos propostos podem ser utilizados para no controle de qualidade da OLM em SQR e produto acabado. / The prodrug olmesartan medoxomil (OLM) is a selective angiotensin II receptor blocker (ARB). In Brazil, it is available as coated tablets (Benicar®). It was approved by FDA in 2002. There is no monograph available for this drug in any official code. According to this, the main purpose of this study was to develop a quality control analytical methodology for OLM in bulk material and dosage form, to establish in vitro dissolution kinetic for OLM coated tablets, and to investigate the crystalline behavior of OLM bulk material. The investigation of melting range and application of techniques such as infrared spectrophotometry (IR), as well as the 1H and 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy were used to identify OLM. Ultraviolet (UV) spectrophotometry, thin-layer chromatography (TLC), highperformance liquid chromatography (LC) and micellar electrokinetic chromatography (MEKC) were used for qualitative analysis of the drug in coated tablets. The quantitative determination was carried out through the development and validation of a stability-indicating LC and MEKC methods, evaluating the parameters described in the guidelines such as: specificity, robustness, linearity, detection and quantitation limits, precision, and accuracy. The results were compared statistically by ANOVA (p = 0.05), and no difference was found between them for both bulk material and coated tablets. A dissolution test was developed and validated according to the guideline proposed by the USP Forum, using 900 ml of dissolution medium containing 0.5% of sodium lauryl sulfate (w/V) pH 6.8, at 37 ± 0.5 °C, paddle at 50 rpm, and quantitation by LC and UV spectrophotometry. The resulting dissolution profiles did not show statistical difference (p > 0.05) between methods. The dissolution profiles of Benicar®, reference formulation, and Olmetec®, another commercial formulation available, were considered similar, using model independent (f1, f2, and dissolution efficiency) methods. The dissolution kinetic of both formulations, using model dependent approaches, revealed that Benicar® followed the Hixson-Crowell model, while Olmetec® the zero-order model. The calculated values of t50% and t80%, obtained from zero-order equation, were similar of experimental values found in the dissolution profile for both products. The attenuated total reflectance Fourier transformed infrared (ATR-FTIR) spectrophotometry, along with differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG), X-ray powder diffraction (XRPD), and scanning electron microscopy (SEM) allowed to identify one amorphous and other polymorphic forms of OLM. According to the obtained results, all proposed methods could be used in the quality control of OLM bulk material and coated tablets.

Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. &Tul.) Mart. é uma espécie nativa do Rio Grande do Sul, conhecida popularmente como pau-sabão, devido à capacidade de suas folhas e cascas formarem abundante espuma em água. A espécie congênere chilena, Q. saponaria, é uma das principais fontes industriais de saponinas, as quais são utilizadas, entre outros, como adjuvantes em vacinas. Tendo em vista a presença de saponinas em Q. brasiliensis, métodos por cromatografia em camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foram desenvolvidos para a caracterização e o doseamento de fração purificada de saponinas, a partir do extrato aquoso de folhas, denominada QB-90. Ensaios para verificar a toxicidade subcutânea e o perfil dose-dependente para atividade adjuvante também foram realizados com esta fração. Para o doseamento de QB-90 no extrato aquoso foi desenvolvido e validado um método por CLAE empregando coluna de fase reversa C8, sistema isocrático acetonitrila:água, fluxo de 0,8 ml/min e detecção a 214 nm. Na validação do método, foram avaliados os parâmetros de linearidade e intervalo de variação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Em relação à toxicidade subcutânea de QB-90 em camundongos, não foram observados efeitos sistêmicos no intervalo de doses de 50 a 400 μg. Vacinas experimentais preparadas com herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) como antígeno e QB-90 (50-200 μg) foram capazes de aumentar a resposta imunológica em camundongos de modo comparável às saponinas de Q. saponaria (QUIL-A®, 100 μg). Com vistas à potencial utilização sustentável da espécie brasileira na obtenção de saponinas de interesse industrial, protocolos básicos de obtenção de plantas de Q. brasiliensis por micropropagação e por germinação de sementes foram desenvolvidos. Para melhor compreender o perfil de acúmulo de QB-90, seu conteúdo foi investigado em diferentes órgãos vegetais, em diferentes estações do ano e durante o desenvolvimento de plântulas, assim como em resposta a fatores de estresses bióticos e abióticos. O conteúdo de QB-90 não foi afetado pela aplicação de ácido salicílico exógeno (5 mM). No entanto, foi aumentado pela aplicação exógena de ácido jasmônico (40 μM e 400 μM), bem como pela exposição à radiação UVC. Tendência de aumento no teor de QB-90 foi observada com a aplicação de dano mecânico controlado e com a exposição à radiação UVB. A distribuição órgão-específica de QB-90 foi avaliada, detectando-se maiorconcentração nas folhas do que em raízes e caules de plantas propagadas em laboratório. O teor de QB-90 também foi analisado nas diferentes estações climáticas ao longo de dois anos, indicando que a redução da insolação, geralmente associada a períodos de baixa pluviosidade, está associada à maior produção de QB-90. / Quillaja brasiliensis (A. St.-Hil. & Tul.) Mart. is a native tree of Rio Grande do Sul, the Southern state of Brazil, commonly known as soap tree due to the capacity of their leaves and barks to produce abundant foam in water. The related Chilean species, Q. saponaria, is one of the main sources of industrial saponins which are used as adjuvant formulation for vaccines. Considering the presence of saponins in Q. brasiliensis, thin-layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) methods were developed to characterize and quantify the purified saponin fraction named QB-90, obtained from the aqueous extract of leaves. Additionally, the subcutaneous toxicity and dose-response profile to adjuvant activity of QB-90 were evaluated in mice. An HPLC method was developed and validated to quantify QB-90 content in aqueous extract, employing RP-8 column, mobile phase acetonitrile:water, flow rate of 0.8 ml/min and detection at 214 nm. The validation parameters evaluated were linearity and range, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness. In relation to QB-90 subcutaneous toxicity in mice, systemic effects were not observed in doses ranging from 50-400 μg. Experimental vaccines prepared with bovine herpesvirus type I (BoHV-1) antigen and QB-90 (50- 200 μg) were able to enhance the immune responses of mice in a comparable manner to saponins from Q. saponaria (QuilA, 100 μg). Considering the potential sustainable utilization of the Brazilian species as a source of saponins of industrial use, basic protocols for obtaining Q. brasiliensis plants by micropropagation and seed germination were developed. To better understand the accumulation patterns of QB-90, we investigated its content in different plant organs; throughout the seasons and during seedling development, as well as in response to potential biotic and abiotic stress factors. Content of QB-90 wasn’t affected by exogenous application of salicylic acid (5mM). However, it was increased by exogenous application of jasmonic acid (40 μM and 400 μM), as well as by exposure to UVC. Trends toward increase in QB-90 content were observed with exposure to UVB and wounding. The organ-specific QB-90 distribution was evaluated and higher amounts were observed in leaves than roots and stems of plants propagated in the laboratory. Variations inQB-90 content in different seasons for two years showed that lower insolation, generally combined with low precipitation periods, were associated with higher QB- 90 content.

[pt] Métodos baseados na cromatografia líquida micelar (MLC) com detecção fluorimétrica foram desenvolvidos para dois estudos de caso. No primeiro deles, seis B-carbolinas (harmol, harmalol, harmane, norharmane, harmine e harmaline) foram plenamente separadas de modo a se aplicar o método para a determinação dos alcaloides em formulações de Passiflora incarnata L., extrato seco de Passiflora alata Dryander e em urina. A separação foi realizada em coluna cromatográfica C18, utilizando fase móvel tamponada (pH 8,0) contendo 220 mmol L-1 de dodecilsulfato de sódio (SDS)/acetonitrila (97/3 por cento v/v). A detecção fluorimétrica permitiu que se atingissem limites de detecção (LOD) abaixo de 3,6 ng g-1 com repetibilidade e precisão intermediária entre 0,1 e 5 por cento. As incertezas combinadas associadas à concentração das B-carbolinas ficaram entre 1 e 9 por cento. O método proposto foi comparado ao método baseado na cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) com detecção absorciométrica e os resultados com MLC se mostraram superiores do ponto de vista da capacidade de detecção (por serem os alcaloides naturalmente muito fluorescentes) e de recuperação. Para as amostras de fitoterápicos, o harmol foi quantificado tanto nas amostras de medicamento de Passiflora incarnata quanto em urina de voluntário após a administração de fitoterápico. O harmine foi detectado apenas na amostra de medicamento. Os alcaloides norharmane, harmine e harmaline foram identificados no chá misto de Maracujá, no qual continha em sua composição extrato seco de Passiflora alata Dryander. Na segunda abordagem, um método por MLC foi desenvolvido para a determinação de galantamina e de seus principais metabólitos (N-desmetil galantamina, O-desmetil galantamina, epigalantamina e N-óxido galantamina). A separação da galantamina e dos metabólitos foi feita utilizando coluna cromatográfica C18 com porosidade de 300 angstroms e fase móvel constituída de tampão (pH 5,0) contendo 25 mmol L-1 de SDS/acetonitrila (97/3 por cento v/v). A detecção fluorimétrica permitiu limites de detecção abaixo de 343 ng g-1, repetibilidade e precisão intermediária entre 2,2 e 4 por cento. As incertezas combinadas associadas à concentração de galantamina e dos metabólitos ficaram entre 0,3 e 11 por cento. Ensaios de recuperação foram realizados em amostra de urina fortificada com padrões da galantamina e metabólitos e os resultados obtidos ficaram entre de 91,4 e 114,8 por cento. A comparação entre o método por MLC e o método por cromatografia líquida de alta eficiência com fase reversa foram feitas com amostras de medicamento cujo princípio ativo era o hidrobrometo de galantamina. Os resultados dos teores de galantamina e as variâncias das medidas obtidas por ambos os métodos foram estatisticamente iguais. A sensibilidade da curva analítica obtida por MLC foi duas vezes maior do que a encontrada por cromatografia por fase reversa. Análises de urina de ratos coletadas após a administração do medicamento foram realizadas com o método proposto, sendo que a galantamina mais os metabólitos N-óxido galantamina e N-desmetil galantamina foram identificados nas amostras. Para melhor avaliar o efeito de amplificação de fluorescência da galantamina pelo ambiente organizado, experimentos foram feitos com a separação cromatográfica de fase reversa e com a adição de solução rica em micelas de SDS após a passagem do analito pela coluna cromatográfica. As condições de separação incluíram o uso de coluna cromatográfica C18, fase móvel constituída por tampão (pH 5,0) contendo 2 por cento de propano-2-ol (v/v)/ acetonitrila (80/20 por cento v/v). A solução micelar de SDS (100 mmol L-1), misturada à fase móvel após a coluna cromatográfica, foi preparada com a mesma composição da fase móvel. A sensibilidade da curva analítica de galantamina foi três vezes maior quando o meio micelar foi usado. O resultado prova que o ambiente micelar favorece a medição fluorimétrica de galantam / [en] Methods based on micellar liquid chromatography (MLC) with fluorimetric detection have been developed for two case studies. In the first, six B-carbolines (harmol, harmalol, harmane, norharmane, harmine and harmaline) were fully separated allowing the application of the method for the determination of these alkaloids in Passiflora incarnata L. formulations, in Passiflora alata Dryander dry extract and in urine. The chromatographic separation was performed on a C18 column using a buffered mobile phase consisting of disodium hydrogen phosphate (pH 8.0) containing 220 mmol L-1 of sodium dodecyl sulfate (SDS)/acetonitrile (97/3 percent v/v). The fluorimetric detection allowed limits of detection (LOD) below than 3.6 ng g-1 to be achieved with intermediary precision and repeatability between 0.1 and 5 percent. The calculated combined uncertainties of the concentration of B-carbolines were between 1 and 9 percent. The proposed method was compared with the method based on micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with absortionmetric detection. The MLC results were superior from the viewpoint of the detection power (since they are very fluorescent alkaloids) and also in terms of recovery. The harmol was quantified in Passiflora incarnata phitotherapic samples and in urine collected from a voluntary after of the administration of herbal medicine. The harmine was detected only in the phitotherapic sample. The norharmane, harmine and harmaline alkaloids were identified in Passion Fruit tea, which contained dry extract of Passiflora alata Dryander. In the second approach, a method for MLC was developed for the determination of galantamine and its main metabolites (N-demethyl galantamine, O-demethyl galantamine, epigalantamine and N-oxide galantamine). The separation was performed using a C18 chromatography column with porosity of 300 angstroms and with mobile phase consisting of buffer (pH 5.0) containing SDS (25 mmol L-1)/acetonitrile (97/3 percent v/v). The fluorimetric detection enabled LOD below 343 ng g-1 with intermediate precision and repeatability between 2.2 and 4 percent. Combined uncertainties for concentration of galantamine and metabolites were between 0.3 and 11 percent. Recovery experiments were performed on urine samples fortified with galantamine standards and metabolites with results between 91.4 and 114.8 percent. A comparison between the proposed MLC method and reverse phase high performance liquid chromatography was made using medicine samples containing galantamine hydrobromide as the active principle. Galantamine levels and variances achieved with these methods were statistically equal. The analytical curve sensitivity by MLC was two times higher than that found with reverse phase high performance liquid chromatography. Analysis of rat urine, collected after the administration of the medicine, were performed with the proposed method enabling the identification of galantamine, N-oxide galantamine and N-demethyl galantamine. To better evaluate the fluorescence amplification effect of galantamine in the organized environment, experiments were made with conventional chromatographic separation and post-column addition of the aqueous solution rich in micelles. The separation conditions included the use of C18 chromatographic column, mobile phase consisting of buffer (pH 5.0) containing 2 percent of propan-2-ol (v/v)/acetonitrile (80/20 percent v/v). The micellar solution of SDS (100 mmol L-1), added after the chromatographic column, was prepared with the same composition of the mobile phase. The column temperature was 25 degrees C and the sample volume was 20 uL. The sensitivity of the analytical curve of galantamine was three times higher when the micellar solution was mixed, proving that the organized environment favors the galantamine fluorescence even at flow regime. Recoveries with or without post-column mixing with the micelle rich solution were between 97.5 and 102.2 percent.

O chá-verde brasileiro, obtido a partir das partes aéreas de Camellia sinensis var. assamica, teve sua produção recentemente implantada no Brasil devido ao emergente consumo. As principais atividades farmacológicas atribuídas a esta planta estão relacionadas à atividade antioxidante, quimiopreventiva e antitumoral. Neste trabalho foi desenvo lvido e validado método por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para avaliar o perfil dos constituintes majoritários [galato de epigalocatequina (EGCG), epigalocatequina, cafeína, galato de epicatequina (ECG) e epicatequina] do chá-verde brasileiro coletado na primavera e verão, e utilizando diferentes sistemas de extração. A resposta foi linear na faixa de 37-185 μg/ml para cafeína, 99-500 μg/ml para EGC, 20-100 μg/ml para catequina, 30-150 μg/ml para epicatequina, 150-800 μg/ml para EGCG, 20-105 μg/ml para galato de galocatequina e 40-205 μg/ml para ECG (r > 0,9999 para todos os compostos). Foi, também, avaliada a atividade antioxidante in vitro através do método fotocolorimétrico do DPPH· e do método enzimático da hipoxantina/xantina oxidase. Todos os sistemas de extração testados e seus respectivos extratos liofilizados apresentaram rendimento superior a 30%, sendo que o melhor sistema teve rendimento médio de 36,29%, e se mostrando mais eficiente na extração de EGCG e ECG. As amostras do verão apresentaram melhor atividade antioxidante em comparação às da primavera. Os teores dos componentes ECG e EGCG foram os únicos que correlacionaram com a atividade antioxidante in vitro (DPPH·). A análise estatística não mostrou diferença significativa (a = 0,05) nos teores de catequinas totais entre as estações primavera e verão. / The Brazilian green tea, produced from Camellia sinenis var. assamica, have been cultivated in Brazil recently because the rise at its consumption. The main pharmacological activities attributed to this plant are related to antioxidant activity as chemopreventive and anti-cancer agent. Herein, a new HPLC method was developed and validated to evaluate the profile of the major Brazilian green tea constituents [epigallocatechin gallate (EGCG), epigallocatechin, caffeine, epicatechin gallate (ECG) and epicatechin] between spring and summer, using different extraction systems. The response was linear over a range of 37-185 μg.mL-1 for caffeine, 99-500 μg.mL-1 for epigallocatechin, 20-100 μg.mL-1 for catechin, 30-150 μg.mL-1 for epicatechin, 150-800 μg.mL-1 for EGCG, 20-105 μg.mL-1 for gallocatechin gallate and 40- 205 μg.mL-1 for ECG (r > 0.9999 for all compounds). Likewise, the in vitro antioxidant activity was evaluated using DPPH· assay and hipoxanthine/xanthine oxidase assay. The extractors systems to produce the freeze-drying extract had presented yield up of 30%. The best system an average yield of 36.26% showed more efficient to extract EGCG and ECG. The summer samples presented better antioxidant activity when compared with spring samples. Only ECG and EGCG contents presented correlation with in vitro antioxidant activity (DPPH· assay). The statistic analysis did not show significant difference (a = 0.05) in total catechin content between spring and summer seasons.

O pró-fármaco olmesartana medoxomila (OLM) é um anti-hipertensivo representante da classe dos bloqueadores seletivos dos receptores da angiotensina II (BRA). No Brasil, encontra-se disponível sob a forma de comprimidos revestidos (Benicar®). Foi aprovado pelo FDA em 2002. Não existe monografia disponível para este fármaco em nenhum código oficial. Desse modo, este trabalho objetivou o desenvolvimento de métodos analíticos para quantificação da OLM na substância química de referência (SQR) e forma farmacêutica, estabelecer a cinética de dissolução in vitro para os comprimidos revestidos deste fármaco e por fim investigar a presença de diferentes estruturas polimórficas da SQR deste anti-hipertensivo. A determinação da faixa de fusão, a espectrofotometria na região do infravermelho (IV), assim como a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C permitiram a identificação da SQR. Os métodos por espectrofotometria na região do ultravioleta (UV), cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE) e cromatografia capilar eletrocinética micelar (MECC) foram utilizados para análise qualitativa do fármaco no produto acabado. A determinação quantitativa foi realizada através do desenvolvimento e validação de método indicativo da estabilidade por CLAE e MECC, avaliando-se os parâmetros descritos pelas guias de validação como: especificidade, robustez, linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão e exatidão. Determinou-se ainda, a intercambialidade dos mesmos, através de análise estatística por ANOVA (p = 0,05), e comprovou-se que ambos podem ser utilizados para análise qualitativa e quantitativa da OLM em matéria-prima e produto acabado. O teste de dissolução foi desenvolvido e validado de acordo com o guia proposto pelo USP Fórum, utilizando como meio de dissolução 900 ml de uma solução a 0,5% (p/V) de lauril sulfato de sódio pH 6,8, a 37 ± 0,5 °C, pás a 50 rpm e quantificação por CLAE e espectrofotometria na região do UV. A análise do teor de OLM dissolvida, realizada por ambos os métodos, não apresentou diferença estatística (p > 0,05). Os perfis de dissolução do Benicar®, medicamento referência, e do Olmetec®, outra formulação disponível no mercado, foram considerados semelhantes, após aplicação do método modelo-independente (f1 e f2) e eficiência de dissolução. Avaliou-se, também, a cinética de dissolução de ambas as formulações através da aplicação de métodos modelo-dependentes. Os perfis de dissolução do Benicar® e Ometec® foram descritos pelos modelos propostos por Hixson-Crowell e de ordem zero, respectivamente. Os valores calculados para t50% e t80%, obtidos através da aplicação da equação de ordem zero, foram semelhantes aos valores experimentais encontrados no perfil de dissolução de ambos os produtos. As técnicas de espectrofotometria por reflexão difusa no IV com transformada de Fourier (ATRFTIR), difração de raios-X de pó (XRPD), calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria (TGA) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) permitiram a identificação de uma forma amorfa e outra polimórfica da SQR da OLM, diferentes daquela descrita na literatura. Logo, de acordo com os resultados obtidos, todos os métodos propostos podem ser utilizados para no controle de qualidade da OLM em SQR e produto acabado. / The prodrug olmesartan medoxomil (OLM) is a selective angiotensin II receptor blocker (ARB). In Brazil, it is available as coated tablets (Benicar®). It was approved by FDA in 2002. There is no monograph available for this drug in any official code. According to this, the main purpose of this study was to develop a quality control analytical methodology for OLM in bulk material and dosage form, to establish in vitro dissolution kinetic for OLM coated tablets, and to investigate the crystalline behavior of OLM bulk material. The investigation of melting range and application of techniques such as infrared spectrophotometry (IR), as well as the 1H and 13C nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy were used to identify OLM. Ultraviolet (UV) spectrophotometry, thin-layer chromatography (TLC), highperformance liquid chromatography (LC) and micellar electrokinetic chromatography (MEKC) were used for qualitative analysis of the drug in coated tablets. The quantitative determination was carried out through the development and validation of a stability-indicating LC and MEKC methods, evaluating the parameters described in the guidelines such as: specificity, robustness, linearity, detection and quantitation limits, precision, and accuracy. The results were compared statistically by ANOVA (p = 0.05), and no difference was found between them for both bulk material and coated tablets. A dissolution test was developed and validated according to the guideline proposed by the USP Forum, using 900 ml of dissolution medium containing 0.5% of sodium lauryl sulfate (w/V) pH 6.8, at 37 ± 0.5 °C, paddle at 50 rpm, and quantitation by LC and UV spectrophotometry. The resulting dissolution profiles did not show statistical difference (p > 0.05) between methods. The dissolution profiles of Benicar®, reference formulation, and Olmetec®, another commercial formulation available, were considered similar, using model independent (f1, f2, and dissolution efficiency) methods. The dissolution kinetic of both formulations, using model dependent approaches, revealed that Benicar® followed the Hixson-Crowell model, while Olmetec® the zero-order model. The calculated values of t50% and t80%, obtained from zero-order equation, were similar of experimental values found in the dissolution profile for both products. The attenuated total reflectance Fourier transformed infrared (ATR-FTIR) spectrophotometry, along with differential scanning calorimetry (DSC), thermogravimetry (TG), X-ray powder diffraction (XRPD), and scanning electron microscopy (SEM) allowed to identify one amorphous and other polymorphic forms of OLM. According to the obtained results, all proposed methods could be used in the quality control of OLM bulk material and coated tablets.

A análise de fármacos é fundamental nas diversas fases do desenvolvimento farmacêutico, tais como em estudos de formulação, estabilidade e controle de qualidade do produto. O mesilato de gemifloxacino (MGF), liberado para uso clínico no Brasil em novembro de 2006 com o nome comercial de Factive®, é uma fluorquinolona indicada para o tratamento da exacerbação aguda da bronquite crônica e da pneumonia adquirida da comunidade. A literatura pesquisada apresenta poucos relatos de determinação quantitativa e de estudos de estabilidade do fármaco em comprimidos revestidos. Anteriormente aos estudos, foi realizada a caracterização da substância química de referência (SQR) de MGF por espectrofotometria no infravermelho (E IV), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN 1H) e carbono (RMN 13C), análise térmica por calorimetria exploratória de varredura (DSC) e determinação da faixa de fusão. Métodos analíticos para determinação qualitativa e quantitativa foram desenvolvidos e validados por espectrofotometria na região do ultravioleta (E UV) e visível (E VIS), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), eletroforese capilar (EC) e ensaio microbiológico pelo método de cilindros em placas. A validação de um método de dissolução baseado em dados in vivo do fármaco também foi realizada. A elucidação do produto de degradação isolado em condições alcalinas foi realizada por E IV, RMN de 1H, 13C e correlação (COSY, HSQC e HMBC), espectrometria de massas (EM) e emissão atômica. Estudos de citotoxicidade, fototoxicidade, genotoxicidade e fotogenotoxicidade foram empregados para conhecimento da toxicidade dos produtos analisados. / The drug analysis is essential in all areas of the pharmaceutical development, such as during formulation studies, stability and quality control of the product. Gemifloxacin mesylate (GFM), approved for clinical use in Brazil in November of 2007 with the commercial name of Factive®, is a fluoroquinolone prescribed for the treatment of acute exacerbations of chronic bronchitis and community-acquired pneumonia. The research literature shows a few studies of quantitative determination and stabilities studies of the drug in coated tablets. Previously, it was performed the characterization of the reference chemical substance of GFM by infrared spectrometry (IR), nuclear magnetic resonance of 1H (1H NMR) and 13C (13C NMR), thermal analysis by differential scanning calorimetry (DSC) and determination of the melting range. Analytical methods for qualitative and quantitative determination were developed and validated by ultraviolet (UV) and visible (Vis) spectrophotometry, highperformance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis (CE) and microbiological assay applying the cylinder–plate method. The validation of the dissolution method based on in vivo data of the GFM was also performed. The elucidation of the isolate degradation product in alkaline conditions was performed by IR, 1H, 13C and correlation (COSY, HSQC and HMBC) NMR, and mass spectrometry (MS). Cytotoxicity, phototoxicity, genotoxicity and photogenotoxicity studies were carried out for the toxicity knowledge of the analyzed products.

O trevo-vermelho (Trifolium pratense L.), uma das leguminosas forrageiras mais utilizadas na agricultura mundial, contém as isoflavonas formononetina e biochanina A, e em menores concentrações daidzeína e genisteína. Estes compostos têm ganhado muito interesse devido aos relatos de seus benefícios à saúde humana. Recentemente, no ano de 2009, esta espécie foi incluida na lista da Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS) que contém plantas medicinais com potencial de gerar produtos para serem produzidos e distribuídos pelo SUS. Mas é importante destacar que não existem estudos de quantificação de isoflavonas em plantas de trevo-vermelho cultivados no Brasil. Os objetivos deste trabalho foram validar método de análise de amostras de trevo-vermelho por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE); quantificar quatro isoflavonas em 78 acessos de trevo-vermelho; verificar as modificações sazonais na concentração de três acessos de trevo-vermelho; aumentar os níveis de isoflavonas através de melhoramento genético; e determinar a atividade anti-inflamatória in vivo e in vitro e de atividade de inibição da acetilcolinesterase de um extrato seco de trevo-vermelho. Para analisar as plantas por CLAE, estas foram hidrolisadas, separadas por diclorometano, e ressuspendidas em metanol. O método de CLAE usado foi validado. As isoflavonas (daidzeína, genisteína, formononetina e biochanina A) foram quantificadas em 78 acessos de trevo-vermelho, os conteúdos das agliconas (expressos em μg/g de planta seca, n=3) destes compostos variaram entre 0,00 a 137,91 para daidzeína; 14,70 a 516,51 para genisteína; 452,97 a 28548,65 para formononetina; e 1967,64 a 20145,27 para biochanina A, e a concentração total de isoflavonas variou entre 9,81 e 36,36 mg/g. O estudo sazonal mostrou que a concentração total das isoflavonas não difere entre as estações, mas verifica-se que na primavera (quando o trevo-vermelho está no estágio reprodutivo) se observam concentrações inferiores, e no inverno (quando a planta está no estágio vegetativo) são encontradas concentrações mais elevadas. No estudo de melhoramento genético foi possível observar um aumento na concentração total de isoflavonas. A atividade anti-inflamatória in vitro foi medida através da mobilização de leucócitos, pelo ensaio de quimiotaxia na câmara de Boyden. A atividade anti-inflamatória in vivo foi avaliada pelo teste de edema de pata de rato induzido por carragenina. Os resultados do teste anti-inflamatório in vitro mostram que houve significante inibição da migração dos leucócitos nas concentrações de 100,0 (94,73% de inibição), 50,0 (95,39% de inibição), 25,0 (94,73% de inibição), 10,0 (84,68% de inibição) e 5,0 (78,75% de inibição) μg/mL de extrato seco de trevo-vermelho. O teste anti-inflamatório in vivo demonstrou significante atividade nas doses testadas, 100 e 50 mg/kg de extrato seco de trevo-vermelho. O percentual médio de inibição do edema foi 63,37%. O teste da inibição da acetilcolinesterase não demonstrou atividade. Os resultados deste estudo sugerem que se pode produzir plantas com concentrações mais elevadas de isoflavonas para a produção de fitomedicamentos com maior qualidade, e o extrato de trevo-vermelho pode ser adequado para o tratamento de doenças inflamatórias. / Red clover (Trifolium pratense L.) is one of the most utilized forage legume in the world agriculture and contains the isoflavones formononetin and biochanin A, and in smaller concentration daidzein and genistein. These compounds have gained a high interest due to their human health benefits. Recently this species was included in the list of Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS) which contains medicinal plants that have potential to generate products to be produced and distributed by SUS. But it is important to highlight that does not exist any study of isoflavones quantification in red clover plants cultivated in Brazil. The aims of this work were to validate a method to analize red clover samples by High Performance Liquid Cromatography (HPLC); to quantify four isoflavones compounds in 78 red clover accessions; to verify seasonal modifications in the isoflavone concentration of three red clover accessions; to increase isoflavones levels through plant breeding; and to determine in vivo and in vitro anti-inflammatory activity, and inhibitory activity of acetylcholinesterase of a red clover dry extract. To analyze the plants by HPLC, they were hydrolyzed, separated by dichloromethane, and resuspended with methanol. The HPLC method used was validated. Isoflavones (daidzein, genistein, formononetin and biochanin A) were quantified in 78 red clover accessions, the aglycone contents (expressed in μg/g of dry material, n=3) of these compounds varied from 0.00 to 137.91 to daidzein; 14.70 to 516.51 to genistein; 452.97 to 28548.65 to formononetin; and 1967.64 to 20145.27 to biochanin A, and the total isoflavone concentration ranged between 9.81 and 36.36 mg/g. The seasonal study showed that the total concentration of isoflavones is not statistically different at different seasons, but is possible to verify that at spring (when red clover is at reproductive stage) we could observe the lowest concentration, and at winter (when red clover is at vegetative stage) we found the highest concentration. In the breeding study we could observe an increase in the total concentration of isoflavones. The in vitro anti-inflammatory activity was measured towards by leucocytes mobilization, by chemotaxis assay in Boyden´s chamber. The in vivo anti-inflammatory activity was tested by a carrageenan-induced rat paw edema test. The results of anti-inflammatory in vitro test showed that there was a significant inhibition of leukocyte migration at concentrations of 100.0 (94.73% of inhibition), 50.0 (95.39% of inhibition), 25.0 (94.73% of inhibition), 10.0 (84.68% of inhibition) and 5.0 (78.75% of inhibition) μg/mL of red clover dry extract. The in vivo anti-inflammatory test demonstrated significant activity in the tested doses, 100 and 50 mg/kg of red clover dry extract. The average of edema inhibition percentage was 63.37%. The inhibition of acetylcholinesterase test did not show activity. The results of this study suggest that we can select or produce plants with higher concentrations of isoflavones to produce phytomedicines with higher quality, and the red clover extract might be suitable for the treatment of inflammatory diseases.

Objetivos: os objetivos gerais deste trabalho foram desenvolver, validar e comparar métodos indicativos de estabilidade para a análise do cloridrato de butenafina (BTF), matéria-prima e forma farmacêutica, bem como determinar a cinética de degradação do fármaco em condição de estresse. Adicionalmente, o trabalho visou à validação de método para avaliar e comparar a penetração/permeação cutânea da BTF de diferentes formulações. Métodos: Um método indicativo de estabilidade para análise da BTF por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi desenvolvido e validado, conforme normas do ICH. A cinética de degradação do fármaco (matériaprima e creme) frente à luz UVC foi determinada. Testes para o desenvolvimento de método quantitativo por eletroforese capilar para a análise do fármaco isoladamente e presente na formulação foram realizados. O método analítico cromatográfico previamente desenvolvido para a formulação semi-sólida foi validado para a quantificação de BTF na pele suína. Em seguida, as penetrações/permeações cutâneas do fármaco utilizando células de Franz foram analisadas visando à comparação de duas formulações comerciais (uma delas brasileira e a outra americana). Resultados e Conclusões: O método de CLAE indicativo de estabilidade desenvolvido demonstrou ser adequado para a determinação da substância ativa na formulação mesmo na presença de produtos de degradação, bem como para a quantificação do fármaco na pele suína e no fluído receptor. Os principais fatores extrínsecos que promovem a degradação do fármaco foram estabelecidos: luz, oxidação e meio básico (este último somente na presença de excipientes). A determinação da cinética de fotodegradação como sendo de primeira ordem demonstra que o processo é dependente da concentração do fármaco, reforçando a necessidade de proteção frente à luz. Já o método por eletroforese capilar mostrou-se não específico frente à formulação placebo simulado, inviabilizando seu uso para o creme. Na avaliação da permeação cutânea das formulações brasileira e americana não foi detectada presença considerável do fármaco no fluído receptor para ambos os produtos. Já na verificação da penetração, não houve diferença significativa na retenção do fármaco na epiderme, entretanto, na derme a diferença foi estatisticamente significativa, com maior concentração retida na análise da formulação americana (α = 0,05). / Objectives: The aim of the present work was to develop, validate and compare stability indicating methods to quantify butenafine hydrochloride (BTF), raw material and commercial cream, as well as to establish the degradation kinetics of the drug in a stress condition. Also, the study had the goal of validating a method to assess and compare the cutaneous permeation/penetration of two different formulations. Methods: A stability-indicating method for the analysis of BTF by high performance liquid chromatography (HPLC) was developed and validated according to the ICH guidelines. The degradation kinetics of the drug (raw material and cream) under the UVC light was determined. Analyzes to develop and validate an analytical method by capillary electrophoresis, to quantify the drug by itself and in the cream, were performed. The chromatographic method previously developed for the semi-solid product was validated to quantify the drug in porcine skin. Then, the cutaneous permeation/penetration of BTF, through the Franz-type cell, was analyzed to compare two different commercial formulations (one of them is Brazilian and the other is American). Results and Conclusions: The developed stability-indicating method was adequate to determine the active substance in the formulation even in the presence of the degradation products, as well as to quantify the drug in porcine skin and in the receptor fluid. The main extrinsic factors that promote the drug degradation were established: light, oxidative and basic media (the last in the presence of the excipient ingredients). The photodegradation kinetics was determined as first order showing that the process is dependent on the drug concentration, reaffirming the necessity of protection against light. The method by capillary electrophoresis was not specific considering the placebo formulation, hindering its use to the cream. During the cutaneous permeation analysis, no drug was found in the receptor media of both the Brazilian and the American formulations. No difference was verified to the epidermis, although to the dermis there was a statistical distinction as the concentration of retained drug from the American formulation was higher (α = 0,05).